Anda di halaman 1dari 10

MAKALAH PRAKTIKUM

DASAR-DASAR GENETIKA

EKSTRAKSI DNA

Disusun Oleh :

Nama : Arum Kuncoro Wati

NIM : 17/412818/PN/15140

Gol./Kel : B2

Asisten : 1. Alfain Nisa H.U


2. Farida Muthia
3. Dhimas F.A

LABORATORIUM PEMULIAAN TANAMAN DAN GENETIKA

DEPARTEMEN BUDIDAYA PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA

2018
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Ekstraksi DNA adalah proses dan tahapan pertama yang dilakukan untuk mendapatkan
total DNA dari suatu biota untuk selanjutnya dilakukan analisis molekuler. Analisis tingkat
molekuler dengan DNA sebagai objeknya diawali dengan proses ektraksi DNA untuk
mendapatkan DNA yang murni dengan konsentrasi tinggi sehingga dapat digunakan untuk
analisis molekuler selanjutnya, seperti PCR, RLFP, dan RAPD (Fitriya dkk., 2015).

Secara umum, ekstraksi DNA meliputi beberapa tahapan proses penting, yaitu dari
mulai tahap persiapan hingga akhirnya diperoleh ekstrak DNA yang terlarut dalam suatu
larutan penyangga/ buffer khusus. Larutan buffer digunakan untuk menyimpan dan
mempertahankan kondisi DNA secara kualitatif dan kuantitatif dalam jangka waktu yang
panjang. Secara kualitatif berarti larutan buffer harus dapat mempertahankan kualitas DNA
yang terlarut tetap dalam kondisi baik. Secara kuantitatif, larutan buffer mampu
mempertahankan jumlah DNA yang terlarut sehingga jumlahnya tetap (tidak ada yang rusak
dan mengalami penurunan kualitas). Adapun tahap proses ekstraksi dimulai dari persiapan,
pemilihan metode hingga didapatkan ekstrak DNA. Keberhasilan ekstraksi DNA dapat diukur
melalui pengecekan keberadaan band DNA dengan metode elektroforesis atau melalui
pengukuran konsentrasi DNA terlarut dengan metode spektrofotometri (Marwayana, 2015).

Ekstraksi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis molekuler.
Permasalahan utama yang sering muncul dalam proses ekstraksi DNA tanaman adalah
kehadiran senyawa kontaminan pada sampel yang diisolasi seperti senyawa polisakarida,
polifenol, protein,RNA, dan senyawa metabolit sekunder . Permasalahan yang sering muncul
saat ekstraksi DNA yaitu DNA patah-patah selama proses ekstraksi, DNA mengalami
degradasi akibat kehadiran enzim nuklease, adanya kontaminasi senyawa polisakarida, dan
ikut terisolasinya senyawa metabolit sekunder. Kehadiran senyawa kontaminan tersebut dapat
menghambat berbagai proses mulai dari pemotongan DNA, amplifikasi, hingga kloning.
Jarak merupakan salah satu tanaman yang daunnya memiliki kandungan getah yang cukup
tinggi sehingga mempersulit proses isolasi DNA (Nugroho dkk., 2016).

Prinsip dasar metode ekstraksi berupa tahapan lisis, pemisahan DNA dari pengotor dan
pemurnian DNA. Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal
isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau
jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan
metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun
enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang
dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel
Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan
membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida
dalam komponen sel.

Pada tahapan pemisahan DNA dari pengkotor, seringkali digunakan chelating


agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim
DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim
DNAse DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari
kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.

Setelah proses pemisahan DNA dari pengotor, tahapan selanjutnya adalah pemurnian
DNA. DNA yang didapat dipekatkan melalui pemisahan menggunakan etanol maupun
isopropanol, dimana kedua senyawa akan mempresipitasi DNA pada fase aqueus sehingga
DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan
sentrifugasi. Pencucian dengan etanol mampu menghilangkan residu klorom yang berasal dari
tahapan sebelumnya.

Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik konvensional maupun
menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara konvensional bisa dilakukan antara lain dengan
metode CTAB/NaCl, metode SDS, dan metode fenol kloroform. Seiring perkembangan ilmu
pengetahuan dan teknologi, ektraksi DNA dapat dilakukan menggunakan kit dari berbagai
merk. (Fitriya dkk., 2015).
CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi
protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila
dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke
dalam buffer ekstraksi. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA
yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan
karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Metode ini tidak membutuhkan biaya yang
lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini
adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol
dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan
DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang
umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang dan pengaruh cara
maupun lama waktu penyimpanan (Latif and Osman, 2017).
Metode kit meliputi Tissue Lysis Buffer, Brinding Buffer dan Proteinase K. Tissue
Lysis Buffer berperan dalam penghancuran membran sel oleh EDTA, Brinding Buffer
berperan dalam mengikat DNA dan Proteinase K berperan dalam menghilangkan kontaminan
protein. Keunggulan metode kit adalah sederhana, pengerjaan tidak rumit (proses presipitasi
tidak ada) dan aman (tidak menggunakan kloroform maupun deterjen sehingga risiko terpapar
bahan toksik terminimalisir). Namun, disisi lain biaya yang dibutuhkan sangat besar karena
alatnya mahal (Latif and Osman, 2017).

B. Tujuan
Praktikum Dasar-Dasar Genetika berjudul Ekstraksi DNA bertujuan untuk
membandingkan konsentrasi dan kemurnian DNA menggunakan metode konvensional dan
metode kit.
II. ISI
A. Hasil

Pada praktikum Ekstraksi DNA yang telah dilakukan, didapatkan hasil berupa :

Tabel 1. Hasil Ekstraksi DNA dengan Metode Konvensional

No Sampel Kemurnian Konsentrasi (ng/μl)


1 Buah Mangga 1.00 100
2 Buah Pepaya 1.00 200
3 Buah Stroberi 0.833 500

Tabel 2. Hasil Ekstraksi DNA dengan Metode Kit Thermo Scientifics

No Sampel Kemurnian Konsentrasi (ng/μl)


1 Buah Mangga 1.250 500
2 Buah Pepaya 1.200 600
3 Buah Stroberi 2.000 200
4 Daun Mangga 1.038 2700
5 Daun Jeruk 1.100 1100
6 Daun Puring 1.667 500

B. Pembahasan

Praktikum Dasar-Dasar Genetika tentang Ekstraksi DNA dilakukan di Laboratorium


Pemuliaan Tanaman dan Genetika, Departemen Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian,
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Praktikum dilaksanakan pada tanggal 20 November
2018 pukul 09.00 – 14.00 WIB. Pada praktikum Ekstraksi DNA dilakukan 3 metode berupa
metode konvensional dan metode Kit.

Alat dan bahan yang digunakan dalam metode konvensional berupa sampel (stroberi,
mangga dan pepaya), ½ sendok teh garam dapur, alkohol, 2 sendok teh sabun cuci piring, 100
mL aquades, plastik dengan klem, gelas, mikropipet, alat sentrifuse, spektofotometer dan
kertas saring. Langkah kerja yang dilakukan dimulai dari pemasukkan masing-masing sampel
ke dalam plastik dengan klem, dilanjutkan dengan pemukulan sampel hingga halus. Larutan
lisis dibuat dari sabun cuci piring dan garam yang dilarutkan dalam aquades. Sabun cuci
berfungsi untuk memecah membran sel agar komponen dalam sel keluar, sedangkan garam
berfungsi untuk memisahkan DNA dari pengotor. Dilakukan pemasukkan larutan lisis ke
dalam plastik berisis sampel halus dan di homogenkan, namun larutan dijaga agar tidak
berbusa. Penuangan larutan ke dalam gelas yang telah dilapisi kertas saring. Ditambahkan
alkohol dingin yang berfungsi untuk mengendapkan DNA sedangkan kontaminan lain akan
tetap larut. Ketika berhasil, DNA akan menggumpal di atas permukaan larutan. Dilakukan
penggambilan DNA dengan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube, lalu
disentrifuse. Supernatan yang terbentuk dibuang sehingga menyisakan pellet. Pellet dicuci
menggunakan etanol dan disimpan selama 24 jam. Dilakukan kuantifikasi konsentrasi dan
kemurnian DNA dengan spektofotometer sinar UV.

Alat dan bahan yang digunakan dalam metode kit berupa sampel ( daun dan buah dari
stroberi, mangga dan pepaya), microtube, gotri, larutan lisis buffer A, larutan lisis buffer B,
RNAse, waterbath, presipitation solution, alat sentifuse, binding solution, etanol absolute,
wash buffer, dan elution buffer. Langkah kerja yang dilakukan berupa pencucian sampel
kemudian dilakukan penimbangan sebanyak 0,05 gram dan dimasukkan dalam microtube 1,5
ml. 2 gotri dimasukkan dan ditambahkan 350 μl larutan lisis buffer A kemudian digrinder
selama 2 x 20 detik. Larutan lisis buffer berfungsi untuk menurunkan tegangan permukaan
cairan dan melarutkan lipid sehingga membran sel terdegradasi secara kimiawi dan organel
sel keluar. Grinding dilakukan untuk mendegradasi membran sel secara mekanis. Setelah
proses grinding ditambahan 50 μl larutan lisis buffer B dan 20 μl RNAse A kemudial
divortex selama 1 menit. RNAse berfungsi untuk mendegradasi RNA agar tidak mengotori
DNA dan vortex digunakan untuk menghomogenkan larutan. Selanjutnya larutan diinkubasi
dalam waterbath yang berfungsi untuk mengefektifkan proses lisis, menghancurkan protein,
phenol, polisakarida, dan menonaktifkan DNAse yang dapat merusak DNA. Selanjutnya
ditambahkan 130 μl presipitation solution untuk mengendapkan protein, phenol dan
polisakarida. Larutan diinkubasi selama 5 menit di lemari es, kemudian disentrifuse selama 5
menit pada 14.000 rpm yang bertujuan untuk memisahkan partikel berdasarkan berat
molekul. Pada tahap ini dihasilkan supernatan dan pellet (DNA berupa cairan bening di atas
lapisan). Supernatan dihilangkan hingga tersisa pellet. Pellet ditambah dengan 400 μl Binding
solution dan etanol absolute. Campuran diambil 600 μl dimasukkan ke filter column untuk
dilakukan langkah pencucian yang terdiri atas spin column dan collection tube dan
disentrifuse selama 1 menit pada 8.000 rpm kembali dan larutan pada collection tube
dibuang. Kemudian diulangi kembali langkah pencucian sebanyak 2x. Endapan DNA dicuci
kembali dengan wash buffer 500 μl untuk membersihkan dari endapan garam dan di
sentrifuse selama 1 menit pada 10.000 rpm, kemudian buang larutan pada collection tube.
Sentrifuse kembali selama 3 menit pada 14.000 rpm untuk menggeringkan filter column. Spin
column dipindahkan dalam micro tube dan ditambahkan larutan elution buffer sebanyak 100
μl dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit kemudian di sentrifuse pada 1000 rpm
selama 1 menit. Kemudian larutan DNA disimpan selama 24 jam dilanjutkan dengan analisa
spektofotometer.

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsip isolasi
DNA secara umum ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik
untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan
akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi
merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.
Ekstraksi dan pemurnian DNA pada dasarnya merupakan serangkaian proses
pemisahan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Ekstraksi untuk memperoleh DNA
yang berkualitas tinggi merupakan kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam analisis
molekuler dan merupakan salah satu faktor keberhasilan dalam amplifikasi DNA yang akan
digunakan dalam analisis karakter 5-7 genetika. Ekstraksi yang baik didukung oleh hasil
kuantitas DNA ekstrak yang diperoleh. Pengukuran kuantitas DNA dilakukan dengan metode
spektrofotometri menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) 260 dan 280
nm. Kemurnian DNA ditentukan dengan menghitung rasio absorbansi pada A260 dengan
A280 (Ratio A260:A280). Molekul DNA dikatakan murni jika rasio absorbansinya berkisar
antara 1.8 – 2.0 (Mustafa dkk., 2016). Jika terdapat kontaminasi fenol atau protein maka nilai
rasio akan kurang dari 1.8 sedangakan jika terdapat pengotor dari RNA, maka rasio akan
melebihi 2. Informasi mengenai konsentrasi dan kemurnian DNA sangat diperlukan untuk
mengetahui derajat kontaminasi suatu sampel dan apakah sampel tersebut baik untuk
digunakan pada tahap selanjutnya. Oleh karena itu, dilakukan pengukuran terhadap kuantitas
baik konsentrasi maupun kemurnian DNA genom.
Pada praktikum yang telah dilakukan, didapatkan bahwa kuantifikasi kemurnian DNA
menggunakan metode konvensional pada buah mangga dan pepaya sebesar 1.000 sedangkan
pada buah stroberi sebesar 0.833. hasil kuantifikasi kemurnian DNA menggunakan metode
kit Thermo Scientifics pada buah stroberi, mangga dan pepaya berturut-turut sebesar 2.000;
1.250; dan 1.200. Dari hasil yang didapatkan, dapat ditarik kesimpulan bahwa penggunaan
metode kit memberikan hasil isolasi DNA yang lebih murni dibandingkan metode
konvensional. Pada metode kit kemurnian berkisar antara 1.200 hingga 2, sedangkan pada
metode konvensional, kemurnian hanya berkisar antara 0.833 hingga 1. Pada metode
konvensional terjadi pengotoran DNA oleh fenol ataupun protein, dibuktikan bahwa
kemurnian kurang dari 1.8. pada metode kit hanya buah mangga dan pepaya yang terkena
pengotor dari fenol/protein dan jumlahnya lebih sedikit dari pengotor di metode konvensional
karena nilai kemurnian di metode kit lebih tinggi. Pada stroberi dalam metode kit memiliki
kemurnian paling optimal diantara yang lain.
Pada daun mangga, jeruk dan puring dalam metode kit memiliki kemurnian secara
berturut-turut sebesar 1.038; 1.100; dan 1,667. Daun mangga dan jeruk memiliki kontaminasi
fenol/protein yang lebih besar daripada daun puring. Daun puring sendiri kemurnian DNA
yang didapatkan mendekati nilai optimal.
III. PENUTUP
A. Kesimpulan

Dari praktikum ekstraksi DNA yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa
ekstraksi DNA menggunakan metode kit menghasilkan DNA yang lebih murni dan lebih
bebas kontaminasi protein dibandingkan dengan metode konvensional.
Daftar Pustaka

Fitriya,R.T., M. Ibrahim., dan L.Lisdiana. 2015. Keefektifan metode isolasi DNA Kit dan
CTAB/NaCl yang dimodifikasi. LenteraBio Vol. 4 No. 1: 87–92.

Latif, A.A., and G.Osman. 2017. Comparison of three genomic DNA. Plant Methods. Vol
13:1-9.

Marwayana, O.N. 2015. Ekstraksi DNA dari sampel jaringan otot. Oseana. Vol XI No 2: 1-9.

Mustafa, H., I.Rachmati., dan Y.Udin. 2016. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA
genom nyamuk. Jurnal Vektor Penyakit. Vol. 10 No. 1: 7-10.

Nugroho, K., R.T.Teryanan., H.Rijzaani., dan P.Lestari.2016. Metode ekstraksi DNA pada
Jatropha spp. tanpa menggunakan nitrogen cair. Jurnal Littri 22(4): 159 - 1 6 6
Lampiran

Gambar 1. Hasil Semua Pengujian Kuantifikasi Kemurnian dan Konsentrasi DNA