Incidencia de Rhizotonia Sclerotium

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UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
DEPARTAMENTO DE AGRONOMÍA
INCIDENCIA DE Rhizoctonia spp., Sclerotium rolfsii Y

Macrophomina phaseolina EN FRIJOL COMÚN EN VILLA CLARA.
BASES PARA EL MANEJO INTEGRADO
Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas
Autor. Ing. Manuel Díaz Castellanos, M. Sc.

Tutor. Prof. Tit., Ing. Lidcay Herrera Isla, Dr. Cs.
Consultante. Ing. Reinaldo Quiñones Ramos, M. Sc.
Santa Clara
2011
Todo hombre debe decidir
una vez en la vida,
si se lanza a triunfar
arriesgándolo todo;
o se sienta en su balcón tranquilamente,
a contemplar el desfile de los triunfadores.
Anónimo
Agradecimientos
Hace mucho tiempo una frase llamó mi atención "La gratitud es la memoria del corazón".
Quiero, por tanto, expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que de alguna
forma influyeron en la realización y culminación de este proyecto.
A mi tutor Dr. Cs. Lidcay Herrera Isla, por su contribución a mi formación profesional y
personal.
A la Doctora Maryluz Folgueiras, por su paciencia y contribución a la mejora del documento.
Al Doctor Michel Leiva Mora, por su contribución, incondicionalmente, a la mejora del

documento y de mi formación.
A la Doctora Yaquelyn Nerey, la que tardía pero segura, hizo suya esta tesis.
Al administrador José Paz, por su preocupación constante por el desarrollo del trabajo.
A los que me ofrecieron su apoyo incondicional: Dr. C. Orlando Saucedo, Marlén Cárdenas,
Gudelia Rodríguez, Dr. C. Edilberto Pozo.
A Guillermo, Guinia, César, jefes de las fincas, y trabajadores donde se desarrollaron los
experimentos de campo.
A los especialistas René Cupull, Rafael Jiménez Carrazana y Angel Mollineda por sus
contribuciones a mi formación profesional.
A Marianela Sibat, del Centro de Documentación de la FCA.
Al Máster Rafael Sosa, por sus lanzamientos indescifrables.
Al Máster Ray Espinosa por ayudarme a descifrar esos lanzamientos.
A los estudiantes y maestrantes que colaboraron con sus investigaciones a la realización de

este trabajo: Clara Elena Fajardo, Inocencio Martínez, Yanet Reinaldo, Máximo Delgado,
Yosbel Hernández, César Fernández, Aynel Egües, Maikel Abreu, Minelys González,
Yánder Fernández Cancio, Eduán Valdés e Idania Tirado.
A la Licenciada Milagros
Al Dr. C. Luis A. Barranco y a Carmen Mendoza, del Vicedecanato de Investigaciones y

Postgrado
A la Dirección de la Facultad de Ciencias Agropecuarias
A mis compañeros del Departamento de Agronomia
A mis amigos, que simpre estuvieron al tanto de la marcha del proceso, Raul Collado, Ojito y
Yuniel.
Y por último, un agradecimiento especial a mi familia, por su comprensión y apoyo.

A Yía "El Dulcero" y Mariana "La Costurera" dondequiera que estén
A Claudia
SÍNTESIS
Con los objetivos de identificar los hongos patógenos del suelo involucrados en la
pudrición de raíces y tallos del frijol común (Phaseolus vulgaris), así como
determinar el efecto de la composición varietal, el tipo de suelo, la fertilización y el
tratamiento de semillas con bacterias antagonistas y Quitosana sobre la incidencia
de estos hongos, se condujeron varios experimentos en el período comprendido
entre enero del año 2007 hasta mayo de 2011. Rhizoctonia spp., S. rolfsii y M.
phaseolina fueron las especies que incidieron sobre el frijol y su porcentaje de
incidencia estuvo relacionada con el color de las semillas. Las variedades más
afectadas fueron las que tenían semillas de testa blanca, a estas le siguieron las
rojas y, finalmente las menos afectadas fueron las negras. Los análisis de la
composición química de la testa de la semilla mostraron diferencias significativas en
cuanto al contenido de compuestos fenólicos entre las semillas blancas, rojas y
negras. Estas últimas contenían la mayor cantidad de fenoles. El recubrimiento de
las semillas con Rhizobium phaseoli y micorrizas, así como la aplicación de compost
en el fondo del surco y el empleo de bacterias antagonistas y quitosana redujeron las
afectaciones por hongos del suelo e incrementaron el rendimiento del cultivo. M.
phaseolina se asoció más a los suelos Ferralíticos. El manejo de la variedad, el uso
de productos orgánicos y biofertilizantes, así como el empleo de organismos
antagonistas y sustancias elicitoras en el tratamiento a la semilla, son una alternativa
para reducir las afectaciones por hongos del suelo en el frijol común, o en otros
cultivos donde estos organismos causan afectaciones.

Tabla de contenidos
1. INTRODUCCIÓN ...............................................................................................................................1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. .........................................................................................................5
2.1. Rhizoctonia solani Kühn ........................................................................................................7
2.2. Sclerotium rolfsii Sacc ..........................................................................................................11
2.3. Macrophomina phaseolina (Tassi.) Goid. .......................................................................13
2.4. Métodos de lucha. ..................................................................................................................15
2.4.1. Control cultural ................................................................................................................16
2.4.1.1. Enmiendas orgánicas ............................................................................................16
2.4.1.2. Rotación de cultivos. ..............................................................................................16
2.4. 1.3. Labores agrotécnicas ............................................................................................17
2.4.1. 4. Resistencia varietal ................................................................................................18
2.4.2. Control químico ....................................................................................................................18
2.4.3. Solarización .....................................................................................................................19
2.4.4. Control biológico.............................................................................................................19
2.4.5. Control con sustancias naturales .........................................................................................21
2.4.6. Control Integral ....................................................................................................................22
3. MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................................................25
3.1. Aislamiento, identificación y patogenicidad de hongos del suelo causantes de

enfermedades en frijol común ....................................................................................................25
3.1.1. Aislamiento, identificación y agresividad de Rhizoctonia spp. ..........................25
3.1.2. Aislamiento, identificación y patogenicidad de Sclerotium rolfsii Sacc..........30
3.1.3. Aislamiento, patogenicidad y agresividad de aislados de Macrophomina

phaseolina (Tassi) Goid............................................................................................................31
3.2. Incidencia de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos del suelo sobre
variedades de frijol ........................................................................................................................33
3.2.1. Caracteres de la testa de la semilla asociados a la resistencia del frijol
común a hongos fitopatógenos del suelo ...........................................................................35
3.2.1.1. Ensayos biológicos .................................................................................................36
3.2.1.2. Tamizaje fitoquímico ...............................................................................................37
3.2.1.3. Cuantificación de compuestos fenólicos en extractos acuosos obtenidos

de testas de variedades de frijol común ..........................................................................37
frijol común en dos tipos de suelo. ...........................................................................................38
3.4. Efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos fitopatógenos del suelo

en frijol común ................................................................................................................................38
3.4.1. Influencia de la fertilización sobre el rendimiento agrícola .................................40
3.5. Incidencia de hongos del suelo sobre plantas de frijol provenientes de semillas
tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana.................................................................41
3.5.1. Efecto de los tratamientos sobre el rendimiento agrícola y sus componentes.

.........................................................................................................................................................42
3.5.2. Efecto in vitro de Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis, Pseudomonas

aeruginosa y Pseudomonas fluorescens sobre hongos del suelo patógenos al
frijol ................................................................................................................................................42
3.5.2.1 Difusión en agar ........................................................................................................42
3.5.2.2 Determinación de la presencia de metabolitos volátiles con actividad

antifúngica ...............................................................................................................................43
3.6. Efecto in vivo del tratamiento a la semilla con bacterias antagonistas y

Quitosana sobre la severidad de la enfermedad causada por hongos del suelo
patógenos al frijol ..........................................................................................................................44
3.7. Análisis de los suelos ...........................................................................................................45
3.7.1. Análisis químico....................................................................................................................46
3.7.2. Análisis físico ........................................................................................................................46
3.7.3. Análisis microbiológico del Suelo ........................................................................................47
3.8. Variables climatológicas ......................................................................................................47
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN......................................................................................................49
4.1. Aislamiento, identificación y patogenicidad (agresividad) de hongos del suelo
causantes de enfermedades en frijol común..........................................................................49
4.1.1 Aislamiento, identificación y agresividad de Rhizoctonia spp. ...........................49
4.1.2. Aislamiento, identificación y patogenicidad de Sclerotium rolfsii Sacc..........53

phaseolina (Tassi) Goid............................................................................................................55
variedades de frijol ........................................................................................................................58
4.2.1. Caracteres químicos de la testa de la semilla de frijol común asociados a la

resistencia a hongos fitopatógenos del suelo. ..................................................................64
4.2.1.1. Ensayos biológicos .................................................................................................64
4.2.1.2. Tamizaje fitoquímico ...............................................................................................64
4.2.1.3. Cuantificación de compuestos fenólicos en extractos acuosos obtenidos

de testas de variedades de frijol común. .........................................................................65
frijol común en dos tipos de suelos..........................................................................................67
4.4. Efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos fitopatógenos del suelo

en frijol común ................................................................................................................................70
4.4.1. Influencia de la fertilización sobre el rendimiento agrícola .................................74
4.5. Incidencia de hongos del suelo sobre plantas de frijol provenientes de semillas
tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana.................................................................75
4.5.1. Influencia de bacterias antagonistas y Quitosana sobre el rendimiento. .......79

frijol. ...............................................................................................................................................81
4.5.2.1. Difusión en agar ......................................................................................................81
4.5.2.2. Determinación de la producción de metabolitos volátiles con actividad

antifúngica ...............................................................................................................................81
4.5.3. Efecto in vivo del tratamiento a la semilla con bacterias antagonistas y

quitosana sobre la severidad de la enfermedad causada por hongos del suelo
patógenos al frijol ......................................................................................................................83
5. CONCLUSIONES ............................................................................................................................89
6. RECOMENDACIONES ...................................................................................................................91
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................96
ANEXOS ..............................................................................................................................................136
1. INTRODUCCIÓN
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) está ubicado entre los cinco cultivos con mayor
superficie dedicada a la agricultura en los países latinoamericanos (Peña-Cabriales,
2002) y es el tercero en importancia después del frijol de soya (Glycine max (L.)
Merr.) y el cacahuate (Arachis hypogea L.) (Lin, 2008).
En el mundo se siembran cerca de 25 millones de hectáreas con un rendimiento
promedio de 0,7 t ha-1 y los principales productores son India, Brasil, China, EE.UU. y
México, quienes contribuyen con el 57,8 % de la producción mundial (Cabral, 2006).
En muchos países de América Latina el frijol es la principal fuente de proteínas para
la población (Guzmán-Maldonado et al. 2000). Por otro lado, se ha demostrado que
el frijol contiene además, gran cantidad de compuestos nutracéuticos tales como
fibras, inhibidores de proteasa, acido fítico, polifenoles y taninos (Espinosa et al.,
2006).
En Cuba, se cultiva a lo largo y ancho del país y alcanza un área de 112 702 ha
aproximadamente, incluyendo el sector estatal (6 353 ha) y no estatal (106 349 ha),
con rendimientos de 0,57 y 0,72 t ha-1, respectivamente. Se destacan las provincias
de Villa Clara, Holguín y La Habana (ONE, 2010). En la dieta del cubano, los frijoles
secos representan una de las principales fuentes de proteína y calorías, con una
dependencia del cultivo superior al 50 % (ONE, 2007).
La producción nacional no cubre las necesidades del consumo por lo que es
necesario importar alrededor de 110 000 toneladas por año (Faure, 2003),
equivalentes a 48 millones de dólares (FAO, 2004). Estas cifras dan una idea de la
necesidad de explotar todos los recursos posibles para incrementar los niveles de
1
producción actuales si se quiere mantener los índices de consumo establecidos, sin
incrementar excesivamente las importaciones. Urge entonces aumentar los
rendimientos del cultivo, cuyo potencial puede alcanzar 5 t/ha bajo condiciones de
fertilidad (CIAT, 2000), dada esta diferencia por las deficiencias nutricionales y la
incidencia de plagas y enfermedades.
En muchos lugares donde se cultiva el frijol común, las enfermedades son el factor
más importante en la reducción de los rendimientos. Entre los organismos causantes
se encuentran los hongos del suelo, existiendo en nuestro país, condiciones
favorables para el desarrollo de esos organismos. Se destacan entre las especies
más importantes Rhizoctonia spp., Sclerotium rolfsii Sacc. y Macrophomina
phaseolina Tassi (Goid.), los que pueden ocasionar pérdidas en el rendimiento del
cultivo del orden del 90 % en América Latina (CIAT, 1988) y entre 25 y 50 % en Cuba
(González, 1988).
En Villa Clara, en el 2005 y 2006 la presencia de M. phaseolina en las semillas fue la
causa de la descalificación de seis toneladas de frijol común y tres toneladas de
habichuela, a utilizar como material de siembra (González, 2007).
Para el control de estos microorganismos se han empleado métodos que incluyen el
control cultural, resistencia varietal, control químico, solarización, control biológico,
entre otros. Estos métodos tienen sus inconvenientes específicos, por lo que las
tendencias actuales se inclinan por un manejo integrado de los mismos (Folch et al.,
1997).
Numerosos estudios se han desarrollado en nuestro país sobre la bioecología y
control de especies de hongos fitopatógenos que habitan en el suelo (González,
2
1988; Martín, 2001; Herrera, 2004). Sin embargo, en la actualidad estas
enfermedades constituyen una causa importante de bajos rendimientos en los
cultivos, por lo que se hace necesario ampliar los estudios y utilizar e incluir
alternativas que reduzcan las pérdidas y contribuyan a las sostenibilidad de nuestras
producciones agropecuarias.
Hipótesis
El manejo de la variedad, el tipo de suelo y la fertilización, así como el empleo de
microorganismos antagonistas y sustancias naturales para la protección de las
semillas, reducirán la incidencia de enfermedades causadas por hongos del suelo
patógenos al frijol común y con ello se contribuirá al aumento de los rendimientos
agrícolas de este cultivo.
Objetivo general
Evaluar el efecto de la composición varietal, el tipo de suelo, la fertilización y el
tratamiento a las semillas con Quitosana y bacterias antagonistas y promotoras del
crecimiento sobre la incidencia de enfermedades causadas por hongos del suelo
patógenos al frijol común.
Objetivos específicos:
1. Identificar y determinar la incidencia de los hongos del suelo patógenos al frijol
común.
3
2. Relacionar la incidencia de los principales agentes patógenos con las variedades
(color de la testa) y el tipo de suelo.
3. Evaluar el efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos fitopatógenos
del suelo y el rendimiento en el frijol común.
4. Evaluar el efecto del tratamiento a la semilla con Quitosana y bacterias
antagonistas y promotoras del crecimiento, sobre la incidencia de hongos
fitopatógenos del suelo y el rendimiento en el frijol común.
4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa comestible más importante
en el mundo, cultivada en muchos países, especialmente en América Latina y África;
siendo una fuente importante de proteínas. Sin embargo, los rendimientos actuales
son bajos, no sobrepasando en muchos casos el 20 % del rendimiento máximo del
cultivo (Chailloux et al. 1996).
En muchos lugares donde se cultiva el frijol, las enfermedades son el factor más
importante en la reducción de los rendimientos (Opio y Senguoba, 1991),
encontrándose entre los organismos causantes los hongos del suelo. En
Latinoamérica, el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) de Colombia
destaca que el cultivo es atacado por numerosos organismos fitopatógenos. La
incidencia y daño ocasionado varían significativamente entre estaciones, de un año a
otro, y entre localidades, por lo que es imposible obtener información para
clasificarlas en orden de prioridad. Entre las enfermedades fúngicas más importantes
del cultivo reportan la roya, Uromyces phaseoli var. typica Arthur, la antracnosis,
Colletotrichum lindemuthianum Sacc. & Magnus (Glomerella cingulata (Stoneman)
Spauld. & H. Schrenk) y las pudriciones radicales: Rhizoctonia solani Kühn, Fusarium
spp. Sclerotium rolfsii Sacc. (Athelia rolfsii (Curzi) C.C. Tu & Kimbr.) y Thielaviosis
bassicola (Berk y Br.) Ferr. causantes de pérdidas que pueden alcanzar el ciento por
ciento del cultivo (CIAT, 1988).
Mayea et al. (1983) destacaron entre las principales enfermedades del frijol en Cuba
al tizón común (Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Smith)), Antracnosis
5
(Colletotrichum lindemuthianum), la Roya (Uromyces phaseoli typica.), Mancha
angular (Isariopsis griseola Sacc.), Tizón ceniciento del tallo (Macrophomina
phaseolina Tassi. (Goid.)), la Pudrición del tallo (Rhizoctonia solani) y la marchitez
por Sclerotium (S. rolfsii)
Un amplio estudio sobre las enfermedades fúngicas que afectan al frijol común en
Cuba fue realizado por González (1988) quien refirió que la importancia de las
enfermedades en el cultivo está determinada por las características que las mismas
presentan bajo nuestras condiciones, los factores climáticos que prevalecen en cada
época de siembra, así como las características de los microclimas existentes en cada
región donde se cultiva el frijol común y las resumió en orden de importancia y
frecuencia, en las regiones oriental, central y occidental del país, destacándose la
roya, Uromyces phaseoli y las pudriciones radicales y del tallo, Rhizoctonia solani
Sclerotium rolfsii. y Macrophomina phaseolina.
Estudios realizados en la región central del país por Martin (2001) abordaron
aspectos bioecológicos y de control de S. rolfsii, especie fitopatógena presente en
numerosos cultivos de la región y en diferentes suelos. Investigaciones durante más
de 25 años sobre los principales hongos fitopatógenos que viven en el suelo, fueron
realizadas por Herrera (2004), las cuales trataron aspectos sobre la bioecología y
control de especies de los géneros Ceratocystis Ellis & Halst, Fusarium Link 1809,
Macrophomina Petr., Rhizoctonia DC, Sclerotium Tode y Thanatephorus.
En la actualidad las pudriciones radicales continúan entre las enfermedades que
mayores pérdidas causan en el cultivo. Entre los agentes causales se destacan
6
Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii. y Macrophomina phaseolina, los cuales pueden
ocasionar pérdidas en el rendimiento entre un 25 y un 50 % (González, 1988).
2.1. Rhizoctonia solani Kühn
Este hongo se clasifica dentro de la Clase Deuteromycetes u hongos imperfectos,
Orden Mycelia sterilia. En su etapa perfecta se corresponde con Thanatephorus
cucumeris (A. B. Frank) Donk, Familia Ceratobasidiaceae, Orden Cantharellales,
Subclase Incertae sedis, Clase Agaricomycetes, División Basidiomycota, Reino Fungi
(Index Fungorum, 2008).
Rhizoctonia solani es el agente causal de la rizoctoniosis, también conocida en
muchos lugares como chancro del cuello, tallo hueco, damping off o marchitez de las
posturas, pudriciones del tallo y órganos subterráneos, en numerosas plantas
cultivadas y silvestres. El hongo presenta amplia distribución mundial siendo
reportado en numerosos países.
Este hongo afecta mucho más las plántulas jóvenes que el tejido de las plantas
adultas, causando la enfermedad conocida como damping off o marchitez de las
posturas. Por lo general la enfermedad se encuentra localizada y en sus últimas
fases dentro de las parcelas pueden observarse fácilmente, pequeños parches en los
que han muerto las plantas. Los síntomas aéreos no sirven para diferenciar la
enfermedad en el campo (González, 1988). Mayea et al. (1983) señalan que en
plantas pequeñas aparecen en el tallo e hipocotilo úlceras de color pardo-rojizo, de
varios tamaños, delimitadas usualmente por un borde oscuro, las que luego se
vuelven ásperas, se secan y destruyen la médula. El hongo ataca además las raíces,
7
causando pudriciones en la base de la planta (González, 1988). El micelio es
ramificado y tabicado, uniformemente distribuido por la superficie del hospedero,
aunque a veces se aglomera y forma cordones visibles macroscópicamente. En los
cordones de mayor espesor se forman los esclerocios de color pardo intenso. Son de
forma aplastada y redondeada, cubiertos por un fieltro espeso y aterciopelado.
Aunque se ha informado sobre la aparición de los esclerocios en las lesiones, éstos
no son siempre fáciles de ver, contrario a lo que ocurre con S. rolfsii, el cual es fácil
de diagnosticar por la presencia de abundantes esclerocios de color crema a pardo
oscuro. Los esclerocios de R. solani tienen coloración mucho más oscura, siendo
ambas enfermedades fáciles de diferenciar. Las hifas jóvenes presentan una
coloración pardo amarilla a pardo oscura. Sus ramificaciones aparecen en ángulo
recto, con un tabique a una distancia no menor de 10 nm del punto de inserción.
Según Pichardo (1990) aislados de R. solani difieren en patogenicidad y morfología,
así como en características culturales y fisiológicas. No es una especie única, sino
una colección de poblaciones que da origen al concepto de Grupo Anastomosis (AG)
en el cual se agrupan organismos de la misma especie que pueden entrecruzar sus
hifas. González (2008a) señala que R. solani es la especie más estudiada dentro del
complejo Rhizoctonia. Se encuentra dividida en 14 grupos de anastomosis (AG) que
se subdividen en grupos según caracteres morfológicos, bioquímicos y moleculares.
Puede afectar a más de 500 especies de plantas superiores y provocar damping off
en posturas, lesiones necróticas en raíces y semillas y tallos, además de lesiones
foliares. Refiere además, que hasta mediados de 1980, la clasificación se basó en
8
caracteres morfológicos, número de núcleos por célula vegetativa, patogenicidad y
anastomosis hifal. Este último es el criterio más usado hasta la fecha.
Los enfoques recientes para caracterizar los distintos aislamientos incorporan
caracteres que se obtienen a través de técnicas moleculares como hibridización de
ADN, el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción y la
secuenciación directa de genes, entre otros (Carling y Kuninaga, 1990; Vilgalys y
González, 1990; Cubeta et al., 1996).
El hongo, según Pupo y Heredia (1998) se transmite, además, por las semillas
infectadas. Según Finch y Finch (1987) la penetración del hongo en el hospedero es
directa, formando agregados hifales (cojines de infección) en las raíces, que más
tarde ocasionan la decoloración y muerte de las mismas, con la siguiente
penetración. Cuando la hifa de Rhizoctonia se pone en contacto con la superficie
externa del hospedante se produce un fenómeno de reconocimiento que origina un
aumento de la ramificación micelial y formación de estructuras de infección
(apresorios) o ramas hifales en forma de T, las cuales forman lo que se conoce como
cojines de infección, que le permite al hongo penetrar al tejido vegetal intacto
(cutícula y epidermis). En el transcurso del proceso infeccioso se produce un
intercambio de sustancias entre la planta (exudados vegetales) y el hongo (enzimas
extracelulares). Después de la formación de los cojines de infección, ocurre la
penetración cuticular o estomática, esta última es muy rara, aunque se ha informado
solo para el AG I. Posteriormente ocurre la colonización de los tejidos con la
producción de enzimas hidrolíticas que degradan las paredes celulares. Se ha
9
demostrado que miembros del AG4 producen enzimas pectinolíticas y celulolíticas.
Esto ocurre preferentemente en suelos húmedos, pudiendo ser destruidas muchas
plantas jóvenes. Según Llacer (1996) los propágulos de esta especie son orientados
por los exudados radicales de sus hospedantes y entre las sustancias que estimulan
su orientación se encuentran aldehidos y policetoles. Las plantas más viejas pueden
ser atacadas, pero sobre éstas la invasión del hongo se limita al tejido externo
cortical, sobre el cual el hongo produce alargadas quemaduras y lesiones rojizas.
Según Mayea y Padrón (1983) una parte de su ciclo lo pasa saprofíticamente sobre
las partículas orgánicas del suelo o formando micorrizas, hasta que por determinados
factores se vuelve perjudicial para los semilleros provocando pudriciones y otros
trastornos. Herrera (2004) señala que la actividad saprofítica de R. solani permanece
inalterable durante los primeros 6 meses de establecerse en el suelo, mientras que a
partir de este período la supervivencia decrece a 25 cm de profundidad hasta un 60
% y a 15 cm a 90 %, manteniéndose el 100 % en la superficie del suelo, lo que
evidencia que la actividad saprofítica del patógeno disminuye a medida que aumenta
la profundidad.
El efecto de la temperatura ha sido estudiado por numerosos investigadores. Allison
(1952) y Sherwood (1969) encontraron que el rango óptimo de temperatura es de 25
a 30 ºC En cuanto al pH se ha reportado que el género Rhizoctonia presenta un
crecimiento limitado a valores que oscilan entre 2,3 y 3,8 y que el valor óptimo varía
de 4,5 a 7, estando los límites máximos entre 6,7 y 9. La humedad del suelo
constituye un factor determinante para la actividad biológica de Rhizoctonia solani. El
10
hongo es capaz de sobrevivir durante muchos años tanto en períodos de humedad
como de sequía.
2.2. Sclerotium rolfsii Sacc
Desde que en 1892, Rolfs reportó y describió por primera vez en el sur de la Florida
a Sclerotium rolfsii Sacc. causando la enfermedad conocida como Tizón del Sur, en
el cultivo del tomate (Solanum esculentum Mill.), muchos estudios se han
desarrollado sobre esta importante especie. A pesar de ello, el organismo continúa
causando problemas en numerosos cultivos, principalmente en regiones tropicales y
subtropicales.
El hongo se clasifica dentro de la Clase Deuteromycetes u hongos imperfectos,
Orden Mycelia Sterilia. Presenta como telemorfo un basidiomiceto denominado
primeramente Corticium rolfsii Curzi, después Pellicularia rolfsii (Curzi) West y
actualmente conocida como Athelia rolfsii (Curzi) C.C. Tu y Kimbrough (Domsch et
al, 1980), Familia Atheliaceae, Orden Atheliales, Subclase Agaricomycetidae, Clase
Agaricomycetes, División Basidiomycota, Reino Fungi (Index fungorum, 2008). En
cuanto a los hospederos Díaz y Castro (2005) plantean que el hongo afecta más de
200 géneros de plantas. Arnold (1986) reporta entre las principales especies
hospedantes del organismo patógeno a Ipomoea batatas (L.) Lam., Solanum
tuberosum L., Phaseolus vulgaris L. y Helianthus annus L., entre otras.
El hongo ataca las posturas en los semilleros durante la germinación de las semillas
o posteriormente, causando lesiones en la base de los hipocotilos de las plántulas,
caracterizada por hundimiento, ablandamiento y decoloración de la corteza,
11
justamente en la línea del suelo, donde aparece una mancha oscura en la base del
tallo, que aumenta hasta que se forma un anillo a su alrededor. Cuando llega a esta
fase, la planta queda tan debilitada en la base del tallo que termina por caer. Los
síntomas de la parte aérea son: clorosis, lenta defoliación y marchitez permanente.
En las partes subterráneas la infección también progresa y causa separación de la
corteza de los tejidos de la raíz (González, 1988). Sobre los tallos afectados se
forma una capa de micelio extramatrical, dentro del cual se forman los esclerocios
del hongo, de tamaño pequeño, 859 µm los redondos y 852-976 µm los ovoides,
inicialmente blancos y posteriormente pardo oscuros (Mayea y Padrón, 1983). Los
síntomas y signos del patógeno facilitan bastante la identificación de la enfermedad
en el campo.
Sclerotium presenta micelio compuesto por hifas tabicadas y finas, de paredes
delgadas que se integran en cordones. Las células del micelio son variables, entre
150-250 µm de largo por 2-9 µm de ancho, con uniones características en forma de
hebilla, las cuales tienen gran valor en la identificación de este hongo (González,
1988). El organismo puede transmitirse por semilla (Pupo y Heredia, 1998), así
como mediante esclerocios y micelio transportado por semillas agámicas de
diferentes cultivos, suelo, restos de cosecha, implementos agrícolas, y por el hombre
mismo (González, 1988). Según Beaute y Rodríguez-Kabana (1981) los esclerocios
pueden sobrevivir en el suelo de 2 a 5 años, lo cual dificulta las prácticas de rotación
de cultivo para su control, resaltando que alta humedad y temperatura mayor de 20
ºC disminuyen su supervivencia. Con relación al efecto de la temperatura Herrera
(2004) destaca que para Sclerotium rolfsii coinciden las temperaturas para el
12
crecimiento del micelio con las de la infección (28-34 grados). El efecto del pH ha
sido estudiado por numerosos autores, Punja (1985) reportó que S. rolfsii crece
mejor en pH en el rango de 2 a 7, siendo el óptimo entre 4 a 5. Urquijo et al. (1971)
encontraron que S. rolfsii crece mejor en suelos ácidos y Herrera (2004) no encontró
formación de esclerocios a pH entre 7 y 8.
Otro factor ambiental importante en el desarrollo y patogenicidad de S. rolfsii es la
humedad del suelo. Según Herrera (2004) el micelio de S. rolfsii en condiciones de
alta humedad se reduce en viabilidad a partir de los 7 días. Estos resultados
coinciden con los encontrados por Beaute y Rodríguez-Kabana (1981) quienes
observaron que el micelio desapareció rápidamente en presencia de alta humedad.
En suelo seco la supervivencia del micelio fue de 100 % hasta los 35 días,
disminuyendo a un 80 % a los 49 días. En condiciones naturales del suelo no hubo
cambios hasta los 35 días, sólo a los 49 días se notó una caída de la supervivencia
debido a las fuertes precipitaciones. La tendencia de germinación de los esclerocios
durante los 49 días de sobresaturación del suelo estuvo entre 60-80 % hasta los 35
días, a partir de donde disminuyó a cero (Herrera, 2004). Beute y Rodríguez-Kabana
(1981) señalaron que bajo un régimen de alta humedad del suelo la supervivencia
de los esclerocios fue significativamente más baja cuando las temperaturas se
mantuvieron por encima de los 20 ºC.
2.3. Macrophomina phaseolina (Tassi.) Goid.
Este organismo es considerado, según Hall (1991), un gran problema en el sur de
los Estados Unidos, el Caribe, América Central y Suramérica, provocando grandes
pérdidas en diferentes cultivos, entre los que se destaca el frijol común.
13
El hongo está ubicado taxonómicamente en la Familia Botryosphaeriaceae, Orden
Botryosphaeriales, Subclase Incertae sedis, Clase Dothideomycetes, División
Ascomycota, Reino Fungi. (Index Fungorum, 2008).
Macrophomina phaseolina presenta una fase esclerocial (Micelia Sterilia) Rhizoctonia
bataticola (Taub.) Buttler, la cual consiste en micelio y microesclerocios (esclerocios
negros) de forma esférica e irregular, los cuales se desarrollan con facilidad en
medios de cultivo. La fase picnidial, con la formación de picnidios negros, ostiolados
y globosos se desarrolla sólo en medios de cultivos especiales. En la naturaleza se
forma sólo en algunos hospederos y en ciertas condiciones. Las picnidiosporas son
ovaladas, hialinas, sin septas (Díaz, 1990).
El hongo ataca la raíz y tallo de las especies hospedantes mediante las
picnidiosporas y microesclerocios que sobreviven en el suelo y constituyen el inóculo
primario. La penetración al tejido se produce directamente mediante apresorios y lo
invade extra e intracelularmente, además, el organismo patógeno produce enzimas
pectinolíticas y toxinas de importancia para la patogénesis. Las plantas de frijol son
atacadas en todos los estados. En semilleros produce damping off pre y post-
emergente con una reducción del vigor de las plantas. El hongo causa clorosis,
defoliación prematura, maduración temprana, achaparramiento y muerte de la planta
(Olaya y Abawi, 1993). Frecuentemente afecta los hipocotilos y produce manchas
oscuras hundidas tan pronto como los mismos emergen del suelo. Los cotiledones
de las semillas portadoras de la enfermedad aparecen manchados de color pardo
oscuro a pardo violáceo, en las hojas y tallos de las plantas adultas se puede
14
observar necrosis acompañada de las fructificaciones del hongo (Tarakanta et al.,
2005).
Souza et al. (1980) plantean que M. phaseolina es el hongo más frecuente en el
cultivo del frijol, con una reducción acentuada de la germinación causando la muerte
de hasta el 70 % de las plántulas. Las infecciones pueden provenir de semillas
infectadas (Pupo y Heredia, 1998). El hongo sobrevive en el suelo en formas de
esclerocios, la primera fuente de inóculo, los que son formados en el tejido del
hospedante y aportados al suelo cuando el cultivo muere. Los microesclerocios
viables han mostrado persistencia en el suelo de 3 meses a 7 años.
Olaya y Abawi (1996) señalan que altas temperaturas y estrés hídrico incrementan la
susceptibilidad del hospedero y reducen la actividad de los antagonistas del hongo.
Banerje et al. (1985) señalan que altos regímenes de humedad estimularon la acción
lítica del micelio. La población decrece (85 %) a una humedad de saturación después
de 180 días. Dhingra (1985) plantea que a 60 % de humedad de capacidad de
campo la población se reduce de 96 – 99 %. La producción de esclerocios fue
estimulada por la baja humedad de suelo. La presencia de residuos de cultivo
permite la colonización y sobrevivencia del patógeno hasta 70 % de la capacidad de
campo.
2.4. Métodos de lucha.
Los métodos de lucha contra las enfermedades provocadas por hongos del suelo se
distinguen de los empleados contra otros organismos patógenos foliares. La
integración de prácticas culturales como el enmendado del suelo con materia
15
orgánica, la rotación de cultivos, el control químico, el control biológico y el manejo
del riego son entre otros, factores a tener en cuenta para el control de las mismas.
2.4.1. Control cultural
2.4.1.1. Enmiendas orgánicas
Se ha demostrado que la mayor influencia de la materia orgánica sobre los
patógenos radicales es a través de modificaciones de las actividades microbianas. El
control de éstos se produce por inacción o lisis de los esclerocios o hifas,
directamente o seguido de un corto período de estimulación del crecimiento.
La adición de materia orgánica mejora el vigor de las plantas e incrementa la
resistencia de la mismas al ataque de organismos patógenos (Lampkin, 1999).
Aplicaciones de materia orgánica redujeron las afectaciones de M. phaseolina en
maní en un 32 % comparado con las plantas no tratadas (Harinat y Subbarami,
1996).
Morales et al. (2007) encontraron una reducción de la enfermedad causada por S.
rolfsii con el empleo de estiércol líquido de cerdos. Los autores explican este efecto
debido al incremento de la actividad microbiana, concentracion de amonio y niveles
de Zinc y Cobre en el suelo, coincidiendo con Blum y Rodríguez-Kábana (2004) al
emplear enmiendas con Mucuna deeringiana, Pueraria lobata, y corteza de Pinus
sp. en el control de S. rolfsii en el suelo.
2.4.1.2. Rotación de cultivos.
Rosado et al. (1987) plantean que la resistencia a R. solani depende del manejo
dado al agrosistema y destacan la rotación de cultivos como una técnica que
16
garantiza una menor incidencia de hongos del suelo. Estos autores encontraron que
la rotación maíz-frijol redujo notablemente las pérdidas producidas por organismos
patógenos del suelo, en este último. Hagan (1983) reportó como cultivos a rotar con
el maní, para disminuir las afectaciones de S. rofsii, maíz, sorgo, algodón y la
mayoría de las hierbas usadas para pastos. La integración de cebolla dentro de los
esquemas de rotación de maní y frijol, provocó una significativa reducción del
porcentaje de plantas afectadas de un 25 a un 30 % (Zeidan, 1986). En estudios
realizados sobre sistemas de rotación, Hernández (1996) encontró que en rotaciones
cuyo cultivo fundamental de frío fue el frijol común, se cuantificaron densidades de
esclerocios por kilogramo de suelo significativamente superiores que aquellos donde
se cultivó papa en frío. Bhattacharyta y Malhotra (1979) reportaron en la India, que
la incidencia de M. phaseolina fue reducida cuando la papa fue precedida por
Crotalaria juncea. Singh et al. (1996) señalaron que el manejo de enfermedades
mediante sistemas de rotación de cultivos puede ser un método más práctico, al
intercalar cultivos no compatibles con los principales organismos patógenos que
atacan al próximo en la rotación; estos autores señalan que el ciclo de dichos cultivos
es de vital importancia en este aspecto.
2.4. 1.3. Labores agrotécnicas
Las labores agrotécnicas pueden emplearse efectivamente para el combate de
hongos del suelo en varios cultivos. La aradura profunda en el cultivo de la zanahoria
disminuyó en un 50 % la densidad del inóculo de S. rolfsii en el campo (Gurkins y
Jenkins, 1985). Un método de cultivo que no acerque suelo y materia orgánica a la
base del tallo también logró disminuir significativamente el daño de S. rolfsii en maní.
17
(Garren y Duque, 1958). Tanaka et al. (1993) señalaron como un método para
controlar S. rolfsii reducir la viabilidad de los esclerocios con el anegamiento de los
suelos; esto puede ser debido a la disminución de O 2 en el suelo, producción de
sustancias anfúngicas (ácidos orgánicos) e incremento de organismos competitivos
en el suelo. Prácticamente, el mismo puede ser efectivo para controlar S. rolfsii en
suelos que puedan ser fácilmente cubiertos con agua.
2.4.1. 4. Resistencia varietal
Mora y Blumm (1990) plantean que debido al alto rango de hospederos, se ha
complicado el trabajo de los fitomejoradores en la búsqueda de resistencia genética
a hongos del suelo, lo que coincide con Singh et al. (1996) respecto a M. phaseolina.
2.4.2. Control químico
Los intentos de control químico de hongos del suelo han sido infructuosos debido a la
poca persistencia de los productos químicos, la existencia de un alto número de
hospedantes, proliferación rápida de los organismos patógenos, así como abundante
producción de esclerocios, los cuales persisten en el suelo por varios años. Sharma y
Sohi (1981) redujeron completamente las afectaciones por R. solani con el uso de
Benomil, Carbendazim y Tridemorfe en tratamientos a la semilla. Pozo (1988) obtuvo
buenos resultados empleando Benzotiazol, Thiram, y Carboxin + Thiram en
tratamientos a la semilla en la variedad de frijol Carioca en el control de
enfermedades radicales. Por otra parte Acimovic et al. (1982) reportan al Benomil
como el fungicida más efectivo contra M. phaseolina. En Cuba, González y Pupo
(1985) destacan buenos resultados con Benomil, Captan, Captan + Benomil y Benmil
+ TMTD. Martín (2001) obtuvo buenos resultados con el empleo in vitro de

18
Difeconazol 25 % (Score), Tebuconazol 25 % (Folicur), Propiconazol 25 % (Tilt) y
Tebuconazol + Triadimenol triademol, en el control de S. rolfsii.. Palavan (2001)
utilizó el fungicida Difluoromethylornithine (DFMO) el cual inhibió el crecimiento
micelial de Macrophomina phaseolina. Resultados positivos in vitro obtuvo Folgueras
(2010) con el empleo del TMTD. Partridge (2007) plantea que en la actualidad no
existen fungicidas eficientes para el control de M. phaseolina en condiciones de
producción y que lo más apropiado es el adecuado manejo agrotécnico del cultivo.
2.4.3. Solarización
Un método con un gran potencial para el control de organismos patógenos del suelo
es el acolchamiento del mismo con películas de polietileno (solarización), aplicado
por primera vez por los israelíes a mediados de la década de los setenta. Resultados
positivos con el empleo de este método han sido reportados por Esqueda - Valle y
Zenteno-Zevada (1991) en el control de R. solani y Mihail y Alcorn (1984) en el
control de S. rofsii aplicando la solarización en época de verano. Según estos
autores, el método es inefectivo contra M. phaseolina. En Cuba, González et al.
(2002 a, b) lograron la reducción de la supervivencia de Rhizoctonia solani con el
empleo de cobertor plástico.
2.4.4. Control biológico
Debido a que el control químico del patógeno es costoso, el control cultural difícil de
aplicar y se carece de variedades resistentes, surge la alternativa del control
biológico como una posible solución para la reducción de las enfermedades.
Entre los microorganismos más empleados en el control biológico de hongos
fitopatógenos del suelo se destaca el género Trichoderma Pers, el cual ha sido
19
investigado por diferentes autores (Punja, 1985; Papavizas, 1989) y Stephanova,
(2007); Folgueras (2010 y Reyes (2011) en Cuba.
Otros microorganismos han sido reportados como antagonistas de hongos del suelo,
entre los que se encuentran Bacillus subtilis (Ehrenberg) como antagonistas de S.
rolfsii (Kimm et al. 1997); Pseudomonas fluorescens (Trevisan) Migula, como
antagonista de R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina (Thara, 1994), Pseudomonas
cepacia y Bacillus cereus, como antagonistas de R. solani. (Echávez et al., 1997) y
Rhizobium leguminosarum biovar. phaseoli como antagonista de R. solani (Mora,
1996).
Bocourt et al. (2009) en una prospección de hongos del suelo con potencialidades
para el control biológico en suelos de agroecosistema cubanos reportaron, en un
suelo Ferralitico Rojo con Nicotiana tabacum, Arachis hypogea y Sorghum bicolor,
nueve especies con potencialidades para el control biológico, entre las que citan a:
Aspergillus candidus Link. antagonista de Sclerotium cepivorum y M. phaseolina;
Clonostachys rosa (Link) Schoers, Samuel, Seyfery WW. Gams. antagonista de R.
solani y Fusarium solani, y Paecilomyces lilacinus (Thorne) Samsan, biocontrolador
de M. phaseolina y S. cepivorum.
Por otra parte Cuervo et al. (1998) destacan que las micorrizas vesicoarbusculares
(MVA) Glomus fasciculatum (Thaxt.) Gerd. & Trappe y G. mosseau, solas o en
combinación, disminuyeron el ataque de R. solani y Fusarium oxysporum E.F. Sm.
& Swingle.
20
De cualquier forma muchos son los reportes sobre la utilización de microorganismos
como antagonistas de los principales hongos fitopatógenos del suelo, sin embargo
esta práctica debe ser más extendida pues los tratamientos de semilla de forma
comercial en el mundo desarrollado, continúan haciéndose en gran medida con
productos químicos.
2.4.5. Control con sustancias naturales
Como una forma de explorar nuestros recursos vegetales y animales en la búsqueda
de compuestos bioactivos, que representen una alternativa en el control de
organismos fitopatógenos han sido estudiadas plantas aromáticas, y muchos
constituyentes de aceites esenciales por su actividad biológica, entre las que se
destacan propiedades antimicrobianas, antioxidantes y antimutagénicas
Begum et al. (2004) reportaron actividad antifúngica de un compuesto orgánico
aislado a partir del extracto de rizoma de Acorus calamus contra Macrophomina
phaseolina (Tassi) Goid., Curvularia lunata (Wakker) Boedijn y Alternaria alternata
(Fr.) Keissl. Resultados positivos encontraron Pirajno et al. (2004) con aceites
esenciales de Laurus nobilis, Mentha piperita y Ruta graveolaens contra Rhizoctonia
solani y Sclerotinia sclerotiorum y Vaillant et al. (2008) al evaluar el efecto inhibitorio
de cinco monoterpenos sobre un aislado de Rhizoctonia solani en papa: timol,
alcanfor, citronelal (Cymbopogon nardus L.) y 1,8 cineol encontrados en aceites
esenciales. En México, Zamora-Natera et al. (2005) encontraron actividad antifúngica
in vitro del extracto crudo de semilla de Lupinus exaltatus contra Sclerotium rolfsii,
Alternaria solani (Ellis & G. Martin) L.R. Jones & Grout, Rhizoctonia solani y Fusarium
21
oxysporum. Resultados similares obtuvieron Bernal-Alcocer et al. (2005). Puente
(2007) encontró efecto antifúngico in vitro de extractos acuosos de Bixa orellana L.,
Euphorbia lactea Haw., Petiveria aliaceae L., Phyla strigulosa Mart.& Gal. y Wedelia
trilobata Hitchc. frente a R. solani y S. rolfsii. En condiciones de campo, Robaina et
al. (2008) encontraron, con el empleo del extracto de Wedelia trilobata (L.) Hitchc
aplicado a la semilla, efecto fungicida sobre S. rolfsii.
La quitina es un polisacárido que se encuentra ampliamente distribuido en la
naturaleza, constituyendo el segundo polímero más abundante después de la
celulosa, forma parte del caparazón de crustáceos, moluscos, insectos y otros seres
vivos, cuyo derivado principal es la quitosana, la cual tiene en la actualidad amplios
usos en la medicina, así como en la agricultura, ya que aplicada al suelo protege a
las plantas contra la toxicidad de los metales (Cartaya et al., 2008 y 2009) y ha sido
reportada con efecto directo en la inhibición del crecimiento de hongos fitopatógenos,
asi como responsable de la activación de mecanismos de defensa en las plantas
(Chang et al., 1995).
2.4.6. Control Integral
Como se explicó anteriormente los diferentes métodos de lucha contra las
enfermedades causadas por hongos del suelo hongos tienen sus inconvenientes
específicos, por lo que las tendencias actuales se inclinan por un control integrado
de las mismas. Elad et al. (1980) reportaron un trabajo de control integrado de
hongos fitopatógenos del suelo utilizando solarización, empleo de productos
químicos, agentes biocontroladores, combinaciones de cultivo profundo y normal con
22
empleo de fertilizantes cálcicos y nitrogenados para el control de S. rolfsii en el
cultivo de la zanahoria, teniendo como resultado una disminución considerable del
ataque de este hongo. Jenkins y Averre (1986) estudiaron los problemas y progresos
en el control integrado del tizón sureño (S. rolfsii) y concluyeron que es positivo
evitar el aporque, enterrar los restos vegetales, selección negativa, incremento de la
distancia de siembra, control de plantas hospedantes, rotación de cultivos, aradura
profunda, solarización, resistencia varietal, control biológico, demostrando con ello la
importancia de este tipo de práctica. Araya y Hernández (2006) señalan entre las
medidas para reducir las afectaciones por pudriciones radicales en el frijol común, en
Costa Rica: Rotación de cultivos (arroz, maíz, yuca, pastos), siembra en tierras bien
drenadas o evitar encharcamientos, labranza mínima, uso de semilla de calidad, y
tratamiento a la semilla con Benomil, Carboxin + Captan, Clorineb, PCNB.
El Instituto Iberoamericano de Cooperación para la Agricultura (2008) destaca que no
existen variedades resistentes para América Central y establece un programa de
manejo integrado que comprende el uso de semilla sana y nueva (preferiblemente
certificada), siembra en cantero alto, evitar suelos encharcados, rotar con yuca,
maíz, pastos; trabajar con labranza mínima y usar coberturas (malezas quemadas,
restos de maíz, etc.) y el tratamiento a la semilla con fungicidas (Benomil, PCNB,
Carboxin, Rizolex).
En Cuba el MINAGRI (2000) recomienda contra las pudriciones radicales y del tallo
en el cultivo: usar semillas limpias y libres de organismos patógenos, sembrar en
suelos con buen drenaje, evitar dañar las raíces, erradicar malezas susceptibles,
23
sembrar cultivos no susceptibles en suelos infestados, y el uso de variedades
resistentes cuando sea posible.
De las consideraciones anteriormente expresadas se puede concluir la importancia
que tienen las enfermedades provocadas por hongos del suelo en el cultivo del frijol
y la necesidad de estudiar las afectaciones que se producen por este concepto en
nuestro país, así como proponer medidas para su posible control utilizando
elementos que conlleven cada vez más a una agricultura sostenible.
24
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se desarrolló en la Facultad de Ciencias Agropecuarias (FCA) de la
Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (UCLV), en el período comprendido
entre enero de 2007 y mayo de 2011.
3.1. Aislamiento, identificación y patogenicidad de hongos del suelo causantes
de enfermedades en frijol común
Se colectaron plantas de frijol común con síntomas de enfermedades causadas por
hongos del suelo, procedentes de zonas productoras de las provincias de Villa Clara
y Sancti Spiritus.
3.1.1. Aislamiento, identificación y agresividad de Rhizoctonia spp.
Aislamiento
Los aislados de este hongo se obtuvieron a partir de zonas necróticas de raíces y
tallos de plantas cultivadas en campos de frijol en Villa Clara, así como de muestras
de suelos pertenecientes a los agrupamientos Ferralítico y Pardo Sialítico
(Hernández et al., 1999), las cuales fueron colocadas en macetas. Posteriormente se
sembraron semillas de frijol de la variedad Güira 89 desinfectadas con hipoclorito de
sodio al 1 %. Siete días después se colectó el tejido enfermo y se procedió al
aislamiento.
Los tejidos afectados, provenientes tanto de las plantas obtenidas en campo como
en suelo, se colocaron en cámara húmeda y las colonias con características del
género Rhizoctonia se purificaron en Agar Papa Dextrosa (PDA).
25
Identificación de aislados de Rhizoctonia spp.
Con el objetivo de identificar los aislados de Rhizoctonia spp. se utilizaron técnicas
tales como tinción de núcleos, zimograma péctico, RCP-PLFR (Reacción en Cadena
de la Polimerasa-Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción) de
la región ITS (del inglés Internal Transcribed Spacer) del ADN ribosomal (ADNr) y
secuenciación de la propia región, según los procedimientos descritos por
Pannecoucque et al. (2008). Estos análisis se realizaron en el laboratorio de
Fitopatología de la Facultad de Bioingeniería de la Universidad de Gante, Bélgica.
Tinción de núcleos.
Para distinguir las especies de los aislados se determinó el número de núcleos
mediante la tinción con 10ȝJP/ -1 de 4,6-diamino-2-fenil indol (DAPI; Sigma-Aldrich)
de hifas jóvenes obtenidas en microcultivos sobre agar-agua. Las observaciones se
realizaron a través de un microscopio Olympus BX51.
Zimograma péctico
Para el análisis de las enzimas pécticas se empleó el sistema vertical de gel-
electroforesis descrito por Schneider et al. (1997). Los aislados crecieron en un
medio que contenía 1 % de pectina cítrica (Sigma-Aldrich, lote: 013K007) durante 10
días, en la oscuridad. Posteriormente se tomaron díez micro-litros filtrados de cada
muestra los cuales se colocaron en un gel de poliacrilamina nativo del inglés (native
polyacrylamine gel) y se llevó a cabo la electroforesis nativa en geles de
poliacrilamida con el uso de un equipo Mini Protean III (BioRad). El gel separador
26
contenía 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8), 10 % de acrilamida (acrylamide) y 0,1 % de
pectina cítrica, mientras que el gel apilador estaba compuesto de 0,5 M Tris-HCL (pH
6,8), 5 % de acrilamida y 0,03 % de pectina cítrica. El buffer de electroforesis
contenía 0.025 M Tris y 0.192 M Glicina (pH 8.3). Los geles se corrieron a 20 mA
durante 30 minutos a una temperatura de 4 °C y seguidamente a 30 mA durante 60
minutos a esta misma temperatura. Después de la electroforesis, los geles fueron
incubados en 0.1 M DL- ácido málico por una hora a temperatura ambiente,
posteriormente se tiñeron con 0, 02 % de Rutenio rojo por dos horas y la fijación se
realizó durante toda la noche en 3 mM de Na 2 CO 3 . Los zimogramas obtenidos de los
aislados se compararon con los patrones de aislados cuyos grupos de anastomosis
eran conocidos.
Análisis del RCP-PLFR de la región ITS del ADNr
La extracción de ADN se realizó a partir de aislados cultivados durante 7 y 10 días en
medio líquido de papa dextrosa (Difco). El micelio de cada aislado fue filtrado del
medio y secado con papel de filtro estéril. Posteriormente se maceró en nitrógeno
líquido, hasta un polvo fino. Los siguientes pasos de extracción se condujeron de
según las instrucciones del protocolo de extracción de ADN DNeasy® Plant Mini Kit,
(Qiagen, Alemania) acorde con las especificaciones de los fabricantes. Se utilizaron
los oligonucleótidos ITS4 (5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3´) e ITS5 (5´-GGA
AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3´) para amplificar la región ITS del rADN,
incluyendo el ADN ribosomal 5.8 S (White et al., 1990).
27
La reacción de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se
condujo añadiendo 2 ȝ/GH$'1JHQómico (5 -QJȝ/-1Dȝ/GHXQDPH]FODGH
PCR, la cual contenía 2.5 ȝ/ [ GHO EXIIHU GH 3&5 4LDJHQ ȝ/ VROXFL
ón -Q
4LDJHQ ȝ/ GH G173V P0 )HUPHQWDV *PE+ \ ȝ/ GH DJXD HVW
éril
bidestilada y consistió en un paso inicial de desnaturalización a 94°C por 10 minutos,
seguido por 35 ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 55°C y un minuto a 72°C. El
ciclo terminó con un paso final de extensión a 72°C por 10 minutos. El equipo
empleado fue un termociclador Mastercycler gradient, (Eppendorf, Alemania).
El producto de la amplificación fue posteriormente analizado por PLFR utilizando
enzimas de restricción descritas por Guillemaut et al. (2003). Para ello se tomaron
alícuotas (4- ȝ/ GHO SURGXFWR GH 5&3 ODV FXDOHV IXHURQ GLJHULGDV HQ XQ YROXPHQ
ILQDOGHȝ/FRQ8GHHQGRQXFOHDVDV0XQ,0VH,\XQDFRPELQDFL
ón de AvaII y
HincII (Fermentas GmbH). Los fragmentos de restricción fueron separados por
electroforesis en un gel de agarosa (4 %) en un buffer TAE a 100 V y visualizado por
tinción con bromuro de etidio en un transluminador ultravioleta. Los fragmentos de
restricción de los aislados fueron comparados con aquellos pertenecientes a aislados
cuyos grupos de anastomosis eran conocidos.
Secuenciación de la región ITS del ADNr
Para la amplificación de la región ITS se utilizaron los oligonucleótidos ITS1 (5’-TCC
GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) e ITS4 (White et al., 1990). El volumen total de
reacción fue de 50 ȝ/FRQWHQLHQGR ȝ/GHDJXDHVWéril bidestiladaȝ/QJ
ȝ/-1ȝ/[EXIIHUGHUHDFFLón, 3 ȝ/GH0J&O 2 (25 P0ȝ/GHG173V mM),
28
1 ȝ/GHFDGDȝ0GHFHEDGRU\ȝ/GH7DT$'1SROLPHUDVD 8ȝ/-1; Sigma-
Aldrich). La amplificación se inició con una desnaturalización a 94°C por tres
minutos, seguido de 30 ciclos de 94°C por 90 segundos, 55 °C por 90 segundos, 72
°C por dos minutos, con una extensión final a 72 °C por 10 minutos. Los productos
de la RCP fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa (1 %) en un buffer
TAE y se purificaron para remover exceso de cebadores y/o dNTPs. La
secuenciación se hizo utilizando CEQDTCS secuenciación química (Beckman
Coulter Inc.) y posteriormente fueron corridos en un secuenciador automático de
ADN (automated DNA capillarity sequencer) (CEQ 2000-XL; Beckman Coulter Inc.).
Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa de alineación múltiple
CLUSTALW (Thompson et al., 1994) y el alineamiento fue chequeado visualmente.
El porcentaje de similitud de secuencias de la región ITS fue calculada a partir de los
datos, utilizando BIOEDIT versión 7.0.4.1.
Determinación de la agresividad de los aislados en frijol
Los estudios de patogenicidad se realizaron en condiciones semicontroladas. El
inóculo de cada aislado de Rhizoctonia spp. se produjo en Erlenmeyers de 500 mL
los cuales contenían granos de arroz previamente autoclaveados durante 21 minutos
por dos días consecutivos. Dichos Erlenmeyers fueron inoculados con discos de
PDA conteniendo micelio del hongo, proveniente de las márgenes de colonias de
cuatro días de edad, y posteriormente se incubaron por 10 días a 28 ± 2°C.
Semillas de frijol de la variedad Güira 89, previamente desinfectadas con hipoclorito
de sodio al 1 % y enjuagadas con abundante agua estéril, fueron germinadas en
29
bandejas de 22 x 15 x 6 cm, las cuales contenían suelo Pardo Sialítico
autoclaveado. Una semana después cada plántula fue transferida a macetas (1
plántula/maceta y 10 macetas por aislado) que contenían 392 g de suelo estéril y 8 g
de inóculo. Diez días después, la severidad de la enfermedad fue evaluada
separadamente en tallos y raíces utilizándose la escala propuesta por Keijer et al.
(1997) con modificaciones. Para el tallo: 0= ausencia de síntomas; 1= pequeñas
lesiones negras o pardas menores de 1 mm de diámetro; 2= lesiones cubriendo
menos del 75 % de la superficie del tallo, 3= lesiones cubriendo más del 75 % de la
superficie del tallo; 4= planta muerta. Para la raíz: 1= decoloración amarilla o parda
cerca de la base del tallo; 2= decoloración amarilla o parda cerca de la base del tallo
más puntas pardas, 3= superficie totalmente parda cubriendo más del 75 % de la
superficie de la raíz; 4= planta muerta. Los resultados se analizaron separadamente
para las raíces y tallos. Los datos fueron sujetos a la prueba de Kruskal-Wallis y
cuando se encontraron diferencias significativas se utilizó la prueba de Mann-
Whitney. Todos los análisis se hicieron a través del paquete estadístico SPSS 16.0
para Windows.
3.1.2. Aislamiento, identificación y patogenicidad de Sclerotium rolfsii Sacc.
Aislamiento e identificación
Plantas enfermas, provenientes de zonas productoras de Villa Clara, fueron lavadas
con agua corriente. El tejido afectado se colocó en placas de Petri conteniendo Agar
agua con 25 mg/L de cloranfenicol, las cuales fueron incubadas a 28±2 0C durante 7
días. Seguidamente se tomaron hifas de las colonias con aspecto de S. rolfsii y se
30
transfirieron a placas de Petri con medio PDA, las cuales fueron incubadas durante 7
días a 28±2 0C. Posteriormente la autenticidad del hongo fue comprobada teniendo
en cuenta los criterios de Mayea y Padrón (1986) y Leiva-Mora et al. (2005). Las
observaciones se realizaron mediante un microscopio clínico Motic con aumento 40
x.
Patogenicidad
El estudio de la patogenicidad se realizó siguiendo el mismo procedimiento descrito
para Rhizoctonia en cuanto a la producción del inóculo e inoculación del suelo. En
este caso se utilizó la variedad de frijol BAT 482 (Testa blanca). La presencia de la
enfermedad se diagnosticó de acuerdo con los síntomas descritos por Schwartz y
Galvez (1980) y Punja (1985) en frijol para este microorganismo. Todos los estudios
se desarrollaron en el Laboratorio de Fitopatologia de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la UCLV.
phaseolina (Tassi) Goid.
x Aislamiento
Plantas de frijol con chancros negros sobre el tallo y en algunos casos con presencia
de esclerocios y/o picnidios, procedentes de campos cultivados de Villa Clara y Sancti
Spíritus, fueron colocadas en cámara húmeda. Aproximadamente 48 horas después
los picnidios se dejaron descargar durante dos horas sobre un portaobjeto estéril que
contenía una fina lámina de PDA con Sulfato de Gentamicina (1 %p/v). Como
recipiente de descarga se emplearon frascos del cultivo de tejido de plantas de 500
31
mL de capacidad. El micelio fue transferido a placas de 9 cm de diámetro que
contenían 10 mL de medio PDA. Las colonias individuales no contaminadas fueron
transferidas a tubos de ensayos que contenían 5 mL de PDA inclinado e incubadas
durante 15 días a 30 ºC. Posteriormente cada aislado fue conservado a 4 ºC e
incorporado a la colección de cultivo de hongos fitopatógenos del IBP.
x Caracterización cultural y morfológica
La caracterización cultural de los aislados se realizó teniendo en cuenta los criterios
de De la Garza y Díaz (1989). Para ello se colocaron discos de micelio de 0,5 cm de
diámetro (1 disco/aislado/placa), provenientes de las márgenes de colonias
previamente crecidas durante 72, en placas de Petri (diámetro 9 cm) con 10 mL de
PDA. Las placas se incubaron durante 7 días a 28±2 ºC y pasado este tiempo se
caracterizó cada aislado.
x Determinación de la agresividad de los aislados en frijol
Para determinar la agresividad de cada aislado se utilizó la variedad de frijol BAT
482. La producción de inóculo se llevó a cabo en Erlenmeyers de 500 mL que
contenían 200 g de harina de maíz, previamente esterilizados, inoculados con 50 mL
de una suspensión esclerocial cuya concentración era de 1.25x104escl.ml-1
aproximadamente. Cada recipiente se colocó en oscuridad constante dentro de una
cámara climatizada Gallenkamp a 30 °C durante 15 días. Posteriormente por cada
400 g de suelo autoclaveado, del tipo Pardo mullido medianamente lavado
(Hernández et al., 1999), se añadieron 50 g de inóculo. Cuatrocientos cincuenta

32
gramos de la mezcla suelo-inóculo fueron vertidos en cada maceta, en las cuales se
sembraron 5 semillas desinfectadas con anterioridad en hipoclorito de sodio al 2 %.
Cada maceta fue regada con 50 mL de agua desionizada estéril. Catorce días
después de la siembra se evaluó la agresividad, empleándose para ello la escala
propuesta por Van Schoonhoven y Pastor Corrales, 1987 (Anexo 1).
Se empleó un diseño completamente aleatorizado con 10 réplicas por cada aislado.
Los datos se procesaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y cuando se
encontraron diferencias significativas se utilizó la prueba de Mann-Whitney. Todos
los análisis se hicieron a través del paquete estadístico SPSS 16.0 para Windows.
Todos los estudios se desarrollaron en el Laboratorio de Fitopatología del Instituto de
Biotecnología de las plantas de la UCLV.
3.2. Incidencia de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos del suelo
sobre variedades de frijol
Con el objetivo de estudiar la incidencia de hongos fitopatógenos del suelo sobre 16
variedades de frijol (Tabla 3.1) se condujo un experimento en la estación
experimental agrícola “Álvaro Barba Machado” de la UCLV. El mismo se inició el 18
de enero de 2007 y se repitió el 19 de enero de 2008. Se utilizó un diseño en
bloques al azar con 3 réplicas. En cada uno de ellos la distancia de siembra fue de
0.45 m x 0.07 m y las parcelas tenían 4 surcos de 5 m lineales para un área de 6.75
m2. Los estudios se condujeron en un suelo Pardo Sialítico (Hernández., et al 1999).
Las labores fitotécnicas aplicadas al cultivo únicamente fueron las relacionadas con
33
la eliminación de plantas indeseables y un riego en siembra. No se aplicaron
productos químicos ni biológicos.
Tabla 3.1. Variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris) estudiadas.
No. Variedad Color de la testa
1 Cuba Cueto 25-9 N Negra

2 Güira-89 Negra
3 Bat 304 Negra
4 Bat 58 Negra
5 Tomeguín 93 Negra
6 Cut 53 Negra
7 ICA Pijao Negra
8 Cuba Cueto 25-9 R Roja
9 Cuba Cueto 25-9 C Colorada
10 Delicias 364 Roja
11 Velasco largo Roja
12 Md 3036 Roja
13 Bat 93 Crema
14 Cuba Cueto 25-9 B Blanca
15 Bat 482 Blanca
16 Judía blanca Blanca
Para determinar el tipo de hongo fitopatógeno, siete días después de la siembra se
inició la toma de muestra. La misma se mantuvo semanalmente hasta la cosecha.
Las plantas con síntomas de marchitez y/o lesiones sobre el tallo se trajeron al
laboratorio de Fitopatologia de la FCA y los órganos afectados se colocaron en
cámara húmeda a temperatura ambiente, en un período comprendido entre 48-72
horas. Posteriormente las muestras fueron analizadas bajo un esterecospio Olympus.
Las hifas, provenientes del tejido, se colocaron sobre un portaobjetos y se
identificaron, teniendo en cuenta lo descrito por Bannert y Hunter (1986) para los
34
hongos del suelo patógenos al frijol, utilizando un microscopio clínico Motic con
aumento 40 x.
El porcentaje de incidencia de cada hongo se determinó dividiendo el número de
plantas afectadas entre el número de plantas totales y multiplicando el resultado por
100 (Schoonhoven y Pastor-Corrales, 1987).
Los datos del experimento se analizaron para cada año por separado empleándose
la prueba de Kruskal- Wallis. En ambos casos el análisis se hizo través del paquete
estadístico SPSS 16.0 para Windows.
3.2.1. Caracteres de la testa de la semilla asociados a la resistencia del frijol
común a hongos fitopatógenos del suelo
El experimento se realizó en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias con los objetivos de evaluar el efecto in vitro de extractos
acuosos, obtenidos de la testa de semillas de frijol común, sobre el crecimiento
micelial de hongos del suelo patógenos a este cultivo así como determinar algunos
de los caracteres químicos de la testa relacionados con la resistencia y/o tolerancia a
las enfermedades causadas por estos organismos. Para ello se utilizaron semillas
negras, rojas y blancas de las variedades Tomeguín 93, Delicias 364 y Bat 482
respectivamente, las cuales tenían 30 días de cosechadas y habían sido secadas al
sol.
x Preparación de los extractos vegetales.
35
Las testas fueron separadas de los cotiledones con el empleo de un escalpelo. Se
tomaron 0.7 g del material seco, triturado y tamizado (diámetro aproximadamente 5
mm) de cada variedad, y se le adicionaron 7 mL de agua destilada y desionizada.
Luego se dejaron en maceración durante 24 horas en la oscuridad, y sometidos,
posteriormente, a un proceso de filtrado con el empleo de un papel de filtro.
3.2.1.1. Ensayos biológicos
El efecto in vitro de los extractos acuosos, obtenidos de la testa de las semillas,
sobre el crecimiento micelial de R. solani (AG4 HGI), M. phaseolina (CCIBP Mp2) y
S. rolfsii, se determinó mediante el método del antibiograma (antifungigrama).
Para la realización de las pruebas biológicas los extractos se filtraron por membranas
miliporos de acetato de celulosa, de 0,2 µm de diámetro MINISART£ (Sartorius), para
la eliminación de bacterias y/o esporas de hongos causantes de contaminación. En
el centro de placas de Petri, de 9 cm de diámetro y que contenían PDA, se colocó un
disco de 10 mm de diámetro con micelio de cada especie fitopatógena. En los
extremos se colocaron 4 discos de papel de filtro Whatman£ de 5 mm de diámetro,
previamente impregnados con 10 microlitros de los extractos estudiados. Las placas

0
fueron incubadas a 28±2 C. Los controles consistieron en placas con discos
impregnados con agua estéril. Se emplearon 4 placas por especie fitopatógena. La
determinación de zona de inhibición fue realizada a los 7 días posteriores.
36
A partir de las soluciones iniciales se realizó el análisis de las propiedades físico-
químicas de los extractos obtenidos con el pH/conductímetro Inolab Level 1 (Anexo
2).
3.2.1.2. Tamizaje fitoquímico
Los extractos acuosos que mostraron inhibición del crecimiento micelial fueron
tamizados fitoquímicamente mediante los procedimientos referidos en la Norma
Ramal de Salud Pública 311/98.
x Ensayo de Espuma (Saponinas).

x Ensayo de Fehling (Carbohidratos reductores)
x Ensayo de Shinoda (Flavonoides).
x Ensayo de Dragendorff (Alcaloides).
x Ensayo de cloruro férrico (Fenoles y taninos)
3.2.1.3. Cuantificación de compuestos fenólicos en extractos acuosos
obtenidos de testas de variedades de frijol común
El contenido total de fenoles fue determinado por el método colorimétrico con el
reactivo Folin Ciocalteu (Dewanto et al., 2002). Fueron colocados 100 µl de las
diluciones de los extractos en tubos de ensayo de 15 cm de largo, mezcladas con
400 µl de agua destilada y 250 µl del reactivo de Folin 1N. Posteriormente (5 min.)
fue agregado 1,25 ml de una solución de Na 2 CO 3 al 20 % y se dejaron en reposo
durante dos horas.
Se utilizó el ácido gálico como patrón y se elaboró una curva de calibración a partir
de concentraciones conocidas del mismo. Las concentraciones de los extractos se
expresaron como mg equivalentes de ácido gálico (GAE)/gramo de testa seca. La

37
absorbancia se midió en un espectrofotómetro RAILEYGH UV-1601 (República
Popular China) a una longitud de onda de 750 nm. Los muestras fueron triplicadas y
los valores de concentraciones obtenidas sometidos a análisis estadísticos.
sobre frijol común en dos tipos de suelo.
La incidencia de hongos fitopatógenos del suelo sobre la variedad blanca BAT 482
se estudió en condiciones de campo en un suelo Pardo Sialítico (Hernández., et al
1999), localizado en la Cooperativa de Créditos y Servicios "Roberto Rodríguez" de
Santa Clara, y en un suelo Ferralítico (Hernández et al., 1999) ubicado en el huerto
"Sandino" de Remedios. El experimento se inició, simultáneamente, en ambas
localidades, en enero de 2009. El diseño experimental utilizado, la toma y el análisis
de muestras así como la determinación de la incidencia se realizaron de igual forma
al experimento descrito anteriormente en el acápite 3.2.
Los resultados experimentales fueron sujetos a análisis de varianza (multifactorial
ANOVA) a través del paquete estadístico SPSS 16.0 para Windows.
3.4. Efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos fitopatógenos del
suelo en frijol común
Con el objetivo de estudiar el efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos
fitopatógenos en frijol se realizó un experimento en un suelo Pardo Sialítico
(Hernández., et al 1999) ubicado en el huerto “El Jardín” de la Empresa de Cultivos
Varios “Diamante” de Santa Clara. El mismo se desarrolló en el período comprendido
entre enero y abril de 2009 y se repitió en igual período en 2011. Se utilizó la
38
variedad Bat 482 de testa blanca, sembrada a 0,45 m x 0,07 – 0,10 m en parcelas
que tenían un área de 6,75 m2 con 4 surcos de 5 metros lineales. El experimento se
realizó con tres réplicas. Los tratamientos y controles utilizados aparecen en la Tabla
3.2. La toma y el análisis de muestras, así como la determinación de la incidencia se
realizaron de igual forma al experimento descrito en el acápite 3.2.
Tabla 3.2. Tratamientos y controles utilizados para determinar el efecto de la fertilización

sobre la incidencia de hongos fitopatógenos del suelo en Phaseolus vulgaris,
variedad Bat 482.
Tratamientos Controles
EcoMic£ (5 kg/46 kg de semillas)
a*
Control absoluto (No fertilización)
b**
Compost (4 t/ha) Control estándar (Urea 46%. 70 KgN/ha) **
Rhizobium phaseoli (8.2 x 1010UFC/mL.
1 kg/46 kg de semillas) c*
a
biopreparado a partir de hongos micorrizogénos del género Glomus (20 esporas por gramo de
inoculante) procedente del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Patente No. 22641
b
compost elaborado a partir de residuos de caña de azúcar.
c
procedente del Laboratorio de Microbiología de la FCA de la UCLV, la cual fue aislada de nódulos de
raíces de P. vulgaris sembrado en un suelo Pardo mullido medianamente lavado (Hernández et al.,
1999)
* En estos tratamientos la semilla fue recubierta.
**Se aplicaron en siembra. El compost en el fondo del surco y la urea inmediatamente después de la
siembra.
x Preparación de Rhizobium phaseoli
Las bacterias se precultivaron en tubos de ensayo con 5 mL de caldo nutriente,
durante 48 h. Posteriormente se multiplicaron en un Erlermeyer con 100 mL de caldo
nutriente y se colocaron en un agitador orbial Gerhardt durante 24 h a 30 0C.
Seguidamente se inocularon en placas de Petri conteniendo Agar nutriente y se
incubaron durante 48 horas a 28±20C en incubadora Memmert (Alemania). Se
39
calculó la concentración mediante el empleo de la cámara de Neubauer, al
microscopio óptico (Motic).
x Recubrimiento de las semillas
En el caso de Rhizobium phaseoli la semilla se recubrió según la metodología de
Hamdi (1985) modificada por Cupull et al. (2003), la cual emplea zeolita (0.5 mm de
diámetro de partículas) como sustrato y almidón de yuca al 8 % como adherente.
Cada 10 g de zeolita se añadieron 5 mL de suspensión bacteriana. La proporción de
semilla/zeolita empleada fue de 7:1 (p/p). Se secaron al aire entre 24 y 48 horas y se
sembraron posteriormente. Para EcoMic£ las semillas se recubrieron según la
metodología elaborada por el INCA (2001).
El análisis de los datos se realizó a través de la prueba de comparación de Kruskal-
Wallis utilizando el paquete estadístico SPSS 16.0 para Windows.
3.4.1. Influencia de la fertilización sobre el rendimiento agrícola
El peso total de las semillas se determinó para cada tratamiento y para los controles
utilizados en este estudio. Cuando se cosecharon las plantas de cada parcela se
determinó el peso total de los granos, para ello se empleó una balanza Gallenkamp y
se expresó en g/m2. Los datos se analizaron a través del paquete estadístico SPSS
16.0 para Windows y se emplearon las pruebas de comparación de medias de
Duncan para los datos correspondientes a semillas por legumbre, peso de cien
semillas y peso total de las semillas. Kruskal-wallis se utilizó para el número de
legumbres por plantas.
40
3.5. Incidencia de hongos del suelo sobre plantas de frijol provenientes de
semillas tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana
El estudio fue conducido en el año 2009 durante los meses de enero a abril y se
repitió en estos mismos meses del año 2011. Ambos ensayos se realizaron en un
suelo Pardo Sialítico (Hernández., et al 1999) ubicado en el huerto “El Jardín” de la
Empresa de Cultivos Varios “Diamante” de Santa Clara. En la tabla 3.3 se presentan
los tratamientos y controles empleados. La variedad utilizada, el marco de siembra,
el tamaño de las parcelas experimentales, el número de réplicas así como la toma y
el análisis de muestras y la determinación de la incidencia coinciden con el
experimento descrito en el acápite 3.2.
Tabla 3.3. Tratamientos y controles utilizados para determinar el efecto del tratamiento de
semilla con bacterias antagonistas y Quitosana sobre la incidencia de hongos
fitopatógenos del suelo en Phaseolus vulgaris, variedad Bat 482.
Tratamientos Concentración
Burkholderia cepacia CCIBP556W a 4.6x109 UFC/mL
Bacillus subtilis ATCC 6051b 1.8x108 UFC/mL
Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 c 1.7x108 UFC/mL
Pseudomonas fluorescens CMR12 d 5.6x109 UFC/mL
Chitoplant ® e 0.1%
Control estándar (TMTD 80% PH) f 0.3%

Control absoluto (semillas sin tratar)
a,b,c,d
Método de aplicación: recubrimiento de la semilla
e
ChitoPlant® (99 % chitosana, 0.05 % Boro, 0.05 % Cinc). Método de aplicación: inmersión de las semillas
por 1 hora.
f
Thiram (tetrametil tiuran disulfuro). Método de aplicación: inmersión de las semillas por 10 minutos
41
Durante el experimento no se aplicaron fertilizantes ni se emplearon químicos para el
control de plagas. Las atenciones culturales consistieron en el control mecánico de
malezas. Se realizaron riegos de superficie en presiembra, y antes de las fases de
floración y maduración. Los resultados se procesaron a través de Kruskal-Wallis con
el empleo del paquete estadístico SPSS versión 16.0 para Windows.
3.5.1. Efecto de los tratamientos sobre el rendimiento agrícola y sus
componentes.
Los procedimientos fueron iguales a los realizados en el acápite 3.4.1
frijol
Con el objetivo de evaluar la actividad antifúngica de las cepas bacterianas
estudiadas se utilizó el método de difusión en agar propuesto por Bauer et al. (1966)
y se realizó un ensayo para determinar la presencia de metabolitos volátiles
utilizándose la metodología de Velásquez et al. (2010), con modificaciones.
3.5.2.1 Difusión en agar
Se empleó la variante de la doble capa (Lalande y Bissonette, 1989). Cada bacteria
se cultivó en placas de Petri con agar nutriente. A las 24 horas se colocó encima una
capa de PDA y en el centro de la capa un disco de 10 mm de la especie fitopatógena
estudiada. El mismo provenía de las márgenes de su respectiva colonia cultivada en
PDA. Las placas fueron incubadas a la oscuridad a 28±2 0C. La inhibición del
42
crecimiento micelial se evaluó según lo propuesto por Rahman et al. (2007) a las 72
horas de iniciado el experimento.
3.5.2.2 Determinación de la presencia de metabolitos volátiles con actividad
antifúngica
Para la determinación de la presencia de metabolitos volatiles se empleó la
metodología de Velásquez et al. (2010). En este ensayo las especies bacterianas se
sembraron en placas de Petri que contenían agar nutriente. En otras placas, que
contenían PDA, se colocó un disco de 10 mm de la especie fitopatógena estudiada.
Posteriormente se colocaron las partes de las placas conteniendo bacterias y hongos
una sobre la otra, evitando el contacto fisico de ambos microorganismos y se sellaron
con parafilm. Las placas fueron incubadas a 28±2 0C en condiciones de oscuridad.
Al igual que para el método de difusión en agar la inhibición del crecimiento micelial
se evaluó según lo propuesto por Rahman et al. (2007) después de 72 horas de
iniciado el experimento.
En ambos estudios se utilizaron diseños completamente aleatorizados con 4
repeticiones por tratamiento. El control consistió en placas que contenían cada hongo
cultivado sobre PDA sin tratamiento alguno. Los controles se incubaron bajo las
mismas condiciones que los tratamientos. Los datos se procesaron estadísticamente
mediante la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan a través del
paquete estadístico SPSS 16.0 para Windows.
43
3.6. Efecto in vivo del tratamiento a la semilla con bacterias antagonistas y
Quitosana sobre la severidad de la enfermedad causada por hongos del suelo
patógenos al frijol
Con la intención de determinar la severidad causada por hongos del suelo sobre
plantas descendientes de semillas tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana,
se realizó un experimento en condiciones semicontroladas. Se utilizó un suelo Pardo
mullido medianamente lavado (Hernández et al., 1999). Parte de este fue
autoclaveado durante 1 hora a 121 0C en autoclave Rypa® (España) y posteriormente
utilizado en los tratamientos y controles que requerían del suelo en esta condición
(Tabla 3.4). Los hongos fitopatógenos en estudio se inocularon, por separado, al 2 %
(p/p) 48 horas antes de la siembra. La producción del inóculo y la inoculación se hizo
en el laboratorio de microbiología Agrícola de la FCA siguiendo el procedimiento
descrito para estudiar la agresividad de los aislados de Rhizoctonia spp. en el acápite
3.1.1.
El tratamiento de las semillas se realizó por inmersión durante 30 minutos en la
suspensión bacteriana; la cual se produjo como se describe en el experimento 3.4 y
que contenía como adherente miel final de caña al 1 %. Transcurridos los 30 minutos
se decantó la solución y se secaron las semillas a temperatura ambiente sobre
papel de filtro en placas de Petri. Seguidamente 5 semillas de la variedad BAT- 482
fueron sembradas en cada maceta y estas se colocaron en el área protegida del IBP.
Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con 7 tratamientos y 4 réplicas.
44
Tabla 3.4. Tratamientos utilizados para determinar el efecto, in vivo, del tratamiento a
semillas con bacterias antagonistas y Quitosana sobre la incidencia de hongos
fitopatógenos del suelo en Phaseolus vulgaris, variedad Bat 482.
Tratamientos Concentración
Burkholderia cepacia CCIBP556W 4.9x109 UFC/mL
Bacillus subtilis ATCC 6051 1.5x109 UFC/mL
Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 1.8x109 UFC/mL
Pseudomonas fluorescens CMR12 6.6x109 UFC/mL
Chitoplant ® a 0.1%
Control estándar (TMTD 80% PH) b 0.3%

Control relativo (semillas sin tratar y suelo autoclaveado e
inoculado)
a
método de aplicación inmersión 1 hora
b
método de aplicación inmersión 10 minutos
Las evaluaciones consistieron en determinar la severidad de la pudrición de raíces y
tallos a través de la escala propuesta por Van Schoonhoven y Pastor Corrales, 1987
(Anexos 1 y 3) a partir de los cinco días después de la siembra y hasta los 14. Las
macetas se regaron cuando fue inoculado el hongo en el suelo para asegurar el
establecimiento del mismo, el día de la siembra y a través de todo el experimento
para mantener la humedad del suelo. Los datos se procesaron mediante la prueba
de comparación de medias de Kruskal-Wallis utilizando el paquete estadístico
mencionado para los demás experimentos.
3.7. Análisis de los suelos
Los análisis químicos, físicos, y microbiológicos de los suelos empleados para los
experimentos de campo se realizaron en el laboratorio de química del suelo del
Laboratorio Provincial de Suelos de Villa Clara, en el laboratorio de física de suelos
45
del Centro de Investigaciones Agropecuarias (CIAP) de la FCA y en el laboratorio de
microbiología de esta misma facultad. Las muestras de suelos se tomaron de los
primeros 20 cm de cada campo, se homogenizaron y se procesaron en los lugares
antes mencionados para los análisis pertinentes.
3.7.1. Análisis químico
Se realizaron según la norma ramal NRAG-837, 1986, utilizando los métodos
siguientes:
x P 2 O 5 y K 2 O. Método de Oniani (refern). Solución extractiva de ácido sulfúrico
(0.1N). El P 2 O 5 se determinó colorimétricamente y el K 2 O por fotometría de
llama.
x Materia Orgánica. Método colorimétrico de Warkley y Black (1934). Oxidación
con dicromato de potasio y ácido sulfúrico concentrado.
x pH H 2 O y pH KCL. Potenciómetro. Relación suelo: Solución 1: 2.5.
3.7.2. Análisis físico
x Factor de Estructura (FE) según Cairo (2001).
x Agregados estables en agua. Método de Henin citado por Cairo y Fundora
(1994)
x Permeabilidad y agregados estables según Henin et al. (1958) citado por
Cairo y Fundora (1994)
46
3.7.3. Análisis microbiológico del Suelo
Se empleó el método de conteo en placas mediante diluciones seriadas (Mayea et
al., 1983).
x Bacterias. Agar glicerina Pectona. Dilución107
x Hongos Agar rosa Bengala. Dilución 105
x Actinomicetos. Agar almidón amoniacal. Dilución 105
x Azotobacter. Agar Ashbys. Dilución104
3.8. Variables climatológicas
Las variables climáticas: temperatura máxima, mínima y media del aire, humedad
relativa y precipitaciones (acumulados y días con lluvias) fueron aportadas por las
estaciones meteorológicas de Caibarién (78348), del Yabú (78343) y de la Estación
Experimental “Álvaro Barba Machado” de la UCLV. Los datos de la primera se
utilizaron para analizar los resultados del experimento realizado en Remedios y para
el caso de la segunda los de los experimentos llevados a cabo en Santa Clara. Los
datos sobre precipitaciones, provenientes de la estación meteorológica de la estación
experimental, se tomaron para analizar los resultados de los experimentos realizados
en dicha estación experimental y en la CSS “Roberto Rodríguez”.
47
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Aislamiento, identificación y patogenicidad (agresividad) de hongos del
suelo causantes de enfermedades en frijol común
Los hongos fitopatógenos encontrados en campos de frijol común fueron Rhizoctonia
spp. Sclerotium rolfsii Sacc. y Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. Estos
microorganismos han sido reportados como una de las principales causas de la
disminución de la producción de este cultivo en Cuba (Mayea et al., 1983; González,
1988).
4.1.1 Aislamiento, identificación y agresividad de Rhizoctonia spp.
Se obtuvieron 15 aislados de Rhizoctonia spp., pertenecientes a las especies
Rhizoctonia solani y Rhizoctonia binucleada. De ellos 8 son multinucleados y
corresponden a la primera especie, mientras que los siete restantes son binucleados
y pertenecen a la segunda (Figura 4.1). Godoy-Lutz et al. (2003 y 2008), Eken y
Demirci (2004) y Yan et al. (2005 y 2007) reportaron asociación de dichas especies
con el cultivo del frijol.
a b c
Figura 4.1. Hifas de Rhizoctonia spp. observadas bajo microscopio clínico (a) y fluorescente
(b y c). Rhizoctonia solani (a) y Rhizoctonia binucleada (b).
49
La caracterización de los grupos de anastomosis (GA) de los aislados
multinucleados, realizada mediante zimograma péctico y análisis de RCP-PLFR de la
región ITS del ADN ribosomal, mostró que CuVC-Rs1, CuVC-Rs5, CuVC-Rs6,
CuVC-Rs7, CuVC-Rs8, CuVC-Rs10 y CuVC-Rs11 poseen perfiles de zimograma y
de RCP-PLFR comunes entre sí y que los mismos coincidieron con los perfiles del
patrón AG 4 HGI. Para el caso de CuVC-Rs61, el cual fue caracterizado utilizando
solamente la segunda técnica, los resultados indicaron que pertenece al mismo
grupo de anastomosis. Con el objetivo de confirmar el resultado obtenido para el
aislado CuVC-Rs7 la región ITS del ADN ribosomal fue secuenciada. Finalmente se
confirmó el resultado obtenido mediante otras técnicas. Dicho aislado mostró alta
similitud (99 %) con el aislado TO-3, accesión AY152703, proveniente de tomate e
identificado como R. solani AG4 HGI (Kuramae et al., 2003). Los aislados de
Rhizoctonia binucleada CuVC-Rb2, CuVC-Rb3, CuVC-Rb4, CuVC-Rb12, CuVC-
Rb13, y CuVC-Rb62, caracterizados únicamente por secuenciación de la región ITS,
mostraron alta similitud (98-99%) con la accesión DQ102433, la cual corresponde al
aislado Str111 de Rhizoctonia binucleada AG-F (Sharon et al., 2007). El aislado
CuVC-Rb9 fue asignado a AG A al mostrar una homología del 97% con el aislado
Str116 (accesión DQ102413) (Sharon et al., 2007) (Tabla 4.1).
50
Tabla 4.1. Caracterización por análisis zimograma péctico, PCR-RFLP y secuenciación de la
región ITS del ADN ribosomal de aislados de Rhizoctonia spp. colectados en
campos de frijol común en Villa Clara, Cuba.
Caracterización por
Zimograma Secuenciación ITS
* PCR-RFLP
Aislado péctico ADNr
CuVCRs 1 AG4 HGI AG4 HGI

CuVCRs 7 AG4 HGI AG4 HGI AG4HGI
CuVCRs 61 AG4 HGI
CuVCRb 2 AGF
CuVCRb 3 AGF
CuVCRb 4 AGF
CuVCRb 12 AGF
CuVCRb 13 AGF
CuVCRb 62 AGF
CuVCRb 9 AGA
*
CuVCRs: Cuba Villa Clara Rhizoctonia solani
CuVCRb: Cuba Villa Clara Rhizoctonia binucleado
La presencia de R. solani AG 4 ha sido reportada por varios autores en frijol (Warren
et al., 1972; Galindo et al., 1982; Bolkan y Ribeiro, 1985; Sumner, 1985; Balali y
Kowsari, 2004, Yang et al., 2007 y O'Brien et al., 2008). Aunque existen pocos
reportes sobre la incidencia de Rhizoctonia binucleada en este cultivo, los grupos de
anastomosis AG F y AG A también han sido asociados con el mismo (Eken y
Demirci, 2004 y Yang et al., 2005).
Determinación de la agresividad de los aislados en frijol común
Las pruebas de patogenicidad mostraron que todos los aislados causaron síntomas
de decoloración y necrosis, los cuales coinciden con los descritos por Abawi y
51
Pastor-Corrales (1990) para este cultivo. Sin embargo, se encontraron diferencias
estadísticas entre la severidad de la enfermedad causada por R. solani y Rhizoctonia
binucleada, así como entre los grupos de anastomosis de esta última (Tabla 4.2). Por
otro lado, se observaron diferencias en cuanto al órgano de la planta afectado por
ambas especies (Figura 4.2). Los aislados de R. solani fueron los más agresivos y
causaron pudrición del tallo y de las raíces, mientras que los de R. binucleada fueron
menos agresivos y solamente causaron pudrición de las raíces. En esta especie AG
F fue más agresivo que AG A.
a b c
Figura 4.2. Agresividad de aislados de Rhizoctonia spp. en frijol común. Raíz sana (a).
Lesiones causadas por Rhizoctonia solani AG4 HGI (b) y Rhizoctonia
binucleada (c).
A pesar de que las enfermedades causadas por Rhizoctonia en frijol han sido
reportadas frecuentemente en Centroamérica y el Caribe (Echávez-Badel et al.,
2000; Coyne et al., 2003), en Cuba no se habían desarrollado estudios sobre la
variabilidad genética de aislados de este hongo asociados al frijol común. La
52
información encontrada hasta la fecha está relacionada con estudios biológicos del
complejo Rhizoctonia en tabaco (González, 2008b), quien caracterizó 14 aislados, de
los cuales 5 correspondieron a R. solani, teleomorfo Thanatephorus cucumeris y 9 a
Ceratorhiza RT Moore (Teleomorfo Ceratobasidium Rogers). Ambos produjeron
lesiones similares en posturas de tabaco.
Tabla 4.2. Pruebas de patogenicidad y agresividad de los aislados de Rhizoctonia spp.

sobre raíces y tallos de frijol común (variedad Güira 89).
AG/subgrupo Raíz Tallo
Aislado Media* Rangos Media Rangos

medios medios
R. solani AG 4 HGI 1 3,7 108,30a 3.7 109,65a

5 3,8 112,70a 3.8 113,60a
6 3,6 103,90a 3.7 109,65a
7 4,0 121,50a 4.0 121,50a
8 3,6 103,90a 3.7 109,65a
10 3,8 112,70a 3.7 109,65a
11 3,5 99,75a 3.4 100,65a
61 3,7 108,30a 3.7 109,65a
Rhizoctonia binucleada AG F 2 2,0 36,0b 0 35,50b

3 2,1 40,15b 0 35,50b
4 2,2 44,30b 0 35,50b
12 2,0 36,00b 0 35,50b
13 2,2 44,30b 0 35,50b
62 2,2 46,40b 0 35,50b
Rhizoctonia binucleada AG A 9 1,30 14,30c 0 35,50b

*Medias de los valores de la escala
Rangos medios con letras no comunes en el sentido de las columnas difieren para P<0.05 por la
prueba de comparación de rangos múltiples
4.1.2. Aislamiento, identificación y patogenicidad de Sclerotium rolfsii Sacc.
A partir de zonas decoloridas de plantas de frijol que mostraban síntomas de
marchitez en el campo y, en algunos casos, presencia de hifas blancas sobre la
base del tallo, así como esclerocios sobre la zona del suelo cercana a la planta, se
53
aisló S. rolfsii. Todas las placas que contenían dicho hongo presentaron micelio de
color blanco, textura algodonosa, no funiculosa, color del reverso blanco cremoso,
ausencia de líquido de transpiración, pigmentos y cristales. Dichas características se
corresponden con lo descrito por Mayea y Padrón (1983), Martín (2001) y Leiva-Mora
et al. (2005). S. rolfsii presentó un micelio compuesto por hifas tabicadas y finas, de
paredes delgadas que se integraron en cordones miceliales con aspecto de tela de
araña o de abanico en el cual pueden verse conexiones de agarre. El hongo
desarrolló esclerocios globosos y redondos de color blanco a carmelita oscuro.
b c
Figura 4.3. Producción de esclerocios en cámara húmeda (a), colonia (b) e hifas (c) de
Sclerotium rolfsii.
54
Patogenicidad
Las plantas inoculadas con S. rolfsii presentaron lesiones acuosas oscuras sobre la
base del tallo, las cuales se extendieron, en algunos casos, a las raíces. Con
frecuencia se observó abundante micelio blanco y esclerocios adheridos a la base del
tallo. Estos resultados coinciden con los reportados por Schwartz y Galvez, (1980) en
frijol.
phaseolina (Tassi) Goid.
Se obtuvieron siete aislados monospóricos de Macrophomina phaseolina (Tabla 4.3).
Tabla 4.3. Aislados de M. phaseolina colectados en campos de frijol en las provincias de Villa
Clara y Sancti Spiritus.
* **
Aislado Procedencia
CCIBP Mp 2 Estación Experimental de Zootecnia. UCLV.
CCIBP Mp 8 Municipio Yagüajay. Provincia Sancti Spiritus.
CCIBP Mp 9 Municipio Yagüajay. Provincia Sancti Spiritus
CCIBP Mp 10 Municipio Yagüajay. Provincia Sancti Spiritus
CCIBP Mp 11 Estación Experimental Agrícola. UCLV.
*
CCIBP Colección de Cultivos Instituto de Biotecnología de las Plantas. Mp. Macrophomina phaseolina
**
Cada aislado procede de campos diferentes en cada localidad
Las colonias mostraron micelio de color blanco durante los primeros días, el cual fue
tornándose gris oscuro con la edad de la hifa y la formación de esclerocios. El
reverso de las colonias fue de color negro sin difusión de pigmentos al medio de
cultivo. No se observó la presencia de líquido de transpiración en la superficie de las
colonias. Resultados similares fueron publicados por Cabrera et al. (2001) en

55
estudios conducidos sobre este hongo en soya. Por otro lado Crous et al. (2006) y
Partridge (2007) reportaron aislados con caracteres similares a los encontrados en
este trabajo.
Se observaron hifas hialinas, septadas, con numerosas ramificaciones. La mayoría
de las hifas secundarias formaban ángulos rectos con respecto a sus parentales y en
ocasiones ángulos agudos. La dimensión ancho promedio de las hifas fue
aproximadamente de 10 ȝm. Los esclerocios observados fueron de forma esférica a
ovoides o irregular, con dimensiones que variaron de 120-240 ȝm (Figura 4.4).
Dichas características coinciden con las reportadas para aislados asociados con frijol
(Hall, 1994 y Purkayastha, 2006) y soya (Distefano et al., 1997 y Hartman et al.,
1999).
a b
< 90º 240 ȝm
90º
120 ȝm
Figura 4.4. Hifas mostrando ramificaciones con diferentes ángulos respecto a las hifas
parentales (a). Esclerocios con diferentes dimensiones (b).
En este estudio no se observaron picnidios en medio de cultivo PDA lo cual
concuerda con los resultados de los trabajos conducidos por De la Garza y Díaz
(1989).
56
Determinación de la agresividad de los aislados en frijol
Todos los aislados fueron patogénicos, sin embargo existieron diferencias
significativas en la agresividad de los mismos. El aislado CCIBP Mp 2 resultó ser el
más agresivo, mostrando diferencias estadísticamente significativas con el resto de
los aislados, mientras que CCIBP Mp 8 fue el menos agresivo, con diferencias
estadisticas con los demás. Los aislados CCIBP Mp 3, CCIBP Mp 9 y CCIBP Mp 11
no mostraron diferencias estadísticas entre ellos (Tabla 4.4). La variación en la
agresividad entre cepas de M. phaseolina fue reportada anteriormente por Mayek et
al. (2001) y Purkayastha et al. (2006), quienes encontraron diferencias, incluso, entre
aislados que procedían de una misma planta.
Tabla 4.4. Agresividad de los aislados de M. phaseolina hacia frijol (Phaseolus vulgaris var.
BAT 482). (Porcentaje de tejido afectado).
Aislados % tejido afectado

CCIBP Mp 2 82,2 a
CCIBP Mp 11 67,5 b
CCIBP Mp 3 66,6 b
CCIBP Mp 9 64,2 b
CCIBP Mp 7 58,5 c
CCIBP Mp 10 51,1 d
CCIBP Mp 8 46,3 e
EE (±) 2,48
Medias con letras similares no difieren para P<0.05, según la prueba de Duncan.
Los síntomas característicos del tizón ceniciento observados en BAT 482 se
corresponden con lo descrito por Mayek et al. (2001, 2002 y 2004) en frijol. Estos
autores encontraron lesiones oscuras en los cotiledones, tallos con coloraciones
57
castaño oscuro a negro a la altura del nivel del suelo, marchitez, clorosis y muerte de
las plantas.
sobre variedades de frijol
El experimento realizado entre enero y abril de 2007 y de 2008 mostró la presencia
de R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina en ambos años. En 2007 la incidencia (%) de
estas especies sobre las 16 variedades en estudio osciló entre 0 y 12 para R. solani,
0 y 9 para S. rolfsii y 0 y 2,5 para M. phaseolina con un promedio de incidencia de
3,5; 2,8 y 0,3 % respectivamente. En el año siguiente la incidencia fluctuó entre 0,5 y
3,5 % para el primero, 0 y 9 % para el segundo y para el último se mantuvo la misma
fluctuación. Comparados con el año anterior el promedio de incidencia disminuyó a
2,1 % para R. solani y aumentó a 1,18 % para M. phaseolina y a 4,1 % para S.
rolfsii. Cuando se asociaron los porcentajes de incidencia de estos hongos al color
de la testa de las variedades estudiadas, se observó la misma tendencia en ambos
años. Estos incidieron más en las variedades blancas que en las de color rojo y
negro. Estas últimas mostraron los menores promedios de incidencia (Tabla 4.5).
58
Tabla 4.5. Rangos y porcentajes promedios de incidencia de R. solani, S. rolfsii y M.
phaseolina sobre frijol común.
% de incidencia
Color de la testa
Negra Roja Blanca
Años Especie RI* PI** RI PI RI PI
R. solani 0-2 0,7 2-5 3,4 7,5-12 9,1

2007 S. rolfsii 0-1,5 0,6 2,5-4 2,9 4,0-9 6,3
M. phaseolina 0-0,5 0,07 0 0 1-2,5 1,7
R. solani 0,5-1,5 1,1 2-3,5 2,7 3-3,5 3,2

2008 S. rolfsii 0-2 1,0 4-6 5,34 7,5-9 8,0
M. phaseolina 0-1,5 0,6 0-2 1,2 2-2,5 2,3
* RI: rango de incidencia
** PI: promedio de incidencia
La figura 4.5 muestra la incidencia de R. solani y S. rolfsii en cada una de las
variedades seleccionadas para este estudio en los años 2007 y 2008
respectivamente.
En el año 2007 la variedad blanca Bat 482 fue la más afectada por R. solani seguida
por Judía Blanca. La primera difirió del resto de las variedades mientras que la
incidencia de este hongo sobre la segunda no difirió estadísticamente de las demás
variedades blancas, excepto con Bat 482, pero sí con las rojas y las negras. La
variedad roja de mayor porcentaje de incidencia fue Cuba Cueto 25-9-R, la cual fue
significativamente diferente de las negras pero no del resto de las rojas ni de la
crema Bat 93 y la blanca Cuba Cueto 25-9-B.
59
R. solani no incidió sobre Bat 58 (negra) y los menores porcentajes de incidencia se
encontraron en las variedades negras Tomeguín 93, Bat 304, Güira 89 entre las
cuales no se encontraron diferencias significativas, ni tampoco se encontró
diferencias entre estas y el resto de las negras y las rojas Cuba Cueto 25-9-C y
Velasco.
Figura 4.5. Porcentaje de incidencia de R. solani (A y C) y S.rolfsii (B y D) sobre variedades

de frijol cultivadas en un suelo Pardo Sialítico en los años 2007 (A y B) y 2008 (C
y D).
La incidencia de S. rolfsii en este mismo año fue mayor, coincidentemente con la
incidencia de R. solani sobre Bat 482. También coincidentemente, seguida por Judía
60
Blanca y Bat 93. El porcentaje de incidencia fue diferente entre ellas y estas a su vez
difirieron del resto.
Las variedades Tomeguín 93, y Cut 53 no fueron afectadas por S. rolfsii. Dentro de
las menos afectadas se encuentran las de testa negra Bat 58, Güira 89, Cuba Cueto
25-9-N y Bat 304. En las tres primeras el hongo incidió un 0,5 % y en la última un
1 % sin que la diferencia fuera estadísticamente significativa. Sin embargo, estos
valores fueron diferentes estadísticamente del resto de las variedades.
M. phaseolina solamente afectó cuatro variedades. De ellas una de testa negra y tres
de testa blanca. Los mayores porcentajes de incidencia se encontraron en las
variedades de testa blanca. La variedad más afectada fue Bat 482, la cual no difirió
de Cuba Cueto 25-9-B, pero sí de Judía Blanca y Cuba Cueto 25-9-N.
En el año 2008, a diferencia del 2007, R. solani incidió sobre todas las variedades
estudiadas. Aunque en este año las variedades blancas continuaron siendo las más
afectadas, no se encontraron diferencias estadísticas entre ellas, las variedades de
testa roja y las de testa negra Cuba Cueto-25-9-N, Bat 304 y Cut 53. Por otra parte,
los porcentajes de incidencia de este hongo patógeno sobre las variedades blancas
Cuba Cueto-25-9-B (3,50 %) y Bat 482 (3, 00 %) coincidieron con los de las rojas
Cuba Cueto 25-9-R y Delicias 364, respectivamente.
El menor porcentaje de incidencia de R. solani (0,5 %) en este año, se encontró en
Güira 89, Tomeguín 93 e ICA Pijao, que no difirió estadísticamente del resto de las
variedades de testa negra, roja, y Judía Blanca.
61
También S. rolfsii incidió en todos los cultivares en el 2008, incluyendo Tomeguín 93
y Cut 53 que no fueron afectadas en 2007. El mayor porcentaje de incidencia fue
sobre Bat 482 (9,00 %), el cual difirió estadísticamente de las variedades de testa
negra y roja, pero no del resto de las de testa blanca.
Las variedades menos afectadas fueron Güira 89, Bat 304 e ICA Pijao con 0,5 % de
incidencia, sin diferencias estadísticas con el resto de las variedades de testa negra,
Delicia 364 y Md 3036 (Rojas), y con diferencias estadísticas con las de testa blanca.
M. phaseolina incidió en 12 de los 16 cultivares evaluados. Las variedades no
afectadas por esta especie fueron las de testa negra Cuba Cueto 25-9-N, Bat 58, ICA
Pijao y la de testa roja Md 3036. El mayor porcentaje de incidencia (2,5) fue sobre
Cuba Cueto 25-9-B y Bat 482 las cuales difirieron del resto de las variedades
afectadas. Entre estas últimas no se encontraron diferencias estadísticas.
Los hongos fitopatógenos encontrados en este estudio han sido asociados
anteriormente con el cultivo del frijol en Cuba (Mayea et al., 1983; González, 1988,
Díaz y Herrera, 2000; Herrera, 2004; Nerey et al., 2009a y 2010). Por otro lado la
respuesta diferencial de las variedades ante el ataque de R. solani, S. rolfsii y M.
phaseolina, encontradas en esta investigación, han sido señaladas en otros trabajos.
Díaz y Herrera (2000) reportaron que dichos hongos incidieron en todas las
variedades utilizadas, pero aquellas cuya cubierta de la semilla era negra resultaron
las más tolerantes. También Sánchez et al. (1992), Herrera (2004) y López (2005)
reportaron que la susceptibilidad del frijol a R. solani estuvo asociada a la
pigmentación de las semillas. En sus trabajos, las variedades rojas y blancas fueron
62
las más susceptibles. Por otro lado, Mayek-Pérez et al. (2002, 2004) y Beas et al.
(2004) refirieron que los genotipos de frijol de testa negra mostraron mayor
resistencia a M. phaseolina que los de testa roja, beige o jaspeada.
Coincidentemente Athayde (2004), al estudiar el patosistema caupí (Vigna
unguiculata (L) Walp-Macrophomina phaseolina en Brasil, encontró las mayores
afectaciones en semillas de color testa blanca, respecto a marronas y cremas.
Según González (1988) la resistencia del frijol al ataque de hongos del suelo está
asociada a la presencia de antocianinas en los hipocotilos. De acuerdo con sus
estudios las variedades de testa negra tienen mayor contenido de antocianinas que
las de testa roja y blanca.
En esta investigación R. solani incidió durante las tres primeras semanas del cultivo,
mientras que S. rolfsii y M. phaseolina fueron encontrados durante el desarrollo de
todo el cultivo. Este resultado puede estar asociado al mecanismo de infección de
estos hongos. Estudios precedentes indicaron que la maduración del hipocotilo en
frijol conlleva a la transformación de pectina a pectatos de calcio (Bateman y
Lumsden, 1965), por lo que con la edad de la planta aumenta la calcificación de la
pared celular y el grosor de la cutícula. R. solani, a diferencia de S. rolfsii y M.
phaseolina, no hidroliza pectatos de calcio ya que la enzima encargada de la
maceración de los tejidos (poligalacturonasa) es inhibida por el calcio (Bateman,
1964). Consecuentemente, existe resistencia natural del frijol a este hongo, la cual
está asociada a la expansión y maduración del hipocotilo (Bateman y Lumsden,
1965; Stockwell, 1984; Stockwell y Hanckey, 1985).
63
4.2.1. Caracteres químicos de la testa de la semilla de frijol común asociados a
la resistencia a hongos fitopatógenos del suelo.
4.2.1.1. Ensayos biológicos
Las variedades de testa negra presentaron, en los ensayos de campo, porcentajes
de incidencia de R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina, inferiores a las variedades de
testa blanca. Al analizar el efecto in vitro de los extractos de las semillas sobre el
crecimiento micelial de estos organismos, se observó inhibición del crecimiento de R.
solani y M. phaseolina con los extractos de variedades de testa negra y roja. Los
extractos de testa blanca no inhibieron el crecimiento de ninguna de las especies
estudiadas. Es de destacar que ninguno de los extractos empleados inhibió el
crecimiento de S. rolfsii. Estos resultados indicaron la presencia de sustancias con
efecto inhibitorio en la testa de la semilla. Los mismos coinciden con los reportados
por Prasad y Weigle (1976) quienes asociaron factores de la testa de la semilla a la
resistencia a R. solani.
4.2.1.2. Tamizaje fitoquímico
Los resultados del tamizaje fitoquímico mostraron la presencia de compuestos
fenólicos en los extractos acuosos obtenidos a partir de testas de semillas de las
variedades estudiadas (Tabla 4.6).
64
Tabla 4.6. Metabolitos secundarios presentes en extractos acuosos de testas de semillas de
variedades de P. vulgaris.
Metabolitos secundarios Tomeguín 93 Delicias 364 Bat 482
Alcaloides - - -
Saponinas + + +
Fenoles y taninos +++ ++ +
Flavonoides +++ ++ +
Carbohidratos reductores - - -
Leyenda: +++ Alto ++ Medio + Bajo - Ausencia
4.2.1.3. Cuantificación de compuestos fenólicos en extractos acuosos
obtenidos de testas de variedades de frijol común.
Los resultados de la cuantificación de compuestos fenólicos mostraron diferencias
estadísticas significativas entre las variedades. Los mayores contenidos de fenoles
se cuantificaron en la variedad de testa negra, seguida por la roja, con diferencias
estadísticas entre ellas, y en menor cuantía la variedad de testa blanca (Tabla 4.7).
Tabla 4.7. Cuantificación de fenoles en extractos acuosos de testas de variedades de frijol

común expresados en mg de ácido Gálico (GAE) equivalentes/g testa.
mg GAE/g testa
Variedad Medias reales Rangos medios
Tomeguín 93 2,29 8a
Delicias 364 1,71 5b
Bat 482 0,21 2c
Rangos medios con letras no comunes difieren por la Prueba de Kruskal-Wallis
Estos resultados corroboran lo reportado por Prasad y Weigle (1975). Dichos autores
relacionaron la resistencia a los ataques de hongos que viven en el suelo a la
presencia de sustancias de origen fenólico en la testa de la semilla. Según ellos las
variedades negras tenían mayores cantidades de esta sustancia. Igualmente, Telek y

65
Freytag (1985), asociaron compuestos fenólicos con la resistencia a este tipo de
organismo. Ellos aislaron e identificaron compuestos fenólicos de testas de frijol
negro, rojo y blanco, sin embargo no encontraron cantidades apreciables de fenoles
en la testa del frijol blanco.
En la literatura consultada existen limitados reportes sobre la relación de los
extractos de testa de frijol común con los hongos fitopatógenos del suelo. La mayoría
de estos estudios están vinculados, principalmente, al efecto antioxidante de los
compuestos fenólicos presentes en la testa y grano de las semillas (fenoles,
antocianinas, flavonoides y taninos), así como su efecto sobre la cocción (Elías et al.,
1979; Iniestra et al., 2005; Salinas et al., 2005; Peguero, 2007).
Gnannamanickan (1979) reportó, en semillas de frijol común, la presencia de
fitoalexinas como faseolina, faseolinisoflavona, cumestriol y kievitona. Vidal (2002) y
Mishra et al. (2010) destacaron que los fenoles cumplen importantes funciones en las
plantas entre las que se encuentran formar parte de los mecanismos de defensa
contra organismos patógenos mediante la síntesis de fitoalexinas. Estas son
mayoritariamente polifenoles, principalmente isoflavonoides, compuestos tóxicos
para los microorganismos. Las fitoalexinas son responsables de la prevención de las
infecciones, de la inhibición de enzimas producidas por los microorganismos
patógenos que degradan las paredes celulares de las plantas, de la producción de
lignina por las enzimas peroxidasas, polímero que se localiza en las paredes
celulares de las plantas dando resistencia al ataque de hongos y contribuyendo a la
impermeabilización de la célula, de la inhibición de la formación de cutinasas,
66
enzimas producidas por los organismos patógenos, de la formación de sustratos de
compuestos antifúngicos y la inducción de resistencia.
En Cuba, Pupo (2010) trabajó con extractos de plantas e identificó varios
flavonoides (cirsimaritina, pectolinaringenina, salvigenina, xanthomicrol, santoflavona,
apigenina y genkuanina) que mostraron actividad contra A. solani y A. porri.
Previamente, Pandey et al. (2002) y Li et al. (2005) habían informado sobre la
actividad antifúngica de estos compuestos contra especies de Alternaria.
También en Cuba, Hernández (2011) reportó la presencia de alcaloides, fenoles,
taninos, flavonoides y saponinas en tejidos foliares de plantas de frijol común. Los
tres primeros fueron encontrados en las variedades Ica Pijao (negra) y Bat 482
(blanca), mientras que la última sólo fue encontrada en la variedad Ica Pijao, la cual
fue menos atacada por plagas insectiles.
sobre frijol común en dos tipos de suelos.
El ensayo para determinar la incidencia de enfermedades, causadas por hongos
fitopatógenos del suelo sobre la variedad Bat 482, en los suelos Pardo Sialítico y
Ferralítico, indicó que no todos los hongos identificados aparecieron en los dos tipos
de suelo. R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina fueron encontrados en el suelo
Ferralítico mientras que en el Pardo Sialítico no se detectó M. phaseolina. Los
análisis de ANOVA factorial indicaron que tanto la especie fitopatogéna como el tipo
de suelo influyeron significativamente en la incidencia de las enfermedades causadas
por hongos del suelo patogénicos al frijol. Por otro lado, teniendo en cuenta que la
67
interacción entre estos factores fue significativa, el porcentaje de incidencia de la
especie estará influenciado por ambos factores (Anexo 4).
En el suelo Ferralítico M. phaseolina fue el hongo que más incidió (20 %). Este difirió
significativamente de S. rolfsii (7,5 %) y R. solani (3,0 %), los cuales, a su vez,
difirieron entre ellos. De los dos hongos encontrados en el suelo Pardo Sialítico, fue
S. rolfsii el que más incidió (8 %) difiriendo significativamente de R. solani (3,5 %)
(Figura 4.5).
Figura 4.5. Porcentaje de incidencia de R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina sobre frijol

(variedad Bat 482) cultivado en dos tipos de suelo.
La presencia de M. phaseolina en el suelo Ferralítico y no en el Pardo Sialítico se
explica por las diferencias que existen en estos suelos con respecto a la capacidad
de retención de agua, y la relación entre el contenido hídrico del suelo y la capacidad
de sobreviviencia del hongo. Estudios conducidos por Olaya et al. (1996) mostraron
que cuando el potencial mátrico del suelo es alto, la sobrevivencia de los esclerocios
de este hongo es drásticamente reducida, la que es menos afectada a medida que la
humedad disminuye. Por tanto M. phaseolina no va a prevalecer en suelos cuya

68
textura y permeabilidad garanticen altos niveles de humedad por tiempos
prolongados. Según Cardona (2006) M. phaseolina es un hongo habitante del suelo
que tiene la capacidad de crecer vegetativamente y producir gran cantidad de
esclerocios sobre tejido vegetal en condiciones de bajos potenciales hídricos (1.880 J
kg-1) (10) y mantener en un 100 % viables sus esclerocios en suelos secados al aire,
tanto pasteurizados como natural, lo cual demuestra la gran capacidad de
sobrevivencia en suelos secos. Este autor encontró una alta correlación entre los
factores temperatura, contenido de humedad y el número de esclerocios por g de
suelo-1. Estos dos factores abióticos explican la epifita del hongo en áreas
caracterizadas por condiciones de alta temperatura y condiciones de sequía. El
análisis de las características físicas y químicas (Anexo 5) mostró que el suelo
Ferralítico posee mayor contenido de arcilla, donde predomina arcillas del tipo 1:1
(Caolinita) las cuales propician la poca retención de agua. El suelo Pardo Sialítico
posee menor contenido, sin embargo el tipo de arcilla que predomina es 2:1
(Monmorillonita), la cual le confiere al suelo mayor capacidad de retención de agua.
Por otro lado el suelo Ferralitico posee menor capacidad de intercambio catiónico
que el suelo Pardo Sialítico, lo cual constituye un factor de predisposición de la
planta al ataque del hongo.
Unido al efecto del suelo sobre la incidencia de las enfermedades causadas por
organismos patógenos que viven en este medio, esta investigación determinó que la
especie patogénica también incide sobre la aparición de dichas enfermedades. En
ambos suelos S. rolfsii resultó tener mayor incidencia en la pudrición de raíces y
tallos de frijol que R. solani, y esta diferencia fue significativa. Estudios previos
69
revelaron que cuando estos dos hongos están presentes en el suelo a temperaturas
superiores a los 22 °C, S. rolfsii es el principal agente causal de la pudrición de
raíces y tallos del frijol, mientras que R. solani es un coinvasor cuya capacidad
competitiva es significativamente afectada (Nerey et al., 2009b).
4.4. Efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos fitopatógenos del
suelo en frijol común
El estudio del efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos patógenos al
frijol mostró la presencia de R. solani y S. rolfsii. El primero solamente apareció en
2009 mientras que el segundo se encontró en este mismo año y en 2011.
El promedio de incidencia de R. solani disminuyó de 2,5 %, donde no se aplicó
fertilizante, a 0,5 % en los tratamientos donde la semilla se recubrió con EcoMic y
con R. phaseoli. A pesar de que la incidencia también disminuyó en el resto de los
tratamientos no se encontraron diferencias significativas entre ninguno de los
tratamientos y los controles utilizados. Para el caso de S. rolfsii, en el año 2009, el
promedio de incidencia osciló entre 6,2 % en el control sin fertilizar, y 1,0 % en el
tratamiento donde la semilla fue recubierta con EcoMic. Similares resultados mostró
la repetición del experimento en 2011. El mayor promedio de incidencia también fue
en las parcelas sin fertilizar (6,5 %) y el menor (1,0 %) en los tratamientos donde se
empleó EcoMic y R. phaseoli. En ambos años la incidencia de S. rolfsii fue
significativamente menor en cada uno de los tratamientos empleados, comparado
con el control sin fertilizar. No obstante, no se encontraron diferencias significativas
entre los tipos de fertilizantes empleados (Tabla 4.8).
70
Tabla 4.9. Efecto de la fertilización sobre la incidencia de S. rolfsii en Phaseolus vulgaris
(variedad Bat 482) cultivada en un suelo Pardo Sialítico en los años 2009 y 2011.
% de incidencia de Sclerotium rolfsii
2009 2011
Tratamientos Medias reales Rangos medios Medias reales Rangos medios
EcoMic 1,0 2,50 b 1,0 4,66 b
Compost 2,0 7,00 b 1,5 6,16 b
R. phaseoli 2,0 7,00 b 1,0 4,66 b
Urea 2,5 9,50 b 2,5 10,50 b
No fertilización 6,2 14,00 a 6,5 14,00 a
Rangos medios, en una misma columna, seguidos por letras diferentes, son estadísticamente
diferentes según la prueba de rangos múltiples de Kruskal-Wallis.
.
Los resultados obtenidos confirman el efecto positivo del empleo de la fertilización
orgánica y la biofertilización con hongos micorrícicos y rizobacterias promotoras del
crecimiento vegetal. Estos tipos de fertilizante contribuyen a la sanidad de la planta y
a su crecimiento y desarrollo (Guillon et al., 2002). Martínez y Hernández (1995)
señalan entre las ventajas de estos microorganismos, la mejora en la nutrición de la
planta, la producción de sustancias activas estimuladoras del crecimiento vegetal y el
beneficio en la protección del sistema radicular contra organismos fitopatógenos. Los
hongos micorrícicos aumentan la absorción de fósforo, cinc, azufre, calcio, cobre,
molibdeno y boro en las plantas y por lo tanto, favorecen la fijación biológica del
nitrógeno cuyo proceso exige una elevada cantidad de fósforo y molibdeno
redundando en una mayor actividad nitrogenasa (Silveira, 1992). Debido a estas
condiciones, las plantas micorrizadas son más competitivas y toleran mejor el estrés
71
ambiental que las plantas sin micorrizar. Por otro lado, es importante destacar el rol
que cumplen las micorrizas en la protección de las raíces contra el ataque de hongos
patógenos del suelo como Fusarium y Rhizoctonia. Básicamente, el hongo crea una
barrera mecánica a través del manto de hifas e impide la penetración de los
organismos patógenos. Las micorrizas ejercen además, un efecto positivo sobre la
estructura del suelo. Wright (2000) descubrió la producción de una sustancia
denominada “glomalina”, una glicoproteina exudada por los micelios de los hongos
micorrízicos, que presenta una estructura diferente de cualquier otro componente de
la materia orgánica. Según este autor, la glomalina es una sustancia que le provee al
suelo buena estructura, señalando además, que la misma no es solamente el
pegamento que une el humus a los compuestos del suelo, sino que también la
glomalina almacena 27 % de la cantidad total de carbono del suelo. Rillig y Wright
(2000) encontraron que el efecto directo de la glomalina fue mucho más fuerte que
el efecto directo de las hifas de los propios hongos.
El efecto de las micorrizas como limitantes de las poblaciones de R. solani ha sido
probado por Cupull et al. (2000). Estos autores encontraron, al tratar las raíces de
postura de café (Coffea arabica L.) con estos microorganismos, mayor porcentaje de
germinación y menor ataque de este organismo patógeno. Resultados similares
obtuvieron Cuervo et al. (1998), contra R. solani y Fusarium oxysporum, Ahmed et
al. (1995) contra la pudrición radical del fríjol por R. solani y Yao et al. (2002) en
papa. Pérez et al. (2002a y 2002b) reportaron activación de los mecanismos de
defensa (quitinasa, glucanasa, peroxidasas, polifenoloxidasa, y fenilalanina amonio
liasa) contra el ataque de Alternaria solani y Phytophthora parasítica.

72
En relación con el uso del compost, se ha demostrado que la mayor influencia de
materia orgánica sobre los organismos patógenos radicales es a través de
modificaciones de las actividades microbianas (Whipps, 1992). La pudrición de raíces
causada por R. solani fue controlada en chícharo, fríjol y remolacha, incorporando al
suelo un compost preparado con desechos orgánicos domésticos (Schuler et al.
1989). Wright et al. (1997) redujeron el porcentaje de plantas de frijol enfermas por
organismos patógenos del suelo con el empleo de humus de lombriz.
El uso de compuestos orgánicos, en la mayoría de los casos presenta efecto
supresivo en la reducción de la severidad de las enfermedades y una reducción de la
población del organismo patógeno en el suelo (Santos y Bettiol, 2003; Blum y
Rodríguez-Kábana, 2004), pues la materia orgánica activa la microbiota del suelo,
provoca alteraciones en el pH y la conductividad eléctrica de los suelos, factores que
pueden estimular la supresividad de los suelos a los patógenos.
En el mundo desarrollado la agricultura depende en gran medida del uso de
fertilizantes químicos y pesticidas para mantener sus altas producciones agrícolas,
sin tener en cuenta los terribles daños que estos pueden ocasionar, ya sea afectando
el ciclo global del nitrógeno, contaminando las aguas subterráneas y superficiales e
incrementando los niveles de óxido nitroso (N 2 O) atmosférico y CO 2 , los cuales están
considerados como potentes gases con efecto invernadero. Es necesario entonces,
la aplicación de fertilizantes orgánicos y biológicos, no sólo por términos económicos,
sino para reducir los efectos nocivos de la fertilización nitrogenada en la absorción,
asimilación y disponibilidad de diferentes nutrientes como el fósforo, así como la
73
erradicación de la contaminación tanto atmosférica como a las aguas subterráneas,
siendo este impacto ambiental tan necesario como el impacto económico.
4.4.1. Influencia de la fertilización sobre el rendimiento agrícola
La fertilización influyó positivamente sobre el rendimiento en los dos años en estudio.
Comparados con el control sin fertilizar, este fue significativamente mayor en los
tratamientos donde se fertilizó con EcoMic, Compost y R. phaseoli. Los incrementos
alcanzados con estos tratamientos no difirieron estadísticamente entre sí tanto en el
año 2009 como en 2011 (Tabla 4.9).
Tabla 4.9. Efecto de la fertilización sobre el rendimiento agrícola expresado en g/m2.
Rendimiento g/m2
Tratamientos 2009 2011
EcoMic 192,6 a 196,4 a

Compost 186,6 a 198,7 a
R. phaseoli 201,5 a 203,3 a
Urea 165,9 b 131,6 b
No fertilización 133,3 c 137,0 b
EE 8,2 11,3
Medias con letras no comunes en el sentido de las columnas difieren para P<0.05 por la
Prueba de Duncan
La influencia positiva de la fertilización sobre el rendimiento está relacionada con la
estimulación del crecimiento de las plantas así como la protección de la planta contra
el ataque de organismos patógenos conferida por los fertilizantes orgánicos y
biológicos. Hernández y Guzmán (2002), Khalil et al. (2001) y Bolletta et al. (2002)
asociaron el aumento de la altura de la planta y el aumento del rendimiento total a la
presencia de micorrizas. Por otro lado, Tovar (2000) obtuvo un aumento del
74
rendimiento (26 %), del contenido de nitrógeno (32 %) y del fósforo (28 %) en el
follaje de alfalfa (Medicago sativa) que había sido previamente inoculada con
Rhizobium. Resultados similares obtuvieron Übrahim y Muhammet (2001) y Veito et
al. (2004) en cuanto a la altura, supervivencia de las plantas y rendimiento en masa
seca al primer corte, en este mismo cultivo.
4.5. Incidencia de hongos del suelo sobre plantas de frijol provenientes de
semillas tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana
S. rolfsii y R. solani fueron los hongos del suelo encontrados en las parcelas
destinadas al estudio de la incidencia de hongos fitopatógenos sobre plantas del frijol
provenientes de semillas tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana. S. rolfsii
apareció en todos los tratamientos estudiados tanto en 2009 como en 2011. En
ambos años los mayores porcentajes de incidencia se encontraron en el control sin
tratar. Los mismos fueron significativamente diferentes del resto de los tratamientos,
incluyendo el control con TMTD, en sus respectivos años. Estos últimos no fueron
estadísticamente diferentes entre ellos (Tabla 4.10).
75
Tabla 4.10. Incidencia S. rolfsii sobre plantas de frijol comun (variedad Bat 482) provenientes
de semillas tratadas con bacterias antagonistas y Quitosana.
% de incidencia de Sclerotium rolfsii
2009 2011
Tratamientos Medias reales Rangos Medios Medias reales Rangos Medios
B. cepacia 1,5 11,17 b 1,6 7,16 b

B. subtilis 1,3 11,00 b 2,1 11,66 b
P. aeruginosa 1,0 5,50 b 2,5 14,16 b
P. fluorescens 1,0 5,50 b 2,5 14,16 b
Quitosana 1,0 7,17 b 1,6 6,50 b
TMTD 2,3 16,67 b 1,2 3,33 b
Semillas sin tratar 6,5 20,00 a 6,2 20,00 a
Rangos medios, en una misma columna, seguidos por letras diferentes, son estadísticamente
diferentes según la prueba de rangos múltiples de Kruskal-Wallis.
R. solani solamente incidió en el año 2009. El mayor porcentaje de incidencia (1,8 %)
fue en plantas provenientes de semillas no tratadas (control absoluto). En los
tratamientos donde las semillas se recubrieron con las bacterias o se sumergieron en
una solución de quitosana o TMTD, el promedio de incidencia disminuyó a 0,5 %,
aunque no se encontraron diferencias significativas entre 1,8 y 0,5 %.
La disminución de la incidencia de los hongos fitopatógenos ante la presencia de
bacterias antagonistas ha sido bien documentada. De acuerdo con Raaijmarkers et
al. (2008) los microorganismos biocontroladores afectan las actividades metabólicas
de los patógenos del suelo, así como la distribución temporal y espacial de estos, a
través de la competencia, antagonismo e hiperparasitismo. En la rizosfera, la
competencia toma lugar por espacio y por nutrientes, fundamentalmente por los que
provienen de los exudados de las semillas y la raíz. También existe competencia por
micronutrientes, especialmente por el hierro, que es esencial para el crecimiento y
76
actividad del patógeno. Se conoce que miembros del género Pseudomonas spp.
producen sideróforos, compuestos de bajo peso molecular con gran afinidad por el
hierro, que ponen a estas bacterias en ventaja competitiva frente a los
microorganismos que no la producen (Neilands., 1995).
Por otro lado el empleo de rhizobacterias promotoras del crecimiento vegetal
(PGPR) indujo resistencia en la planta contra el ataque de hongos patógenos del
suelo (Zehnder et al., 2001). El punto de vista incluyó: producción de fitoalexinas
(Van Peer et al, 1991), acumulación de proteínas relacionadas con la patogénesis
(Zedor y Anderson, 1992), deposición de barreras estructurales como la formación de
calosa (Benhamou et al., 1996), promoción de actividad de las peroxidasas (Albert y
Anderson, 1987) así como acumulación de lignina (Anderson y Guerra, 1985) y
producción de glucanasas y quitinasas, causantes de lisis celular en los hongos
(Van Loon et al., 1998). Hernández et al. (2002) encontraron que cepas de
Pseudomonas aureginosa KMPCH y 7NSK2; Pseudomonas fluorescens WCS-417
y J-143 y Burkholderia cepacia 0057, indujeron resistencia contra Colletotrichum
lindemuthianum en frijol. En semillas de chícharo infectadas con Fusarium udum
Butler y tratadas con Bacillus subtilis se incrementó la actividad de las peroxidasas
(Podile y Laxmi, 1998). Resultados similares fueron reportados por Zaccardelli et al.
(2004) para Bacillus spp., inoculados en papa contra Rhizoctonia solani y por Mpiga
et. al. (1997) respecto a P. fluorescens contra F. oxysporium en tomate. En este
último caso se reportó deposición de calosa en la pared interna de la pared celular y
acumulación de sustancias fenólicas.
77
En cuanto a los resultados obtenidos con el empleo de la Quitosana, Athayde (2004)
la reportó como sustancia inductora de resistencia, la cual provocó aumento del
contenido de las enzimas peroxidasas y fenil alanina amonia liasa (FAL) así como de
la síntesis de lignina, y quitinasa, que hidroliza la quitina presente en las paredes
celulares de los hongos, coincidiendo con Rodríguez et al. (2004) quienes
encontraron que la Quitosana aplicada a la semilla estimuló las enzimas defensivas:
en plantas de arroz var. J-104. contra Piricularia grisea. Hernández (2004) demostró que
la Quitosana incrementó la síntesis de compuestos fenólicos en semillas de maní
maduro, lo que produjo una inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y
reducción de la producción de aflatoxinas.
El efecto obtenido en el control de R. solani por la Quitosana corrobora lo referido por
Falcón et al. (2004) en tabaco contra S. rolfsii y R. solani. Similares resultados
obtuvieron Sánchez-Domínguez et al., (2007) frente a Alternaria alternata (Fr.) Keissl,
Camili et al. (2007) contra Botrytis cinerea en postcosecha en uva y Rivero et al.
(2008) frente a Bipolaris oryzae (B. de Han) Shoem.
Se han propuesto diferentes mecanismos, por los que la quitosana puede actuar
sobre los microorganismos e inhibir su crecimiento y desarrollo. Se plantea que la
afectación puede ser sobre la permeabilidad de la membrana citoplasmática,
mediante la interacción de sus grupos NH 3 + con componentes fosfolipídicos
cargados negativamente en las membranas bacterianas, con lo que se altera el
intercambio con el medio, además de la formación de quelatos con los metales de
transición y la inhibición de algunas enzimas (Liu et al., 2004; Balicka-Ramisz et al.
78
2005). El biopolímero puede actuar a nivel molecular, sobre los ácidos nucleicos y
alterar sus funciones, mediante cambios transcripcionales específicos (Zakrzewska
et al., 2005), o inducir alteraciones estructurales de las células fúngicas como la
presencia de vesículas en el micelio, células sin contenido citoplasmático, otras
desorganizaciones celulares que abarcan la excesiva ramificación y ensanchamiento
de la pared celular, la pérdida de la misma y hasta la desintegración del citoplasma
(Barka et al., 2004).
4.5.1. Influencia de bacterias antagonistas y Quitosana sobre el rendimiento.
En el año 2009 los tratamientos donde se emplearon bacterias y Quitosana
mostraron mayores rendimientos que los controles donde no se trató la semilla y
donde se utilizó TMTD. Estos dos últimos no mostraron diferencias estadísticas
entre ellos pero difirieron del resto de los tratamientos. El tratamiento con Quitosana
resultó el de mayor rendimiento (228.14 g/m2) y fue diferente del resto. No se
encontraron diferencias entre los tratamientos donde se empleó P. aeruginosa y P.
fluorescens, pero estos sí difirieron de B. subtilis y B. cepacia. Los resultados entre
estos últimos no difirieron entre sí (Tabla 4.11).
79
Tabla 4.11. Efecto del tratamiento a la semilla con bacterias antagonistas y quitosana sobre
el rendimiento.
. Rendimiento g/m2
Tratamientos 2009 2011
B. cepacia 161,10 c 202 bc

B. subtilis 169,90 c 198 bc
P. aureginosa 207,40 b 195 c
P. fluorescens 201,48 b 229 a
Quitosana 228,14 a 214 ab
TMTD 146,60 d 175 d
Semillas sin tratar 133,30 d 155 e
EE 7,48 5,34
Medias con letras no comunes en el sentido de las columnas difieren para P<0.05 por la Prueba de
Duncan
En 2011 el tratamiento con P. fluorescens resultó ser el de mayor rendimiento sin
diferencias significativas con la Quitosana, pero sí con el resto de los tratamientos.
Este último no difirió de los tratamientos con B. cepacia y B. subtilis y estos a su vez
no difirieron de P. aeruginosa. Al igual que en el año anterior los menores
rendimientos se encontraron en las plantas provenientes de semillas sin tratar y en
las tratadas con TMTD.
Según Leifert et al. (1994) algunas cepas de Pseudomonas producen hormonas
reguladoras de crecimiento vegetal como etileno, auxina y citoquinina, las que
ejercen su efecto a muy bajas concentraciones y potencian el desarrollo de la planta.
Por su parte Trujillo et al. (2004) cuantificaron ácido 3-indol acético en cepas de
Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia, aisladas de la rizosfera del maíz,
en un rango de 8,1 a 20,5 miligramos/ mL de AIA, el cual es suficiente para lograr
efectos benéficos en la planta.
80
frijol.
4.5.2.1. Difusión en agar
El estudio del efecto in vitro de bacterias antagonistas sobre el crecimiento micelial
de M. phaseolina, R. solani y S. rolfsii mostró que todas las bacterias evaluadas
inhibieron el crecimiento micelial de los hongos estudiados (Tabla 4.12). Los
menores valores de inhibición se encontraron en M. phaseolina, los cuales oscilaron
entre 55,82 y 78,30 %. Los mayores valores de inhibición se encontraron en S. rolfsii
para P. aeruginosa, B. subtilis y B. cepacia con 100, 100 y 80.72 % respectivamente
y en R. solani para P. fluorescens y P. aeruginosa con 100 %.
Tabla 4.12. Crecimiento micelial in vitro de R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina en presencia

de bacterias antagonistas a las 72 horas.
Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial*
Tratamiento S. rolfsii R. solani M. phaseolina
B. cepacia 80.72 a 67.04 b 70.27 ab

B. subtilis 100.00 a 66.26 b 78.30 a
P. aeruginosa 100.00 a 100.00 a 55.82 b
P. fluorescens 40.97 b 100.00 a 61.42 ab
EE (±) 7.76 5.75 3.62
CV (%) 13.30 23.20 18.20
Valores con letras desiguales en una misma columna difieren para P<0.05 por la Prueba de
Duncan.
4.5.2.2. Determinación de la producción de metabolitos volátiles con actividad
antifúngica
81
No se encontró inhibición del crecimiento micelial en ninguno de los tratamientos en
estudio. Las bacterias evaluadas no inhibieron el crecimiento de los hongos en
estudio mediante la producción de metabolitos volátiles. Algunos trabajos han
descrito el efecto inhibitorio de los metabolitos volatiles producidos por bacterias
rizosféricas sobre hongos del suelo (Zuo et al., 2007; Liu et al., 2008).
Rodríguez (2002) encontró, con el empleo de P. fluorescens y Bacillus subtilis
porcentajes de inhibición del crecimiento de 70 y 60 % sobre R. solani. De la primera
aisló los metabolitos diacetilfloroglucinol y Fenacil-1-carboxilo, con efecto antibiótico.
Resultados similares, en cuanto al empleo de bacterias antagonistas en el control de
hongos fitopatógenos en experimentos in vitro obtuvieron Puopolo et al. (2004) y
Dhingra et. al. (2006) para Pseudomonas fluorescens contra R. solani y Fusarium
oxysporum, y Sosa et al. (2006) para Bacillus contra Sclerotium rolfsii y R. solani. Del
mismo modo Chen et al. (2004) encontraron que B. subtilis inhibió el crecimiento de
hongos del suelo como F. oxysporum, R. solani, S. rolfsii, F. moniliforme y F. solani.
Las bacterias antagonistas poseen en su mecanismo biocontrolador la producción de
metabolitos secundarios con acción antibiótica que afectan la viabilidad de los
hongos (Kimm et al., 1997), entre los que se destacan la subtilina (Miguel et al.
2000), metabolito antifúngico producido por B. subtilis, y otros polipéptidos, también
antibióticos, que actúan sobre la pared celular de los hongos (González Fragoso,
2002 y Montealegre, 2005). Mavrodi et al. (2006) y Picard y Bosco (2008) señalaron
que especies de Pseudomonas y otros géneros bacterianos sintetizan fenazinas, que
incluyen alrededor de 50 metabolitos secundarios pigmentados, los cuales ejercen
82
efecto antifúngico. Audenart et al. (2002) encontraron una interacción entre las
fenazinas, piocianinas y el sideróforo pioquelin, producidos por P. aureginosa en la
habilidad de la bacteria de inducir resistencia adquirida. Basurto-Cadena, et al
(.2010) reportó para B. subtilis la presencia de sustancias de origen enzimático o de
toxinas que son producidas por la cepa bacteriana, que lograron lisar el micelio R.
solani. La desintegración de las paredes miceliales dio como resultado la destrucción
total de las estructuras celulares del hongo.
4.5.3. Efecto in vivo del tratamiento a la semilla con bacterias antagonistas y
quitosana sobre la severidad de la enfermedad causada por hongos del suelo
patógenos al frijol
En el experimento desarrollado en condiciones semicontroladas, el tratamiento de
semillas con bacterias antagonistas y Quitosana redujo en más de un 45 % la
severidad de las enfermedades causadas por S. rolfsii, R. solani y M. phaseolina en
Bat 482, comparado con las plantas provenientes de semillas sin tratar, con
diferencias estadísticas significativas. Aunque esta reducción fue significativa para
cada uno de los hongos estudiados, los porcentajes de reducción del tejido afectado,
alcanzados con cada una de las bacterias empleadas, así como con Quitosana y con
el control TMTD no mostraron diferencias entre sí para ninguno de estos hongos.
Las afectaciones de raíces y tallos observadas en las plantas cuyas semillas de
procedencia no recibieron ningún tratamiento y el suelo fue inoculado fueron de
91,10, 100 y 91,10 % para S. rolfsii, R. solani y M. phaseolina respectivamente,
83
mientras que las provenientes del control TMTD mostraron afectaciones de 28,80,
15,52 y 11,10 % para estos mismos patógenos (Tabla 4.13).
Tabla 4.13. Influencia del tratamiento a la semilla con Bacterias antagonistas y Quitosana
sobre la severidad de la enfermedad causada por hongos del suelo patógenos
al frijol (variedad 482).
% de tejido afectado
S. rolfsii R. solani M. phaseolina
Medias Rangos Medias Rangos Medias Rangos
Tratamiento
reales Medios reales Medios reales Medios
Semillas sin tratar 91,10 30,50 a 100 30,50 a 91,10 30,50 a

TMTD 28,80 15,37 b 15,52 17,00 b 11,10 10,50 b
B. cepacia 24,40 12,50 b 19,95 13,37 b 11,10 10,50 b
B. subtilis 33,27 17,62 b 19,97 15,50 b 19,95 17,75 b
P. aeruginosa 42,15 21,25 b 19,97 16,02 b 15,52 17,75 b
P. fluorescens 28,80 16,00 b 24,40 13,37 b 15,52 14,12 b
Quitosana 29,85 16,52 b 19,97 16,02 b 28,25 20,37 b
Medias con letras no comunes en el sentido de las columnas difieren para P<0.05 por la prueba de
comparación de rangos múltiples.
Resultados de trabajos reportados anteriormente, en condiciones de casa de cultivo,
indicaron la significativa variación de la susceptibilidad de plántulas de arroz ante el
ataque de R. solani. Este hongo fue más agresivo en plantas cuyas semillas de
procedencia no fueron tratadas con P. fluorescens (Niknejad, 2004). De igual manera
Jayaraj et al. (2004) lograron reducir esta misma enfermedad con aplicaciones
foliares de B. subtilis y comprobaron que esta bacteria dispara mecanismos de
defensa contra R. solani en arroz. También en frijol, la bacterización de la semilla
redujo las enfermedades foliares de origen bacteriano (Alstrom, 1991, De Meyer y
Höfte, 1997). Especies no patogénicas de Pseudomonas han sido asociadas con
84
rutas metabólicas implicadas con la inducción de resistencia (Ongena et al., 2004 y
2005).
Después de analizados los experimentos, relacionados con el efecto del tratamiento
a las semillas con bacterias antagonistas y Quitosana sobre la incidencia y
agresividad de hongos del suelo patógenos al frijol, concluimos que las cepas
utilizadas tienen un excelente potencial para ser usadas como agentes
biocontroladores de R. solani, S. rolfsii y M. phaseolina, en condiciones de campo.
Consideraciones generales
Los hongos fitopatógenos que habitan en el suelo constituyen un grupo importante
de microorganismos que afectan numerosos cultivos entre los que destaca el frijol
común. Los resultados obtenidos en la investigación mostraron que las especies
fitopatógenas que afectaron al cultivo fueron Rhizoctonia solani, Rhizoctonia
binucleada, S. rolfsii y M. phaseolina, con preferencia por las variedades de testa
blanca, que resultaron las más afectadas. Las especies de Rhizoctonia identificadas
se diferenciaron en cuanto a la parte de la planta afectada, ya que R. solani atacó
tallos y raíces, mientras que R. binucleada solamente atacó raíces, aspectos
importantes a tener en cuenta en los estudios sobre esta enfermedad. Las
variedades de testa negra fueron las menos afectadas y mostraron mayores
cantidades de compuestos fenólicos en la testa de las semillas. La cantidad de
fenoles encontrados difirió significativamente de las semillas rojas y blancas. En
estas últimas fueron cuantificadas las menores cantidades de estos compuestos.
Dichos compuestos están involucrados en mecanismos de resistencia bioquímica
85
contra enfermedades causadas por hongos del suelo. La relación del color de la testa
de las semillas de frijol con la respuesta de estas variedades al ataque de hongos
patógenos del suelo es similar a las encontradas en otros cultivos como el caupí. En
este caso se han encontrado las mayores afectaciones, por hongos que habitan en el
suelo, sobre variedades de testa blanca. Por otro lado, resultados coincidentes
también han sido reportado con estudios sobre insectos plagas en el cultivo. Este
aspecto debe ser considerado en futuras investigaciones.
Otro resultado importante de esta tesis fue la relación encontrada entre la incidencia
de M. phaseolina en frijol y el tipo de suelo. De los dos suelos estudiados, este hongo
se encontró únicamente en el suelo Ferralítico y de los hongos encontrados en el
mismo, fue el de mayor incidencia. En este tipo de suelo M. phaseolina es un
patógeno muy importante ya que la poca retención de agua del mismo garantiza su
sobrevivencia. Por otro lado el incremento de las temperaturas de los suelos, los
bajos contenidos de materia orgánica y la baja fertilidad química también propiciaron
condiciones de estrés en la planta. El hongo aprovecha los periodos fisiológicamente
estresantes para la planta, floración y maduración, para causar las mayores
afectaciones, sobre todo si coinciden con periodos de sequía por falta de
precipitaciones o riegos. En su conjunto, todos estos factores potencian la
peligrosidad de este hongo y aumentan la predisposición al ataque. Además, las
malas prácticas, relacionadas con rotación de cultivos que emplean hospedantes de
M. phaseolina, también contribuyen a incrementar los riesgos de ataque de este
organismo. Actualmente, la extensión en el país de cultivos como sorgo y girasol,
hospedantes de Macrophomina, que generalmente preceden al de frijol constituyen

86
un peligro potencial para un adecuado manejo de este hongo ya que estas prácticas
contribuyen a aumentar el inóculo en el suelo y la sobrevivencia del hongo.
En esta investigación R. solani y S. rolfsii incidieron sobre las plantas cultivadas tanto
en suelos Ferralíticos como en Pardo Sialítico.
La presencia de una u otra especie fitopatógena en el suelo está en dependencia de
múltiples factores. Sin embargo, el suelo juega un papel fundamental. Sus
características físico-químicas y microbiológicas pueden hacer de él un medio
conductivo o supresivo para una enfermedad. La actividad del hombre tiene un
impacto importantísimo sobre las características antes mencionadas. Este puede
contribuir a incrementar el efecto supresivo de un suelo mediante un manejo
adecuado de este. La aplicación de organismos antagonistas tales como las
bacterias P. fluorescens. B. cepacia, B. subtilis, P. aureginosa y sustancias naturales
como la quitosana, así como con el empleo de enmiendas orgánicas y la introducción
de rhizobacterias promotoras del crecimiento vegetal y hongos como las micorrizas
mejoraran el desarrollo, el crecimiento y la sanidad de la planta. Estos organismos
garantizan una adecuada nutrición de la planta e inducen resistencia contra
organismos patógenos, con el consecuente aumento de los rendimientos agrícolas.
Los hongos fitopatógenos que habitan en el suelo siempre existirán y del manejo del
agroecosistema, que incluye el suelo, la variedad, las labores agrotécnicas, el
empleo de organismos antagonistas, enmiendas orgánicas, sustancias naturales,
solarización, entre otros, sin descartar los productos químicos bien empleados,
dependerá que las poblaciones de estos se mantengan a niveles que no afecten las
87
producciones y los rendimientos. Todos estos elementos podrán aplicarse además,
en cultivos donde estos organismos causan pérdidas considerables.
88
5. CONCLUSIONES
1. Los hongos fitopatógenos del suelo que incidieron principalmente sobre el frijol
fueron Rhizoctonia spp., S. rolfsii y M. phaseolina.
2. Se determinaron por vez primera en la provincia de Villa Clara, las especies y
grupos de anastomosis de Rhizoctonia asociadas al frijol. En R. solani el único
presente fue el AG 4 HGI y para R. binucleada los grupos AG-F y AG-A.
3. Los aislados de R. solani causaron pudrición de raíces e hipocotilo, mientras
que los de binucleada solo causaron pudrición de las raíces.
4. La incidencia de Rhizoctonia spp, S. rolfsii y M. phaseolina sobre las
variedades de frijol estudiadas varió en función del color de las semillas. Las
variedades negras fueron las menos afectadas y en ellas se cuantificaron las
mayores cantidades de fenoles.
5. Rhizoctonia spp. y S. rolfsii incidieron en las plantas cultivadas tanto en suelo
Ferralítico como en Pardo Sialítico. La incidencia de cada uno de ellos fue
similar en ambos suelos. M. phaseolina solo incidió en el suelo Ferralítico.
6. La fertilización con micorrizas, bacterias promotoras del crecimiento vegetal y
compost, redujo la incidencia de R. solani en un 2 % y la de S. rolfsii entre un
4 y un 5 %, e incrementó el rendimiento en más de un 40 %.
7. El empleo de bacterias antagonistas y Quitosana redujo la incidencia de R.
solani en un 1,3 % y entre 3,7 y 5,0 % la de S. rolfsii e incrementó el
rendimiento agrícola del cultivo entre un 26 y 53 %.
8. Bajo condiciones semicontroladas, el tratamiento de semillas con bacterias
antagonistas y quitosana redujo en más de un 45 % la severidad de la
89
pudrición de raíces y tallos causadas por Rhizoctonia spp., S. rolfsii y M.
phaseolina en frijol.
90
6. RECOMENDACIONES
1. Profundizar los estudios relacionados con la interacción genotipo-patógeno-
suelo, así como ampliar los estudios sobre los efectos supresivos de los
suelos empleados en el cultivo del frijol en Villa Clara con el objetivo de
elaborar una estrategia de manejo integrado que permita disminuir las
pérdidas en el cultivo del frijol.
2. Continuar estudios sobre la fertilización orgánica con el empleo del compost
así como el uso de micorrizas y de Rhizobium spp. encaminados a precisar
las dosis y técnicas de aplicación.
3. Precisar en el tratamiento de semillas con bacterias antagonistas la
concentración a emplear así como las técnicas de aplicación.
4. Ampliar los estudios sobre el uso de la Quitosana a dosis inferiores y
superiores a 0,01 % tanto en tratamiento a la semilla como al suelo.
5. Promover el efecto supresivo del suelo mediante el uso de enmiendas
orgánicas, bacterización de semillas con organismos antagonistas o bacterias
promotoras del crecimiento vegetal.
91
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Biochemistry 39: 2371-2379.

ANEXOS
Anexo 1. Escala para la evaluación de la severidad de las enfermedades causadas

por Macrophomina phaseolina y Sclerotium rolfsii en frijol común.
Grado Descripción
1 Sin síntomas visibles de la enfermedad
3 Pudrición carbonosa restringida a los cotiledones. En Sclerotium rolfsii, 1

% del hipocotilo con síntomas. Tejidos inferiores del tallo con lesiones
pequeñas y susceptibles.
5 Aproximadamente 10 % del hipocotilo y tejidos inferiores del tallo con

lesiones, acompañadas con estructuras de fructificación del hongo.
7 Aproximadamente 25 % del hipocotilo y tejidos inferiores del tallo con

lesiones, acompañadas con estructuras de fructificación del hongo
9 Aproximadamente 50 % o más del hipocotilo y tejidos inferiores del tallo

con lesiones, y gran número de estructuras de fructificación del hongo.
Anexo 2. Características físico-químicas de los extractos acuosos de testa de

semillas del frijol común.
Variedad TDS (mg/L) Conductividad Salinidad

(mScm -1 )
Tomeguín 93 428 479 0
Delicias 364 239 268 0
Bat 482 246 278 0
Anexo 3. Escala para la evaluación de la severidad de las enfermedades causadas
por R. solani en frijol común
Grado Descripción
1 Sin síntomas visibles de la enfermedad
3 Decoloración ligera, ya sea sin lesiones necróticas; o aproximadamente

un 10 % del hipocotilo y la raíz cubiertos con lesiones
5 Aproximadamente 25 % de los tejidos del hipocotilo y raíz cubiertos con

lesiones, pero lo tejidos se conservan firmes y hay poco deterioro del
sistema radical. Síntomas fuertes de decoloración.
7 Aproximadamente 50 % de los tejidos del hipocotilo y raíz cubiertos con

lesiones, que se combinan con ablandamiento, pudrición y reducción
considerable del sistema radical.
9 Aproximadamente 75 % o más de los tejidos del hipocotilo y raíz con

estados avanzados de pudrición, en combinación con una reducción
severa del sistema radical.
Anexo 4. Análisis de varianza de la incidencia de tres hongos fitopatógenos sobre la

variedad Bat 482 en dos tipos de suelos
Factor Grados de Cuadrado medio Nivel de

libertad significación
Tipo de suelo 1 180.500 .000
Especie fitopatógena 2 70.875 .000
Tipo de suelo*Especie fitopatógena 2 210.125 .000

Anexo 5. Características de los suelos estudiados
Localidad Remedios Santa Clara

Soil Taxonomy/1992 Rhodic Eutrustox Mollic Eutroppept
FAO-UNESCO/1990 Ferralsol Cambisol
Hernández et al. (1999) Ferralítico Pardo Sialitico
pH KCl 5,90 6,38
pH H 2 O 6,57 7,08
CIC (cmol kg-1 ) 14,0 33,70
MO % 2,23 2,32
P 2 O 5 (mg 100g-1 ) 34,20 35,70
K 2 O (mg 100g-1 ) 13,36 22,60
Ca (cmol.kg-1 )
Mg (cmol.kg-1 )
CIC (cmol.kg-1 ) 14,00 33,70
FE % 69,30 71,70
AE % 65,98 66,95
Arcilla % 72,5 62,00
Perm (log K) 2,09 2,14
Analisis microbiológicos (UFC/mL)
Bacterias (106) 2,60 107 3,2 107
Hongos (105) 1,99 106 4,2 105
Actinomicetos (105) 1,05 105 2,1 105
Azotobacter (104 2,15 105 3,15105
Anexo 6. Caracterización química del compost elaborado a partir residuos de centros

de acopio.
N P C MO Ca Mg K Zn Cu Fe
pH
% C/N ppm
7.2 2.92 0.44 28.0 48.2 9.58 778.4 54.2 74.40 11.20 0.15 16.14
Anexo 7. Variables climatológicas 2007 - 2008. Estación 78343. Santa Clara, Villa
Clara.
Temperatura (oCelsius) HR Acumulado Días con

Mes Máxima Mínima Media (%) pluvial precipitaciones
(mm)
2007
Enero 27,80 18,60 23,22 94,83 26,4 5
Febrero 28,70 17,46 23,09 95,32 0,0 0
Marzo 29,01 18,88 23,95 94,12 17,0 2
Abril 30,50 18,54 24,54 96,33 59,2 6
2008
Enero 27,20 17,02 22,11 93,48 34,0 3
Febrero 29,00 18,15 24,01 94,68 15,1 4
Marzo 29,25 18,56 23,85 92,29 43,0 4
Abril 30,04 18,50 24,28 90,82 102,8 8
Anexo 8. Variables climatológicas 2009,2011. Estación 78343. Yabú. Santa Clara,

Villa Clara.

(mm)
2009
Enero 26,36 15,86 20,27 78,83 7,6 5
Febrero 25,78 15,34 20,26 90,21 12,5 4
Marzo 28,11 16,33 22,22 93,12 25,3 8
Abril 31,18 19,06 25,12 92,06 96,6 8
2011
Enero 27,02 16,23 21,03 94,13 92,6 3
Febrero 28,20 17,24 22,72 95,56 19,6 2
Marzo 29,05 16,86 22,93 94,17 16,1 6
Abril 32,40 19,60 26,00 92,90 98,2 3
Anexo 9. Variables climatológicas 2009. Estación 78348. Caibarién, Villa Clara.

(mm)
Enero 25,44 16,87 22,05 88,19 21,1 4
Febrero 24.56 18,50 21,53 80,03 5,1 5
Marzo 25,66 18,99 22,32 84,00 32,0 9
Abril 29,21 21,32 25,27 80,06 25,6 9

Incidencia de Rhizotonia Sclerotium

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

       !"

INCIDENCIA DE Rhizoctonia spp., Sclerotium rolfsii Y

Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas

Autor. Ing. Manuel Díaz Castellanos, M. Sc.

una vez en la vida,

o se sienta en su balcón tranquilamente,

a contemplar el desfile de los triunfadores.

A la Doctora Maryluz Folgueiras, por su paciencia y contribución a la mejora del documento.

Al Doctor Michel Leiva Mora, por su contribución, incondicionalmente, a la mejora del

A Marianela Sibat, del Centro de Documentación de la FCA.

Al Máster Rafael Sosa, por sus lanzamientos indescifrables.

Al Máster Ray Espinosa por ayudarme a descifrar esos lanzamientos.

A los estudiantes y maestrantes que colaboraron con sus investigaciones a la realización de

Al Dr. C. Luis A. Barranco y a Carmen Mendoza, del Vicedecanato de Investigaciones y

A la Dirección de la Facultad de Ciencias Agropecuarias

A mis compañeros del Departamento de Agronomia

Y por último, un agradecimiento especial a mi familia, por su comprensión y apoyo.

determinar el efecto de la composición varietal, el tipo de suelo, la fertilización y el

tratamiento de semillas con bacterias antagonistas y Quitosana sobre la incidencia

de estos hongos, se condujeron varios experimentos en el período comprendido

phaseolina fueron las especies que incidieron sobre el frijol y su porcentaje de

composición química de la testa de la semilla mostraron diferencias significativas en

cuanto al contenido de compuestos fenólicos entre las semillas blancas, rojas y

negras. Estas últimas contenían la mayor cantidad de fenoles. El recubrimiento de

en el fondo del surco y el empleo de bacterias antagonistas y quitosana redujeron las

afectaciones por hongos del suelo e incrementaron el rendimiento del cultivo. M.

phaseolina se asoció más a los suelos Ferralíticos. El manejo de la variedad, el uso

de productos orgánicos y biofertilizantes, así como el empleo de organismos

antagonistas y sustancias elicitoras en el tratamiento a la semilla, son una alternativa

cultivos donde estos organismos causan afectaciones.

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. .........................................................................................................5

2.1. Rhizoctonia solani Kühn ........................................................................................................7

2.2. Sclerotium rolfsii Sacc ..........................................................................................................11

2.3. Macrophomina phaseolina (Tassi.) Goid. .......................................................................13

2.4. Métodos de lucha. ..................................................................................................................15

2.4.1. Control cultural ................................................................................................................16

2.4.1.1. Enmiendas orgánicas ............................................................................................16

2.4.1.2. Rotación de cultivos. ..............................................................................................16

2.4. 1.3. Labores agrotécnicas ............................................................................................17

2.4.1. 4. Resistencia varietal ................................................................................................18

2.4.2. Control químico ....................................................................................................................18

2.4.3. Solarización .....................................................................................................................19

2.4.4. Control biológico.............................................................................................................19

2.4.5. Control con sustancias naturales .........................................................................................21

2.4.6. Control Integral ....................................................................................................................22

3. MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................................................25

3.1. Aislamiento, identificación y patogenicidad de hongos del suelo causantes de

3.1.1. Aislamiento, identificación y agresividad de Rhizoctonia spp. ..........................25

3.1.2. Aislamiento, identificación y patogenicidad de Sclerotium rolfsii Sacc..........30

3.1.3. Aislamiento, patogenicidad y agresividad de aislados de Macrophomina

3.2.1.1. Ensayos biológicos .................................................................................................36

3.2.1.2. Tamizaje fitoquímico ...............................................................................................37

3.2.1.3. Cuantificación de compuestos fenólicos en extractos acuosos obtenidos

3.4. Efecto de la fertilización sobre la incidencia de hongos fitopatógenos del suelo

3.4.1. Influencia de la fertilización sobre el rendimiento agrícola .................................40

3.5.1. Efecto de los tratamientos sobre el rendimiento agrícola y sus componentes.

3.5.2. Efecto in vitro de Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis, Pseudomonas

3.5.2.1 Difusión en agar ........................................................................................................42

3.5.2.2 Determinación de la presencia de metabolitos volátiles con actividad

3.6. Efecto in vivo del tratamiento a la semilla con bacterias antagonistas y

3.7. Análisis de los suelos ...........................................................................................................45

3.7.1. Análisis químico....................................................................................................................46

!"