DISCUSIÓ N No 1

TÉCNICAS EN BIOLOGI ́A CELULAR Y MOLECULAR

OBJETIVO GENERAL

Desarrollar algunas técnicas empleadas en biologi ́a molecular para el estudio de la célula y sus
componentes.

OBJETIVOS ESPECI ́FICOS

1.Explicar en qué consisten o a que se denominan técnicas de Biologiá Molecular.

se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o
extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar
una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en
bacterias u otros vectores como virus , PCR Etc.

2. Enumerar las utilidades que brindan estas técnicas en el campo de la medicina.

1- Diagnosticó de enfermedades hereditarias

2- Diagnóstico de contaminación bacteriana en los alimentos
3- Diagnóstico viral o de infección viral
4- Mejoramiento genético de una especie
5- Diagnóstico de identidad forense

3. Explicar los pasos, usos, aplicaciones, ventajas y desventajas de cada una de las
siguientes técnicas

- Cultivo Celular
es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas, pueden
cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular"
Cómo se cultivan las células?
La mayori ́a de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e
incluso presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de
plástico y con medios de cultivo adecuados. Asi ́, las células pueden ser observadas
continuamente bajo el microscopio o analizadas bioqui ́micamente, para estudiar los
efectos del agregado o remoción de moléculas especi ́ficas, como hormonas o factores
de crecimiento. Además, se pueden estudiar las interacciones entre células, cultivando
en la misma placa más de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con
cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro” (“en vidrio”), para diferenciarlos
de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o experimentos “in vivo”
(“en organismo viviente”)

se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas

pluricelulares, especialmente células animales.
Métodos generales y parámetros más importantes en el seguimiento de un cultivo
celular
-Multiplicación
-Tripsinización
-Viabilidad y recuento celular -Contaminaciones -Congelación y descongelación
Microscopio invertido
Se aplica para la manufactura de vacunas virales y diversos productos biotecnológicos.
Los productos biológicos producidos mediante la tecnología del ADN recombinante en
cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintéticas, inmunobiológicos (anticuerpos
monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancerígenos).

Ventajas
-Permiten un control preciso y fino del medio ambiente

En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: Físico-químicos (pH,
temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial...), y fisiológicos
(hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...)

- Caracterización y homogeneidad de la muestra

Las células en cultivo de una línea celular, o de una línea continua son homogéneas,
con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con facilidad un número
elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de
heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de
experimentación.

- Economía
Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en
volúmenes reducidos, y con un acceso directo de las células a la droga las
concentraciones requeridas son mucho más bajas que en el animal completo.

desventajas

- Técnica sensible
El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes
más habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas...) y además dado que
proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una
compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto
supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual
es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal calificado para
su manipulación.

- Cantidad y costo
El costo de producción de 1 g de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al
obtenido en el animal. Asimismo existe una limitación de producción, que es del orden
de 10 g de células en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere
instalaciones de tipo industrial.

- Inestabilidad
Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la
dotación cromosómica aneuploide. La población celular puede variar su composición si
alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente
superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de
una generación a la siguiente. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables
que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o
después de un determinado número de generaciones.
 -La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de
animales de experimentación
El cultivo celular no puede reemplazar siempre el ensayo "in vivo" pero es una
alternativa válida en muchas situaciones.

Fraccionamiento celular
-
es una técnica de laboratorio, tras la disgregación, en la que se intenta reagrupar las
partículas, generalmente células u orgánulos celulares, en función de sus propiedades
biofísicas.
Pasos, Existen tres etapas principales en el fraccionamiento celular:

1. Disgregación o rotura (homogeneización) de las células y liberación de los orgánulos.

El tejido se homogeneiza, normalmente en una solución tampón isotónica usando una

variedad de mecanismos (moler, picar, triturar, cambios de presión, choque osmótico,
congelación y descongelación, homogeneización con ultrasonidos...)
La solución se homogeneiza en una solución isotónica para detener el daño osmótico, con una
solución tampón para regular el pH, y a una temperatura muy baja para evitar daños
enzimáticos. Los orgánulos se mantienen en frío, en un medio isotónico y tamponado.

El resultado ahora es una pasta fina de líquido, el homogenato de células, que consta de
células intactas y componentes celulares. Con un cuidadoso trabajo se mantienen intactos los
orgánulos celulares, siendo funcionales en gran medida.

2. Macrofiltración.

Este paso puede no ser necesario dependiendo de la fuente de las células. Si se trabaja con
tejidos animales, es probable que se liberen restos de tejido conectivo que debe ser eliminado.
Habitualmente, la filtración se realiza ya sea mediante el vertido a través de un tejido poroso o
con un filtrado por succión empleando el correspondiente filtro de cerámica con un tamaño de
poro adecuado.

3. Purificación de componentes celulares o fraccionamiento celular propiamente dicho:

Se aplican técnicas de centrifugación diferencial y en gradiente.

Se realiza por centrifugación en gradiente de densidad o por centrifugación diferencial,

aumentando secuencialmente la velocidad de giro y la fuerza gravitacional, dando como
resultado una separación secuencial de los orgánulos de acuerdo con su densidad.

En la centrifugación en gradiente de densidad se sitúa el homogeneizado en un medio con

un gradiente de densidad y se centrifuga. Ahora los componentes de la célula se separan,
migrando cada uno a la zona de densidad similar. Este método es útil si se desea aislar
componentes celulares de tamaño semejante con una diferencia de densidad baja.
 En la centrifugación diferencial es un proceso de separación que puede separar los
componentes celulares por centrifugación repetida, a velocidades cada vez mayores. En
estas condiciones, los componentes de la célula se separan en función de su tamaño y
densidad: los componentes de gran tamaño y más densos migran más rápidamente hasta
el fondo a velocidades relativamente bajas y forman un sedimento.

Se usa para el estudio de las diferentes estructuras intracelulares, orgánulos específicos, o

para investigar posibles asociaciones entre estas estructuras con ácidos nucleicos o proteinas.

Ventajas
Aislamiento
Con el fraccionamiento de la célula, biólogos pueden aislar o purificar organelos específicos
para el estudio adicional. Pueden realizar experimentos con muestras puras de estos
orgánulos que serían imposible o más difícil con la célula todo intacta. Las mitocondrias, por
ejemplo, podrían ser purificadas para su uso en experimentos probando cómo ciertos
compuestos afectan la cadena de transporte de electrones o fosforilación oxidativa (ambos
son parte del proceso que almacena la energía cosechada de la glucosa en una forma útil para
la célula).

Fiabilidad
Se han desarrollado métodos confiables para aislar a determinados tipos de organelos de las
células. Por lo general un homogeneizado o mezcla se prepara de una muestra de tejido. El
homogeneizado es un poco como una sopa había preparada por fractura abierta todas las
células por lo que su contenido se convierte mezclado. A continuación, el homogeneizado
puede ser centrifugado, hecho girar en un tubo de ensayo o tubo de la centrífuga en una
máquina con un rotor girante que generará el contenido de cada uno hacia fuera del tubo. Este
proceso separa el contenido sobre la base de su densidad. Variando la velocidad de la
centrifugadora o la longitud de tiempo para que los contenidos son centrifugados, científicos
pueden recuperar una muestra de los organelos que quieren estudiar.

Desventajas

Muerte de la célula
Preparando un homogeneizado necesariamente implica matar a las células. En muchos casos,
esto puede no ser una desventaja; Si se trata de un científico para el estudio de los organelos
dentro de la célula, la muerte de la célula es inmaterial. Por otra parte, una vez que las células
están muertas no es posible ver eventos que normalmente se producirían en una célula viva en
tiempo real. Los científicos suelen utilizan otras técnicas, como el etiquetado con una proteína
fluorescente, para seguir lo que ocurre en células vivas.

Tiempo
Al igual que muchos procedimientos en laboratorios biológicos, fraccionamiento celular es
algo lento. Las muestras se deben girar en la centrifugadora durante un período bastante largo
de tiempo para obtener buena separación; Además, debe a menudo ser girar varias veces,
dependiendo del orgánulo que están tratando de aislar. Después de cada vuelta debe se
decantó el sobrenadante (el líquido por encima de los restos sedimentados o precipitado en el
tubo de centrífuga) sin verter el precipitado y el precipitado debe ser nuevamente suspendido
si contiene el componente de interés
-Centrifugación diferencial

La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente

densidad por medio de una fuerza giratoria. La fuerza centrífuga es provista por una máquina
llamada centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotación que origina
una fuerza que produce la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad.

Centrifugación diferencial

Es el método de separación más común utilizado hoy en día para fraccionar las células; es
decir, se utiliza generalmente para separar las células en sus diferentes organelos, para luego
hacer un análisis posterior de sus partes.
Este tipo de técnica no es útil para separar moléculas. En cambio, se puede emplear para
realizar la separación de, por ejemplo, los orgánulos celulares, de células, entre otras
partículas.
Pasos, para La centrifugación en el laboratorio se realiza por medio de un aparato llamado
centrífuga, en el cual se colocan tubos de ensayo que contienen la mezcla; la centrífuga gira
con tal velocidad que separa el sólido y lo deposita en el fondo del tubo. Luego se efectúa una
filtración o una decantación. Este procedimiento, es muy útil cuando el sólido que está
disperso en el líquido es muy fino y no sedimenta.

Ventajas
Cuando se requiere separar componentes por medio de la centrifugación por sedimentación,
se requiere la realización de varias centrifugaciones; en las que cada vez hay que ir
incrementando la fuerza centrífuga para separar las partículas que quedan en el sobrenadante
y que tienen una menor tasa de sedimentación. Hay otros procedimientos que separan varias
capas en una sola centrifugación, y por ende son más rápidos

Desventajas
es propenso a la contaminación. Este problema se ha solucionado lavando el sedimento, para
luego repetir el procedimiento de centrifugación y filtrado de la muestra. A diferencia de este
método, los procedimientos de centrifugación por gradientes de densidad, tienen la gran
ventaja de permitir realizar una separación más precisa de las partículas, logrando así aislar los
componentes con un mínimo de contaminación.

Otra desventaja es que requiere que los componentes que se van a centrifugar, tengan una
fuerte diferencia respecto a la velocidad de sedimentación; pues cuando son muy parecidas,
estos componentes tienden a sedimentar juntos y se hace muy difícil separarlos.
- Electroforesis en gel

es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como ARN
y proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través
de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas
se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se
separan unas de otras.
Todas las moléculas de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa. Debido a esto, la
electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño. La
electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ADN están presentes en una
muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros.
La separación de moléculas en la electroforesis se basa en la carga (sobre lo que se aplica la
fuerza) y la sección transversal efectiva de la molécula en el estado que se encuentre: plegada,
desnaturalizada, ligada a otras moléculas, etc.
Un conjunto de fragmentos de ADN se separa por tamaño porque todos pertenecen al mismo
tipo de molécula. En general, la única diferencia importante entre los distintos fragmentos
debería ser su longitud.
Que significa Electroforesis?

El sufijo foresis significa "migración" o "movimiento". El prefijo electro nos dice que estamos
utilizando electricidad para hacer que las moléculas migren.

¿Qué es un gel?

Como su nombre lo indica, en la electroforesis en gel participa un gel: un bloque de material

similar a la gelatina. Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacárido
llamado agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas. Cuando la agarosa se
calienta en una solución amortiguadora (agua mezclada con algunas sales) y deja enfriar, se
forma un gel sólido ligeramente blando. A nivel molecular, el gel es una matriz de moléculas
de agarosa que se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y que forman pequeños
poros.
En un extremo, el gel tiene muescas en forma de ranuras llamadas pozos, que son donde se
colocarán las muestras de ADN

Puntos más importantes:

• La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su
tamaño.
• Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una
corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
• Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo.
Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los
fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.
• Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden
verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo
tamaño.
APLICACIONES

Ácidos nucleicos
En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es
debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN
dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es inversamente
proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN y ARN (una sola cadena), dichas
moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma más complicada, según la
estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan
romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son
empleados para 'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración
dependa únicamente y exclusivamente del tamaño y no de la estructura formada tras el
plegamiento.
Proteínas
Las proteínas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus
velocidades de migración no son similares entre las proteínas. Incluso puede que no migren ni
al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoeléctrico). En estos casos, las
proteínas se desnaturalizan mediante la adición de un detergente como el dodecilsulfato
sódico/dodecilfosfato sódico (SDS/SDP) y un agente reductor como el 2-mercaptoetanol. Los
detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a través
del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas
que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación carga/masa
similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la proteína
en sus sub-unidades. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria y
cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su estructura
terciaria ni a su interacción con otras macromoléculas. Así, los más grandes se desplazan más
lentamente.

VENTAJAS
Costo
Correr un gel de electroforesis es una herramienta rentable para dactilar. Hay una variedad de
tamaños para elegir dependiendo de la cantidad de muestras de sujeto y la frecuencia relativa
de la máquina se está ejecutando. Algunas máquinas son del tamaño de una novela del libro
en rústica y otros son del tamaño de una tabla. El medio usado para el gel es otro elemento
rentable. Un tipo común de gel es el gel de agarosa, que se hace sobre todo de un tampón.
Esta solución se necesita para llevar a cabo la electricidad de un lado a otro, y generalmente ha
reciclado para otra electroforesis.

Facilidad de uso
Estudiantes universitarios se hacer y ejecutar su propio electroforesis en gel en un curso típico
de la biología. Ya que es uno de los aparatos utilizados en un laboratorio de biología, también
es una de las más fáciles de usar. Un gel se hace usando una fórmula especificada, que puede
calcularse antes de tiempo. Después de cargar las muestras, el aparato se cubre con un escudo
de seguridad, los electrodos se ponen en su lugar y la corriente eléctrica pasa a través de la
máquina. La única parte complicada de la operación es saber cuándo parar la máquina.
Algunos aparatos tienen temporizadores para apagar la máquina antes de que las muestras
escurr el gel.
Muestra recuperación
Un gel de agarosa tiene las ventajas de ser capaces de recuperar la muestra de ADN después
de la prueba se ejecuta. El gel desnaturaliza el ADN hasta el punto que es inutilizable. En
dactilar, pueden hacerse una electroforesis para separar los fragmentos. Los fragmentos se
pueden cortar y aislados para realizar otra prueba. Sin embargo, en algunos casos los
fragmentos de ADN pueden derretirse debido a la corriente. En este caso, la muestra es capaz
de recuperarse y la colocación del fragmento de ADN en el gel puede ser alterada de donde
realmente debe estar.

DESVENTAJA
Una desventaja en el uso de una electroforesis en gel de DNA fingerprinting es que los
fragmentos deben ser de una manera específica. Enzimas de restricción son proteínas que van
a cortar una hebra de ADN en un sitio muy específico, una secuencia de codificación
específica. Hay un montón de enzimas de restricción en el mercado, pero sólo se cortaron
donde hay un sitio de reconocimiento. Esto significa que podría o no podría ser un sitio
específico de una persona a otra. En este sentido, la herramienta del ADN fingerprinting de
electroforesis en gel es sólo tan buena como la enzima de restricción utilizada. Como se
utilizan más las enzimas, se producen fragmentos más, que dan más información para el
análisis.

- ULTRACENTRIFUGACIÓN
Es una Técnica que se utiliza para separar los componentes de una solución según su peso. El
proceso consiste en someter la solución a un campo gravitatorio suficientemente elevado
haciendo girar la muestra a más de 100000 revoluciones por minuto durante un tiempo
prolongado para que los distintos componentes se ordenen por capas.
La centrifugación diferencial es un procedimiento común en microbiología y citología, usado
para separar ciertos orgánulos de su respectiva célula para un análisis posterior de partes
específicas de las células. En el proceso, primero se homogeniza una muestra de tejido para
romper las membranas celulares y mezclar los contenidos de las células. Luego, esta mezcla
homogénea es sometida a repetidas centrifugaciones, cada vez removiendo el precipitado, e
incrementando la fuerza centrífuga. Finalmente, la purificación debe ser hecha por la
sedimentación de equilibrio, y la capa deseada es extraída para un futuro análisis.

La separación está basada en el tamaño y la densidad, donde las partículas más grandes y
densas son precipitadas en centrifugaciones de poca fuerza. Por ejemplo, las células
completas no homogenizadas serán precipitadas en centrifugaciones con poca fuerza y en
cortos intervalos como 1,000g por 5 minutos. Los fragmentos más pequeños de las células y
los orgánulos permanecen en el líquido sobrenadante y requieren más fuerza centrífuga y más
tiempo para precipitarse. En general, uno puede enriquecer (separar o concentrar) los
siguientes componentes de la célula, en orden de separación, con la presente aplicación:
1. Células completas y núcleos;
2. Mitocondria, lisosomas y peroxisomas;
3. Microsomas (vesículas del retículo endoplasmático); y
4. Ribosomas y citosoles.
-Reacción en cadena de la polimerasa

es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de
millones!) de una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que
le interese al experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un
investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el ADN de
la escena del crimen con los sospechosos.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que
pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se
puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros
experimentos.

Se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología

molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

La Taq polimerasa

la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN
mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente
se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se
aisló (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy
termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la que la ADN
polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR
gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas
repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.

Aplicaciones

se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene aplicaciones prácticas en

medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se utiliza para
amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del ADN de los pacientes (o de
ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede utilizarse para detectar el
ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente, es
posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de sangre o tejido.
Puntos más importantes:

• La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas copias de
una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
• La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y requiere de
cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés.
• En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que
permiten la producción de muchas copias de la región blanco.
• La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de forma
rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de ADN.

VENTAJAS clonación de adn

1- Rapidez y sencillez de uso

La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando equipos relativamente poco
sofisticados. Una reacción de PCR ti ́pica consiste en 30 ciclos de desnaturalización,
si ́ntesis y reasociación. Cada ciclo dura ti ́picamente de 3 a 5 minutos y se utiliza un
termociclador que lleva un microprocesador para programar los cambios de
temperaturas y el número de ciclos deseado. Esto supera ampliamente el tiempo
requerido para la clonación en células, que suele ser de semanas, o incluso meses. Por
supuesto, el diseño y si ́ntesis de los oligonucleótidos cebadores también lleva tiempo,
pero este proceso ha sido simplificado gracias a la aparición de programas
informáticos para el diseño de los cebadores, y a la proliferación de casas comerciales
especializadas en la si ́ntesis de oligonucleótidos por encargo. Una vez que se pone a
punto, la reacción puede ser repetida de forma sencilla.

2- Sensibilidad

́
La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades infimas de ADN diana,
incluso a partir de ADN contenido en una sola célula. Esta elevada sensibilidad ha
permitido el desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis molecular
y la aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense, diagnóstico, estudios de
paleontologi ́a molecular, etc) donde las muestras pueden contener muy pocas células.
Sin embargo, el hecho de que el método tenga una sensibilidad tan elevada significa
también que se deben extremar las precauciones para evitar la contaminación de la
muestra con ADN extrañ o.
3- Robustez.

La PCR permite la amplificación de secuencias especificaś de material que contiene

ADN muy degradado, o incluido en un medio que hace problemática su purificación
convencional. Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de
antropologiá y paleontologiá molecular, por ejemplo para el análisis de ADN
recuperado de individuos momificados y para intentar identificar ADN de muestras
fósiles que contienen poqui ́simas células de criaturas extintas hace ya mucho tiempo.
El método se ha empleado con éxito también para la amplificación de ADN de
muestras de tejidos fijadas con formol, lo cual ha tenido importantes aplicaciones en
patologi ́a molecular.
DESVENTAJAS clonación de adn

1- Necesidad de disponer de información sobre la secuencia del ADN diana

Para poder construir oligonucleótidos especi ́ficos que actúen como

cebadores para la amplificación selectiva de una secuencia
particular de ADN se necesita disponer de alguna información
previa sobre la propia secuencia a amplificar. Esto implica, por regla
general, que la región de interés ya haya sido parcialmente
caracterizada, a menudo mediante la aplicación de métodos de
clonación basados en sistemas celulares. Sin embargo, y para casos
concretos, se han desarrollado varias técnicas que reducen o incluso
hacen desaparecer esta necesidad de disponer de información
previa sobre la secuencia del ADN diana.

2- Tamañ o corto de los productos de la PCR

Una desventaja clara de la PCR como método de clonación de ADN

ha sido el tamañ o de las secuencias de ADN que permite clonar. A
diferencia de la clonación de ADN en células, donde pueden
clonarse secuencias de hasta 2 Mb, la información de que se
dispone sobre la mayor parte de secuencias clonadas por PCR sitúa
el tamañ o de los fragmentos clonados entre 0 y 5 Kb, tendiendo
hacia el extremo inferior. Los fragmentos pequeñ os se amplifican
muy fácilmente, pero conforme aumenta su tamañ o se hace más
difi ́cil obtener una amplificación eficiente. En la actualidad sin
embargo ya es posible amplificar secuencias por PCR de tamañ os
entre 20 y 40 Kb

3- Infidelidad en la replicación del ADN

La clonación del ADN en células pasa por la replicación del ADN in
vivo, proceso asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la
existencia, en la célula, de mecanismos de lectura y corrección de
errores. Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro la tasa de
errores cometidos durante el copiado se dispara.
4- Peligro de contaminación
La facilidad con que se amplifica el ADN exige evitar el peligro de
contaminación inherente al poder multiplicador de la reacción. En
un tubo en el que se ha realizado una reacción de PCR hay tal
cantidad de ADN, que al salir caliente del termociclador y abrir este,
el vapor alcanza el ambiente del laboratorio. "Si se pasa un papel
de filtro por los pomos de las puertas, o la superficie del
termociclador, se puede rescatar suficiente ADN como para obtener
una señ al".