INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

Práctica

Efecto del pH y la concentración en la intensidad

de la

fluorescencia de la riboflavina
OBJETIVOS
 Conocer el manejo de un florometro de filtros.
 Determinar el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de florescencia .
 Determinar el efecto de la concetracion de riboflavina en la intensidad de florescencia .

FUNDAMENTO
La fluorescencia se produce cuando una molécula absorbe luz (Longitud de onda de excitación), pasa
a un estado excitado y al retornar a su estado fundamental, emite luz (Longitud de onda de emisión);
la fluorescencia será por tanto la emisión de esa radiación. La energía de la radiación emitida es menor,
y por lo tanto, la longitud de onda es mayor que la de la radiación absorbida (540 nm). La diferencia o
aumento entre estas dos longitudes de onda se denomina desviación de Stokes y, de forma general,
los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con compuestos que tienen
grandes diferencias entre las longitudes de onda de excitación y de emisión. Dentro de los factores
que pueden interferir pueden estar el rendimiento cuántico, estructura molecular, rigidez estructural,
temperatura y disolvente, además de pH y concentración.
Sólo ciertas sustancias poseen la propiedad de ser fluorescentes: los fluorocromos, caracterizados por
la presencia de dobles enlaces conjugados. Compuestos que no son en sí mismos fluorescentes o
sólo débilmente, pueden convertirse en derivados muy fluorescentes mediante reacciones químicas
como condensaciones, sustituciones, deshidrataciones u oxidaciones, o simplemente modificando su
pH particular. La fluorescencia es emitida por los compuestos en todas direcciones, pero sólo se mide
una pequeña parte que llega al detector.La fluorescencia es emitida por los compuestos en todas
direcciones, pero sólo se mide una pequeña parte que llega al detector.

RESULTADOS

Tabla 1 . Resultados de la curva de calibración de riboflavina en diferentes medios.

Riboflavina Intensidad de Intensidad de Intensidad de Intensidad de

(ppm) fluorescencia en fluorescencia en fluorescencia en fluorescencia en
H2O HCl 0.1M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M
0 4.88 4.87 4.85 4.85
1 5.64 5 5.58 4.86
2 6.56 5.15 6.24 4.87
3 7.72 5.29 6.80 4.87
4 8.39 5.41 7.42 4.89
5 8.72 5.53 8 4.90
10 11.68 6.01 9.79 4.94
50 17.16 6.69 14 4.98
pH 5 1 3 13
 10
9
8
7
Intensidad

6
H2O
5
HCl 0.1M
4
CH3COOH 0.9 M
3
NaOH 0.1 M
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6
Rivoflavina (ppm)

Gráfico 1. Curvas tipo de intensidad de fluorescencia contra concentración en ppm de Riboflavina,con lecturas de 0 a 50 ppm.

20

18

16

14

12
intensidad

H2O
10
HCl 0.1M
8 CH3COOH 0.9 M
6 NaOH 0.1 M

0
0 10 20 30 40 50 60
Riboflavina (ppm)

Grafico 2. Curvas tipo de intensidad de fluorescencia contra concentración en ppm de Riboflavina, con intervalor de 0 a 50 ppm
.
1.-¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de máxima emisión?
Porque es justo ahí en donde el analito tiene mayor sensibilidad, es decir en donde cualquier cambio por más
mínimo que este sea se detectara nos proporcionara información acerca de cuáles son las condiciones a las
cuales podemos leer intensidad.

2.- Diga cuales son las formas coenzimaticas de la riboflavina y cuál es su papel en el metabolismo
celular.
Biológicamente se conocen dos derivados de la riboflavina, el Flavin mononucleótido (FMN) y el Flavin adenin
dinucleótido (FAD). Las flavoenzimas catalizan reacciones de oxido-reducción en las cuales el grupo flavina es
el agente que se reduce u oxida. En casos en los cuales la flavina no está unida covalentemente a la enzima,
está fuertemente unida. La constante de disociación para enzimas-flavina esta entre 10-8 y 10-11. Estas
reacciones generalmente están ligadas a la obtención de energía en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
Preguntas extra
3.Investigue y coloque las estructuras de resonancia de riboflavina.

4.-Colocar tres diferencias entre fluorescencia y fosforescencia .

-Tiempo de emisión , la fluorescencia es rápido en nanosegundo; mientras que la fosforescencia es en
minutos.
 ANALISIS DE RESULTADOS

La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende

del pH al cual se encuentren, tanto para la forma ionizada como la no ionizada emitirán diversos valores
de intensidad.
Como podemos observar en los resultados obtenidos en el efecto del pH y la concentración en la
intensidad de florescencia de riboflavina ,durante el análisis de la práctica se emplearon diferentes
disolventes entre estos a pH`s ácidos y básicos, uno de los álcalis que se utilizo fue hidróxido de
sodio, en el cual se puede observar que la pendiente de su curva está ligeramente recta a comparación
de las otras curvas de los disolventes , lo cual indica que se vio afecta de una manera drástica la
sensibilidad de la intensidad de emisión, esto debido a que el disolvente interaccionó con la riboflavina,
provoco que al interaccionar se generara un estado en el cual se encuentra completamente oxidada,
este efecto se observa en el grupo carbonilo, en el cual un par de electrones π han migrado al oxígeno,
con este fenómeno se generan nuevos niveles de transición de mayor energía (n----- π*), que
finalmente se afecta en la disminución de la intensidad de emisión o el estado triplete (sistema con 3
posibles valores de Spín) y evita la fluorescencia.

Dentro de los ácidos que empleamos uno de ellos fue un ácido inorgánico fuerte, el cual es ácido
clorhídrico. La riboflavina es resistente a los ácidos fuertes pero como se nota en la solución de HCl
está también perdió su fluorescencia , ya que la diferencia en el efecto del disolvente hace que sea
más sensible y esto sucede ya que disminuyen el número de pares de electrones libres (debido a la
cantidad de protones en el medio) y sin aparear del nitrógeno, haciéndolos de menor energía, sin
embargo la intensidad no aumenta demasiado. En el caso del ácido débil (ácido acético )se observa
un comportamiento parecido al del agua pero con un poco de variación en la concentración respecto
a la cantidad emitida de fluorescencia, esto se origina porque el ácido acético realmente no interactúa
de manera importante con la riboflavina, además de que es un ácido que por su naturaleza no cede
de manera inmediata y fácil sus protones al medio evitando su modificación química.
Se puede decir que la riboflavina es muy inestable a diferente pH, debido a que cuando se tiene en
agua su fluorescencia es la esperada,el efecto de la fluorescencia y sin en cambio con los otros
disolventes un ácido y un álcali a pesar de tener la misma concentración en todas las soluciones las
lecturas fueron distintas. En el caso del agua se observó un claro aumento proporcional de la
concentración con el efecto de la fluorescencia, esto debido a que el agua no afecta de ninguna manera
a la riboflavina, al contrario la disuelve mejor, debido a los puentes de hidrogeno que se forman entre
los grupos alcohol de la ribosa, entre los grupos carbonilos y los nitrógenos dentro de los heterociclos
, y no intercambian o modifican enlaces π, deduciendo que efectivamente no existe.
 Conclusiones
 La riboflavina es inestable a pH ácido y álcali, mantiene su fluorescencia a pH neutro (agua
destilada).
 La naturaleza química del analito es importante al momento de elegir el disolvente.
 Los protones y iones hidroxilo impiden la fluorescencia.
 La concentración es directamente proporcional a la fluorescencia.

Bibliografía

 Alfonso R. Genaro “Remington Farmacia, Volumen 2” 20ª edición. Editorial Panamericana S. A. Mexico
2003 pág 2170-2171

 Adela Mauri Aucejo, María José Llobat Estellés, Rosa Herráez Hernández. “Laboratorio de análisis
instrumental” Editorial PUV ER. Universidad de Valencia, 2010. Pág 70-75