LAPORAN KIMIA INSTRUMEN

Penentuan Kadar Parasetamol Dan Kafein Dengan

Menggunakan
High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)
Tanggal Praktikum : 24 Februari 2015

Dosen Pengampu:Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si.

Disusun Oleh :

Kelompok 11

Qisti Septia W.A ( 1305852 )

Santi Dwi Permata Sari ( 1300590 )

Shela Surya Dwiyani ( 1300731 )

LABORATORIUM KIMIA INSTRUMEN

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
 Tanggal Praktikum : 25 Februari 2015

Penentuan Kadar Parasetamol Dan Kafein Dengan

Menggunakan
High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)

A. Tujuan Praktikum :
- Memahami cara kerja instrument HPLC
- Melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian instrument HPLC
- Menentukan / menghitung kadar Parasetamol dan Kafein dengan menggunakan
High Peformance Liquid Chromatography ( HPLC )

B. Tinjauan Pustaka:
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah metoda
kromatografi cair bertekanan tinggi. HPLC sangat berguna untuk analisis kimia secara
kualitatif dan kuantitatif senyawa organic atau anorganik yang berkadar sangat kecil,
dalam skala ng/L. juga metoda ini hanya memerlukan jumlah cuplikan yang sangat
kecil(ml). oleh karena itu HPLC, misalnya dapat digunakan dalam analisis cuplikan
Kimia Lingkungan, Farmasi, atau kedokteran. (Tim Dosen Kimia Instrumen.2001:1)
Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran
luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/ area standar.
Pada prakteknya teknik perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya
melibatkan satu konsentrasi standar. Oleh karena itu, lebih akurat dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Kromatografi menyangkut metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi
differensial komponen sampel diantara dua fasa. Menurut pengertian ini kromatografi
selalu melibatkan dua fasa ,yaitu fasa diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile
phase). Fasa diam berupa padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan
(kertas atau suatu adsorben) sedangkan fasa gerak berupa cairan disebut eluen. Fase gerak
ini mengakibatkan terjadinya migrasi differensial komponen-komponen dalam sampel.
(budiasih,dkk.199:68)
 Prinsip kerja HPLC adalah berdasarkan distribusi differensial komponen di
antara dua fasa yang disebabkan oleh perbedaan kepolaran. Prinsip kerja alat instrument
HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui
kolom ke detektor. Cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen – komponen campuran.
Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute – solute terhadap fasa diam. Solute –
solute yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.
Sebaliknya, solute –solute yang kuat interaksinya dengan fasa diam maka solute –solute
tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar
kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram GC, jumlah peak menyatakan jumlah
komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.
Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC.
Gambar skema instrument HPLC:

Sumber:https://www.google.com/search?q=skema+instrument+hplc&ie=utf-8&oe=utf-8
Terdapat dua perbedaan dalam HPLC berdasarkan polaritas dari pelarut dan
interaksi terhadap fasa diamnya.
1. Fasa normal HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat lebih polar daripada
pelarutnya.
2. Fasa balik HPLC, dimana dengan fasa diamnya bersifat non-polar dibandingkan
dengan pelarutnya.
Jenis retensi solute merupakan dasar dalam HPLC karena pemisahan senyawa
bergantung pada jenis dan kekuatan interaksi solute dengan fasa diam. Mekanisme
retensi dapat dikelompokan menjadi 5 katagori :
1. Kromatografi Adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang
agak polar. Partikel- partikel silica atau alumina biasanya digunakan sebagai
adsorben. Gugus – gugus polar silanol pada permukaan silica dan gugus – gugus polar
aluminol pada permukaan alumina bertindak sebagai tempat-tempat adsorbs untuk
molekul polar. Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar dan jenis
kromatografi ini disebut kromatografi fasa normal.
2. Kromatografi Partisi
Dalam kromatografi ini, biasanya fasa gerak lebih polar daripada fasa diam
sehingga kromatografi jenis ini disebut juga kromatografi fasa terbalik. Fasa diam
(polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah
kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi
ini disebut kromatografi cair cair (LLC).
3. Kromatografi Fasa terikat
Kromatografi fasa terikat dilakukan dalam dua cara, yaitu fasa normal dan fasa
balik. Fasa diam dari fasa terikat terdiri dari suatu pengepak silica yang disalinasi
(misalnya C8 dan C18), fasa diam yang dipakai adalah C5 atau C15 BPC packing.
Fasa gerak terdiri dari suatu larutan buffer (ditambah suatu kosolven organik seperti
methanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion
tanding, yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel. Fasa terikat
mempunyai beberapa keuntungan merupakan fasa yang stabil.
4. Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran – campuran
ion atau molekul – molekul yang dapt diionkan. Ion – ion bersaing dengan ion fasa
gerak untuk memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam.
5. Kromatografi eksklusi ukuran
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari
zat padat. Pemisahan terjadi karena solute – solute berdifusi masuk dan keluar pori-
pori material paking kolom. Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk
kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.

Adapun Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi atau HPLC :

1. Fasa gerak
 Fasa gerak dalam HPLC adalah zat cair. HPLC mempunyai lebih banyak
pilihan fasa gerak. Dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen –
komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute –
solute. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu factor penentu
keberhasilan proses pemisahan.
a. Persyaratan fasa gerak HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus
memenuhi beberapa persyaratan berikut :
1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan
yang dianalisis.
2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran
yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
3) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan dalam
kolom
4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan
tidak beracun
5) Zat cair tidak kental
6) Fasa gerak harus sesuai dengan detektor

2. Pompa
Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus
memenuhi persyaratan :
a. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi
b. Kecepatan alir berkisar 0,1 – 10 mL / menit
c. Bahan tahan korosi
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom.
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu
membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis
dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
 Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe
memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Gambar : Pompa HPLC

3. Injektor
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi
yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum : Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan
pada kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja
sampai 60 - 70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan
semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum
yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 µ dan dilakukan dengan cara automatis
(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih
kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi LOAD,
 sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Gambar : injektor
Gambar : Proses injeksi
4. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang
terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya
pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya
kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan
preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom ditampung pada tabung yang
berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Berhasil atau
gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang
sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan
poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi
bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, c-8,
cyanopropyl. Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak
dipakai dalam HPLC,
b. Kolom preparatif : Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang
kolom 25 -100 cm.
 Gambar : Kolom C-18
5. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis
kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise)
yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe
senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur
sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT yang umum
digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel
panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan
range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama
pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan
dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:
- Detektor Fluorometer
- Detektor lonisasi nyala
- Detektor Spektrofotometer Massa
- Detektor Refraksi lndeks
- Detektor Elektrokimia
- Detektor Reaksi Kimia
 Gambar : Detektor UV
Sumber : https://www.google.com/search?q=gambar+detektor+uv&ie=utf-8&oe=utf-8

a. Detektor UV
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa- senyawa organic.
Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang
gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang
diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang yang digunakan 254 nm
karena kebanyakan senyawa organik menyerap sinar UV pada sekitar panjang
gelombang.

6. Rekorder
Berfungsi menampilkan hasil dari pemisahan kromatografi. Kromatogram
berupa waktu retensi (sumbu x) dan intensitas penyerapan (sumbu y). Hal ini dapat
digunakan untuk analisis kualitatif suatu komponen. Area puncak setara dengan
konsentrasi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Hasil kromatogram akan kurang baik dikarenakan adanya pelebaran puncak.
Pelebaran yang terjadi dapat disebabkan oleh tiga faktor, yaitu :
a. Difusi Eddy
Difusi Eddy terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen ke
detektor yang menyebabkan puncak kromatogram melebar. Hal ini disebabkan
karena terdapat perbedaan ukuran partikel penyusun kolom yang tidak merata.
b. Transfer massa
Transfer massa terjadi karena perbedaan waktu kedatangan komponen
ke detektor yang menyebabkan puncak kromatogram melebar.
c. Difusi longitudinal
Difusi longitudinal terjadi karena perbedaan waktu kedatangan
komponen ke detektor yang menyebabkan puncak kromatogram melebar.
 Pelarut dalam HPLC diantaranya n-heksana, sikloheksana, tetraklorometana,
metilbenzena, isopropanol, etanol, methanol, asam etanoat, dan air. Sementara fasa
diam dalam HPLC diantaranya oktilsilika, propilsilika, aminopropil, asam sulfonat,
dan amina kuartener. (al-anshory,2007:2-6)

Parasetamol dan kafein umumnya terdapat bersama-sama dalam satu tablet

obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan dapat menyerap sinar UV. (Tim Dosen Kimia Instrumen.2011:17)
Parasetamol berwujud serbuk hablur berwarna putih tidak berbau dan sedikit
pahit. Mengenai kelarutannya parasetamol larut dalam air mendidih dan dalam NaOH
1N, mudah larut dalam etanol, memiliki rumus empiris C8H9NO2 .Adapun struktur
kimia parasetamol adalah:

Gambar: struktur parasetamol

Kafein dengan rumus empiris C8H10N4O2 adalah senyawa alkaloid xantina
berbentuk Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang psikoaktif dan
diuretic ringan. Adapun struktur kimia darikafein adalah :

Gambar: Struktur Kafein

(Sudjadi,Rahman.1994:36)
C. Alat dan Bahan Praktikum :
o Alat yang digunakan :
Nama Alat Ukuran Jumlah
Perangkat HPLC 1 set
Labu Ukur 10 mL 6 buah
Labu Ukur 50 mL 1 buah
Corong pendek 6 buah
Penyangga corong 1 buah
Pipet tetes 3 buah
Botol vial 2 buah
Pipet volum 10 mL 1 buah
Pipet volum 7 mL 1 buah
Pipet volum 2 mL 1 buah
Pipet volum 3 mL 1 buah
Pipet volum 4 mL 1 buah
Pipet volum 5 mL 1 buah
Syringe membrane
1 buah
selulosa nitrate
Ultrasonic Vibrator 1 set
Gelas kimia 100 mL 2 buah
Kertas saring 6 lembar

o Bahan yang digunakan :

Nama Bahan Jumlah
Parasetamol p.a 25 mg
Kafein 12,7 mg
Asetonitril,KH2PO4,Isopropil
500 mL
Alkohol
Sampel obat 6,00 mg
Aquabides secukupnya
Methanol secukupnya
 D. Bagan Alir

Langkah Kerja Pengamatan

1) Pembuatan fasa gerak → Fasa gerak telah tersedia di
KH2PO4 0,1 M laboratorium, zat cair tidak
 Diambil sebanyak 420 mL berwarna

 Ditambahkan 20,00 mL methanol → Volume fasa gerak yang

 Ditambahkan 30,00 mL asetonitril digunakan 110 mL

 Ditambahakan 30,00 mL isopropil → Parasetamol yang

alcohol ditimbang 25 mg
→ Parasetamol berupa serbuk
 Disaring menggunakan membrane
putih
whatman filter PTFE 0,2 µm
→ Kafein yang ditimbang
 Disonikasi selama 30 menit
12,7 mg
Hasil
→ Kafein berupa serbuk putih
→ pelarut yang digunakan
2) Pembuatan larutan Induk parasetamol
sebanyak 50 mL dan
Parasetamol p.a
disonikasi selama 1 menit
 Ditimbang 25 mg
sebelum tanda batas.
Kafein p.a
→ setelah tanda batas
 Ditimbang 12,5 mg
disonikasi kembali selama 5
Parasetamol 25 mg dan kafein 12,5 mg
menit
 Dimasukkan ke dalam labu 50 mL
→ Didapatkan Konsentrasi
 Ditambahkan pelarut sebanyak 20 mL larutan induk
 Disonikasi selama 15 menit Parasetamol : 500 ppm
 Diencerkan dengan pelarut hingga Kafein : 254 ppm
tanda batas → Larutan Induk : tidak
 Disaring dengan membran berwarna
 Disonikasi
 Dihitung konsentrasi larutan induk
untuk parasetamol dan kafein
Hasil
 3) Pembuatan deret larutan standar parasetamol
Larutan induk parasetamol dan kafein
 Dipipet masing-masing sebanyak
1,2,3,4,5 dan 6 mL ke dalam labu
ukur 10 mL
 Ditambahkan pelarut hingga tanda
batas
 Disaring masing-masing dengan
membrane whatman PTFE 0,2 µm
 Dipindahlan ke botol vial → Larutan tidak dipindahkan

Larutan dalam botol vial ke botol vial

 Disonikasi selama 5 menit

 Diinjeksikan ke system HPLC dengan
→ Kurva kalibrasi ada dalam
volume penyuntikan 20 µL
data pengamatan
 Dibuat kurva kalibrasi
→ Sampel yang digunakan :
Hasil
Panadol Extra ( Serbuk putih )
6,00 mg
4)Pembuatan larutan sampel parasetamol
→ Berat rerata sampel
Tablet obat
Panadol : 0,69652 mg
 Ditimbang 20 tablet dan ditentukan
→ Berat rerata sampel
berat rata-rata tablet
Bodrex: 0,84019 mg
 Digerus tablet dengan lumping dan
→ Kandungan Sampel
alu
Panadol Extra dalam
Serbuk obat
kemasan:
 Diambil sejumlah 25 mg
Parasetamol : 500 mg
 Dimasukkan ke dalam labu ukur 25
Kafein : 65 mg
mL
 Ditambahakn 1 mL pelarut → Kandungan Sampel
 Disonikasi selama 10 menit Bodrex dalam kemasan :
Serbuk obat yang telah disonikasi Parasetamol : 600 mg
 Diencerkan dengan pelarut hingga Kafein : 50 mg
garis tanda
  Dikocok dan disaring melalui
penyaringan kering ( 1 mL filtrat
pertama dibuang dan filtrate
selanjutnya ditampung)
Sampel obat yang telah disaring
 Dipipet 1 mL dan dimasukkan ke
dalam labu ukur 10 mL
→ Labu ukur yang digunakan
10 mL
→ Sonikasi dilakukan 5 menit
sebelum
→ Pelarut yang digunakan
Aqua bides
→ Penyaringan menggunakan

 Ditambahakn pelarut hingga garis selulosa nitrat 0,45 μm

tanda → Injeksi yang digunakan

 Disaring dengan membrane whatman berukuran 25 µL

PTFE 0,2 µm → Larutan sampel tak

 Disonikasi selama 5 menit berwarna

 Diinjeksikan ke dalam sistem HPLC

Hasil

5)Penyiapan instrument HPLC

Instrumen HPLC
 Dipastikan kabel penghubung listrik
tersambung dengan benar
 Ditekan tombol ON pada sakelar
listrik
 Botol fasa gerak diisi dengan volume
yang memadai, dan botol penampung
dikosongkan
 Tombol ON pada alat ditekan
berturut-turut untuk power, detector
dan pompa
 Dilakukan pemprograman oleh alat
computer, diikuti langkahnya sesuai
intruksi
 Dipilih mode yang sesuai dengan
parameter kondisi instrument
 Dialirkan fasa gerak
 (instrument siap digunakan bila respon kromatogram
tidak muncul lagi (baseline mendatar)

 Larutan standar diinjeksikan berturut-
turut (mulai dari konsentrasi terendah)
kemudian larutan sampel)
 Dicetak hasil pengukuran, kondisi
percobaan dicatat
 Pompa dimatikan dengan menyoroti
tanda pompa dalam computer setelah
selesai
 File ditutup sesuai petunjuk, computer
dimatikan
 Tekan tombol off pada
pompa,detector dan power secara
berurutan
 Sambungan listrik diputuskan
Hasil
Keterangan :
Fasa Gerak : KH2PO4 0,01 M, 20 mL
methanol, 30 mL asetonitril dan 30 mL
isopropil alcohol
Kolom (fasa diam) : C-18 (15 cm)
Panjang gelombang : 215 nm
Laju alir : 1 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL

C. PERHITUNGAN DATA
1) Menentukan Konsentrasi Larutan Induk
a. Parasetamol
Massa parasetamol standar = 25 mg
Volume larutan = 50 mL = 0,05 L
 𝑚𝑔 25 𝑚𝑔
𝑝𝑝𝑚 = = = 500 𝑝𝑝𝑚
𝐿 0,05 𝐿
b. Kafein
Massa Kafein standar = 12,5 mg
Volume larutan = 50 mL = 0,05 L
𝑚𝑔 12,5 𝑚𝑔
𝑝𝑝𝑚 = = = 250 𝑝𝑝𝑚
𝐿 0,05 𝐿

2) Pembuatan Deret Larutan Standar Parasetamol

 𝐶1 = 500 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 2 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
2 𝑚𝐿
𝐶2 = × 500 𝑝𝑝𝑚 = 100 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 500 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 3 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
3 𝑚𝐿
𝐶2 = × 500 𝑝𝑝𝑚 = 150 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 500 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 4 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
4 𝑚𝐿
𝐶2 = × 500 𝑝𝑝𝑚 = 200 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 500 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 5 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
 5 𝑚𝐿
𝐶2 = × 500 𝑝𝑝𝑚 = 250 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 500 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 6 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
6 𝑚𝐿
𝐶2 = × 500 𝑝𝑝𝑚 = 300 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 500 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 7 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
7 𝑚𝐿
𝐶2 = × 500 𝑝𝑝𝑚 = 350 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
3) Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein
 𝐶1 = 254 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 2 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
2 𝑚𝐿
𝐶2 = × 254 𝑝𝑝𝑚 = 50,8 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 254 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 3 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
3 𝑚𝐿
𝐶2 = × 254 𝑝𝑝𝑚 = 76,2 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 254 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 4 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
 4 𝑚𝐿
𝐶2 = × 254 𝑝𝑝𝑚 = 101,6 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 254 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 5 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
5 𝑚𝐿
𝐶2 = × 254 𝑝𝑝𝑚 = 127 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 254 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 6 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
6 𝑚𝐿
𝐶2 = × 254 𝑝𝑝𝑚 = 152,4 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿
 𝐶1 = 254 𝑝𝑝𝑚 𝐶2 = ?
𝑉1 = 7 𝑚𝐿 𝑉2 = 10 𝑚𝐿
𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑉1
𝐶2 = × 𝐶1
𝑉2
7 𝑚𝐿
𝐶2 = × 254 𝑝𝑝𝑚 = 177,8 𝑝𝑝𝑚
10 𝑚𝐿

E. ANALISIS DATA
1) Data Penimbangan Sampel Obat ( Panadol Extra )
m1 = 0,6899 mg m6 = 0,6918 mg
m2 = 0,6989 mg m7 = 0,6985 mg
m3 = 0,7041 mg m8 = 0,7006 mg
m4 = 0,6935 mg m9 = 0,6947 mg
m5 = 0,6948 mg m10 = 0,6984 mg
Massa rerata sampel obat ( panadol extra ) = 0,6952 mg
2) Data Penimbangan Sampel Obat ( Bodrex )
m1 = 0,8331 mg m6 = 0,8315 mg
m2 = 0,8530 mg m7 = 0,8418 mg
m3 = 0,8497 mg m8 = 0,8568 mg
m4 = 0,8326 mg m9 = 0,8312 mg
m5 = 0,8350 mg m10 = 0,8472 mg
Massa rerata sampel obat ( Bodrex ) = 0,8402 mg

3) Tabel Deret Larutan Standar Parasetamol

No Konsentrasi (ppm) Luas Area

1 100 4250914
2 150 6308666
3 200 8440476
4 250 10128325
5 300 12296071
6 350 14466379

Kurva Kalibrasi Parasetamol

16000000
14000000
12000000
10000000
Luas Area

8000000
6000000
4000000
2000000
0
0 100 200 300 400
Konsentrasi (ppm) y = 40416x + 221617
R² = 0.999
4) Kadar Parasetamol dalam sampel :
Massa Sampel Panadol = 6,00 mg
Luas Area Parasetamol = 12755224
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐿𝑢𝑎𝑠 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
=
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑎𝑟𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 𝐿𝑢𝑎𝑠 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑃𝑎𝑟𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙
𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 12755224
=
350 𝑝𝑝𝑚 14466379

𝑝𝑝𝑚 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = 308,6003 𝑝𝑝𝑚

a. Massa parasetamol dalam 6,00 mg panadol ( 10 mL )
Luas Area Parasetamol = 3948526
𝑦 = 40416𝑥 + 221617
12755224 = 40416𝑥 + 221617
40416𝑥 = 12533607
𝑥 = 310,1149792 𝑝𝑝𝑚
*x : Parasetamol
Kadar Parasetamol dalam 6,00 mg sampel obat Panadol Extra ( 10 mL )
310,1149792 𝑚𝑔
310,1149792 𝑝𝑝𝑚 =
1𝐿
310,1149792 𝑝𝑝𝑚 𝑥
Dalam 10 mL : = 0,01 𝐿
1𝐿
𝑥 = 3,101150 𝑚𝑔
Dalam sampel panadol 6,00 mg terdapat Parasetamol sebesar 3,101150 mg
Dalam 1 tablet Parasetamol :
3,101150 𝑚𝑔 × 696,52 𝑚𝑔
= 360,00213 𝑚𝑔
6,00 𝑚𝑔

5) Tabel deret Larutan Standar Kafein

No Konsentrasi ( ppm ) Luas Area
1 50,8 4635278
2 76,2 6938088
3 101,6 9285885
4 127 11087295
5 152,4 13272908
6 177,8 15430555
 Kurva Kalibrasi Kafein
18000000
16000000
14000000
12000000
Luas Area

10000000 y = 84120x + 493473

8000000 R² = 0.9989
6000000
4000000
2000000
0
0 50 100 150 200
Konsentrasi (ppm)

6) Kadar Kafein dalam Sampel

Luas Area Kafein = 3948526
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 (2 𝑚𝐿) 𝐾𝑎𝑓𝑒𝑖𝑛 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 (2 𝑚𝐿)
=
𝐿𝑢𝑎𝑠 𝐴𝑟𝑒𝑎 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥
4635278 50,0 𝑝𝑝𝑚
=
3948526 𝑥
𝑥 = 432736 𝑝𝑝𝑚
*ket: x = kafein
Kadar Kafein dalam 6,00 mg sampel obat Panadol Extra ( 10 mL )
43,2736 𝑚𝑔
43,2736 𝑝𝑝𝑚 =
1𝐿
43,2736 𝑝𝑝𝑚 𝑥
Dalam 10 mL : =
1𝐿 0,01 𝐿
𝑥 = 0,432736 𝑚𝑔
Dalam sampel obat panadol 6,00 mg terdapat kafein sebesar 0,432736 mg
0,432736 𝑚𝑔 × 696,52 𝑚𝑔
Dalam 1 tablet kadar kafein : = 50,2349 𝑚𝑔
6,00 𝑚𝑔
D. Pembahasan
Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan kadar parasetamol dan kafein
dalam sampel obat dengan instrumen HPLC. Sampel obat yang digunakan adalah
jenis obat sakit kepala yaitu panadol. Adapun prinsip dasar dari HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) pada praktikum kali ini adalah adanya
perbedaan koefisien distribusi antara komponen fasa gerak dan fasa diam. Praktikum
ini menggunakan HPLC fasa terbalik, karena fasa diam yang digunakan bersifat
nonpolar yaitu C-18 dan fasa gerak gerak yang digunakan ( campuran dari KH2PO4
0,01 M, methanol, asetonitril dan isopropil alkohol) bersifat polar. Mode operasional
yang digunakan pada praktikum kali ini adalah mode isokratik dimana komposisi fasa
gerak dan laju kolom dibuat tetap sebesar 1 mL/menit.
Langkah pertama yang dilakukan adalah membuat larutan induk
parasetamol. Parasetamol berupa serbuk berwarna putih yang tertimbang 25 mg
sedangkan kafein berupa serbuk berwarna putih yang tertimbang sebesar 12,7 mg.
Untuk melarutkan parasetamol dan kafein digunakan pelarut, Pelarut yang
digunakan adalah campuran dari KH2PO4 0,01 M, methanol, asetonitril dan
isopropil alkohol yang tidak berwarna. Pelarut yang digunakan dikombinasikan
komposisinya bertujuan untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok sehingga
faktor human error dapat dihindarkan. Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi
persyaratan fasa gerak HPLC yaitu: jernih, murah, mudah diperoleh, dan tidak
kental. Proses degassing dilakukan untuk menghomogenkan dan menghilangkan
gelembung-gelembung gas pada larutan induk. Karena dengan adanya gas dalam
larutan sampel dapat menghambat pergerakan eluen sehingga terganggunya
pemisahan pada kolom karena larutan sampel tidak merata dan akan menyebabkan
terjadinya pelebaran puncak kromatogram. Selain itu, penghilangan gas ini juga
diperlukan untuk menghindari noise pada detektor terutama fase organik berair.
Langkah berikutnya yaitu pembuatan larutan standar. Pembuatan larutan
standar dilakukan untuk menentukan kurva kalibrasi parasetamol. Kurva kalibrasi
dibuat sebagai pembanding. Variasi konsentrasi yang digunakan untuk parasetamol
secara berturut-turut adalah 100 : 150 : 200 : 250 : 300 dan 350 ppm. Sementara untuk
standar kafein berturut turut adalah 50,8 : 76,2 : 101,6 : 127 : 152,4 : dan 177,8 ppm.
Pembuatan larutan standar tersebut dilakukan secara kuantitatif. Oleh karena itu,
penimbangan larutan baku parasetamol harus tepat, pemipetan larutan induk harus
tepat, pengenceran larutan baku menjadi larutan standar harus pas sampai tanda batas.
Pembuatan masing – masing konsentrasi dan pelabelan harus dilakukan secara teliti
untuk mencegah terjadinya kekeliruan. Larutan standar diinjeksikan secara berurutan
dari konsentrasi terendah sampai konsentrasi tertinggi.
Dalam membuat larutan sampel sampel obat ditimbang dalam 10 kali
penimbangan per tablet dan dihasilkan rata rata penimbangan untuk panadol 695,2 mg
dan untuk bodrex adalah 840,19 mg. Sampel yang dianalisis beratnya 6 mg. Pada
pembuatan lautan sampel parasetamol, sampel obat yang berupa tablet ditimbang satu
per satu. Hal ini dilakukan karena massa masing-masing tablet tidak sama, sehingga
digunakan massa rata-rata dari kesepuluh tablet. Pengenceran filtrat dengan
aquabides dimaksudkan untuk membuat konsentrasi lebih kecil lagi dan mudah di
analisis karena masih berada di dalam range kurva kalibrasi larutan standar. untuk
membebaskan larutan sampel dari kotoran partikulat maka larutan standar tersebut
disaring dengan selulosa nitrat dan dihomogenkan dengan ultrasonik vibrator.
Digunakan membran selulosa nitrat untuk menyaring karena komponen yang akan
dipisahkan (parasetamol dan kafein) bersifat polar.
Alat HPLC diset sesuai dengan kebutuhan pengukuran yaitu dengan panjang
gelombang 215 nm, laju alir 1mL/menit.Pada saat memasukan larutan standar
maupun larutan sampel tidak terlalu banyak cukup dengan 20 mikoliter, karena jika
terlalu banyak dapat menyebabkan band broadening (pelebaran peak) dan pada saat
memasukan cuplikan pada syringe tidak ada gelembung udara agar menghasilkan
pemisahan yang baik. Sebelum digunakan, syringe harus dibilas dengan mengunakan
metanol agar terbebas dari kotoran.

Pada proses pemasukan cuplikan kedalam alat HPLC dilakukan dengan

menggunakan alat injeksi syiringe. Syringe disuntikan melaui septum (seal karet),
cuplikan yang masuk kemudian dialirkan oleh fasa gerak dengan bantuan pompa.
Dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solute yang kuat
interaksinya dengan dengan fasa diam akan tertahan. Dalam hal ini parasetamol yang
lebih polar dibandingkan kafein tertahan lebih lama pada fasa diam dalam kolom.
Sehingga setelah keluar kolom akan dideteksi oleh detector yang kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram yang menghasilkan puncak

Kolom yang digunakan dalam percobaan ini adalah kolom yang berisi fasa
diam C-18 denagna panjang 15 cm yang bersifat nonpolar dan merupakan hasil
reaksi antara silika dengan alkilklorosilana dimana gugus alkilnya (R) adalah n-
oktadesil. Fasa diam tersebut terikat pada fasa pendukung yaitu silika. Dalam hal ini,
fasa diam lebih nonpolar dari fasa geraknya sehingga mode yang digunakan adalah
mode fasa terbalik. HPLC fasa terbalik ini baik untuk memisahkan campuran
komponen-komponen yang bersifat polar seperti parasetamol dan kafein.. fasa diam
yang digunakan dalam HPLC harus tahan terhadap tekanan tinggi, karena apabila
digunakan struktur dengan pori yang besar akan mudah rusak. Hal ini disebabkan
menurunnya permeabilitas akibat tekanan tinggi. Sementara proses elusi yang
digunakan adalah isocratic. Mode isokratik dilakukan pada temperature tetap dan
komposisi fasa geraknya sama selama pengukuran berlangsung yaitu pada suhu 27 C
dan laju alir nya 1 mL/menit.
Dalam pengelusian, parasetamol terelusi lebih awal dengan waktu retensi
lebihh pendek yaitu 2,26 menit dibbandingkan kafein yaitu 2,89 menit.. Kepolaran
dapat dilihatdari struktur senyawanya dimana parasetamol hanya memilki satu ikatan
CH3 sementara kafein 3 ikatan CH3. Oleh karenanya, senyawa-senyawa kafein akan
menghabiskan dalam kolom lebih lama dan mempunyai waktu retensi yang besar.
Sementara, molekul parasetamol dalam campuran akan menghabiskan waktunya
untuk bergerak bersama dengan pelarut sehingga akan keluar terlebih dahulu dan
mempunyai waktu retensi yang kecil. Detektor yang digunakan pada peralatan HPLC
ini adalah spektrofotometer UV, yaitu karena ada gugus kromofor pada sampel.
Analisis; kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel
parasetamol dan kafeinn dengan larutan standar. Waktu retensi larutan standar untuk
parasetamol adalah 2,24 menit sedangkan waktu retensi sampel adalah 2,26 menit.
Sementara waktu retensi larutan standar untuk kafein adalah 2,86 dan 2,86 menit.
Sedangkan waktu retensi pada sampel adalah 2,89 menit. Analisis kuantitatif dari
pengukuran diperoleh dari luas area peak dalam kromatogram yang memiliki waktu
retensi sama. Pengukuran larutan standar dengan meningkatnya konsentrasi diperoleh
luas area yang meningkat pula.
Pelebaran puncak kromatogram dapat terjadi karena Adanya difusi Eddy zat
padat di dalam kolom tidak seragam dan kepadatannya tidak merata sehingga
komponen sampel berjalan tidak mulus, panjang jalan yag dilalui sampel tidak
merata. Selain itu, juga bias terjadi transfer massa karena pengaturan laju alir yang
tidak tepat sehingga ada komponen yang tertinggal didalam kolom.
 Pada percobaan ini, untuk menentukan kadar parsetamol dan kafein dalam
sampel obat diperlukan deret larutan standar parasetamol dan kafein dengan berbagai
konsentrasi untuk membuat kurva kalibrasi. Setelah didapat luas area untuk masing-
masing konsentrasi, dibuat kuva kalibrasi dengan memplotkan konsentrasi terhadap
luas area dan didapat garis lurus. Dari pengolahan data percobaan, diperoleh kadar
parasetamol yaitu sebesar 364,98 mg per tablet panadol dan kadar kafein 50,1355 mg
per tablet panadol.

Analis Kesalahan dalam praktikum kali ini adalah. Adanya perubahan tekanan
dan suhu saat proses pemisahan HPLC. Adanya perubahan tekanan dan suhu akan
menyebabkan pemisahan tidak berjalan sempurna. Kekurang telitian yang dilakukan
saat pembuatan deret larutan standar. Selain itu, saat penginjeksian sampel dilakukan
secara perlahan. Hal ini tidak boleh dilakukan karena akan ada tekanan balik dari
injektor dan juga saat menginjeksikan harus benar benar dipastikan tidak ada
gelembung yang diakibatkan dari mobilitas partikel yang menyebabkan pemisahan
yang kurang baik.

E. Kesimpulan

Dari praktikum kali ini untuk menganalisis kadar parasetamol dan kafein dalam
sampel obat sakit kepala (panadol) menggunakan instrumen HPLC didapat kadar
parasetamol dalam sampel obat sebesar 364,98 mg/tablet sementara kadar kafein
sebesar 50,1355 mg/tablet.
F. Daftar Pustaka

Al-Anshory, Jamaludin. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung : Universitas

Padjadjaran

Budiasih, Endang, dkk. 1999. Analisis Instrumentasi. Malang: Universitas Negeri

Malang

Sudjadi dan Rahman, A. 1994. Analisis Obat dan Makanan. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar

Tim Dosen Kimia Analitik. 2013. Petunjuk Praktikum Kimia Instrumen. Bandung: LKI
Universitas Pendidikan Indonesia
G. Lampiran
i) Dokumentasi

Alat dan Bahan yang digunakan saat Praktikum

Perangkat HPLC Syringe yang digunakan dalam HPLC

Pelarut Aqua Bidestilata Proses Sonifikasi

 Larutan Standar Labu ukur yang digunakan 10 mL

Sampel yang digunakan Pelarut ( Fasa gerak)

Kertas saring yang telah terpasang dalam corong kecil Proses Filtrasi Sampel

Proses penyaringan menggunakan selulosa nitrat

Penyiapan Sampel dan Larutan
standar yang akan diinjeksikan
Tempat Penginjeksian Cuplikan Pompa dalam HPLC

Kolom dalam HPLC Hasil Kromatogram sampel

ii) Print out Hasil Kromatogram