TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADEMÍCO DE
MAESTRO EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA EN LA
ESPECIALIDAD DE PROCESOS
AGROINDUSTRIALES
PRESENTA:
2
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
A Dios por brindarme la posibilidad de poder concluir esta grandiosa etapa en mi vida, a mis padres y familiares
por su apoyo incondicional, a la Dra. Dulce María Díaz Montaño por darme la oportunidad de incorporarme a
su grupo de investigación, por los sabios consejos, amistad y paciencia mostrada para el desarrollo y culminación
de este trabajo de investigación, a la Dra. Mirna Estarrón Espinosa por su paciencia y constante apoyo
proporcionado en la parte cromatográfica y analítica de este trabajo de tesis, al Dr. Héctor Escalona por la
asesoría en la etapa sensorial y estadística y al Dr. Enrique Herrera por su apoyo durante el montaje y
monitoreo de los experimentos desarrollados en continuo.
A todos mis compañeros del laboratorio de Biotecnología Industrial por su constante apoyo y ánimo.
Al CIATEJ por el apoyo en instalaciones y laboratorios y a todas las personas tan amables que laboran en él que
hicieron posible y llevadero cada día de trabajo.
A CONACYT por la beca otorgada y al proyecto PROTECO No. 24547, SEP-CONACYT por el financiamiento
otorgado.
4
CIENCIA Y TECNOLOGIA
Los abajo firmantes miembros del comité tutorial del estudiante Ivonne Wendolyne
González Robles, una vez leída y revisada la Tesis titulada “ESTUDIO DE LA
FERMENTACIÓN DEL JUGO DE AGAVE EN CULTIVOS MIXTOS DE
LEVADURAS TEQUILERAS DEL GÉNERO KLOECKERA Y SACCHAROMYCES:
EFECTO DEL SISTEMA FERMENTATIVO Y LAS CONDICIONES
NUTRIMENTALES” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada
por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia y Tecnología en la opción
terminal de Procesos Agroindustriales durante el examen correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los seís días del mes de Enero del año 2012.
Nombre y firma
Asesor
CIENCIA Y TECNOLOGIA
Guadalajara, Jalisco a 6 de Enero del 2012
Los abajo firmantes miembros del Jurado del Examen de Grado del estudiante Ivonne
Wendolyne González Robles, una vez leída y revisada la Tesis titulada “ESTUDIO DE
LA FERMENTACIÓN DEL JUGO DE AGAVE EN CULTIVOS MIXTOS DE
LEVADURAS TEQUILERAS DEL GÉNERO KLOECKERA Y SACCHAROMYCES:
EFECTO DEL SISTEMA FERMENTATIVO Y LAS CONDICIONES
NUTRIMENTALES” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada
por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia y Tecnología en la opción
terminal de Procesos Agroindustriales durante el examen correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los seís días del mes de Enero del año 2012
Nombre y firma
Vocal
6
Índice de Contenido
CONTENIDO Pág.
I
Índice de Contenido
II
Índice de Contenido
III
Índice de Contenido
3. Resultados y discusiones………................................................................................. 88
3.1 Fermentación de jugo de agave por lote utilizando las levaduras del
género Saccharomyces (S1 y S2) y Kloeckera (K1 y K2) en cultivo puro y
mixto ………........................................................................................................ 89
IV
Índice de Contenido
V
Índice de Contenido
VI
Índice de Tablas
VII
Índice de Tablas
Tabla 3.11 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
para cada componente …………………………………………................................... 125
Tabla 3.12 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K.
africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto ………………………….. 127
Tabla 3.13 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
para cada componente …………………………………………................................... 130
Tabla 3.14 Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los
destilados de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos …….. 132
Tabla 3.15 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
para cada componente …………………………………………................................... 135
Tabla 3.16 Condiciones experimentales y factores estudiados en la fermentación en
continuo de K. africana (K1) en cultivo mixto con S. cerevisiae (S1) ………………. 138
Tabla 3.17 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos
obtenidos en los estados estacionarios de las primeras cuatro condiciones probadas
en las fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto en
medio reformulado …………………………………………........................................ 146
Tabla 3.18 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos
en los estados estacionarios de las últimas cinco condiciones probadas de las
fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto en medio
basal y el punto al centro …………………………………………............................... 147
Tabla 3.19 Parámetros cinéticos obtenidos en los estados estacionarios de las
diferentes condiciones probadas de las fermentaciones en continuo de K. africana y
S. cerevisiae en cultivo mixto …………………………………………....................... 148
Tabla 3.20 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio reformulado
de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) …………………………………………............................................... 153
Tabla 3.21 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio basal y punto
al centro de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y
VIII
Índice de Tablas
Tabla 3.22 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
para cada componente …………………………………………................................... 156
Tabla 3.23 Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes
principales (PC) de los cultivos mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio
de fermentación …………………………………………............................................. 156
Tabla 3.24 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio
reformulado de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1)
y S. cerevisiae (S1) …………………………………………........................................ 161
Tabla 3.25 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio
basal y en el punto al centro de las fermentaciones en cultivo mixto de K. africana
(K1) y S. cerevisiae (S1) en reactor continuo ………………………………………... 162
Tabla 3.26 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
para cada componente ………………………………………….................................. 163
Tabla 3.27 Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes
principales (PC) de los cultivos mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio
de fermentación …………………………………………............................................. 164
Tabla 3.28 Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio
reformulado de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1)
y S. cerevisiae (S1) …………………………………………........................................ 168
Tabla 3.29 Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio
basal y punto al centro de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K.
africana (K1) y S. cerevisiae (S1) …………………………………………………… 169
Tabla 3.30 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
173
para cada componente …………………………………………..................................
IX
Índice de Tablas
X
Índice de Figuras
Figura 2.6 Cultivo continuo empleado en las fermentaciones en cultivo mixto ……... 62
Figura 2.7 Cámara de Neubauer y microscopio empleados ………………………….. 63
Figura 2.8 Centrifuga SOLBAT C- 600 ……………………………………………… 64
Figura 2.9 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) en medio
WL obtenidas de las fermentaciones con S. cerevisiae y K. africana en cultivo puro
y mixto …………………………………………………………………...................... 67
Figura 2.10 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) de los
cultivos mixtos en medio YEPD y medio YPD+CHY de las fermentaciones con S.
XI
Índice de Figuras
Figura 2.11 Espectrofotómetro y microplaca empleados para la técnica del DNS …... 70
Figura 2.12 Equipo YSI modelo 2700 Select empleado para la determinación de
etanol …………………………………………………………………......................... 71
Figura 2.13 Destilador utilizado a nivel laboratorio …………………………………. 73
Figura 2.14 Equipo HPLC de Varian ProStar ………………………………………... 74
Figura 2.15 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un Head space …………. 75
Figura 2.16 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un detector de ionización
de flama (FID) …………………………………………………………………........... 76
Figura 2.17 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un espectrómetro de
masas …………………………………………………………………......................... 78
Figura 2.18 Panel de jueces efectuando evaluación sensorial en el laboratorio del
CIATEJ …………………………………………………………………..................... 80
Figura 3.1 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC, biomasa, azúcares
reductores y etanol de las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S.
cerevisiae (S1), S. cerevisiae (S2), K. africana (K1) y K. apiculata (K2)…………... 92
Figura 3.2 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC, biomasa, azúcares
reductores y etanol de las fermentaciones en cultivo mixto formadas por las
levaduras S. cerevisiae (S1), S. cerevisiae (S2), K. africana (K1) y K. apiculata
(K2) …………………………………………………………………........................... 95
Figura 3.3 PCA de compuestos volátiles de las cepas de levaduras S. cerevisiae (S1),
S. cerevisiae (S2), K. africana (K1) y K. apiculata (K2) en cultivo puro y mixto ….. 102
Figura 3.4 PCA de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados S. cerevisiae
(S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto …………………………………….. 106
Figura 3.5 PCA de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos S.
cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto …………………………. 110
Figura 3.6 Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos de S. cerevisiae (S1)
y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto ………………………………………….. 113
Figura 3.7 Perfiles sensoriales de olor, aroma, gusto y sensaciones trigeminales de los
destilados S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto ……………. 113
XII
Índice de Figuras
Figura 3.8 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC, biomasa, azúcares
reductores y etano de las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S.
cerevisiae (S1) y K. africana (K1)………………………………………...………….. 118
Figura 3.9 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC, biomasa, azúcares
reductores y etanol de las fermentaciones empleando las levaduras S. cerevisiae (S1)
y K. africana (K1) en cultivo mixto ………………….................................................. 119
Figura 3.10 PCA de compuestos volátiles en mosto de las fermentación en medio
reformulado empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y
mixto ……………………………………………………............................................. 124
Figura 3.11 PCA de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados obtenidos
de las fermentaciones en medio reformulado empleando S. cerevisiae (S1) y K.
africana (K1) en cultivo puro y mixto ……………………………………………….. 129
Figura 3.12 PCA de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos de
las fermentaciones en medio reformulado empleando S. cerevisiae (S1) y K.
africana (K1) en cultivo puro y mixto ……………………………………………….. 134
Figura 3.13 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC, biomasa, azúcares
reductores y etanol de las fermentaciones en continuo en cultivo mixto empleando
las levaduras S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1)………........................................... 139
Figura 3.14 Morfología al microscopia (40×) de K. africana y S. cerevisiae en
cultivo mixto bajo diferentes condiciones de cultivo, en las fermentaciones del jugo
de agave en cultivo continuo …………………………………………………………. 149
Figura 3.15 PCA de compuestos volátiles en mosto de las fermentaciones en
continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo mixto ………... 155
Figura 3.16 PCA de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados obtenidos
de las fermentaciones en continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1)
en cultivo mixto ……………………………………………………............................ 163
Figura 3.17 PCA de las familias de compuestos volátiles minoritarios de los
destilados obtenidos de las fermentaciones en continuo empleando S. cerevisiae (S1)
y K. africana (K1) en cultivo mixto ………………………………………………….. 171
Figura 3.18 PCA de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos de
las fermentaciones en continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en
XIII
Índice de Figuras
XIV
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
XV
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
XVI
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
XVII
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
meta Metálico
mfne 5-Metil-2(5H)-furanona
mfona 5-Metil-2(3H)-furanona
µmáx Velocidad específica de crecimiento máxima (h-1)
mttfona 2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona
mtton 2-Metil tetrahidro-3-furanona
MS-MS Espectrometría de masas acoplado espectrometría de masas
NaOH Hidróxido do de Sodio
Nuez Nuez
º Bx Grados Brix
oca; oct-ac Ácido octanoico
ocdec-et Octadecanoato de etilo
oco Octan- 3-ol
oct-et; oct-etil Octanoato de etilo
ole-e Oleato de etilo
paja-húm Paja húmeda
PCA Análisis de componentes principales
PE Productividad de producción de etanol (g/l-h)
Pic Picante
PLS Prueba de cuadrado mínimos parciales
pol 4-Penten-1-ol
prop n-Propanol
prop-ac Ácido propanoico
Px Productividad de formación de biomasa (g/l-h)
qp Velocidad específica de producción de etanol (g/g-h)
XVIII
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
S1 Saccharomyces cerevisiae
S2 Saccharomyces cerevisiae
sal Salado
solv Solvente
suavid Suavidad
SPME-HRGC- Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con relación
IRMS isotópica
SPME-CG-EM Microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases
t Tiempo (h)
τ Tiempo de residencia (h)
T-hum Trapo húmedo
terp α-Terpineol
tet-et Tetradecanoato de etilo
tfar trans-Farnesol
tner trans-Nerolidol
ttdol Tetradecanol
UFC Unidades formadoras de colonia
V Volumen de operación del biorreactor (l)
vin Vinagre
vvm Volumen de aire por volumen de líquido por minuto
WL Medio WL (Bioche ika)
x Concentración de biomasa (gL-1)
x0 Concentración inicial de biomasa (gL-1)
Xo Concentración de biomasa en la alimentación (gL-1)
xt Concentración de biomasa en un tiempo t
YEPD Agar YEPD
XIX
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
XX
ABSTRACT
ABSTRACT
Tequila can be obtained either by spontaneous fermentation or by inoculation with the yeast
first stages of fermentation are characterized by the growth of certain non-Saccharomyces yeasts
belonging to the Torulaspora, Kluyveromyces and Hanseniaspora genera. Subsequent stages are
considered to be beneficial due to their high alcohol production and the release of important
metabolites such as esters, terpenes, acetoin and acetic acid that markedly impact the aroma and
flavor of the alcoholic beverage. Despite of the advantages of using pure cultures of S. cerevisiae
for ease of control and homogeneity of fermentation, many authors suggest that the use of non-
Saccharomyces yeasts in co-culture with S. cerevisiae improves the sensory properties of the
final product. The presence and survival of these non-Saccharomyces yeasts during fermentation
is influenced by several factors including: competition for sugar uptake, oxygen availability,
nutrient limitation, presence of toxic compounds, and ethanol tolerance. In this context, the
objective of this work was to study the effects of oxygen, temperature, and growth factors on the
genera in the fermentation of agave juice in mixed culture with S. cerevisiae in batch and
continuous cultures.
First, the fermentation kinetics of Kloeckera and Saccharomyces yeast strains were characterized
separately in pure cultures and then together in a mixed culture. For the pure cultures, Kloeckera
showed limited growth and fermentative capacity compared to S. cerevisiae, which presented
esters, acetic acid and acetoin than did S. cerevisiae, which produced high concentrations of
6
higher alcohols, acetaldehyde and ethyl esters. The mixed culture produced higher concentrations
of higher alcohols and acetaldehyde than did the pure culture of S. cerevisiae and produced
africana.
Next, the effect of certain growth factors on the survival and fermentative capability was
analyzed for pure cultures of K. africana and S. cerevisiae, and for a mixed culture of both yeasts.
These cultures were fermented in two different media: a reformulated medium, supplemented
with ammonium sulfate, thiamine and asparagine; and the basal medium supplemented with
ammonium sulfate. For K. africana in pure culture grown in the reformulated media, the biomass,
CFU, ethanol production, and reducing sugar consumption increased by 44%, 50%, 75%, and
45%. For S. cerevisiae in pure culture, they increased 4.2%, 75%, 25%, and 3.5%; and for the
mixed culture they increased by 4.66%, 94%, 90%, and 7% respectively compared to the basal
media. The production of volatile compounds by each different culture was similar for both
media. K. africana in pure culture produced higher concentrations of acetate esters, n-butanol,
acetoin, acetic acid and 5-methyl furfural than did S. cerevisiae, which produced predominantly
high concentrations of higher alcohols, ethyl esters and acetaldehyde. The mixed culture
produced intermediate concentrations of acetate and ethyl esters compared to K. africana and S.
cerevisiae in pure culture. The mixed culture also produced concentrations of higher alcohols and
2-acetyl furan similar to K. africana in pure culture and concentrations of isoamyl acetate and 2-
Finally, the effects of oxygen, temperature and fermentation media on the survival and
7
studied. Of these factors, the fermentation media was the most important to the survival of K.
africana in a mixed culture with S. cerevisiae. In comparison to the basal media, under the
conditions developed in the reformulated media, the biomass, CFU, ethanol production, and
reducing sugar consumption increased by 40%, 70%, 13% and 10% respectively. Nevertheless,
the third condition (25ºC, 0.03 vvm in reformulated medium) was the most important, because it
significantly stimulated the growth and survival of K. africana and S. cerevisiae in mixed culture.
Furthermore, the reformulated media produced higher concentrations of higher alcohols, ethyl
esters and acids, than were produced in the basal media. On the other hand, the basal media
produced higher concentrations of acetate esters, acetaldehyde, furans, ketones, terpenes and
acetals.
8
RESUMEN
RESUMEN
El tequila puede ser obtenido, de la fermentación espontánea del jugo de agave ó por inoculación
con S. cerevisiae. Sin embargo en la mayoría de las destilerías, la fermentación ocurre de manera
espontánea, caracterizándose las primeras etapas por el crecimiento de levaduras no-
Saccharomyces de los géneros Torulaspora, Kluyveromyces y Hanseniaspora y las etapas
posteriores son invariablemente dominadas por levaduras alcohol tolerantes como
Saccharomyces. Actualmente el crecimiento de las levaduras no-Saccharomyces es considerado
benéfico, debido al realce del sabor y el olor de la bebida por la alta producción y liberación de
importantes metabolitos como ésteres, terpenos, acetoína y ácido acético. Sin embargo su
crecimiento ésta condicionado a las primeras etapas de la fermentación, después del cual mueren
por una presunta intolerancia a etanol y/o limitación nutricional. A pesar de las enormes ventajas
que representa el utilizar cultivos puros de S. cerevisiae con respecto al fácil control y
homogeneidad durante la fermentación, algunos autores han sugerido utilizar levaduras no-
Saccharomyces en cultivo mixto con S. cerevisiae, debido a que su empleo podría mejorar las
propiedades sensoriales de la bebida. Por esta razón, varios estudios han sido realizados con el
objetivo de elucidar las posibles causas de la muerte de las levaduras no-Saccharomyces durante
la fermentación en cultivo mixto con S. cerevisiae, encontrando que la temperatura de
fermentación, la aireación del medio y la composición en nutrientes del medio son factores
determinantes en la supervivencia. En este contexto, el objetivo del presente trabajo fue estudiar
el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento en la fermentación de jugo de
agave en lote y en continuo de cultivos mixtos de levaduras tequileras no-Saccharomyces del
género Kloeckera con S. cerevisiae, buscando incrementar la prevalencia y capacidad
fermentativa de las levaduras no-Saccharomyces. Primeramente se caracterizaron las cinéticas de
fermentación de las levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces en cultivo puro y mixto en
medio basal. Durante estos cultivos, las levaduras Kloeckera presentaron un limitado crecimiento
y capacidad fermentativa en comparación con Saccharomyces que mostraron una alta eficiencia
fermentativa. La mayor concentración de ésteres de acetato, ácido acético y acetoína se presentó
en los cultivos puros de Kloeckera y de alcoholes superiores, acetaldehído y ésteres de etilo en
los cultivos puros de Saccharomyces, en los cultivos mixtos debido al limitado crecimiento de
Kloeckera y al mayor dominio de Saccharomyces durante la fermentación, la concentración de
10
compuestos volátiles estuvo fuertemente orientada a la producción de alcoholes superiores y
acetaldehído como en los cultivos de Saccharomyces y a producir concentraciones intermedias de
ésteres de etilo debido a la influencia de Kloeckera. Posteriormente se analizó el efecto de ciertos
factores de crecimiento (medio reformulado) sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de
K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae, encontrándose durante estos cultivos en K.
africana un incremento de 1.2 veces mayor en la formación de biomasa, 2.16 y 15 veces mayor
en la formación de UFC en cultivo puro y mixto, 4.27 veces en la producción de etanol y se
detectó el consumo total de los azúcares del medio en comparación con las cinéticas de
fermentación en medio basal. Adicionalmente durante estos cultivos, K. africana presentó la
mayor concentración de ésteres de acetato, n-butanol, acetoína, ácido acético y 5-metil furfural.
S. cerevisiae nuevamente produjo la mayor concentración de alcoholes superiores, ésteres de etilo
y acetaldehído y en cultivo mixto la concentración producida de alcoholes superiores y 2-acetil
furan fue similar a la de K. africana, de acetato de isoamilo, 2-fenil etanol a S. cerevisiae y de
ésteres de etilo y acetato se produjo una concentración intermedia. A pesar que durante los
cultivos en medio reformulado K. africana aumentó significativamente su crecimiento y
capacidad fermentativa, su población celular continuó declinando. Por lo anterior, además del
medio de fermentación se analizó el efecto del oxígeno y la temperatura en continuo. Durante
estos cultivos, el medio de fermentación fue el factor de mayor peso sobre la supervivencia y
capacidad fermentativa de K. africana, debido a que durante las condiciones en medio
reformulado se incrementó 1.45 veces la formación de biomasa, 3.13 y 4.9 veces la formación de
UFC en S. cerevisiae y K. africana, 1.12 veces la producción de etanol y se consumió el 90% de
los azúcares del medio en comparación con las condiciones en medio basal. Sin embargo la
condición que favoreció el mayor crecimiento de K. africana así como de S. cerevisiae fue la
tercera condición (25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado), alcanzándose las máximas
concentraciones de biomasa, etanol y UFC (5.85 y 51. 35 gL-1, 1057.53, 7855 × 106 UFC mL-1)
con un total consumo de los azúcares del medio. Durante estas condiciones el oxígeno, la
temperatura y el medio de fermentación influyeron significativamente en la composición volátil
de la bebida, sin embargo el medio de fermentación fue el factor de mayor peso. Presentándose la
mayor concentración de alcoholes superiores, ésteres de etilo y ácidos en las condiciones en
medio reformulado y la mayor concentración de ésteres de acetato, acetaldehído, furanos, cetonas,
terpenos y acetales en las condiciones en medio basal.
11
ANTECEDENTES
ANTECEDENTES
El tequila es una bebida alcohólica destilada elaborada de la fermentación del jugo de Agave
tequilana Weber variedad azul (NOM-006-SCFI-2005, 2006) y cuyo proceso de elaboración
incluye: la cosecha de la planta de agave, el cocimiento de las cabezas para hidrolizar los
fructanos, la molienda de las cabezas de agave para extraer los azúcares, la fermentación de los
azúcares del jugo y una doble destilación del mosto para producir tequila “blanco” y si el
producto lo requiere un proceso de añejamiento de 3 a 12 meses para obtener tequila “reposado”
o “añejo” (Cedeño, 1995; NOM-006-SCFI-2005). Durante el proceso de elaboración de tequila,
la fermentación alcohólica representa la etapa de mayor importancia, debido a que durante este
período las levaduras producen etanol y compuestos volátiles y no volátiles que forman el
bouquet de la bebida (Valle-Rodríguez et al., 2011). Las características óptimas de las levaduras
empleadas para la fermentación incluyen: alta producción de etanol, alta velocidad de
fermentación, eficiencia en la conversión de sustrato a etanol, tolerancia a etanol y presión
osmótica, balance en la producción de compuestos volátiles deseables y baja producción de
biomasa (Pretorius, 2000).
13
alcanzar concentraciones que conducen a la muerte celular de algunas levaduras, incluyendo
cepas de S. cerevisiae (Ludovico et al., 2001; Fleet, 2003). (2) La llamada actividad killer ciertas
levaduras (Pérez et al., 2001; Mendoza et al., 2007). Este mecanismo consiste en la producción
de glicoproteínas extracelulares específicas por ciertas cepas de levadura (levaduras killer) que
son capaces de matar a otras cepas de levadura (levadura sensibles). (Díaz-Montaño & Rámirez-
Cordova, 2009). Algunas cepas que exhiben actividad killer positiva son levaduras del género
Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces,
Metschikowia y Cryptococos. (3) Mecanismo de contacto entre célula y célula. Nissen &
Arneborg (2003) reportó que la muerte temprana de dos levaduras vinícolas (K. thermotolerans y
T. delbrueckii) durante la fermentación mixta con S. cerevisiae no es debida a la presencia de
etanol ni a algún compuesto tóxico sino a un mecanismo de contracto entre célula y célula que
ocurre cuando S. cerevisiae esta presente en altas concentraciones celulares, abatiendo el
crecimiento de las levaduras presentes en menor cantidad. (4) Limitación nutricional en el medio
de cultivo. Durante la fermentación del mosto, el oxígeno y el nitrógeno asimilable son
rápidamente agotados debido tanto a las condiciones de crecimiento semianaeróbico, como al
bajo contenido de nitrógeno del jugo. Hansen et al (2001) reportó que T. delbrueckii y K.
thermotolerans son menos tolerantes a condiciones de baja disponibilidad de oxígeno que S.
cerevisiae, precisando de este nutriente para su crecimiento. Adicionalmente, trabajos previos
efectuados con H. guillermondii y K. africana han revelado que estas cepas tienen escaza
capacidad fermentativa debido al deficiente consumo de azúcar, en algunos casos relacionado con
una limitación nutricional y no a una intolerancia a etanol (Albergaria et al., 2003; Díaz-Montaño
et al., 2008). Bajo esta temática, recientemente se ha reportado que K. africana es capaz de
sobrevivir por mayor tiempo en la fermentación del jugo de agave, principalmente cuando el
medio no es limitante en nutrientes y se trabaja dentro de ciertas condiciones operacionales
(flujos volumétricos de aire < 0.03 vvm y temperaturas < 30ºC) (Díaz-Montaño et al., 2010;
Valle-Rodríguez et al., 2011).
14
HIPÓTESIS
HIPÓTESIS
Dado que existe evidencia experimental de que las levaduras no-Saccharomyces pueden
sobrevivir a lo largo de la fermentación cuando se proporcionan las condiciones adecuadas; se
propone que la concentración de oxígeno disuelto, la temperatura y la presencia de factores de
crecimiento son los principales factores que permitirán que una levadura tequilera del género
Kloeckera aumente su capacidad fermentativa al trabajar en cultivos mixtos con levaduras del
género Saccharomyces; contribuyendo además a diversificar el perfil aromático de la bebida.
16
JUSTIFICACIÓN
JUSTIFICACIÓN
18
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos específicos
20
IMPACTO
IMPACTO
Científico
Tecnológico
Económico
Social
La obtención de un tequila con mayor riqueza aromática, permitirá abrir un nuevo mercado a
nivel nacional e internacional, por lo que aumentaría las exportaciones fortaleciendo a la industria
y por ende manteniendo el empleo a su personal.
Regional
Ecológico
Con los resultados obtenidos en este trabajo, se evaluará la posibilidad de fermentar altas
concentraciones de azúcar, con la finalidad de disminuir las descargas contaminantes (vinazas)
así como reducir el uso de la energía durante la destilación.
22
FUNDAMENTACIÓN
FUNDAMENTACIÓN
FUNDAMENTACIÓN
24
FUNDAMENTACIÓN
La fermentación alcohólica es el proceso por el cual, los azúcares simples como la glucosa o la
fructosa contenidas en el mosto se convierten en alcohol etílico. Para llevar a cabo este proceso es
necesaria la presencia de levaduras, y algunas clases de bacterias donde el oxígeno es el
desencadenante inicial de la fermentación, ya que las levaduras lo van a necesitar en su fase de
crecimiento (Amaral, 1989). Sin embargo en el proceso de fermentación conviene que la
presencia de oxígeno sea pequeña para evitar el consumo de etanol por parte de los
microorganismos y la conversión de éste en ácido acético y acetilo.
25
FUNDAMENTACIÓN
La ruta metabólica para la conversión de los azúcares en etanol y dióxido de carbono y otros
compuestos es llevada a cabo a través de la glucólisis, la cual se ilustra en la Figura 1.1.
26
FUNDAMENTACIÓN
Las levaduras son microorganismos unicelulares que presentan formas ovaladas, redondas y
elípticas, miden de 3-7 micras de ancho por 5-12 de largo y son cerca de cinco veces más grandes
que las bacterias. Existen alrededor de 350 especies de levaduras (cada una con un aspecto
morfológico característico que aún en cultivo puro presentan variaciones considerables de tamaño
y forma de las células individuales, dependiendo de la edad y del medio), separadas en unos 39
géneros.
La reproducción de las levaduras puede ser por un proceso asexual o sexual, siendo la más común
la reproducción asexual a través de la formación de un brote o protuberancia en la superficie de la
célula madre, que después de crecer se separa, formando una célula nueva. Este ciclo es de
aproximadamente 30 minutos, produciendo la célula madre cerca de 24 generaciones de células
hijas durante su ciclo vital (Pelczar et al., 1990). En el metabolismo de las levaduras los
nutrientes son transformados en células y productos nuevos mediante una serie de reacciones
llevadas a cabo por la ruta de Embden – Meyerhof – Parnas (EMP) (Figura 1.1), en la cual el
ácido pirúvico producido durante la glucólisis se convierte en acetaldehído y etanol, donde
monosacáridos como glucosa y fructosa son los componentes principales ya que interviene como
generador de energía y material de construcción celular (Quintero, 1993).
27
FUNDAMENTACIÓN
adecuado perfil de aromas, altos rendimientos y, una buena estabilidad de la cepa (Lachance,
1995). Las levaduras del género Saccharomyces dominan la fermentación alcohólica, siendo sus
características principales: alta tolerancia a alcohol (>11 %v/v), estabilidad de cultivo, alta
rapidez de división y rápido consumo de azúcares, tolerante a un rango amplio de pH (2.4 – 8.2),
alta conversión de azúcar a etanol y una baja exigencia en las necesidades nutrimentales
(azúcares simples como fuente de carbono, sales de amonio como fuente de nitrógeno y en
alguno casos la biotina o vitamina B8 como factores de crecimiento) (Pretorius, 2000). En
adición, las levaduras del género Saccharomyces presentan otras importantes características que
contribuyen a su alta eficiencia fermentativa como son: 1) Crabtree positivas, es decir su
actividad glicolítica se incrementa en presencia de oxígeno y altas concentraciones de azúcar,
permitiendo un incremento en la biomasa, en concentración intracelular de piruvato y en la
formación de etanol (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009), 2) Las rutas metabólicas de la
fermentación y la glucólisis son muy eficientes en esta levadura, pudiendo convertir el 51% de
los azúcares iniciales a etanol y 3) ésta levadura es capaz de resistir el estrés osmótico causado
por las altas concentraciones de azúcar y etanol (Pretorius, 2000; Pina et al., 2004). No obstante a
pesar de su alta capacidad fermentativa, las levaduras del género Saccharomyces presentan una
baja capacidad de síntesis de compuestos sensorialmente importantes, ya que por regla general
las cepas que producen altas concentraciones de etanol, producen menos concentración de
compuestos volátiles (Moreno et al., 1991).
Algunos autores han reportado que las primeras etapas de la fermentación espontáneas en vinos,
son dominadas activamente por las levaduras no-Saccharomyces (levaduras no convencionales),
principalmente por las cepas de los géneros Kloeckera/Hanseniaspora (Fleet, 2003; Cianni &
Picciotti, 1995) La alta tolerancia a concentraciones de sustrato (> 200 gL-1) de estas levaduras
28
FUNDAMENTACIÓN
explica su predominancia en las primeras etapas de la fermentación (Ciani & Fatichenti, 1999).
Sin embargo el crecimiento de estas levaduras esta condicionado a los primeros días de la
fermentación, tiempo después del cual mueren por una presunta intolerancia a etanol (5-6% v/v)
y/o a una limitación nutricional, cediendo su paso a levaduras mucho más resistentes del género
Saccharomyces (levaduras convencionales) (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009). No
obstante a pesar de su corto periodo activo durante la fermentación, las levaduras no-
Saccharomyces del género Kloeckera/Hanseniaspora contribuyen al sabor y a la calidad
aromática del producto final, ya que tienen la capacidad de producir y secretar enzimas al medio,
tales como β-glucosidasas, que liberan monoterpenos derivados de sus formas glucosidadas,
aportando descriptores florales y frutales al producto final (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova,
2009). La contribución de las levaduras no-Saccharomyces al bouquet de la bebida está
condicionado por su supervivencia durante la fermentación, la cual se ha reportado en las
fermentaciones del jugo de uva y agave depende ciertos factores. Hansen et al. (2001) observó
que la muerte de levaduras del género T. delbrueckii y K. thermotolerants en cultivos mixtos con
S. cerevisiae está asociada principalmente con la baja disponibilidad de oxígeno en el medio de
cultivo y no por la presencia de compuestos tóxicos producidos por S. cerevisiae como el etanol.
Por otro lado Erten (2002) reportaron que la disminución en la población celular de las levaduras
del género apiculata en la fermentación del jugo de uva con S. cerevisiae es debida a la
temperatura de fermentación, obteniéndose una mayor viabilidad a temperaturas bajas (< 20ºC),
un aumento en la concentración de ésteres de etilo y una reducción de alcoholes superiores.
Posteriormente Nissen & Arneborg (2003) dedujeron que la principal causa del paro del
crecimiento K. thermotolerans y T. delbrueckii en la fermentación de jugo de uva en cultivo
mixto con S. cerevisiae no es debida ni a una limitación nutricional ni a la presencia de
compuestos tóxicos inhibitorios, sino más bien a un mecanismo de contacto entre célula y célula
dependiente de la presencia de altas concentraciones de células viables de S. cerevisiae. Llegaron
a estas conclusiones al realizar varias fermentaciones en cultivo puro y mixto con las tres
levaduras. En cultivo puro observaron que K. thermotolerans y T. delbrueckii presentan altas
concentraciones celulares y no cesan su crecimiento; sin embargo para dar respuesta al porqué
del fenómeno observado en cultivo mixto, realizaron fermentaciones en cultivo mixto empleando
un tubo de diálisis compartimentado, el cual separó a S. cerevisiae y las levaduras no-
29
FUNDAMENTACIÓN
Cabe mencionar que durante la fermentación las levaduras nunca encuentran el ambiente
fisiológico óptimo; y son de hecho expuestas simultánea y secuencialmente a una gran cantidad
de condiciones de estrés como son: la oxidación, el estrés hiperosmótico, el estrés iónico, altas
temperaturas, la presencia de ácidos orgánicos y alcoholes, altas concentraciones de etanol,
limitación nutricional e inanición. En respuesta a éstas condiciones de estrés, las células activan y
coordinan una serie de actividades intracelulares específicas para responder, adaptarse y
aumentar la probabilidad de sobrevivir y proliferar. Esta respuesta implica un estricto control del
30
FUNDAMENTACIÓN
31
FUNDAMENTACIÓN
mohos, bacterias) tengan oportunidad de multiplicarse (Brown et al., 1989). Sin embargo, ahora
se sabe que en las fermentaciones espontáneas del vino y del tequila, participan una sucesión de
diferentes poblaciones de levaduras que pueden contribuir positivamente al bouquet de la bebida
final ya que sintetizan una gran variedad de compuestos volátiles (Lachance et al., 1995, Romano
et al., 2003).
32
FUNDAMENTACIÓN
apiculata, C. pulcherrima y S. cerevisiae en la fermentación del jugo de uva; encontrando que las
especies no-Saccharomyces, pueden crecer y sobrevivir en cultivo mixto con S. cerevisiae,
produciendo bajos contenidos de alcohol y altas concentraciones de acetato de etilo. Sin embargo
S. cerevisiae resultó ser la especie dominante en todos los casos, mostrando altos contenidos de
etanol y bajos de acetato de etilo, en comparación a los cultivos puros de las levaduras no-
Saccharomyces. Concluyendo que la presencia de las levaduras no-Saccharomyces durante la
fermentación con S. cerevisiae pudiese ser de interés tecnológico, por el gran contenido de
acetato de etilo y otros ésteres de cadena corta como hexanoato de etilo y acetato de isoamilo
contribuyendo a las propiedades de sabor de la bebida aportando notas florales y frutales.
Tabla 1.1: Productos secundarios de las fermentaciones llevadas a cabo por K. apiculata (K), H. guillermondii
(H) y S. cerevisiae (S) en cultivos puros, mixtos y secuenciales.
Cultivos
Compuestos
-1 Puros Mixtos Secuenciales I Secuenciales II
(mg L )
S H K HS KS HS KS HS KS
Etanol (%) 9.52 4.26 4.42 9.64 9.59 9.54 9.57 10 10.7
n-Propanol 59 17 14 81 82 95 111 146 128
Isobutanol 43 16 13 36 36 37 39 31 34
Alcohol amílico 37 7 8 28 29 16 22 14 16
Alcohol isoamílico 198 22 23 130 125 73 84 63 58
Acetoína Tr 184 147 Tr Tr Tr Tr 11 8
2,3 – Butanediol 448 653 791 415 446 620 654 534 459
Tr: Trazas. Los valores obtenidos es el promedio de triplicados. (Datos obtenidos de Zironi et al. 1995)
Asimismo otro estudio conducido por Moreira et al. (2004) mostró que el empleo de levaduras
no-Saccharomyces del género Hanseniaspora con S. cerevisiae, puede resultar atractivo por la
síntesis de compuestos que contribuyen a la composición aromática del producto final. Llevaron
a cabo fermentaciones en cultivo puro y mixto con H. guilliermondii, H. uvarum y S. cerevisiae.
Encontrando que los cultivos puros y mixtos de las levaduras presentan similares rendimientos
de etanol y diferentes velocidades específicas de crecimiento, produciendo H. guilliermondii la
mayor concentración de acetato de fenetilo y 2-fenil etanol en cultivo puro y mixto y S.
cerevisiae por su parte sólo produjo niveles similares de metionol y 2-metiltetrahidrotiofen-3-ona
que H. guilliermondii. Concluyendo que el empleo de las levaduras apiculata en la fermentación
33
FUNDAMENTACIÓN
del jugo de uva con S. cerevisiae, puede resultar beneficioso por la producción de compuestos
aromáticos que contribuyen significativamente a realzar el bouquet del vino como el acetato de
fenetilo y 2-fenil etanol, aportando sabores florales y frutales.
34
FUNDAMENTACIÓN
En la fermentación alcohólica existen diferentes sistemas de cultivo para producir las células
necesarias y/o para la transformación del azúcar a etanol. En cada uno de estos cultivos es
importante mantener las condiciones óptimas en la cuales la levadura podrá trabajar y transformar
de esta forma la glucosa a etanol, dichas condiciones varían en función de la levadura que se
utilice en la fermentación.
El cultivo por lote también conocido como fermentación discontinua, batch o sistema cerrado, es
el que se utiliza actualmente en la industria del tequila (Figura 1.2). Consiste en preparar un
medio con al menos una fuente de carbono y nitrógeno más el microorganismo (levadura) que se
desee emplear y no se adiciona ningún otro nutriente, es decir, el flujo de alimentación (Fent) y el
flujo de salida (Fsal) son iguales a cero:
Fent = Fsal = 0
Algunas de las ventajas que se presentan al utilizar un cultivo por lote es que los costos de
inversión son muy bajos, requiere escaso control y puede ser escalado al proceso industrial sin
muchos problemas (Çaylak & Vardar-Sukan, 1998). Una de las desventajas del cultivo por lote es
que requiere mucho espacio en planta, y el periodo de fermentación es largo (Virkajarvi, 2001),
además de los tiempos muertos entre cada corrida.
35
FUNDAMENTACIÓN
(1) Fase de adaptación (lag). En esta etapa, el microorganismo se adapta a las nuevas
condiciones y reorganiza sus constituyentes moleculares y dependiendo de la
composición de los nutrientes, nuevas enzimas son sintetizadas y/ reprimidas.
(2) Fase exponencial. Durante esta fase, los nutrientes se encuentran en exceso, y el
microorganismo crece a su velocidad de crecimiento máxima (µmax), de tal manera que
cada célula se divide para formar dos células, cada una de las cuales también se divide
para formar dos células más y así sucesivamente. La mayor parte de los organismos
unicelulares crecen exponencialmente. La velocidad de crecimiento exponencial varía de
un organismo a otro. Las condiciones ambientales como la temperatura y la composición
del medio de cultivo, afectan a la velocidad de crecimiento exponencial así como a las
características del microorganismo.
36
FUNDAMENTACIÓN
(3) Fase estacionaria. En esta fase no hay aumento neto de microorganismos, lo que no
significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos se
compensa por la muerte de otros. Durante la fases estacionaria la concentración total de
masa celular permanece constante, pero el número de células viables decrece, así mismo
la lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable descender. Durante la fase
estacionaria, la célula cataboliza reservas celulares para generar nuevos bloques de
construcción y monómeros para producir energía. A este fenómeno se le denomina
metabolismo endógeno. La célula también puede gastar energía para mantener una
membrana energizada y transportar nutrientes y para funciones metabólicas esenciales;
tales como, su movilidad y reparación del daño a estructuras celulares. Este gasto
energético es llamado energía de mantenimiento.
(4) Fase de muerte. Durante esta etapa ocurre una disminución en la concentración de células
vivas. Esta baja es resultado de los subproductos tóxicos y/o del agotamiento del abasto
de nutrientes (Black, 1996).
El lapso de cada una de estas fases depende de varios factores tal y como: la cepa de
microorganismo empleado, la composición y concentración del medio de cultivo empleado, las
condiciones operacionales y ambientales, y de la preparación del inóculo.
𝐝𝐱
𝐝𝐭
= 𝛍𝐱 (1)
𝐱 𝐭 = 𝐱 𝟎 𝐞𝛍 (2)
37
FUNDAMENTACIÓN
𝛍 𝐒
𝛍 = (𝐊𝐦á𝐱
!𝐒)
(3)
𝐒
Si el organismo tiene una alta afinidad hacia el sustrato (se tendrá un valor de Ks bajo), la
velocidad de crecimiento no se verá afectada hasta que la concentración de sustrato alcance un
valor muy bajo. Por el contrario si el microorganismo tiene una baja afinidad hacia el sustrato (se
tendrá un valor de Ks alto), y en estas condiciones la velocidad de crecimiento se verá afectada a
una alta concentración de sustrato (Ecuación 3).
38
FUNDAMENTACIÓN
El cultivo continuo o sistema abierto se ha utilizado desde 1950´s en las fermentaciones de vino
y cerveza debido a las altas productividades obtenidas comparadas con los sistemas tradicionales
por lote, sin embargo, la industrial del tequila no ha explorado las posibles mejoras que las
fermentaciones en continuo podrían ofrecer. El sistema en cultivo continuo se caracteriza por
buscar la producción constante de células por un período largo de tiempo, el cual se consigue por
la adición de un volumen constante de sustrato al medio de cultivo y por la salida del mismo
volumen del fermentador. El flujo de alimentación y el de salida de sustrato deben de ser iguales
y diferentes de cero (Figura 1.3) (Çaylak & Vardar-Sukan, 1998; Hernández-Cortés et al., 2009).
Fent = Fsal ≠ 0
El sistema continuo tiene la ventaja de ser un sistema sencillo de operar y controlar durante la
fase estacionaria, lo cual facilita la estandarización del proceso y permite mantener una misma
calidad del producto. Adicionalmente este sistema reduce la contaminación microbiana
manifestándose en mayores rendimientos en la conversión azúcar-etanol, aumenta la
productividad de etanol, incrementa la disponibilidad de espacios en fábricas, debido a que con
este sistema continuo se pueden fermentar grandes volúmenes de medio de cultivo, además de
reducirse los costos de operación del proceso global ya que se puede sincronizar esta etapa con
otras del proceso que también están en continuo, economizando la energía eléctrica y el vapor de
39
FUNDAMENTACIÓN
!" !
!"
= ! x! − x + µμ x
(5)
!"
Sin embargo, cuando se alcanza el estado estacionario !"
= 0 y x! = 0, de tal manera que se
obtiene:
!
!
x = µμx
(6)
40
FUNDAMENTACIÓN
!
!
= D
(7)
D = µμ (8)
En todas las etapas del proceso de tequila se generan compuestos volátiles que impactan en el
bouquet de la bebida final, sin embargo la etapa fermentativa juega un rol muy importante, ya
que ahí se sintetiza todo el etanol y la mayor parte de los compuestos volátiles y no volátiles por
acción de las levaduras; entre los compuestos no volátiles están involucrados: ácidos orgánicos,
aminoácidos y péptidos (Figura 1.4). Dentro de los compuestos volátiles se encuentran los
llamados mayoritarios y los minoritarios que incluyen acetales, ácidos, alcoholes, aldehídos,
ésteres, éteres, furanos, cetonas, fenoles, pirazinas, compuestos azufrados, terpenos, amidas y
aminas (Benn & Peppard, 1996).
41
FUNDAMENTACIÓN
Figura 1.4: Representación esquemática de la derivación de compuestos aromáticos activos provenientes del
metabolismo de los azúcares, aminoácidos y azufre en levaduras.
1.5.1 Compuestos volátiles
42
FUNDAMENTACIÓN
Los alcoholes superiores también conocidos como alcoholes de fusel son metabolitos secundarios
de las levaduras, y pueden tener impactos positivos y negativos en el sabor y el aroma de las
bebidas alcohólicas. Concentraciones excesivas (> 400 mg L-1) de alcoholes superiores pueden
resultar en olores y sabores fuertes y picantes, mientras que a niveles menores (< 300 mg L-1)
imparten características frutales a la bebida. Los alcoholes superiores están divididos en dos
categorías: 1) Los alcoholes alifáticos que incluyen al n-propanol, alcohol isoamílico, isobutanol
y el alcohol amil activo y 2) Los alcoholes aromáticos que están constituidos por el 2-fenil etanol
y el tirosol. Varios factores afectan la concentración de alcoholes superiores como son: el uso de
diferentes cepas de levaduras durante la fermentación, la concentración de aminoácidos
(precursores de los alcoholes superiores) en el mosto, que aumenta con el incremento del
aminoácido correspondiente, la concentración de etanol, la temperatura de fermentación, el pH, la
composición del medio y la aireación (Swiegers & Pretorius, 2005). Se ha reportado que la
presencia de levaduras no-Saccharomyces durante la fermentación afecta significativamente la
concentración de alcoholes superiores, por ejemplo la fermentación en cultivo mixto de P.
fermentans y S. cerevisiae produce un sustancial incremento de alcoholes superiores tal como n-
propanol, n-butanol y 1-hexanol comparado con aquellas fermentaciones efectuadas solamente
con S. cerevisiae (Clemente-Jiménez et al., 2005). Sin embargo otros estudios como el realizado
por Zironi et al. (1993) mostraron que el empleo de levaduras no-Saccharomyces del género
apiculata en cultivo mixto y secuenciales con S. cerevisiae produce concentraciones de alcoholes
similares a las producidas por S. cerevisiae en cultivo puro. La mayoría de los compuestos
volátiles pueden ser producidos por las levaduras (Figura 1.5), por degradación exógena de
aminoácidos, ó por asimilación de azúcares a través de la síntesis de cetoácidos. La piruvato
descarboxilasa convierte al cetoácido resultante en el correspondiente aldehído de cadena
ramificada, y la alcohol deshidrogenasa cataliza la reducción del NADH-dependiente de este
aldehído en el correspondiente alcohol superior. De igual forma, los alcoholes superiores pueden
ser generados por degradación de los aminoácidos de cadena ramificada a través de la ruta de
Ehrilich. Durante este proceso, las levaduras utilizan al menos tres aminotransferasas, cinco
descarboxilasas y seis deshidrogenasas (Díaz-Montaño et al., 2009; Swiegers & Pretorius, 2005).
43
FUNDAMENTACIÓN
1.5.1.2 Glicerol
El glicerol conjuntamente con el etanol, juegan un papel muy importante en la fijación de aromas
que contribuyen a la viscosidad de las bebidas fermentadas. La síntesis de glicerol ocurre en una
reacción acoplada a la glucólisis a nivel del glicerladehido-3-fosfato (Figura 1.4). La formación
de etanol es posible solamente si el NAD+ es regenerado. La regeneración del cofactor
enzimático ocurre principalmente en la producción de glicerol. También, la producción de ácido
succínico y ácido acético restablecen el NAD+ a NADH. Algunos reportes sugieren que las
levaduras del género Kloeckera, producen este metabolito en el rango de 1.36 a 4.44 gL-1 y las
levaduras S. cerevisiae y H. guillermondii lo producen en el rango de 4.8 a 8.3 gL-1
respectivamente (Romano et al., 1997; Rojas et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2008).
44
FUNDAMENTACIÓN
Cerca de 100 ácidos orgánicos se han reportado en bebidas alcohólicas, tales como acetatos,
succinatos, α- cetoglutarato, malato y citrato, los cuales son derivados del piruvato vía ciclo de
los ácidos tricarboxílicos y son producidos por las levaduras, por ejemplo el ácido palmítico,
ácido palmitoleico, ácido esteárico y ácido oleico; estos ácidos son importantes precursores de
ésteres en la producción de bebidas alcohólicas. Los ácidos orgánicos de cadena corta de carbono
describen la acidez volátil en ciertas bebidas como el vino, en donde su contenido se sitúa entre
los 500 y 1000 mg L-1 (10-15% del contenido total del ácido) y por esto, el ácido acético
constituye usualmente cerca del 90% de los ácidos volátiles. El resto de los ácidos volátiles,
principalmente el ácido propanoico y hexanoico son producidos como resultado del metabolismo
de ácidos grasos de levaduras y bacterias. El ácido acético es de particular importancia. A
elevadas concentraciones imparte notas a vinagre (concentraciones entre 0.7-1.1 gL-1), y en el
rango de 0.2-0.7 gL-1 contribuyen a la propiedades de aroma en la bebida. Ciertos reportes han
sugerido que la concentración de ácido acético varía en función de la cepa de levadura empleada
y las condiciones de fermentación (Erten, 2002; Bilbao et al., 1997; Díaz-Montaño et al., 2008,
Romano et al., 2003). Sin embargo otros estudios como el realizado por Rojas et al. (2003)
sugieren similares concentraciones de ácido acético entre diferentes géneros de levadura como H.
guilliermondii y S. cerevisiae en cultivos puros y mixtos, alcanzando concentraciones superiores
a las 900 ppm. Por otro lado Bilbao et al. (1997) observó diferencias en la concentración de ácido
acético con respecto a la temperatura, mostrando que para las levaduras del género Kloeckera la
concentración se sitúan entre 0.66 – 0.77 gL-1 y para S. cerevisiae en el rango de 0.02 – 0.04 gL-1.
Estudios efectuados en tequila por su parte, muestran que las levaduras del género Kloeckera
sintetizan ácido acético en el rango de 92.3±18 ppm y S. cerevisiae no se detectó el compuesto
bajo las condiciones de estudio (Díaz-Montaño et al., 2008).
1.5.1.4 Ésteres
Los ésteres son formados por las levaduras y bacterias a través de la fermentación alcohólica
(esterificación biológica) y una muy pequeña parte durante el añejamiento (esterificación
química). Su producción, puede tener un efecto significativo sobre los aromas y sabores frutales
de la bebida (Figura 1.6). Los ésteres más significativos que tiene un alto impacto sobre las
propiedades aromáticas de la bebida son: el acetato de etilo (aroma frutal y solvente), acetato de
45
FUNDAMENTACIÓN
isoamilo (aroma a pera), acetato de isobutilo (aroma a banana), hexanoato de etilo (aroma a
manzana) y acetato de fenetilo (aroma a miel, frutal y floral). Debido a que el etanol es el alcohol
más abundante, los ésteres de etilo son los que predominan, seguidos por los ésteres amílicos y
propílicos, por su parte el acetato de etilo es el que predomina en bebidas alcohólicas, y cuanto
está presente en altas concentraciones (> 50 mg L-1 en cerveza y >175 mg L-1 en whisky) confiere
malos olores. Los ésteres, especialmente el acetato de etilo, son producidos por las levaduras del
género Kloeckera, principalmente (Romano et al., 2003; Rojas et al., 2001 y Díaz-Montaño et al.,
2008). Otros autores por su parte han reportado que no existen diferencias significativas en su
concentración entre cultivos puros y mixtos de H. guillermondii, H. uvarum y S. cerevisiae
(Moreira et al., 2005). No obstante en cultivos mixtos, los niveles de acetato de etilo producido
podrían contribuir a las notas frutales y mejorar la complejidad general de la bebida. Rojas et al.
(2003) reportó que las fermentaciones en cultivo mixto de levaduras silvestres, tales como H.
guillermondii y P. anomala, con S. cerevisiae incrementan la concentración de ésteres de acetato,
en comparación con las fermentaciones efectuadas con S. cerevisiae en cultivo puro, sin afectar
significativamente la concentración de acetaldehído, ácido acético, glicerol y alcoholes superiores.
Erten (2002) por su parte encontró diferencias significativas en la concentración de acetato de
etilo, butirato de etilo, acetato de isoamilo y hexanoato de etilo en el rango de temperatura de 10
a 25 ºC en los cultivos mixtos de Kloeckera y Saccharomyces. Incrementándose su concentración
a bajas temperaturas.
Por otra parte Benn & Peppard (1996) identificaron más de 175 compuestos volátiles en tres tipos
de tequilas agrupándolos en ocho familias de compuestos, donde la mayor cantidad de
compuestos identificados estuvieron situados en el grupo de los ésteres, con aproximadamente 50
compuestos individuales detectados en los extractos. Siendo la mayoría ésteres de etilo, otros
ésteres de metilo, ésteres de isoamilo y ésteres de fenetilo, que incluían ésteres insaturados, ceto-
ésteres e hidroxiésteres. Todos ellos o su gran mayoría son productos del metabolismo de la
levadura ó son formados subsecuentemente durante el proceso de añejamiento por esterificación
de los ácidos grasos en la presencia de altas concentraciones de etanol.
46
FUNDAMENTACIÓN
Figura 1.6: Representación esquemática de la síntesis de acetato de etilo y acetato de isoamilo en levaduras
Los grupos carbonilo son compuestos que consisten de grupos aldehídos alifáticos, aromáticos y
cetonas: más de 200 miembros de este grupo han sido detectados en bebidas alcohólicas. Una
parte de los compuestos carbonilos se sintetizan por la acción metabólica de las levaduras, la
mayoría se producen por reacciones térmicas, que ocurren durante el procesamiento de la materia
prima y el sustrato, así como en la pasteurización y destilación del producto (Berry & Watson,
1991).
1.5.1.6 Aldehídos
47
FUNDAMENTACIÓN
1.5.1.7 Cetonas
Las cetonas tienen baja volatilidad y alto umbral de sabor (suma de atributos sensoriales que
incluyen el gusto y las sensaciones trigeminales); el más abundante es el piruvato y el menos
abundante el ácido α − cetobutírico, tienen influencia en el sabor del vino y la cerveza. Los
niveles de piruvato son controlados por factores similares a los aldehídos, éstos son producidos
por las levaduras durante las fases activas de fermentación y son reabsorbidos más tarde si la
levadura permanece activa. Los niveles iniciales de piruvato están controlados por factores que
tienen influencia en la velocidad de fermentación y crecimiento de la levadura, la reabsorción es
controlada por los factores que influyen en la viabilidad celular y la actividad bioquímica (Berry
& Watson, 1991). Además del piruvato, otro compuesto importante involucrado en el bouquet de
las bebidas alcohólicas, es la acetoína un compuesto clave en síntesis de 2,3-butanediol y
diacetilo, producido de igual manera durante la fermentación por la actividad microbiana de
levaduras y bacterias. Su contribución al sabor y el aroma no es fácil de evaluar, ya que ni el 2,3-
48
FUNDAMENTACIÓN
butanediol y la acetoína producen olores fuertes, de hecho sus valores de umbral son muy altos
alrededor de los 150 mg L-1, sin embargo el diacetilo se ha asociado como un compuesto que
produce malos olores (a niveles de umbral < 8 mg L-1) (Romano et al., 1996). Este compuesto es
sintetizado a partir del ácido pirúvico a través de la condensación de una molécula de piruvato y
otra de acetaldehído activo que se combinan con el pirofosfato de tiamina (complejo
acetaldehído-TPP), formando el α-acetolactato. El diacetilo proviene de la descarboxilación
oxidativa del α-acetolactato. La acetoína puede ser formada por la descarboxilación no oxidativa
del ácido α-acetolactato o por la reducción del diacetilo (Romano et al., 1996). El principal
factor que afecta su producción es el tipo de levadura utilizada (Romano et al., 2003). Ciertos
reportes sugieren que la producción de acetoína es una característica distintiva de las levadura
apiculata (Romano et al., 1996; Romano et al., 2003; Ciani et al., 2006) alcanzando
concentraciones en el rango de 100 – 200 ppm (K. apiculata y H. guillermondii), por su parte
para S. cerevisiae, se ha asociado su presencia en las primeras etapas de la fermentación,
reduciendo su concentración hacia el final de la misma, posiblemente por su reducción a 2,3-
butanediol (Romano et al., 1996).
49
FUNDAMENTACIÓN
el mosto que contienen sulfuro, sulfato y sulfito (Como el sulfato de amonio o el fosfato
diamonico ) ó de compuestos orgánicos que contienen sulfuro como la cisteína y el glutatión. En
S. cerevisiae el H2S es el producto de una secuencia de reacciones de reducción del sulfato, que
actúa como un intermediario en la síntesis de aminoácidos que contiene azufre (Swiegers et al.,
2005). Existen pocos reportes sobre la producción de compuestos azufrados por levaduras no-
Saccharomyces, sin embargo los pocos disponibles sugieren que K. apiculata y H. guillermondii
producen concentraciones menores de 10 ppm de SO2, y en relación al H2S, K. apiculata produce
las mayores concentraciones (Romano et al., 1997). Por otra parte Moreira et al. (2005) encontró
que la producción de compuestos azufrados esta asociado al tipo de levadura empleada.
Encontrando que los cultivos puros y mixto de levaduras apiculatas como H. uvarum producen la
mayor concentración de estos metabolitos (metionol, ácido 3-metiltiopropionico y 2-metil-
tetrahidrofuran-3-ona).
1.5.1.9 Fenoles
1.5.1.10 Terpenos
50
FUNDAMENTACIÓN
51
FUNDAMENTACIÓN
Existe poca referencia de la producción de amidas y aminas por levaduras, estos compuestos
pueden afectar el sabor de las bebidas alcohólicas en cantidades pequeñas; confiriendo notas
dulces. Las aminas son posiblemente formadas por la descarboxilación de aminoácidos en la
fermentación y por transaminación de un aldehído (Berry & Watson, 1991).
1) Prado et al. (2002) estudió los compuestos volátiles presentes en las diferentes etapas del
proceso de producción del tequila. Para la extracción de los compuestos volátiles se utilizó el
método de extracción líquido-líquido por lote y el extracto se analizó por cromatografía de gases
acoplada a masas (identificación) y cromatografía de gases con un detector de ionización de
flama (cuantificación). En este estudio se separaron 562 compuestos de las diferentes etapas del
proceso de elaboración del tequila, de los 562 se identificaron y cuantificaron 410.
2) Aguilar-Cisneros et al. (2003) evaluaron la autenticidad del tequila. En este estudio se utilizó
la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con relación isotópica (SPME-
52
FUNDAMENTACIÓN
HRGC-IRMS) para comparar tequilas blancos, reposados y añejos auténticos con tequilas
comerciales y otro tipo de bebidas espirituosas. Por otro lado esta técnica les permitió saber el
origen del etanol, es decir, de cual materia prima provenía en base a la relación isotópica que
guardan los elementos carbono y oxígeno del etanol.
3) Vallejo-Córdoba et al. (2000) identificaron los compuestos volátiles de tequilas blancos,
reposados, añejos y extraañejos. La técnica utilizada para la extracción de compuestos volátiles
fue la microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases (SPME-CG-EM). El
método de identificación fue espectrometría de masas. Se identificaron 17 compuestos.
4) Benn & Peppard (1996) estudiaron el aroma característico de tres tipos de tequilas (blanco,
reposado y añejo). Los métodos de identificación que se utilizaron fueron: cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía de gases acoplada a olfatometría
(GC-O). Se analizaron diferentes clases de tequila: blanco, reposado y añejo, en donde el tequila
blanco presentó un mayor número de compuestos volátiles. Se identificaron alrededor de 175
compuestos volátiles. El análisis sensorial les permitió determinar los compuestos que tienen
mayor poder odoractivo en el tequila; estos son isovaleraldehído, alcohol isoamílico,
β−damascenona, 2-feniletanol y vainillina.
5) Estarrón-Espinosa (1997) identificó los principales compuestos volátiles que caracterizan al
tequila blanco 100% de Agave. Para la extracción de los compuestos volátiles se utilizó el
método de extracción líquido-líquido en continuo. Los extractos se analizaron por cromatografía
de gases-espectrometría de masas (identificación) y cromatografía de gases con detector de
ionización de flama (cuantificación).
53
FUNDAMENTACIÓN
que definen el perfil sensorial del producto en olor, gusto, aroma, textura y sensaciones
trigeminales (Meilgaard et al., 1999).
54
PROCEDIMIENTO Y
MÉTODO
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Las levaduras utilizadas fueron: Saccharomyces cerevisiae (S1 y S2), Kloeckera africana (K1) y
Kloeckera apiculata (K2), ambas pertenecientes al banco de cepas del Centro de Investigación y
Asistencia Tecnológica y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ) y aisladas a partir de una
fermentación espontánea de jugo de Agave tequilana Weber var azul (Región central del valle de
Tequila y de la región de Los Altos) (Figura 2.1) (Díaz-Montaño et al., 2008).
Figura 2.1 Morfología de K. africana K1 (A), K. apiculata K2 (B), S. cerevisiae S1 (C) bajo anaerobiosis no estricta
en jugo de agave
56
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
levaduras del género Saccharomyces. Estos cultivos se mezclaron en una proporción 1:1 con una
solución de glicerol (50% v/v), previamente esterilizada y se distribuyó en tubos Eppendorf (de 2
mL) 1 mL de cultivo; posteriormente, los tubos se conservaron en un criorefrigerador a -70 °C.
Jugo de agave utilizado. En todas las fermentaciones llevadas a cabo durante este estudio de
investigación se empleó un mismo lote de jugo de Agave tequilana Weber var. azul 100%
(conteniendo solamente los azúcares extraídos por cocción de las cabezas de agave) que fue
amablemente donado por la destilería de tequila “La Cava de Oro” (ubicada en la Región de
Tequila, Jalisco) y se almacenó a -20 °C en contenedores de 20 L. Previo a su uso, el jugo de
agave se descongeló, se filtró (presentando una concentración de 28-30 °Brix), se ajustó a la
concentración de azúcares deseada según fuera el medio de crecimiento ó fermentación
añadiendo agua destilada y se esterilizó.
Para llevar a cabo el estudio cinético las levaduras seleccionadas en la fermentación de jugo de
agave, las cepas conservadas a -70 ºC se reactivaron como se menciona continuación. (Figura
2.2).
57
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
200 mL de jugo de agave ajustado con agua destilada a 3 ºBrix (27 ± 2 gL-1 de azúcares
reductores) adicionado con 1 gL-1 de sulfato de amonio (220 mg NL-1) para obtener el inóculo. El
cultivo se incubó a 30 ºC y 250 rpm durante 12 h (tiempo en el que a estas condiciones, las
levaduras seleccionadas llegan a la fase de desaceleración en el cultivo por lote, determinado en
la cinética mostrada en la Figura 2.3).
2.5
2.0
Biomasa gL-1
1.5
1.0
K1
0.5 K2
S1
S2
0.0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
Figura 2.3 Cinéticas de crecimiento en lote de S. cerevisiae (S1 y S2) y K. africana (K1) y K. apiculata (K2) en el
medio de crecimiento (González, 2009).
El jugo de agave se ajustó con agua destilada a una concentración inicial de azúcares reductores
de 100 ± 11 gL-1. En la mayoría de los casos, se adicionaron diferentes concentraciones de
nitrógeno orgánico e inorgánico según fuera el tratamiento, asimismo otros nutrientes como
ciertos factores de crecimiento fueron añadidos al medio de cultivo. El pH inicial del medio de
fermentación varió dependiendo de los nutrientes adicionados y de su concentración, pero en
58
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
En cultivo por lote las fermentaciones se efectuaron a nivel matraz y biorreactor dependiendo del
experimento. En matraz se realizaron las fermentaciones de aquellos diseños experimentales en
los que se requerían de varias unidades experimentales, considerando la repetición de cada una de
éstas, como por ejemplo para la selección de las levaduras en cultivo puro y mixto (Figura 2.4-A).
Para llevar a cabo las fermentaciones, se emplearon matraces Erlenmeyer con capacidad de 500
mL que contenían 250 mL de medio de cultivo. Se sellaron con tapones de algodón para permitir
la entrada de oxígeno al medio y la salida de dióxido de carbono que se producía durante la
fermentación. En biorreactor se efectuaron las fermentaciones de los diseños experimentales en
los que se requería la obtención de mosto para destilar y caracterizar aromáticamente. Para
efectuar las fermentaciones se utilizó un biorreactor New Brunswick de 14 L con un volumen de
operación de 10 L. La temperatura y la velocidad de agitación fueron controladas por el mismo
sistema (Figura 2.4-B). Los matraces y biorreactores se esterilizaron y después se enfriaron a
20 °C para inocularlos e iniciar las cinéticas de fermentación respectivas. Los cultivos se
incubaron a 30 °C y 250 rpm durante 72 h. Estas condiciones se fijaron con ayuda de una
incubadora con agitación orbital y un árbol mecánico. En todas las fermentaciones, el pH fue
monitoreado pero no se controló su valor. Durante la operación en lote, únicamente se permitió la
salida del dióxido de carbono producido durante la fermentación.
59
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Figura 2.4 Matraces (A) y Biorreactor New Brunswick de 14 L (B) empleados en las fermentaciones por lote
60
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
biorreactor fue proporcionado por una bomba peristáltica (Cole-Parmer Company, Barrington IL,
EUA) sincronizada con la ayuda de un rotámetro.
Para realizar el cultivo en continuo se acoplaron dos bombas peristálticas: una que regulaba la
entrada del flujo del medio de alimentación al biorreactor y otra que regulaba la salida de mosto
fermentado. Ambos flujos fueron ajustados al mismo valor para mantener un volumen constante
de mosto en el fermentador. El flujo de entrada, se calibró y sincronizó meticulosamente con una
bomba peristáltica de caudal variable (Cole-Parmer Company, Barrington IL, EUA) con la que se
adicionó continuamente medio fresco al Biorreactor. Para mantener el volumen constante, se
retiró mosto con la acción de un sensor de nivel que al cerrar el circuito eléctrico con el mosto,
activaba una bomba peristáltica que retiraba el mosto excedente, así se mantenía el volumen en el
valor deseado (Figura 2.5). El valor del flujo de entrada dependió de la tasa de dilución probada.
El jugo del medio de entrada se preparó en contenedores de 10 L, los cuales fueron esterilizados.
El mosto retirado del fermentador se acumuló en un contendor de 1L sellado (Figura 2.6).
Figura 2.5 Biorreactor Applikon de 3 L conectado a una Bioconsola ADI 1035 utilizado en las fermentaciones en
continuo.
61
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Para la cuantificación de levaduras se empleó una cámara de Neubauer. La cámara está dividida
en tres partes: dos laterales y una central.
La parte central es más baja que las dos laterales y cuenta con una cuadrícula de 1mm2 dividida
en 400 pequeños cuadros de 1/20 mm de lado. Estos 400 cuadros están agrupados en 25 cuadros
grandes (Figura 2.7).
62
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Sobre la cámara se coloca un cubreobjetos dejando un espacio de 1 mm por el cual se coloca una
pequeña cantidad de muestra en la cámara con una micropipeta, la muestra entra a la cámara por
medio de capilaridad, posteriormente se hace una lectura en el microscopio (Olympus CH-2
modelo CHS) con el objetivo de 40X y se hace la lectura de la cantidad de células presentes en
cada cuadro. Con fines estadísticos, sólo se cuentan los cuadros que se encuentran en los
extremos de las esquinas y el del centro; teniendo de esta manera un total de diez cuadros. Para
garantizar un adecuado conteo celular con la cámara, se consideró que cuando había más de 30
células en cada cuadro de la cámara, se debería diluir la muestra.
N!
X = × D × 0.25 x 10!
N!
Donde:
63
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
La determinación de biomasa consiste en centrifugar las muestras a una velocidad de 10,000 rpm
durante 15 min, en una centrífuga SOLBAT C–600 (Figura 2.8); el sobrenadante se utiliza para
realizar los análisis de azúcares, compuestos volátiles y etanol, mientras que el precipitado se
lava con agua destilada y se centrifuga dos veces a una velocidad de 10,000 rpm durante un
tiempo de 15 minutos. A continuación se coloca la pastilla obtenida resuspendida en 5 mL de
agua destilada en un recipiente de plástico previamente secado y pesado, misma que se coloca en
una estufa a una temperatura de 51°C durante 24 horas. Finalmente el recipiente de plástico se
deja enfriar en un desecador y se pesa con la muestra seca (es importante el uso de pinzas para el
manejo de los vasos, para que de esta forma se evite la variación del peso). Con la diferencia de
peso se determina la biomasa generada en gL-1.
Para cuantificar la biomasa producida durante la fermentación, fue necesario restar el peso inicial
de sólidos totales del jugo de agave, al peso de sólidos contenidos en él durante la fermentación,
de tal manera que la concentración de biomasa en gL-1 se determina con la siguiente ecuación:
(X! − X! ) − XS!
X =
V!
Donde:
64
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
La enumeración de levaduras se realizó por medio del método clásico de conteo en placa
reportado por Pérez et al. (2000) y tomando en consideración las especificaciones de la NOM-
092-SSA1-1994. Las muestras fueron tomadas asépticamente durante de la fermentación y
diluidas adecuadamente en agua destilada estéril. En cultivo puro el conteo de las levaduras se
obtuvo a través del uso de medio YEPD-agar (conteniendo 20 gL-1 glucosa, 20 gL-1 de peptona,
20 gL-1 de agar y 10 gL-1 de extracto de levadura y ajustado con HCl al 50% a un pH de 4.7). En
las fermentaciones en cultivo mixto, el conteo de las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2)
fue obtenida por el empleo de medio YEPD-agar adicionado con 0.5 µg/ml de cycloheximida
(YEPD+CYH) (Fluka analytical) (Concentración mínima inhibitoria a la cual cesa el crecimiento
de S. cerevisiae) (Tabla 2.1). El número de células viables de las levaduras Saccharomyces (S1 y
S2) se estableció como la diferencia obtenida entre el número total de colonias en medio YEPD-
agar y el número total de colonias en medio YEPD+CYH. Las cajas con medio YEPD-agar y
YEPD+CYH fueron incubadas a 30ºC por 2 a 6 días y la cuenta se determinó hasta que no se
observaron incrementos en las unidades formadoras de colonia (UFC). Adicionalmente se utilizó
el medio Agar Nutriente WL (Biochemika for microbiology, composición en el ANEXO 1) para
la enumeración de levaduras de las fermentación en cultivo mixto, debido a que facilita su
examinación por permitir diferenciación morfológicas de las levaduras involucradas en el proceso,
al pigmentarlas de dos colores diferentes, para el caso de S. cerevisiae las colonias mostraron una
pigmentación blanca cremosa con forma ovalada y para K. africana las colonias mostraron una
pigmentación verde intensa y un menor tamaño (Tabla 2.2, Figura 2.9 y 2.10). La concentración
en unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro se determina con la siguiente ecuación:
N!
X = × D
V!
Donde:
X = UFC mL-1
NC = Número de colonias contadas en el rango de 30 a 300
Vm = Volumen de la muestra (mL)
D = Dilución de la muestra
65
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Tabla 2.1. Concentración mínima inhibitoria de CYH en µg/mL obtenida para las levaduras K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto.
Tabla 2.2 Concentración celular obtenida para K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto en los
medios WL y YEPD.
La concentración celular para S1 en cultivo mixto en medio YEPD se obtuvo de la diferencia entre el número total
de colonias en medio YEPD y el número total de colonias en medio YEPD+CHY y la concentración celular de K1
en cultivo mixto en medio YEPD fue obtenida del número total de colonias en medio YEPD+CHY. Cada valor
representa el promedio ± la desviación estándar de dos determinaciones. a No se encontraron diferencias
significativas en la concentración celular en UFC entre las cepas en cultivo puro y mixto en medio YEPD y WL.
66
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Figura 2.9 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) en medio WL obtenidas de las
fermentaciones con S. cerevisiae (S1-A) y K. africana (K1-C) en cultivo puro (A y C) y mixto (B).
Figura 2.10 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) de los cultivos mixtos en medio YEPD
(A) y medio YPD+CHY (B) de las fermentaciones con S. cerevisiae (S1-C) y K. africana (K1-D) en cultivo puro.
67
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
68
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Solución de Glucosa
Curva de Calibración.
De la solución de glucosa se hacen diluciones tomando alícuotas de 0, 200, 400, 600, 800 y 1000
µL en tubos de ensayo llevando luego el volumen en cada tubo a 1 mL con agua destilada. Estas
soluciones tienen una concentración de 0 a 2.0 gL-1 respectivamente, a estas muestras se les
determinan azúcares reductores libres.
Se colocan en tubos de ensaye 100 µL de muestra previamente diluida con 100 µL de solución
DNS, se agitan y posteriormente se colocan en un baño de agua a punto de ebullición durante 5
minutos. Los tubos se enfrían en un baño de hielo por 10 minutos, para después agregar 1 mL de
agua destilada y agitar. Un blanco del reactivo debe procesarse bajo el mismo procedimiento al
que se someten las muestras, pero éste tendrá agua destilada en lugar de mosto. Posteriormente se
agrega 100 µL de cada una de las muestras preparadas a un lector de microplacas y se lee la
absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm (Figura 2.11).
Nota: La absorbancia de las muestras debe de ser menor a la máxima obtenida en la curva de
calibración. Las absorbancias obtenidas en la curva de calibración, se someten a regresión lineal,
a fin de obtener una ecuación que prediga la concentración de azúcares reductores directos, en
una muestra de concentración desconocida. Para calcular la concentración de azúcares en las
muestras de las fermentaciones, se utiliza la ecuación obtenida de la regresión, se multiplica por
el factor de dilución y se obtienen las concentraciones en gramos/litro.
69
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Protocolo:
Se tomaron 20 µl de muestra previamente diluida para garantizar que se encuentre dentro del
rango de la gama patrón. Se agregó 1 ml de coloreado de fenol, se agitó girando el tubo
horizontalmente. Inmediatamente después se adiciona 1 ml de hipoclorito alcalino, se agitó
horizontalmente y se dejó reposar 10 minutos. A continuación se agrega 8 ml de agua destilada.
Las mediciones se efectuaron en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 630 nm. Los
valores de absorbancia se compararon contra una curva patrón que comprende el rango de 0 a 1.0
gL-1 de sulfato de amonio.
70
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Figura 2.12 Equipo YSI modelo 2700 Select empleado para la determinación de etanol
Esta técnica se basa en dos reacciones: una de oxidación y otra electroquímica. La reacción de
oxidación consiste en la oxidación del etanol presente en la muestra, por medio de la enzima
etanol oxidasa, produciendo peróxido de hidrógeno y acetaldehído; en seguida, el peróxido de
71
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
El método seguido para el análisis de las muestras fue el siguiente: se colocó 1mL de muestra en
un tubo Eppendorf a una concentración en un rango entre 0.2 y 3 gL-1. Cada 24 h de uso del
equipo, se preparó y se cambió una solución estándar de etanol a 2 gL-1, para efectuar la
autocalibración del equipo. A su vez, se lavó la cámara y las membranas con una solución buffer
cada vez que se terminaba de usar el equipo.
Con el objetivo de analizar la bebida alcohólica que se obtendría a partir de las fermentaciones de
jugo de agave por lote y en continuo, los mostos fermentados, se destilaron y rectificaron en un
destilador de acero inoxidable con capacidad de 6 L, ensamblado a partir de material presente en
el taller del CIATEJ, el cual consistió de las siguientes partes (Figura 2.13):
a) Resistencia: Provee la energía necesaria para calentar y ebullir el líquido dentro del
destilador, el cual debe contener pequeños trozos de material poroso (cerámica, cobre)
para evitar sobresaltos repentinos por sobrecalentamiento.
b) Destilador: espacio de mayor tamaño donde se coloca el mosto por destilar.
c) Cabeza de destilación: lugar por donde salen los vapores de la mezcla.
d) Termómetro/Termopar: Instrumento que permite monitorear la temperatura interna del
líquido durante la destilación que oscila entre los 90-94 ºC durante la primera destilación
y entre 78-80 ºC durante la rectificación (segunda destilación).
e) Tubo refrigerante: permite la condensación de los vapores.
72
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
73
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Las concentraciones de fructosa, glucosa, así como de etanol, glicerol, ácido succínico, ácido
acético, acetoína diacetilo y 2-3-butanediol fueron determinadas mediante el uso de
cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Se utilizó un cromatógrafo de líquidos Varian
ProStar (Palo Alto, California) acoplado a un detector de índice de refracción Varian ProStar 355
(Figura 2.14). Se empleó una columna de exclusión de iones Bio-Rad Aminex HPX-87H (9 µm,
300 x 7.8 mm), la cual se mantuvo a 40°C. La fase móvil consistió de una solución 0.005 M de
ácido sulfúrico, preparada con agua desmineralizada y desgasificada durante 20 min. El flujo de
la fase móvil, se ajustó a 0.4 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 µL. El tiempo de
análisis por cada muestra fue de 50 min
Los compuestos analizados fueron identificados mediante el tiempo de retención de los
estándares puros en la columna. La cuantificación, se basó en curvas de calibración de cinco
concentraciones conocidas de los metabolitos analizados. Las concentraciones de la curva patrón
estuvieron entre 0.2 y 1 gL-1 para 2-3-butanediol, diacetilo, ac. acético y ac. succínico; entre 0.4 y
2 gL-1 para acetoína, entre 1 y 5 gL-1 para glicerol y glucosa, y entre 4 y 20 gL-1 para etanol y
fructosa.
Los compuestos volátiles en mosto fueron analizados por Cromatografía de Gases. El equipo
utilizado para la inyección de muestras fue un Head-space Hewlett Packard modelo 7694E,
74
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
75
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Figura 2.16 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un detector de ionización de flama (FID).
76
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
77
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Para comparar el sabor (conjunto de atributos sensaciones que involucran el gusto, el olor y las
sensaciones trigeminales), el aroma y el nivel de agrado entre los destilados obtenidos de las
fermentaciones por lote y en continuo de los cultivos puros y mixtos, una prueba hedónica fue
implementada con al menos 30 consumidores (ANEXO 3). Por otro lado con la finalidad de
determinar diferencias significativas y propiedades sensoriales en los destilados, la prueba “A”
“No A” fue implementada. Un panel de 8 jueces entrenados (6 mujeres y 2 hombres) participaron
en las evaluaciones sensoriales, las cuales se efectuaron 3 veces por semana en un periodo de 15
a 20 minutos por sesión. Los jueces fueron seleccionados en base a su desempeño por estudios
previos efectuados en los laboratorios de evaluación sensorial del CIATEJ, todos ellos con
experiencia previa en evaluación sensorial con destilados de agave. Una lista con atributos de
sabor y aroma (creada por un estudio previo) se proporcionó a los jueces para desarrollar un
perfil sensorial cualitativo (frecuencia con la que los descriptores fueron mencionados) que
describiera a cada destilado evaluado (ANEXO 4). Se seleccionó a un destilado con una
78
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
característica especifica como la referencia, cada vez que se realizaron las pruebas. La prueba
discriminativa se efectuó por triplicado. Las sesiones se desarrollaron en atmósferas controladas
(30 ºC y desodorizadas) en el laboratorio de evaluación sensorial del CIATEJ (Figura 2.19). Las
muestras fueron ajustadas a 35 % (v/v) y colocadas en frascos ámbar de 80 mL y almacenadas en
la sala de evaluación sensorial al menos 2 h antes de que cada prueba diera inicio.
Figura 2.18 Panel de jueces efectuando evaluación sensorial en el laboratorio del CIATEJ.
79
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Los diseños experimentales planteados, se propusieron en función de cada uno de los objetivos
de este trabajo, siendo los propuestos los siguientes:
Tienen como objetivo el estudio del efecto de un sólo factor sobre una ó varias variables de
respuesta, éste diseño se aplicó en el siguiente objetivo:
Para estudiar las cinéticas de fermentación de cuatro cepas de levaduras del género Kloeckera y
Saccharomyces y caracterizar aromática y sensorialmente los productos de las fermentaciones en
cultivo puro y mixto.
Factor: Cepas de levadura del género Kloeckera y Saccharomyces en cultivo puro y mixto.
Tienen como objetivo el estudio del efecto de varios factores sobre una ó varias variables de
respuesta, éste diseño se aplicó al siguiente objetivo:
80
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Factores: Cepas de levadura del género Kloeckera y Saccharomyces en cultivo puro y mixto y
el medio de fermentación (basal y reformulado).
Tienen como objetivo el estudio del efecto de varios factores sobre varias variables de respuesta, ,
este diseño se aplicó al siguiente objetivo:
Para estudiar el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento sobre la
supervivencia, capacidad fermentativa y aromática de K. africana en continuo en cultivo mixto
con S. cerevisiae, se utilizó un diseño factorial 23:
Factor 1: Medio de cultivo (jugo de agave) con dos niveles: N1: medio basal (suplementado con
sulfato de amonio a 1 gL-1) y N2: medio reformulado (enriquecido con 570 µg L-1
de tiamina,
0.17 gL-1 de sulfato de amonio y 1.56 gL-1 de asparagina) (Valle-Rodríguez et al. 2009)
Factor 3: Aireación con dos niveles: N1: 0.00 vvm y N2: 0.03 vvm.
Factores constantes: agitación del reactor (250 rpm), concentración de azúcares iniciales (100 ±
11 gL-1), jugo de agave empleado, concentración de inóculo en una proporción 1:1 para tener (3.5
81
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
x106 cel/ml), pH sin control, D = 0.04 h-1, 5τ, volumen útil del reactor (1.5 L), métodos
cromatográficos de análisis (CG-FID-HS, CG-FID, CG-EM) y panelistas (Valle-Rodríguez et al.
2009; Morán-Marroquí et al. 2011).
82
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
En los cultivos por lote, se utilizaron diferentes ecuaciones que a continuación se describen:
En el sistema por lote, las velocidades instantáneas de formación de biomasa (rx), etanol (rp) y
consumo de azúcares (rs) se calcularon a partir de los incrementos ó decrementos en las
concentraciones de los productos ó sustratos con respecto al tiempo transcurrido. Se emplearon
las siguientes fórmulas:
∆!
r! = ∆! (1)
∆!"#$
r! = ∆!
(2)
∆!"#
r! = − ∆!
(3)
83
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
Estos valores se obtuvieron a partir de las derivadas instantáneas de las curvas de las cinéticas de
fermentación.
En el sistema por lote, las velocidades específicas de crecimiento (µ), de consumo de azúcares
(qs) y de producción de etanol (qp), se calcularon considerando las velocidades instantáneas entre
la media logarítmica de la concentración de biomasa (ya que la cinética de formación de biomasa
se describe con una función logarítmica). Las ecuaciones empleadas fueron:
!"
! !" !"
!"
µμ = ! !" ≅ !! !!!
(4)
!"
!! !! !! !"
!"
q! = ! ≅ ! = (5)
!" !! !!!
!"
!! !! !! !"
!"
q! = ! ≅ ! = (6)
!" !! !!!
!"!!"
Y !! = !! (7)
! !!"!
! !!
Y !! = !! ! !!"
!
(8)
! !
84
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
!! !!!
P! = !!
(9)
!! !!!
P! = !!
(10)
Velocidades:
r! = XD (11)
85
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
r! = AR ! − AR ! D (12)
r! = E! D (13)
Velocidades específicas:
!!
q! = !
(14)
!!
q! = !
(15)
!
Y!/! = !" (16)
! !!"!
!!
Y!/! = !" (17)
! !!"!
Las productividades de producción de etanol (PE) y de formación de biomasa (PX) son iguales a
las velocidades instantáneas por lo que también son directamente proporcionales a la
concentración y a la tasa de dilución. Las ecuaciones empleadas son las siguientes:
P! = r! = xD (18)
P! = r! = pD (19)
86
PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
El manejo de datos y la creación de tablas y gráficas se realizó con el programa de software Microsoft
Office Excel 2011 para Macintosh©. De igual manera, con esta herramienta se determinaron las
concentraciones, rendimientos, eficiencias y porcentajes de los parámetros cinéticos específicos e
instantáneos. Las gráficas de las cinéticas de fermentación se realizaron con el programa SigmaPlot
Ver. 10.0 de Systat Software, Inc.©
Para el cálculo de los parámetros cinéticos, se realizó el modelado de las cinéticas de formación de
biomasa, consumo de sustrato y producción de etanol por medio del programa CurveExpert Ver.
1.38TM de Daniel Hyams (EBT Comm, Columbus, USA), el cual ajusta los datos cinéticos a varios
modelos matemáticos y matemático-fisiológicos que puedan describir la evolución de la fermentación.
En cada cinética se eligió el modelo con mejor ajuste a los datos experimentales. Los diseños
experimentales unifactorial y factoriales se analizaron con el programa de análisis estadístico y de
experimentos STATGRAPHICS Plus Ver. Centurion XV de Statistical Graphics Corp. El análisis de
componentes principales (PCA) y el análisis de cuadrados mínimos (PLS) se efectuó con el software
Simca (P7.01).
87
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con la finalidad de estudiar el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento en
la fermentación de jugo de agave en lote y en continuo para lograr una mayor prevalencia y
capacidad fermentativa de levaduras tequileras no-Saccharomyces del género Kloeckera al
trabajar en cultivo mixto con levaduras del género Saccharomyces. Se inició con el estudio de las
fermentaciones por lote en cultivo puro y mixto empleando dos cepas de levaduras del género
Kloeckera y dos levaduras del género Saccharomyces identificadas como: Kloeckera africana
(K1), Kloeckera apiculata (K2), Saccharomyces cerevisiae (S1) y Saccharomyces cerevisiae (S2)
para conocer sus capacidades fermentativas y aromáticas y seleccionar las mejores levaduras para
los posteriores análisis en cultivo mixto, este objetivo se efectuó por medio del diseño
experimental unifactorial (sección 2.5.1). Posteriormente se evaluó el efecto de la adición de
ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia, capacidad fermentativa y aromática de
Kloeckera en la fermentación del jugo de agave al trabajar en cultivo puro y mixto con S.
cerevisiae, este objetivo se llevó a cabo utilizando el diseño experimental multifactorial (sección
2.5.2). Finalmente se estudió el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento
sobre la supervivencia, capacidad fermentativa y aromática de K. africana en la fermentación en
continuo en cultivo mixto con S. cerevisiae, este objetivo se realizó utilizando el diseño
experimental factorial (sección 2.5.3).
3.1. Fermentación de jugo de agave por lote utilizando las levaduras del género
Saccharomyces (S1 y S2) y Kloeckera (K1 y K2) en cultivo puro y mixto
Las fermentaciones en cultivos puro de S. cerevisiae (S1 y S2), K. africana (K1) y K. apiculata
(K2) fueron llevados a cabo en jugo de agave a 100 ± 11 gL-1 de azúcares reductores, enriquecido
con 1 gL-1 de sulfato de amonio (medio basal) tal y como se efectúa en la industria tequilera, bajo
condiciones anaeróbicas de crecimiento. Los perfiles de formación de biomasa, unidades
formadoras de colonia (UFC), consumo de azúcares y producción de etanol de los cultivos puros
89
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
se muestran en la Figura 3.1 y sus parámetros cinéticos en la Tabla 3.1. Los comportamientos de
las cepas de levaduras de Saccharomyces y Kloeckera fueron diferentes. Por un lado las
levaduras del género Saccharomyces (S1 y S2) crecieron más rápido que las levaduras del género
Kloeckera (K1 y K2) alcanzando concentraciones de biomasa de 4.2 y 3.2 gL-1 en
aproximadamente 16 h de fermentación, mientras que las del segundo grupo (K1 y K2)
alcanzaron concentraciones de tan sólo 1.83 y 1.93 gL-1 en 20 h de fermentación respectivamente
(Figura 3.1-B, D, F, H). Por otro lado con respecto a la viabilidad celular (UFC), las levaduras
del género Saccharomyces (S1 y S2) permanecieron activas por mucho más tiempo alcanzando
concentraciones de 100 y 140 × 106 UFC ml-1 a las 16 h de fermentación, que las levaduras del
género Kloeckera (K1 y K2), las cuales exhibieron un bajo crecimiento con concentraciones
máximas de 74 y 62 × 106 UFC ml-1 a las 16 y 20 h de fermentación, reduciendo su crecimiento a
concentraciones próximas de 30 × 106 UFC ml-1 a las 72 h de fermentación (Figura 3.1-A, C, E,
G). Con respecto a los perfiles de consumo de azúcares y producción de etanol diferencias
significativas fueron observadas en ambos grupos de levaduras en cultivo puro (95% LSD). Por
ejemplo todas las cepas de levaduras de Saccharomyces (S1 y S2) consumieron completamente
toda su fuente de azúcares entre las 24 y 36 h de cultivo, produciendo altas concentraciones de
etanol (34 - 35 gL-1) comparadas con las levaduras del género Kloeckera (Figura 3.1-B, D). Las
levaduras Kloeckera K1 y K2 mostraron en general un bajo consumo de azúcares dejando de 40 a
50 gL-1 de azúcares reductores en el medio de cultivo a las 72 h de fermentación y alcanzado
bajas concentraciones de etanol próximas a los 10 gL-1 respectivamente (Figura 3.1-F, H).
Estudios previos efectuados en tequila, han reportado resultados similares. Díaz-Montaño et al.
(2008), observó que las levaduras del género Kloeckera presentan una baja capacidad
fermentativa en comparación con las levaduras del género Saccharomyces, posiblemente por una
baja disponibilidad de nutrientes en el medio de cultivo ó por la presencia de compuestos tóxicos
en el jugo de agave. Diferencias significativas (95% LSD) fueron encontradas en la velocidad
específicas de crecimiento máxima (µmax) y de producción de etanol máxima (qpmax), presentando
las levaduras de género Kloeckera valores menores, en el orden de 0.08-0.11 h-1 y de 0.14-0.15
g/g-h respectivamente. Las cepas de Saccharomyces, por su parte alcanzaron los mayores valores
en el rango de 0.18 a 0.27 h-1 para µmax y de 1.12 a 1.45 para qpmax. Conjuntamente, se pudo
observar que las cepas de Saccharomyces presentaron una mayor conversión de azúcares a etanol
(Yp/s) que las dos cepas de Kloeckera (0.10-0.18 g/g), presentando las primeras, los valores más
90
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
cercanos al teórico (0.33-0.34 g/g) (Tabla 3.1). Con respecto a las velocidades específicas de
consumo de sustrato (qsmax) diferencias significativas fueron observadas entre las cepas del
género Kloeckera y Saccharomyces. Obteniendo los valores mayores las cepas del género
Saccharomyces y los menores las cepas Kloeckera. Adicionalmente para los rendimientos de
conversión de sustrato a biomasa (Yx/s) no presentaron diferencias significativas entre cepas
(Tabla 3.1). Con estos resultados se confirma la baja capacidad fermentativa de las levaduras del
género Kloeckera, aun cuando se añadió suficiente cantidad de nitrógeno inorgánico al medio de
cultivo (1 gL-1); revelando que su limitado crecimiento posiblemente sea atribuido a la ausencia
de ciertos factores de crecimiento (vitaminas y aminoácidos) en el jugo de agave (Valle-
Rodríguez et al., 2011). En los siguientes apartados se discute el efecto de estos factores de
crecimiento sobre la prevalencia y capacidad fermentativa de Kloeckera en las fermentaciones en
cultivo puro y mixto con Saccharomyces.
91
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
180x106 120 5 50
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
UFC (ml-1)
120x106 80
100x106 3 30
60
80x106
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20
20x106
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
120x106 80
UFC ml-1
100x106 3 30
80x106 60
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20x106 20
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
180x106 120 5 50
Azucares reductores (g L-1)
160x106 E F
140x106 100 4 40
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
120x106 80
UFC ml-1
100x106 3 30
80x106 60
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20
20x106
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
180x106 120 5 50
Azucares reductores (g L-1)
160x106 G H
140x106 100 4 40
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
120x106 80
UFC ml-1
100x106 3 30
60
80x106
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20
20x106
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 3.1. Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC (A, C, E, G), biomasa (●), azúcares reductores (▲) y
etanol () de las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S1 ( ), S2 ( ), K1 ( ) y K2 ( ).
-1
Las fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con sulfato de amonio (1 gL ). Los valores son las
medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras verticales representan la desviación estándar
del promedio de los datos de las dos fermentaciones.
92
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.1 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas estudiadas en cultivo puro.
Cepa µ max (h-1) qsmax (g/g h-1) qpmax (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
K1 0.110 ± 0.002 2.940 ± 0.640 0.140 ± 0.010 0.027 ± 0.002 0.100 ± 0.016
K2 0.080 ± 0.005 2.790 ± 0.020 0.150 ± 0.020 0.034 ± 0.003 0.180 ± 0.038
S1 0.180 ± 0.030 4.820 ± 0.500 1.120 ± 0.030 0.031 ± 0.006 0.330 ± 0.005
S2 0.270 ± 0.030 3.640 ± 0.250 1.450 ± 0.440 0.028 ± 0.020 0.340 ± 0.010
µmax: velocidad específica de crecimiento máxima; qsmax: velocidad específica de consumo máxima; qpmax: velocidad
específica de producción de etanol máxima; Yx/s y Yp/s : rendimientos de biomasa y etanol; cada valor representa el
promedio ± la desviación estándar de dos fermentaciones.
En adición a los cultivos puros, la Figura 3.2 y la Tabla 3.2 muestran los perfiles de formación de
biomasa, unidades formadoras de colonia (UFC), consumo de azúcares, producción de etanol y
parámetros cinéticos obtenidos de las fermentaciones en cultivo mixto usando las levaduras del
género Kloeckera (K1 y K2) y Saccharomyces (S1 y S2); divididos en tres grupos: Grupo 1
formado por K1+S1(G1), Grupo 2 formado por K2+S1(G2) y Grupo 3 formado por K2+S2 (G3).
Es importante señalar que de las combinaciones posibles en cultivo mixto, el Grupo 4 formado
por K1+S2 no fue posible efectuarlo, por la dificultad que generó al estimar la viabilidad celular
(UFC), al realizar las pruebas de inhibición con CHY. En las primeras ocho horas de cultivo las
levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) y Saccharomyces (S1 y S2) presentaron velocidades
de crecimiento similares, posteriormente las cepas Saccharomyces crecieron mucho más
superando a las levaduras Kloeckera (Figura 3.2-A, C, E). Las levaduras Kloeckera (K1 y K2)
alcanzaron su máximo de crecimiento entre las 20 y 24 h de fermentación con concentraciones de
9.95, 7.5 y 13.2 × 106 CFU mL-1 (K1 del G1, K2 del G2 y K2 del G3) posteriormente su
crecimiento se redujo hasta llegar a concentraciones celulares menores de 6 × 106 UFC mL-1
(Figura 3.2). Por su parte las levaduras del género Saccharomyces (S1 y S2) fueron
caracterizadas por permanecer activas por mayor tiempo a lo largo de la fermentación que las
cepas Kloeckera, llegando a presentar concentraciones celulares máximas de 16.8, 10.9 y 17.1 ×
106 CFU mL-1 (S1 del G1, S1 del G2 y S2 del G3) en las primeras 24 h de cultivo
respectivamente (Figura 3.2). Es interesante observar que a pesar de que las levaduras
Saccharomyces permanecieron activas por mucho más tiempo que las cepas del género
93
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
No se encontraron diferencias significativas (95% LSD) entre los tres grupos en cultivo mixto
con respecto a la formación de biomasa, consumo de azúcares y producción de etanol;
alcanzándose 4.66, 4.68 y 3.66 gL-1 de biomasa en 20 h de fermentación y 42.03, 50.7 y 50.75
gL-1 de etanol en 24 h de fermentación y agotándose completamente los azúcares a las 24 h de
cultivo en el grupo dos y a las 48 h en el grupo uno y tres (Figura 3.2-B, D, F). En relación a los
parámetros cinéticos, el análisis estadístico mostró que no existen diferencias significativas (95%
LSD) en la velocidad especifica de crecimiento máxima (µmax) entre los tres grupos (G1, G2 y
G3) alcanzándose valores de 0.22, 0.27 y 0.31 h-1 respectivamente (Tabla 3.2). Asimismo no se
presentaron diferencias significativas en los rendimientos de conversión de azúcar a etanol (Yp/s)
ni en los rendimientos de biomasa (Yx/s) entre los tres grupos probados (95% LSD) (Tabla 3.2).
Por otro lado con respecto a la velocidad especifica de consumo máxima (qsmax) y la velocidad
especifica de producción de etanol máxima (qpmax) diferencias significativas fueron encontradas
entre los tres grupos en cultivo mixto (95%LSD). Obteniendo el grupo 2 la mayor qsmax con
valores de 16.6 g/g h-1 que los grupos 1 y 3 que presentaron valores de 5.24 y 8.65 g/g h-1
respectivamente y finalmente para qpmax, el grupo 3 presentó el mayor valor con valores de 2.12
g/g h-1 que los grupos 1 y 2 que alcanzaron valores menores 0.91 y 0.78 g/g h-1 respectivamente
(Tabla 3.2).
94
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
20x106 120 7 50
Biomasa (g L-1)
15x106
Etanol (g L-1)
5
80
UFC ml-1
4 30
10x106 60
3 20
40
5x10 6 2
20 10
1
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
20x106 120 6
C Azucares reductores (g L-1) D 50
6
100 5
15x10
Biomasa (g L-1)
40
Etanol (g L-1)
80 4
UFC ml-1
10x106 30
60 3
40 2 20
5x106
20 1 10
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
20x106 120 6
Azucares reductores (g L-1)
E F 50
100 5
15x106
Biomasa (g L-1)
40
Etanol (g L-1)
80 4
UFC ml-1
10x106 30
60 3
40 2 20
5x106
20 1 10
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 3.2 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC (A, C, E), biomasa (●), azúcares reductores (▲) y etanol
() de las fermentaciones en cultivo mixto formadas por las levaduras S1 ( ), S2 ( ), K1 ( ) y K2 ( ). en
tres grupos diferentes: Grupo 1 formado por K1 y S1 (A-B), Grupo 2 formado por las levaduras K2 y S1 (C-D) y el
Grupo 3 formado por las levaduras K2 y S2 (E-F). Las fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con
-1
sulfato de amonio (1 gL ). Los valores son las medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras
verticales representan la desviación estándar del promedio de los datos de las dos fermentaciones.
95
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.2 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas estudiadas en cultivo mixto.
Cultivos mixtos µ max (h-1) qsmax (g/g h-1) qpmax (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
Grupo 1a 0.220 ± 0.060 5.240 ± 0.340 0.910 ± 0.100 0.049 ± 0.005 0.370 ± 0.015
Grupo 2b 0.270 ± 0.060 16.60 ± 4.380 0.780 ± 0.240 0.037 ± 0.050 0.380 ± 0.010
Grupo 3c 0.310 ± 0.160 8.650 ± 6.970 2.120 ± 1.940 0.042 ± 0.010 0.480 ± 0.040
µmax: velocidad específica de crecimiento máxima; qsmax: velocidad específica de consumo máxima; qpmax: velocidad
específica de producción de etanol máxima; Yx/s y Yp/s: rendimientos de biomasa y etanol; a Cultivo mixto formado
por K. africana (K1) y S.cerevisiae (S1); b Cultivo mixto formado por K. apiculata (K2) y S. cerevisiae (S1); c
Cultivo mixto formado por K. apiculata (K2) y S. cerevisiae (S2). Cada valor representa el promedio ± la desviación
estándar de dos fermentaciones.
Comparando los cultivos puros y mixtos, diferencias significativas fueron observadas (95 %
LSD). Por ejemplo, los cultivos puros de Saccharomyces y Kloeckera presentaron una mayor
estabilidad de cultivo a lo largo de la fermentación con concentraciones celulares altas, además
de permanecer activos por mayor tiempo que los cultivos mixtos; los cuales exhibieron un
comportamiento diferente en cada grupo en cultivo mixto, aún a pesar de la presencia de la
misma cepa de levadura en los diferentes grupos formados (Figura 3.2). Trabajos previos han
reportado resultados similares. Mendoza et al. (2007) encontró que los cultivos puros de
K.apiculata y S.cerevisiae alcanzan concentraciones celulares mayores que los cultivos mixtos,
sin embargo en estos cultivos, K. apiculata presentó una mayor estabilidad celular al permanecer
activa por mayor tiempo durante la fermentación, debido a mecanismos que no están
relacionados a la concentración de etanol, a la producción de toxinas killer y a la competencia por
compuestos de nitrógeno asimilables. Se ha observado que el limitado crecimiento de las
levaduras no-Saccharomyces, particularmente del género Kloeckera, se debe a la baja
disponibilidad de nutrientes en el jugo de agave (vitaminas y aminoácidos) y a la presencia de
sustancias inhibitorias formadas durante el cocimiento en el proceso de elaboración de tequila
(Compuestos de Maillard) entre otros (Díaz-Montaño et al., 2008). Los resultados anteriores se
limitan a trabajos en cultivo puro, sin embargo, los mecanismos implicados en cultivo mixto con
este mismo género de levaduras en la fermentación del jugo de agave, puede implicar fenómenos
de mayor complejidad. Por trabajos efectuados en vinos se sabe que la principal causa de la
muerte de la levaduras no-Saccharomyces en cultivo mixto con S. cerevisiae se debe a una baja
capacidad de tolerancia a etanol en comparación con S. cerevisiae. Diversos estudios están siendo
96
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
realizados con el objetivo de elucidar las posibles causas y los mecanismos implicados en este
fenómeno. Como por ejemplo los realizados por Hansen et al. (2001) y Nissen & Arneborg
(2003), concluyeron que la muerte temprana de K. thermotolerans y T. delbrueckii durante la
fermentación mixta con S. cerevisiae se debe principalmente, a la baja disponibilidad de oxígeno
en el medio de cultivo y a un mecanismo de contacto mediado por señales entre célula y célula
que paran el crecimiento de las levaduras presentes en menor concentración (no-Saccharomyces)
cuando S. cerevisiae está presente en alta concentración. Por otro lado Pina et al. (2004),
reportaron que algunas cepas de levaduras como H. guilliermondii y C. stellata pueden soportar
mayores concentraciones de etanol (22-25 % v/v), cuando el medio no es limitante en nutrientes
(ergosterol y Tween 80) y se trabaja dentro de ciertas condiciones operacionales principalmente
en aerobiosis. Adicionalmente, Bilbao et al. (1997) y Erten (2002) determinaron que el
crecimiento y la supervivencia de K. apiculata en la fermentación en cultivo mixto con S.
cerevisiae está fuertemente influenciado por la temperatura de fermentación, favoreciéndose a
temperaturas bajas (< 20ºC) su crecimiento y la síntesis de acetaldehído, acetato de etilo y acetato
de isoamilo. De igual manera Albergaria et al. (2003) y Díaz-Montaño et al. (2010), determinaron
que levaduras como H. guillermondii y K. africana en fermentaciones de jugo de uva y de agave,
respectivamente, presentan una pobre capacidad fermentativa debido a la deficiencia en el
consumo de azúcar, atribuido a una limitación nutricional más que a una intolerancia a etanol.
Los resultados del presente trabajo, fueron obtenidos bajo condiciones tradicionales de la
industria (jugo de agave a 100 gL-1 de azúcares reductores y 1 gL-1 de sulfato de amonio), donde
él único factor que se varió fue la cepa en cultivo puro y mixto. En la sección 3.3 de resultados
se discute el efecto de ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia y capacidad
fermentativa de las levaduras del género Kloeckera.
97
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla 3.3 muestra los principales compuestos volátiles mayoritarios de las fermentaciones en
cultivo puro y mixto empleado las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) y Saccharomyces
(S1 y S2). Las levaduras del género Saccharomyces (S1 y S2) en cultivo puro y mixto se
caracterizaron por presentar altas concentraciones de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil
etanol y acetaldehído (Tabla 3.3). Por otro lado las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) en
cultivo puro, se distinguieron por producir altas concentraciones de acetato de etilo, acetato de
isoamilo y acetato de fenetilo (Tabla 3.3). El n-butanol fue producido en mayor concentración
por K. africana (K1) en cultivo puro (Tabla 3.3). Estos resultados concuerdan con estudios
previos reportados por otros autores. Zironi et al. (1993) publicó que S. cerevisiae en cultivo puro
y mixto con K. apiculata y H. guillermondii producen la mayor concentración de alcoholes
superiores que los cultivos puros de las levaduras no-Saccharomyces. En cambio los cultivos
puros de las levaduras no-Saccharomyces producen las mayores concentraciones de acetoína y 2-
3-butanediol. Díaz-Montaño et al. (2008), encontraron que los cultivos puros de S. cerevisiae se
distinguen por producir las mayores concentraciones de alcoholes superiores y acetaldehído que
los cultivos puros de K. africana y K. apiculata, estas cepas producen la mayor concentración de
acetato de etilo, acetato de fenetilo y ácido acético. K. africana se distinguió del resto de las
cepas estudiadas por detectarse en el medio de cultivo el n-butanol. Adicionalmente se ha
reportado que los alcoholes superiores pueden tener impactos positivos y negativos en el sabor y
el aroma, a concentraciones excesivas (> 400 mg L-1) pueden resultar en olores y sabores fuertes
y picantes, mientras que a niveles óptimos (< 300 mg L-1) imparten características frutales a la
bebida (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño et al., 2010). La concentración de alcoholes
superiores depende del tipo de levadura empleada y de otros factores como: la temperatura, el pH
y la composición de aminoácidos del medio (Swiegers et al., 2005). El acetaldehído en cambio a
bajas concentraciones (< 100 mg L-1) contribuye a las propiedades sensoriales de la bebida
confiriendo notas a manzana, cítricas y nuez. Sin embargo, a concentraciones altas (> 100 mg L-
1
) confiere un olor picante e irritante (Schreier, 1976). Asimismo algunos autores han reportado
que las levaduras no-Saccharomyces del género Hanseniaspora, Candida y Kloeckera son
buenas productoras de ésteres, ácido acético, acetoína y son capaces de promover la liberación de
terpenos al medio. El uso de estas levaduras se ha recomendado en la fermentación en cultivo
mixto con S. cerevisiae, con la finalidad de mejorar las propiedades sensoriales de la bebida.
(Ciani & Picciotti, 1995; Díaz-Montaño et al., 2008; Díaz-Montaño et al., 2010; Romano et al.,
98
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2003; Swiegers et al., 2005; Romano et al., 1996). Se ha reportado que cepas de levaduras de H.
guillermondii son capaces de esterificar varios alcoholes como etanol, geraniol, alcohol
isoamílico y 2-fenil etanol (Rojas et al., 2001). Por otra parte contenidos excesivos de acetato de
etilo (> 200 mg L-1) no mejoran el aroma de las bebidas fermentadas; sino que generan olores
desagradables, pero a concentraciones bajas (rango 50-80 mg L-1) realzan la composición
química de la bebida, aportando notas frutales (Zohre et al., 2002; Moreira et al., 2005). Los
resultados concuerdan con lo reportado, ya que las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) en
cultivo puro y mixto produjeron concentraciones considerables de acetato de etilo en el rango de
33.13 a 74.22 mg L-1 (Tabla 3.3). Para el acetato de isoamilo las levaduras del género Kloeckera
en cultivo puro produjeron las mayores concentraciones (2.97 y 1.43 mg L-1) aportando sabores
frutales como banana y descriptores dulces en un umbral < 1 mg L-1 (Swiegers et al., 2005;
Díaz-Montaño et al., 2010). Los demás ésteres (hexanoato, octanoato y decanoato de etilo)
fueron producidos en una baja concentración (< 0.10 mg L-1) en la mayoría de las cepas
estudiadas en cultivo puro y mixto (Tabla 3.3).
99
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
100
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.3 Concentración de compuestos volátiles producidas por las levaduras Kloeckera africana (K1), Kloeckera
apiculata (K2), Saccharomyces cerevisiae (S1) y Saccharomyces cerevisiae (S2) en cultivos puros y mixtos.
Cultivos puros Cultivos mixtos
Compuestos
(mg L-1) S1 S2 K1 K2 Group 1a Group 2b Group 3c
Σ Aldehídos 157.94 ± 2.71 170.72 ± 3.04 47.89 ± 5.06 46.73 ± 5.94 89.46 ± 2.31 101.04 ± 1.64 144.11 ± 1.45
Acetaldehído 157.94 ± 2.71 170.72 ± 3.04 47.89 ± 5.06 46.73 ± 5.94 89.46 ± 2.31 101.04 ± 1.64 144.11 ± 1.45
Alcoholes 64.18 ± 0.58 63.28 ± 1.15 58.94 ± 0.37 46.05 ± 2.73 66.82 ± 1.6 63.67 ± 1.58 64.99 ± 0.18
d
Metanol 64.18 ± 0.58 63.28 ± 1.15 58.94 ± 0.37 46.05 ± 2.73 66.82 ± 1.6 63.67 ± 1.58 64.99 ± 0.18
Σ Alcoholes
Superiores 284.92 ± 14.25 318 ± 4.99 122.51 ± 6.69 114.69 ± 7.88 247.3 ± 3.50 254.36 ± 9.40 307.28 ± 0.91
n-Propanol d 25.28 ± 2.03 32.18 ± 0.37 27.60 ± 1.35 29.38 ± 2.53 25.55 ± 0.23 23.97 ± 0.5 30.65 ± 0.02
n-Butanol 0.38 ± 0.02 0.77 ± 0.04 4.47 ± 0.18 1.03 ± 0.13 1.31 ± 0.01 0.75 ± 0.014 0.75 ± 0.02
Isobutanol 53.95 ± 3.34 56.74 ± 0.99 23.04 ± 0.28 29.08 ± 2.53 51.69 ± 0.56 54.64 ± 5.03 57.28 ± 0.2
Alcohol isoamílico 156.36 ± 7.15 162.44 ± 2.76 56.91 ± 3.57 42.98 ± 0.65 129.75 ± 1.68 127.91 ± 2.32 148.21 ± 0.25
2-fenil etanol 48.95 ± 1.71 65.87 ± 0.83 10.485 ± 1.31 12.22 ± 2.044 39.00 ± 1.014 47.09 ± 1.53 70.39 ± 0.67
Σ Ésteres 13.45 ± 2.29 14.37 ± 0.439 79.193 ± 1.78 67.74 ± 1.04 34.58 ± 0.914 47.91 ± 2.01 69.124 ± 1.735
Acetato de etilo 13.19 ± 2.26 14.11 ± 0.43 74.22 ± 1.42 65.37 ± 0.80 33.13 ± 1.33 46.44 ± 1.99 67.94 ± 1.64
Acetato de isoamilo 0.13 ± 0.03 0.08 ± 0.003 2.97 ± 0.28 1.43 ± 0.096 0.09 ± 0.001 0.28 ± 0.005 0.14 ± 0.001
Hexanoato de etilo 0.025 ± 0.002 0.030 ± 0.001 0.018 ± 0.001 0.031 ± 0.001 0.022 ± 0.003 0.014 ± 0.001 0.029 ± 0.003
Octanoato de etilo 0.041 ± 0.001 0.052 ± 0.002 nd 0.059 ± 0.006 0.050 ± 0.003 0.053 ± 0.001 0.052 ± 0.002
Acetato de fenetilo nd nd 1.92 ± 0.08 1.79 ± 0.07 1.25 ± 0.01 1.05 ± 0.01 0.91 ± 0.085
Decanoato de etilo 0.064 ± 0.003 0.096 ± 0.003 0.065 ± 0.001 0.061 ± 0.005 0.041 ± 0.001 0.069 ± 0.002 0.053 ± 0.001
nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílico. K1: cultivo puro de K. africana.
K2: cultivo puro de K. apiculata. S1: cultivo puro de S. cerevisiae. S2: cultivo puro de S. cerevisiae. a Cultivo mixto
formado por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1). b Cultivo mixto formado por K. africana (K2) y S. cerevisiae (S1).
c
Cultivo mixto formado por K. africana (K2) y S. cerevisiae (S2). d Compuestos que no presentaron diferencias
significativas entre cepas en cultivo puro y mixto. Cada valor representa el promedio ± desviación estándar de dos
determinaciones.
101
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0.60
dec etil
0.50 A
Cepas de Saccharomyces
0.40 prop
0.30
hex etil acet
0.20
ac isom
0.10 but
Cepas de Kloeckera alcalc
fenisom
p[2]
0.00
-0.10 isob
oct etil
-0.20
ac etil
ac fen
-0.30
Cultivos Mixtos
-0.40
met
-0.50
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
p[1]
4
B
3
S2S2
1
K1
K1 S1
S1
0 K2 K2
t[2]
Grupo 33
Grupo
-1
Grupo 2
Grupo1 2
Grupo
Grupo 1
-2
-3
-4
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
t[1]
Figura 3.3. PCA de (A) compuestos volátiles y (B) las cepas de levaduras en cultivo puro y mixto. acet:
acetaldehído; met: metanol; ac-etil: acetato de etilo; hex-etil: hexanoato de etilo; oct-etil: octanoato de etilo; dec-etil:
decanoato de etilo; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-iso: alcohol isoamílico; alc-fen: 2-fenil
etanol; ac-isom: acetato de isoamilo y ac-fen: acetato de fenetilo. K1: Cultivo puro de K. africana; K2: Cultivo puro
de K. apiculata; S1: Cultivo puro de S. cerevisiae; S2: Cultivo puro de S. cerevisiae; Grupo 1: K1+S1; Grupo 2:
K2+S1; Grupo 3: K2+S2.
102
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.4. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 58.8 Varianza explicada (%) 15
Acetato de isoamilo -0.3552 Metanol -0.4792
Acetato de fenetilo -0.3158 Acetato de fenetilo -0.2649
n-Butanol -0.3106 Acetato de etilo -0.2359
Acetato de etilo -0.2801 Octanoato de etilo -0.1812
n-Propanol -0.2031 Isobutanol -0.0888
Hexanoato de etilo 0.0768 2-Fenil etanol 0.0438
Decanoato de etilo 0.0801 Alcohol isoamílico 0.0534
Metanol 0.1703 n-Butanol 0.1089
Octanoato de etilo 0.2447 Acetato de isoamilo 0.1350
Acetaldehído 0.3265 Hexanoato de etilo 0.2270
2-Fenil etanol 0.3272 Acetaldehído 0.2339
Alcohol isoamílico 0.3436 n-Propanol 0.3997
Isobutanol 0.3536 Decanoato de etilo 0.5504
3.2 Caracterización de los compuestos volátiles en destilados obtenidos con las levaduras
de estudio S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto en medio basal
103
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los destilados se analizaron por CG-FID y en la Tabla 3.5 se reportan los compuestos volátiles
mayoritarios en mg/100 mL de alcohol anhidro producidos por las cepas del género K. africana
(K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto. El destilado del cultivo puro de S. cerevisiae y
el cultivo mixto mostraron un patrón similar en la síntesis de compuestos volátiles mayoritarios,
presentando la mayor concentración de acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol y alcohol
isoamílico. Por su parte el cultivo puro de K. africana (K1) se distinguió por presentar una alta
concentración de ácido acético, n-butanol y furfural (Tabla 3.5). El análisis de varianza
(ANOVA) determinó diferencias significativas en la concentración de todos los compuestos
volátiles mayoritarios entre los tres destilados en cultivo puro y mixto (P < 0.05). El análisis de
rangos múltiples (95% LSD), determinó diferencias significativas en la concentración de acetato
de etilo, lactato de etilo, isobutanol, butanol y alcohol isoamílico entre los tres destilados (Tabla
3.5). Para el destilado de S. cerevisiae (S1) y el destilado del cultivo mixto no se encontraron
diferencias significativas en la concentración de acetaldehído, ácido acético y furfural (95% LSD).
104
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.5: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
en cultivo puro y mixto.
Los tres destilados y sus compuestos volátiles fueron agrupados por el PCA en dos componentes
principales con una varianza explicada del 91.4% (Figura 3.4). Los destilados fueron claramente
distinguidos el uno del otro, siendo marcados por definidas locaciones en la Figura 3.4-B. Los
compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: ácido acético y furfural con pesos
negativos y acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol y alcohol isoamílico con pesos positivos.
Mientras que para el PC-2 fueron: n-propanol con pesos negativos y el lactato de etilo con pesos
positivos (Tabla 3.6). La gran variabilidad observada entre los destilados en cultivo puro y mixto
es debida a factores tales como: el tipo de levadura empleada, las condiciones de fermentación, la
composición del mosto y el sistema de destilación empleado que marcadamente afecta la
105
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
composición final de compuestos volátiles en las bebidas alcohólicas. (Oliveira et al. 2005;
Romano et al. 2003; Díaz-Montaño et al. 2008).
0.60 A lact et
0.50
0.40
but
0.30
Destilado de S.cerevisiae
met
Destilado de K. africana ac etil
0.20
0.10 furf
ac acet
p[2]
-0.20
-0.30
Destilado del cultivo mixto
-0.40
-0.50
-0.60 prop
6
B
4
2 S1
S1
K1
0
t[2]
K1
M1
M1
-2
-4
-6
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
t[1]
Figura 3.4. PCA de (A) compuestos volátiles y de (B) los destilados obtenidos de cultivos puros y mixtos (M1) a
partir de K .africana (K1) y S .cerevisiae (S1). acet: acetaldehído; met: metanol; ac-acet: ácido acético; prop: n-
propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico; ac-etil: acetato de etilo; lact-et: lactato de
etilo y furf: furfural. K1: destilado obtenido del cultivo puro de K. africana; S1: destilado obtenido del cultivo puro
de S. cerevisiae K1+S1: destilado obtenido del cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
106
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.6. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 63.6 Varianza explicada (%) 27.8
Ácido acético -0.3860 n-Propanol -0.5570
Furfural -0.3700 Isobutanol -0.0330
n-Butanol -0.1630 Acetaldehído -0.0240
Lactato de etilo 0.0540 Alcohol isoamílico 0.0060
n-Propanol 0.1110 Ácido acético 0.0690
Metanol 0.2960 Furfural 0.1260
Acetaldehído 0.3710 Acetato de etilo 0.1950
Acetato de etilo 0.3730 Metanol 0.3760
Isobutanol 0.3910 n-Butanol 0.3790
Alcohol isoamílico 0.3940 Lactato de etilo 0.5860
La Tabla 3.7 muestra los compuestos volátiles minoritarios analizados por CG-MS. Benn &
Peppard (1996), analizaron más de 175 compuestos en 3 diferentes marcas de Tequila,
encontrando altas concentraciones de alcoholes superiores y menores de ésteres, acetales,
terpenos, furanos, ácidos, aldehídos, cetonas, fenoles y compuestos azufrados. Por su parte los
compuestos responsables del bouquet de las bebidas fermentadas son los alcoholes superiores,
ésteres, ácidos y el acetaldehído (Díaz-Montaño et al., 2008). Los compuestos volátiles de los
destilados fueron agrupados y divididos en seis familias de compuestos como: ácidos orgánicos,
alcoholes, ésteres, furanos, cetonas y terpenos. El análisis de rangos múltiples (95% LSD) mostró
que no existen diferencias estadísticas en la concentración de hexanoato de etilo, cis-óxido de
linalol y α-terpineol entre los destilados procedentes de los cultivos puros y mixtos de S.
cerevisiae y K. africana (Tabla 3.7). Diferencias significativas en la concentración de ácido
hexanoico, ácido propanoico, 2-etil-1-hexanol, alcohol furfurílico, propianato de fenetilo, acetato
de fenetilo, 2-acetil furan, 5-metil furfural y acetoína fueron encontradas en los destilados,
presentando las mayores concentraciones el destilado de K. africana, mientras que en el destilado
de S. cerevisiae se presentó la mayor concentración de ácido decanoico, 4-penten-1-ol, 2-fenil
etanol, isovalerato de fenetilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, dodecanoato de etilo y 9-
decenoato de etilo. El destilado del cultivo mixto presentó la mayor concentración de ácido
107
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
isobutírico y ácido octanoico (Tabla 3.7). Así como una concentración intermedia en la mayoría
de los compuestos evaluados, debido al efecto interactivo de K. africana y S. cerevisiae durante
la fermentación. Similares resultados han sido reportados por otros autores. Moreira et al. (2005),
reportó que H. guillermondii en cultivo puro y mixto produce la mayor concentración de acetato
de fenetilo y 2-fenil etanol que los cultivos puros y mixtos de S. cerevisiae y H. uvarum.
Asimismo Díaz-Montaño et al. (2008) reportó que las levaduras del género Kloeckera, producen
acetato de fenetilo en mayor concentración que S. cerevisiae, pudiendo su síntesis ser una
característica común de estas levaduras y representar una ventaja por la incorporación de aromas
especiales a la bebida (florales, frutales y a miel). Romano et al. (1996) estudió 96 cepas de K.
apiculata y H. guillermondii por su habilidad para producir acetoína en medio sintético y mosto,
confirmando que una gran cantidad de acetoína es una característica común de ambas levaduras.
La baja cantidad de acetoína encontrada en el destilado de S. cerevisiae y el destilado del cultivo
mixto, puede deberse al hecho de que S. cerevisiae asimila grandes cantidades del metabolito,
posiblemente para su posterior reducción a 2-3-butanediol (Zironi et al., 1993). Díaz-Montaño et
al. (2008) reportó que las cepas de S. cerevisiae producen la mayor concentración de 2-fenil
etanol que las levaduras del género Kloeckera. La alta concentración de 5 metil-furfural y furfural
en el destilado de K. africana, puede explicarse por el hecho de que estos compuestos resultan
tóxicos para el crecimiento celular de las levaduras por inhibición de ciertas enzimas glicolíticas
y el transporte de electrones (Palmqvist et al., 1999 y Díaz-Montaño et al., 2008). Sin embargo,
otros reportes han sugerido que S. cerevisiae puede reducir el furfural a alcohol furfurílico a
través de la alcohol deshidrogenasa, este hecho quizá explique el bajo contenido de furfural y 5-
metil-furfural en los destilados de S. cerevisiae en cultivo puro y mixto (Tablas 3.5 y 3.7). Como
era de esperarse, los destilados producidos por K.africana y S.cerevisiae en cultivo puro son
considerablemente diferentes de aquellos producidos en cultivo mixto; esto es posible observarlo
en la Fig. 3.5. De igual manera que para los compuestos volátiles mayoritarios, el análisis de
componente principales (PCA) explicó el 93.8% de la varianza en dos componentes principales
(Fig. 3.5). Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: acetato de fenetilo,
acetoína, propianato de fenetilo y ácido propionico con pesos negativos y el ácido decanoico y 2-
fenil etanol con pesos positivos. Mientras que para el PC-2 fueron: ácido isobutírico, 9-
hexadecenoato de etilo y el ácido octanoico con pesos negativos y el alcohol furfurílico,
α−terpineol y hexadecanoato de etilo con pesos positivos (Tabla 3.8).
108
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.7: Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los destilados de K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos
109
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Destilado de S. cerevisiae
Destilado de K. africana
10
B
8
4
S1
S1
2
K1
0 K1
t[2]
-2
M1
M1
-4
-6
-8
-10
110
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.8. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1
PC2
Varianza explicada (%) 57 Varianza explicada (%) 36
Acetato de fenetilo -0.2736 Ácido isobutírico -0.3211
Acetoína -0.2699 9-Hexadecenoato de etilo -0.3203
Propionato de fenetilo -0.2688 Ácido octanoico -0.3122
Ácido propionico -0.2681 2-Acetil furan -0.1544
Ácido hexanoico -0.2552 Acetato de fenetilo -0.0408
5-Metil-furfural -0.2511 2-fenil etanol -0.0136
2-Acetil furan -0.2410 Ácido decanoico -0.0064
2-Etil-1-hexanol -0.2005 Acetoína 0.0666
cis-Óxido de linalol -0.1880 Propianato de fenetilo 0.0667
Alcohol furfurílico -0.1581 Ácido propionico 0.0749
α−terpineol -0.0566 Ácido hexanoico 0.0800
Hexadecanoato de etilo 0.0088 cis-Óxido de linalol 0.1035
9-Hexadecenoato de etilo 0.0843 5-Metil-furfural 0.1364
Ácido octanoico 0.0846 4-penten-1-ol 0.1482
Ácido isobutírico 0.0846 9-Decenoato de etilo 0.1999
Decanoato de etilo 0.1825 2-Etil-1-hexanol 0.2064
Octanoato de etilo 0.1838 Decanoato de etilo 0.2493
Isovalerato de fenetilo 0.1838 Dodecanoato de etilo 0.2534
Dodecanoato de etilo 0.1843 Octanoato de etilo 0.2543
9-Decenoato de etilo 0.2239 Isovalerato de fenetilo 0.2543
4-penten-1-ol 0.2476 Alcohol furfurílico 0.2781
Ácido decanoico 0.2739 α−terpineol 0.2948
2-fenil etanol 0.2746 Hexadecanoato de etilo 0.3106
111
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
africana, fue seleccionada como la referencia (A) y se comparó contra los otros destilados:
destilado de S. cerevisiae y el destilado del cultivo mixto, así como contra el destilado de K.
africana. Los datos de las tres réplicas se analizaron a través del estadístico de prueba χ , con el
2
mismo estudio fue posible definir un perfil sensorial cualitativo en olor, aroma, gusto y
sensaciones trigeminales de las tres muestras tomando como referencia los descriptores
generados por Cantor-Solórzano et al. (1999) y Díaz-Montaño (Proyecto PROTECO No. 24547,
SEP-CONACYT) (ANEXO 4).
Los resultados de los niveles de aceptación obtenidos de los destilados para los atributos
sensoriales evaluados se muestran en la Figura 3.6. y los perfiles de olor, aroma, gusto y
sensaciones trigeminales en la Figura 3.7. Los destilados fueron significativamente diferentes en
aroma, gusto y sensaciones táctiles (P< 0.05). No se encontraron diferencias significativas con
respecto al aroma, olor y sensaciones táctiles entre los destilados del cultivo mixto y el destilado
de K. africana (95% LSD); sólo fue diferente el destilado de S. cerevisiae ya que resultó ser el
más agradable de los destilados evaluados (Figura 3.6). Por otro lado con respecto a la prueba
discriminativa “A” “No-A”; se confirmó que no existen diferencias significativas en sabor y
aroma entre los destilados de S. cerevisiae y K. africana (P> 0.05). Sólo fueron diferentes los
destilados de K. africana y el cultivo mixto (P < 0.05). Asimismo diferentes notas asociados al
sabor y aroma fueron distinguidas entre los destilados evaluados; particularmente el destilado del
cultivo puro de K. africana fue caracterizado por presentar notas de dulce, fermentado, frutal y
quemante; mientras que el destilado de S. cerevisiae se caracterizó por presentar notas de madera,
frutal, fermentado, humo, dulce y quemante. El destilado del cultivo mixto presentó notas a nuez,
dulce, salado, madera, frutal y quemante respectivamente (Figura 3.7). Los diferentes
descriptores asociados a cada destilado son resultado del metabolismo de la levadura, de las
condiciones de fermentación y del proceso de destilación (Romano et al. 2003; Díaz-Montaño et
al. 2008). A su vez cada descriptor está asociado a diferentes compuestos volátiles que
contribuyen a las cualidades aromáticas y sensoriales de la bebida. Por ejemplo los ésteres son
responsables de impartir notas frutales y florales; los alcoholes superiores a concentraciones
excesivas (> 400 mg L-1) imparten olores y sabores fuertes y picantes, mientras que a
concentraciones bajas (< 300 mg L-1) imparten características frutales a la bebida; los aldehídos
dan sabores frutales como manzana y nuez; los ácidos confieren aromas picantes y rancios como
112
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
el vinagre y los monoterpenos están asociados a las notas florales (Swiegers et al., 2005; Díaz-
Montaño et al., 2009).
S1 K1 Mixto
6 6 6
4 4 4
2 2 2
0 0 0
-2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 3
Nivel de aceptación Nivel de aceptación Nivel de aceptación
Figura 3.6. Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos de S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo
puro y mixto.
Paja
0.50
Ferm P. - Met - Dul
- Fen
hum
Nuez F. des Mant
Ferm
art
Man. F. Ferm Mad Que Sal
Frut
Res
Mad.R F. Sec Mad Hum
Mad Fru Pic
Mixto S1 K1
Figura 3.7. Perfiles sensoriales de olor, aroma, gusto y sensaciones trigeminales de los destilados de S. cerevisiae
(S1), K. africana (K1) y del Cultivo Mixto (K1+S1). Descriptores de Olor: Ag-coc: agave cocido; Anís: anís; Barn:
barniz; Car: caramelo; Ferm-avin: fermentado avinagrado; F-des: fruta descompuesta; F-ferm: fruta fermentada; F-
sec: fruta seca; Fru: frutal; Mad: madera; Mad-res: madera resinosa; Man-roja: manzana roja; Nuez: nuez; Paja-húm:
paja húmeda; Pic: picante; T.húm: trapo húmedo; Vin: vinagre. Descriptores de aroma: Aceit: aceituna; Anís: anís;
Barn: barniz; Car: caramelo; Fen: fenólico; Ferm: fermentado; Frut: frutal; Hum: humo; Mad: madera; Mad-res:
madera resinosa; Mant-art: mantequilla artificial; P-hum: paja húmeda; Plat: plátano; Solv-frut: solvente frutal; Vin:
vinagre. Descriptores de gusto y sensaciones trigeminales: Ac: ácido; Am: amargo; Dul: dulce; Sal: salado; Pic:
picante; Que: quemante; Met: metálico y Ast: astringente.
113
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.2.4 Conclusiones
Fermentaciones a nivel matraz en medio basal con K. africana (K1), K. apiculata (K2) y S.
cerevisiae (S1 y S2) en cultivos puros y mixtos fueron examinadas. Durante las fermentaciones a
nivel matraz, se observó que K. africana (K1) y K. apiculata (K2) en cultivo puro presentaron un
limitado crecimiento (concentraciones biomasa < 2 gL-1 y de UFC < 80×106 CFU mL-1), un bajo
consumo de azúcares (< 50 gL-1) y baja producción de etanol (< 11 gL-1) en comparación a las
cepas de S. cerevisiae (S1 y S2) que mostraron una alta eficiencia fermentativa; es decir una alta
formación de biomasa (> 3 g/L) y UFC (> 100×106 CFU mL-1), un completo consumo de
azúcares y una alta producción de etanol (> 35 gL-1). En cultivo mixto las levaduras del género
Kloeckera crecieron en menor concentración que las levaduras del género Saccharomyces,
mostrando los tres grupos formados en cultivo mixto patrones similares a los observados para S.
cerevisiae en cultivo puro, debido a la presencia y dominio de esta levadura durante la
fermentación. El análisis en la síntesis de compuestos volátiles en mosto mostró que las levaduras
del género Kloeckera en cultivo puro produjeron altas concentraciones de ésteres de acetato en
relación a las cepas Saccharomyces que mostraron las mayores concentraciones de acetaldehído y
alcoholes superiores. En los cultivos mixtos la influencia de S. cerevisiae y de las levaduras
Kloeckera fue evidente al producirse concentraciones considerables de acetaldehído, isobutanol,
alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y acetato de etilo. La selección de levaduras se realizó a partir
del grupo en cultivo mixto que produjo la menor concentración de alcoholes superiores y
acetaldehído, seleccionándose el grupo uno formado por las cepas K. africana y S. cerevisiae.
114
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
115
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los perfiles cinéticos de: formación de biomasa, unidades formadoras de colonias (UFC)
consumo de azúcares y producción de etanol en cultivo puro y mixto se muestran en la Figuras
3.8 y 3.9 respectivamente y los parámetros cinéticos en la Tabla 3.9. En la Figura 3.8 se observan
los perfiles cinéticos de las fermentaciones en medio reformulado en cultivo puro; por un lado S.
cerevisiae y K. africana en cultivo puro alcanzan la fase estacionaria en 20 h de fermentación con
concentraciones celulares de 410 y 160 × 106 UFC mL-1 respectivamente, reduciendo en un 5 y
22% su población celular a las 72 h de fermentación con concentraciones de 385 y 85.5 × 106
UFC mL-1 (Fig. 3.8). Por otro lado, en relación a la formación de biomasa, consumo de azúcares
y producción de etanol; se observa que S. cerevisiae presenta la mayor formación de biomasa con
valores de 6.8 gL-1 en 24 h de fermentación que K. africana que presenta una menor
concentración (3.25 gL-1); ambos cultivos consumieron los azúcares en 20 y 36 h de fermentación
y produjeron altas concentraciones de etanol (45.37 y 39.89 gL-1) respectivamente (Fig. 3.8). Se
observaron diferencias significativas en el cultivo mixto. S. cerevisiae y K. africana en cultivo
mixto alcanzaron la fase estacionaria en 20 h de fermentación con concentraciones celulares de
160 y 150 × 106 UFC mL-1 respectivamente. Se redujo en 19.43 y 68 % la población celular a las
72 h de fermentación con concentraciones de 123 y 47.5 × 106 UFC mL-1 para S. cerevisiae y K.
116
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
africana (Figura 3.9). De igual manera que en cultivo puro, S. cerevisiae en cultivo mixto con K.
africana mostraron altas concentraciones de biomasa y etanol (5.5 y 38.3 gL-1) y consumo total
de los azúcares del medio (Figura 3.9). Al comparar los parámetros cinéticos entre cultivos, se
observaron diferencias significativas (95% LSD). El cultivo puro de S. cerevisiae mostró la
mayor velocidad especifica de crecimiento máxima µmáx (0.328 h-1) que el cultivo puro de K.
africana y el cultivo mixto (0.22 y 0.168 h-1 respectivamente). Asimismo en relación a la máxima
velocidad especifica de consumo de sustrato máxima (qsmáx), el cultivo puro de S. cerevisiae
mostró mayor velocidad (8.02 g/g h-1) que el cultivo puro de K. africana y el cultivo mixto que
obtuvieron respectivamente 4.526 y 6.873 g/g h-1. Finalmente la máxima velocidad especifica de
producción de etanol (qsmáx) mostraron los mayores valores (6.219 y 5.298 g/g h-1) el cultivo puro
de K. africana y el cultivo mixto en comparación con el cultivo puro de S. cerevisiae (3.46 g/g h-
1) (Tabla 3.8). En relación a los rendimiento de biomasa (Yx/s) diferencias significativas fueron
observadas entre los tratamientos, obteniendo el cultivo puro de S. cerevisiae el mayor
rendimiento, mientras que para los rendimientos de etanol (Yp/s) no se encontraron diferencias
significativas entre cultivos (Tabla 3.8). Al comparar los resultados obtenidos con respecto al
medio basal se encontraron diferencias significativas. K. africana en cultivo puro en medio basal
presentó una baja capacidad fermentativa, debido al consumo incompleto de azúcares(> 40 gL-1),
la baja formación de biomasa y UFC (1.83 gL-1, < 10 × 106 UFC mL-1), así como de etanol (< 11
gL-1), posiblemente por una baja disponibilidad de nutrientes en el jugo de agave, ya que en
medio reformulado para esta misma levadura, se incrementó 1.2 veces la formación de biomasa,
4.27 veces la producción de etanol y 2.16 veces la viabilidad celular (UFC) en cultivo puro con
un consumo total de los azúcares (Figuras 3.2 y 3.8). Para S. cerevisiae en los dos medios
probados (basal y reformulado) en cultivo puro y mixto, se presentó en general una alta eficiencia
fermentativa.
117
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
500x106
A
6
400x10
UFC mL-1
300x106
200x106
100x106
0 10 20 30 40 50 60 70 80
120 8 50
B
Azucares reductores (gL-1)
100
40
6
Biomasa (gL-1)
80
Etanol (gL-1)
30
60 4
A 20
40
2
10
20
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
120 5 50
C
100
Azucares reductores (gL-1)
4 40
Biomasa (gL-1)
80
Etanol (gL-1)
3 30
60
2 20
40
1 10
20
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)
Etanol
Azucares
Biomasa
Figura 3.8 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC (A), biomasa (●), azúcares reductores (▼) y etanol (■) de
las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S. cerevisiae
S1 S1 ( ) y K. africana K1 ( ). Las
-1
fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con sulfatoK1de amonio (0.17 gL-1), asparagina (1.56 gL ) y
-1
tiamina (570 µg L ). Los valores son las medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras
verticales representan la desviación estándar de dos muestras.
118
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
180x106
160x106
A
140x106
120x106
100x106
UFC mL-1
80x106
60x106
40x106
20x106
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
120 7 50
6
B
100
Azucares reductores (gL-1)
40
5
Biomasa (gL-1)
80
Etanol (gL-1)
4 30
60
3 20
40
2
10
20 1
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)
Figura 3.9 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFCBiomasa
(A), biomasa (●), azúcares reductores (▼) y etanol (■) de
las fermentaciones empleando las levaduras S. cerevisiae S1Azucares
( ) y K. africana K1 ( ) en cultivo mixto. Las
Etanol -1 -1
fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con sulfato de amonio (0.17 gL ), asparagina (1.56 gL ) y
-1
tiamina (570 µg L ), Los valores son las medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras
K1
verticales representan la desviación estándar de dos muestras.
S1
119
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.9 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas estudiadas en cultivo puro y mixto.
Cepa µ máx (h-1) qsmáx (g/g h-1) qpmáx (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
K1 a 0.22 ± 0.046 4.526 ± 0.64 6.219 ± 0.298 0.026 ± 0.001 0.393 ± 0.004
S1 b 0.328±0.048 8.02 ± 0.89 3.46 ± 0.054 0.059 ± 0.001 0.395 ± 0.005
K1+S1 c 0.168 ± 0.03 6.873 ± 1.351 5.298 ± 0.25 0.047 ± 0.004 0.343 ± 0.018
µmax: velocidad específica de crecimiento máxima; qsmax: velocidad específica de consumo máxima; qpmax: velocidad
específica de producción de etanol máxima; Yx/s and Yp/s: rendimientos de biomasa y etanol; a Cultivo puro de K.
africana (K1); b Cultivo puro de S. cerevisiae (S1); c Cultivo mixto formado por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
en medio reformulado. Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de dos fermentaciones.
Similares resultados han sido reportados por otros autores. Díaz-Montaño et al. (2010) estudiaron
el efecto de la adición de distintas fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico al jugo de agave
sobre las capacidades fermentativas de S. cerevisiae y K. africana en cultivo puro, encontrando
que S. cerevisiae es capaz de asimilar cualquier fuente de nitrógeno orgánico e inorgánico. K.
africana por su parte sólo es capaz de asimilar fuentes de nitrógeno orgánico como extracto de
levadura, aumentando con ello la capacidad fermentativa a valores similares a los de S. cerevisiae,
con concentraciones de biomasa de 3.20 gL-1, consumiendo de forma efectiva la fuente de
azúcares y alcanzando concentraciones de etanol superiores a los 35 gL-1; mostrando con ello que
el limitado crecimiento de esta levadura está asociado principalmente a la baja disponibilidad de
nutrientes en el jugo agave. Por otra parte Valle-Rodríguez et al. (2011) estudiaron las
necesidades nutricionales mínimas necesarias para lograr aumentar las capacidades fermentativas
de K. africana y la velocidad de la fermentación a valores cercanos a los obtenidos para S.
cerevisiae, optimizándose para ello el medio de cultivo con vitaminas, aminoácidos, y
oligoelementos, encontrando que esta levadura requiere de tiamina como vitamina, asparagina
como aminoácido y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno en concentraciones moderas
para estimular y favorecer su crecimiento.
Cabe resaltar que los resultados anteriores son la base del presente trabajo, el cual se enfoca en
analizar el efecto interactivo de las condiciones nutricionales y operacionales sobre la prevalencia
y la capacidad fermentativa de K. africana al trabajar en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae.
3.3.2 Análisis de los compuestos volátiles en mosto obtenidos en cultivo puro y mixto
120
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
y algunos ésteres que constituyen el principal grupo de compuestos que producen el “bouquet de
la fermentación” (Benn & Peppard, 1996). La Tabla 3.10 muestra las concentraciones de
compuestos volátiles evaluados de las fermentaciones efectuadas en medio reformulado.
Diferencias significativas fueron encontradas entre las cepas en la concentración de acetaldehído,
acetato de etilo, isobutanol, acetato de isoamilo, alcohol isoamílico, hexanoato de etilo, octanoato
de etilo, decanoato de etilo, acetato de fenetilo y 2-fenil etanol (95% LSD). Por otro lado no se
encontraron diferencias significativas en la concentración de metanol, n-propanol y n-butanol
entre las cepas bajo las condiciones de estudio (95% LSD). Asimismo el cultivo puro de S.
cerevisiae presentó la mayor concentración de alcoholes superiores como alcohol isoamílico,
isobutanol y 2-fenil etanol que el cultivo puro de K. africana que produjo la mayor concentración
de acetaldehído, acetato de etilo y acetato de fenetilo (Tabla 3.10). El cultivo mixto presentó
concentraciones intermediadas de acetaldehído, acetato de etilo, acetato de isoamilo, hexanoato
de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, acetato de fenetilo, alcohol isoamílico y 2-fenil
etanol, pudiendo influir positivamente en el bouquet de la bebida al conferir aromas y sabores
únicos, debido al efecto interactivo de ambas cepas durante la fermentación. De igual manera que
los anteriores análisis efectuados a los compuestos volátiles producidos en los diferentes
tratamientos; los compuestos volátiles de los mostos obtenidos de las fermentaciones en cultivo
puro y mixto en medio reformulado con las levaduras K.africana y S.cerevisiae fueron agrupados
y separados en dos compontes principales (PCA) con una varianza explicada del 87.7% (Figura
3.10). Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: acetato de etilo y
acetato de fenetilo con pesos negativos y 2-fenil etanol, isobutanol, octanoato de etilo y acetato
isoamilo con pesos positivos. Mientras que para el PC-2 fueron: acetato de fenetilo con pesos
negativos y el metanol y acetaldehído con pesos positivos (Tabla 3.11). Comparando los
resultados de compuestos volátiles de las fermentaciones en medio reformulado para las cepas K.
africana, S. cerevisiae y el cultivo mixto contra aquellos obtenidos para las mismas cepas pero en
medio basal, diferencias significativas fueron encontradas (95%LSD). En medio basal el cultivo
puro de K. africana mostró una baja concentración de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil
etanol y acetaldehído, mientras que en medio reformulado presentó mayor concentración, debido
al efecto de los factores de crecimiento adicionados al medio de fermentación que lograron
incrementar la capacidad fermentativa de K. africana, sin embargo la concentración de acetato de
etilo y acetato de fenetilo en los dos medios fue alta, posiblemente a que es un compuesto
121
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
característico del metabolismo de esta cepa (Tabla 3.3 y 3.10). Por su parte para S. cerevisiae en
cultivo puro en los dos medios probados, al ser una levadura poco demandante de nutrientes y
con altas capacidades fermentativas, indistintamente del medio de fermentación, en todos los
tratamientos mostró altas concentraciones de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y
acetaldehído (Zironi et al., 1993; Díaz-Montaño et al., 2010). En medio basal el cultivo mixto
mostró concentraciones altas de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y acetaldehído,
debido al dominio de S. cerevisiae durante la fermentación (Tabla 3.3). Sin embargo a pesar del
corto periodo activo de K. africana durante la fermentación en cultivo mixto con S. cerevisiae en
medio basal se promovió la síntesis de acetato de etilo y acetato de fenetilo en concentraciones
considerables como para poder influir en la composición química del mosto. En medio
reformulado, el cultivo mixto presentó mayores concentraciones de n-propanol, acetato de etilo,
acetato de isoamilo y acetato de fenetilo que el cultivo mixto en medio basal debido a la mayor
prevalencia de K. africana durante la fermentación (Tabla 3.10).
Estudios previos han reportado similares resultados. Díaz-Montaño et al. (2008) efectuó
fermentaciones bajo condiciones similares a la realizadas en la industria tequilera (jugo de agave
suplementado con sulfato de amonio) encontrando bajo estas condiciones que las levaduras del
género Saccharomyces producen la mayor concentración de alcoholes superiores, acetaldehído y
algunos ésteres como el hexanoato de etilo en comparación con las levaduras del género
Kloeckera que produjeron una alta concentración de acetato de etilo, ácido acético, acetato de
fenetilo y n-butanol. Por otra parte Ugliano et al. (2010) sugirieron que el manejo de diferentes
concentraciones de fuentes de nitrógeno (fosfato diamónico en el rango de 200-400 mg L-1) en las
fermentaciones del jugo de uva así como el tipo de levadura, pueden ser herramientas poderosas
para modular y mejorar la composición aromática y sensorial de la bebida. Adicionalmente
reportaron que las variaciones en la concentración de fosfato diamónico (DAP), afectan la
formación de acetatos, etil ésteres de ácidos grasos, alcoholes superiores, sulfuro de hidrógeno,
mercaptano de etilo y mercaptano de metilo. Presentándose concentraciones altas de acetatos y
etil ésteres de ácidos grasos al aumentar la concentración de DAP (> 200 mg L-1), sin embargo
para los alcoholes superiores la concentración se redujo con el aumento de DAP. La carencia de
estos nutrientes en el medio de cultivo considerablemente reduce el crecimiento, la viabilidad
celular, el consumo de azúcares, la producción de etanol y los rendimientos de etanol y biomasa.
122
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las levaduras asimilan amonio para sintetizar glutamato y glutamina, que son utilizados como
precursores para otros aminoácidos y como compuestos clave en el metabolismo del nitrógeno y
carbono. Algunos aminoácidos (leucina, valina, isoleucina y treonina) siguen la ruta de Ehrlich
para ser convertidos en compuestos aromáticos (isobutanol, alcohol isoamílico, alcohol amílico y
n-propanol respectivamente), que participan activamente en el bouquet de las bebidas alcohólicas
(Díaz-Montaño et al., 2009). Asimismo además de las fuentes de nitrógeno y los factores de
crecimiento, otros reportes sugieren que el empleo de levaduras específicas como las no-
Saccharomyces del género Kloeckera puede ser significativo por la mayor producción de
compuestos volátiles que impactan sensorialmente como el acetato de etilo (frutal) y acetato de
fenetilo (rosas).
Tabla 3.10 Concentración de compuestos volátiles en mosto producidas por las levaduras Kloeckera africana (K1),
y Saccharomyces cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto.
*: Compuestos con diferencias significativas entre cepas en cultivo puro y mixto; cada valor representa el promedio
± de dos determinaciones. nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílicos. K1:
cultivo puro de K. africana; S1: cultivo puro de S. cerevisiae K1+S1: cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
.
123
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
acet
0.60 A
0.50
met
0.40 Cepa de K. africana
0.30
Cepa de S. cerevisiae
0.20
isob
0.10 dec etil
p[2]
-0.40
ac fen
-0.50
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
p[1]
6
B
2
K1 K1
S1
S1
0
t[2]
-2 M1
M1
-4
-6
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
t[1]
Figura 3.10. PCA de (A) compuestos volátiles y (B) las cepas de levaduras en cultivo puro (K1R, S1R) y mixto
(M1R) en medio reformulado. acet: acetaldehído; met: metanol; ac-etil: acetato de etilo; hex-etil: hexanoato de etilo;
oct-etil: octanoato de etilo; dec-etil: decanoato de etilo; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-iso:
alcohol isoamílico; alc-fen: 2-fenil etanol; ac-isom: acetato de isoamilo y acet-fen: acetato de fenetilo. K1: cultivo
puro de K. africana; S1: cultivo puro de S. cerevisiae K1+S1: cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae
124
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.11. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 69.2 Varianza explicada (%) 18.5
Acetato de etilo -0.3289 Acetato de fenetilo -0.4528
Acetato de fenetilo -0.2294 Acetato de isoamilo -0.2329
Acetaldehído -0.0899 n-Butanol -0.1877
n-Butanol 0.1789 Hexanoato de etilo -0.1620
n-Propanol 0.1862 n-Propanol -0.1369
Metanol 0.2044 2-Fenil etanol -0.1234
Acetato de isoamilo 0.3094 Octanoato de etilo 0.0012
Hexanoato de etilo 0.3159 Acetato de etilo 0.0515
Decanoato de etilo 0.3175 Alcohol isoamílico 0.0534
2-Fenil etanol 0.3238 Decanoato de etilo 0.0915
Isobutanol 0.3246 Isobutanol 0.1443
Octanoato de etilo 0.3261 Metanol 0.4753
Acetato de isoamilo 0.3314 Acetaldehído 0.6203
3.4 Caracterización de los compuestos volátiles en destilados obtenidos con las levaduras
de estudio S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto en medio
reformulado
De igual manera que en la sección 3.2; se llevaron a cabo fermentaciones en cultivo puro y mixto
con las levaduras Kloeckera africana (K1) y Saccharomyces cerevisiae (S1) a nivel piloto
(reactor de 14 L) empleando el medio de fermentación reformulado. Las fermentaciones se
efectuaron bajo condiciones anaeróbicas de crecimiento a 250 rpm y 30ºC y los mostos de cada
fermentación se destilaron. Dado que en la sección 3.1 y 3.3 se observó que el patrón de
producción de compuestos volátiles en mosto para S. cerevisiae (S1) en medio basal y
reformulado es muy similar y se inclina en su mayoría a la producción de alcoholes superiores y
acetaldehído, se decidió omitir su realización de las fermentaciones a nivel piloto (reactor de 14
L); caracterizándose aromáticamente sólo los destilados de las fermentaciones del cultivo puro
de K. africana (K1) y el cultivo mixto de ambas levaduras (K1+S1). Los compuestos
mayoritarios regulados por norma se analizaron por cromatografía de gases (CG-FID) y los
compuestos minoritarios por (CG-MS). Para cubrir este objetivo se implementó el diseño
multifactorial de la sección 2.5.2.
125
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los compuestos mayoritarios de los destilados del cultivo puro de K. africana (K1) y del cultivo
mixto (K1+S1) se muestran en la Tabla 3.12. El análisis de rangos múltiples (95% LSD)
determinó diferencias significativas entre los destilados de K. africana y el cultivo mixto en la
concentración de todos los compuestos volátiles evaluados, con excepción del lactato de etilo y
metanol. El destilado del cultivo puro de K. africana produjo la mayor concentración de ácido
acético, n-butanol y n-propanol que el destilado del cultivo mixto (K1+S1), que presentó altas
concentraciones de acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol, alcohol isoamílico y furfural (Tabla
3.12). Los resultados de este estudio confirman que las principales diferencias entre los destilados,
son debidas al tipo de levadura empleada y a la composición del medio de cultivo (Romano et al.,
2003., Díaz-Montaño et al., 2008). Es interesante observar el efecto de la composición del medio
y del tipo de cultivo sobre la síntesis de compuestos volátiles, debido a que para una misma cepa
(K. africana) pero en medios de fermentación diferentes, la generación de compuestos volátiles
resultó modificada, inclinándose en un medio reformulado a producir altas concentraciones de
ésteres como acetato de etilo y lactato de etilo, alcoholes superiores como n-propanol, n-butanol
y alcohol isoamílico y acetaldehído y en un medio basal sólo a producir concentraciones altas de
ácido acético y furfural (Tabla 3.5 y 3.12). Estas diferencias son debidas como ya se había
mencionado a la composición del medio cultivo, que lograron incrementar la capacidad
fermentativa y aromática de K. africana. Asimismo un patrón semejante es observado con el
cultivo mixto, donde en medio basal el destilado se inclinó a producir como S. cerevisiae altas
concentraciones de n-propanol, isobutanol, alcohol isoamílico y acetaldehído, debido al mayor
dominio de S. cerevisiae durante la fermentación, por el contrario en medio reformulado el
destilado del cultivo mixto se caracterizó por producir además de isobutanol, alcohol isoamílico y
acetaldehído, altas concentraciones ácido acético, acetato de etilo y lactato de etilo (Tabla 3.5 y
3.12), posiblemente por la mayor prevalencia de K. africana durante la fermentación,
modificando de esta forma la composición química de la bebida y por tanto sus características
aromáticas y sensoriales. La concentración de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados
en medio reformulado, se situaron dentro de los rangos permisibles establecidos por la norma
oficial del tequila, con excepción del acetaldehído del destilado del cultivo mixto que sobrepaso
los límites máximos (> 40 mg/100 mL de alcohol anhidro), debido posiblemente al efecto de S.
126
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
cerevisiae durante la fermentación en cultivo mixto y aun menor corte de cabezas durante la
destilación.
Tabla 3.12: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K. africana (K1) y S. cerevisiae
(S1) en cultivo puro y mixto.
*: Compuestos con diferencias significativas entre grupos; Cn: compuesto no incluido en la norma oficial del
Tequila. a: NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de alcohol amílico activo e isoamílico.
K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
Cada valor representa el promedio ± de dos determinaciones.
127
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los dos destilados y sus compuestos volátiles fueron agrupados por el PCA en dos componentes
principales con una varianza explicada del 95.1% (Figura 3.11). Los destilados fueron
claramente distinguidos el uno del otro, siendo marcados por definidas locaciones en la Figura
3.11-B. Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: n-butanol, n-
propanol y ácido acético con pesos negativos y acetato de etilo, isobutanol, alcohol isoamilícos y
acetaldehído con pesos positivos. Mientras que para el PC-2 fueron: furfural con pesos negativos
y el lactato de etilo y metanol con pesos negativos (Tabla 3.13). La gran variabilidad observada
entre los destilados en cultivo puro y mixto además del tipo de levadura empleada y la
composición del medio, es debida a la materia prima y a las condiciones de fermentación y
destilación. Sin embargo, las levaduras y las condiciones de fermentación han sido señalados
como los factores que más influencia tienen sobre el sabor y aroma de las bebidas alcohólicas,
debido a que la mayoría de los compuestos volátiles son formados durante la fermentación
alcohólica (Oliveira et al., 2005; Romano et al., 2003; Arellano et al., 2008; Díaz-Montaño et al.,
2008).
128
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
met
0.70 A
0.60 lact-et
0.30
p[2]
0.20
0.10 acet-et
alc-isom
0.00 prop acet
but isob
acet-ac
-0.10
-0.20
-0.30 furf
6
B
4
2
M1
K1
0
t[2]
K1
M1
-2
-4
-6
-10 0 10
t[1]
Figura 3.11 PCA de (A) compuestos volátiles y de los (B) destilados obtenidos del cultivo puro de (K1) K.africana
y del cultivo mixto (M1) en medio reformulado. acet: acetaldehído; met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-
propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico; acet-et: acetato de etilo; lac-et: lactato de
etilo y furf: furfural. K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del cultivo mixto de K.
africana y S. cerevisiae.
129
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.13: PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 85 Varianza explicada (%) 10.1
n-Butanol -0.3429 Furfural -0.2961
n -Propanol -0.3428 Ácido acético -0.0393
Ácido acético -0.3425 n-Butanol -0.0267
Lactato de etilo -0.2039 Isobutanol -0.0176
Metanol 0.2009 n-Propanol -0.0038
Furfural 0.3110 Acetaldehído 0.0092
Acetato de etilo 0.3419 Alcohol isoamílico 0.0485
Isobutanol 0.3424 Acetato de etilo 0.0774
Alcohol isoamílico 0.3426 Lactato de etilo 0.5932
Acetaldehído 0.3428 Metanol 0.7413
130
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
131
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.14: Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los destilados de K. africana (K1) y
S.cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos
*: Compuestos con diferencias significativas entre destilados. nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de
alcoholes amílico activo e isoamílico. K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del cultivo
mixto de K. africana y S. cerevisiae. Cada valor representa el promedio ± de dos determinaciones.
132
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Estudios similares han sido llevados a cabo previamente. Oliveira et al. (2005) estudió el efecto
de utilizar diferentes géneros de levaduras (seis cepas de S. cerevisiae y una de cada cepa de C.
apícola, H. occidentalis, P. subpelliculosa y S. pombe) sobre la composición y calidad sensorial
de diferentes destilados de cachaça producidos a escala piloto. Encontrando variaciones en la
concentración de los compuestos secundarios entre destilados, sin embargo estas variaciones no
resultaron significativas (P< 0.05) sobre los atributos sensoriales de olor, aroma e impresión
general. El destilado obtenido de S. pompe fue el más desagradable y considerado inadecuado
para la producción de cachaça. Sin embargo, los otros destilados resultaron adecuados para la
producción de cachaça, debido a que resultaron con atributos positivos en la evaluación sensorial.
Los compuestos minoritarios producidos por los destilados del cultivo puro y mixto de
K.africana y S. cerevisiae fueron separados en dos componentes principales (PCA) con una
varianza explicada del 95.5% (Tabla 3.15 y Figura 3.12). Los compuestos con mayor peso sobre
el componente PC-1 fueron: dodecanoato de etilo y hexadecanoato de etilo con pesos negativos y
el 5-metil furfural, decanoato de etilo, trans-nerolidol con pesos positivos. Mientras que para el
PC-2 fueron: ácido propanoico con pesos negativos y acetato de fenetilo, 2-etil-1-hexanol y 2-
fenil etanol con pesos positivos (Tabla 3.15).
133
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6 B
A
4
2
M1
K1
0
t[2]
K1
M1
-2
-4
-6
Figura 3.12 PCA de (A) compuestos volátiles y de los (B) destilados obtenidos del cultivo puro de (K1) K.africana
y del cultivo mixto (M1) en medio reformulado. prop-ac: ácido propanoico, oct-ac: ácido octanoico, dec-ac: ácido
decanoico, hexdec-ac: ácido hexadecanoico, 3-fen-prop: 3-fenilpropanal, 4-pent-o: 4-penten-1-ol, et-prop: 3-
etoxipropan-1-ol, etil-hex: 2-etil-1-hexanol, fen-alc: 2-fenil etanol, fur-alc: alcohol furfurílico, fen-prop: propionato
de fenetilo, lev-et: levulinato de etilo, dec-et: decanoato de etilo, dod-et: dodecanoate de etilo, dec-9-et: 9-decenoato
de etilo, fen-acet: acetate de fenetilo, hexdec-et: hexadecanoato de etilo, hexdec-9-et: 9-hexadecenoato de etilo, acet-
fur: 2-acetil furan, 5mf: 5-metil-furfural, acet: acetoína, 1-hid-2-prop: 1-hidroxy-2-propanona, lin-oxd: cis-óxido de
linalol, terp: α−terpineol y nerol: trans-nerolidol. K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del
cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
134
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.15: PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 89.3 Varianza explicada (%) 6.2
Dodecanoato de etilo -0.21588 Ácido propanoico -0.35468
Hexadecanoato de etilo -0.21552 Ácido octanoico -0.11931
2-Acetil furan -0.21485 Propionato de fenetilo -0.11804
Propionato de fenetilo -0.21227 1-Hidroxy-2-propanona -0.082289
2-Fenil etanol -0.21103 Levulinato de etilo -0.078059
3-Fenilpropanal -0.21067 Ácido hexadecanoico -0.073698
Alcohol furfurílico -0.18478 Hexadecanoato de etilo -0.052128
α−terpineol 0.11981 Ácido decanoico -0.041343
2-Etil-1-hexanol 0.1514 Decanoato de etilo -0.02751
Acetato de fenetilo 0.16606 trans-Nerolidol -0.01535
Ácido propanoico 0.19394 5-Metil-furfural -0.0086409
Ácido octanoico 0.20487 Dodecanoate de etilo 0.007543
4-penten-1-ol 0.2087 3-Etoxipropan-1-ol 0.013759
Ácido decanoico 0.2107 Acetoína 0.038434
cis-Óxido de linalol 0.21139 2-Acetil furan 0.077527
1-Hidroxy-2-propanona 0.21347 9-Hexadecenoato de etilo 0.088343
Levulinato de etilo 0.21383 2-Fenil etanol 0.16595
Ácido hexadecanoico 0.21417 cis-Óxido de linalol 0.16835
9-Hexadecenoato de etilo 0.21465 3-Fenilpropanal 0.1734
3-Etoxipropan-1-ol 0.2147 4-Penten-1-ol 0.20248
Acetoína 0.21537 α−terpineol 0.25008
trans-Nerolidol 0.21583 Alcohol furfurílico 0.39789
Decanoato de etilo 0.21593 2-Etil-1-hexanol 0.44157
5-Metil-furfural 0.21605 Acetato de fenetilo 0.51373
135
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.4.3 Conclusiones
Las cinéticas de fermentación de K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae fueron
examinadas en medio reformulado. Los resultados mostraron que K. africana en cultivo puro y
mixto con S. cerevisiae, es capaz de sobrevivir y aumentar su capacidad fermentativa por mayor
tiempo durante la fermentación, cuando el medio no es limitante en nutrientes. Incrementando 1.2
veces la formación de biomasa, 2.16 y 15 veces la viabilidad celular (UFC), reduciendo un 22 y
68% la población celular en cultivo puro y mixto al final de la fermentación y aumentando 4.24
veces la producción de etanol con un completo consumo de azúcares en comparación con las
fermentaciones efectuadas en medio basal. Con estos resultados, se confirma que el limitado
crecimiento de K. africana, esta asociado principalmente con la baja disponibilidad de nutrientes
en el medio de cultivo. El aumento en la capacidad fermentativa de K. africana, influyó
considerablemente sobre la síntesis de compuestos volátiles, debido al incremento en la
concentración de alcoholes superiores y acetaldehído, sin embargo no se dejaron de lado las
características propias de esta levadura como son alta producción de acetato de etilo y acetato de
fenetilo.
En relación a S. cerevisiae en cultivo puro y mixto presentó una alta eficiencia fermentativa,
mostrando altas concentraciones de biomasa, etanol, alcoholes superiores y acetaldehído y un
total consumo de azúcares, confirmando de esta manera la alta capacidad fermentativa
previamente reportada.
Diferencias significativas fueron encontradas en la concentración de los compuestos volátiles
sintetizados por K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae, debidas al efecto del tipo
de cepa, los nutrientes del medio de cultivo, al tipo de cultivo y a las condiciones de fermentación
y destilación. Mostrando el destilado de K. africana altas concentraciones de ácido acético, n-
butanol, n-propanol, ácido octanoico, decanoato de etilo, 5-metil furfural, acetoína y acetato de
fenetilo y el destilado del cultivo mixto altas concentraciones de acetaldehído, acetato de etilo,
isobutanol, alcohol isoamílico, furfural, 2-fenil etanol y acetato de fenetilo.
En el siguiente capitulo se examinará el efecto de las condiciones operacionales y nutrimentales
sobre las capacidades fermentativas y aromáticas de K. africana en la fermentación en cultivo
mixto con S. cerevisiae en sistema en continuo.
136
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A continuación se resumen y discuten, los resultados de los efectos de cada uno de los factores
estudiados sobre las capacidades fermentativas y aromáticas de K. africana (K1) al trabajar en
cultivo mixto con S. cerevisiae (S1).
137
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.16 Condiciones experimentales y factores estudiados en la fermentación en continuo de K. africana (K1) en
cultivo mixto con S. cerevisiae (S1).
Primeramente el reactor fue operado en cultivo por lote durante las primeras 14 h de
fermentación, tiempo después del cual las bombas de alimentación y extracción de medio fueron
activadas para dar inicio al cultivo en continuo, debido a que en este momento la actividad
metabólica de los microorganismo aún es alta (fase exponencial). Antes de entrar a estado
estacionario el cultivo, éste experimentó un estado transciente, donde el microorganismo se
adapta al nuevo sistema y al aumento en la concentración de sustrato. Al terminar este estado, la
velocidad de crecimiento celular iguala a la de la pérdida de células por el flujo de salida,
alcanzando en este punto el estado estacionario, donde la concentración de biomasa permanece
138
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
constante.
7 120 100
A
6
100
80
5
Azucares reductores (g L-1)
80
Biomasa (g L-1)
60
Etanol (g L-1)
4
60
3
40
40
2
20
20
1
0 0 0
1010
B
109
UFC mL-1
108
107
5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ
106
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Tiempo (h)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 CND
Azucares
Figura 3.13 Perfiles cinéticos (A y B) de: viabilidad celularEtanol
en UFC, biomasa (●), azúcares reductores (▼) y etanol
Biomasa
(■) de las fermentaciones en continuo en cultivo mixto empleando
S1 las levaduras S. cerevisiae S1 ( ) y K. africana
K1 ( ). Las fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix (100 ±K111 gL-1 Azúcares reductores) y D = 0.04 h-1, probando
nueve condiciones de cultivo (CND) en medio reformulado (condiciones 1, 2, 3, 4) y medio basal (condiciones 5, 6,
7, 8), así como la condición en el punto al centro (condición 9). Los datos representan el promedio ± la desviación
estándar de tres muestras (3τ) para el etanol y cinco muestras (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada
condición de cultivo. τ = 25 h.
139
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para alcanzar el estado estacionario del cultivo, cinco tiempos de residencia fueron establecidos
en cada condición de fermentación. Las fermentaciones se efectuaron a una tasa de dilución
constante (D = 0.04h-1), debido a que en esta condición de acuerdo con Valle-Rodríguez et al.
(2011), K. africana presenta la mejor estabilidad y eficiencia fermentativa en comparación a las
fermentaciones efectuadas con tasas de dilución mayores (> 0.04h-1), mientras que para S.
cerevisiae la tasa de dilución resultó ser menor a las reportadas como óptimas para esta levadura
(Moran-Marroquí et al., 2011).
Durante el cultivo mixto de K. africana con S. cerevisiae, los cambios de temperatura, oxígeno y
el medio de fermentación mostraron tener un efecto significativo sobre la producción de biomasa
y UFC (P< 0.05). Encontrándose la mayor concentración de biomasa y UFC en la tercera
condición a 25ºC y 0.03 vvm en medio reformulado (Tabla 3.17). Durante esta condición la
concentración de biomasa fue de 5.85 gL-1 y de UFC para S. cerevisiae de 7855 × 106 UFC mL-1
y para K. africana de 1057.53 × 106 UFC mL-1 respectivamente (Tabla 3.17). Sin embargo a
pesar de que durante esta condición se aumentó significativamente la viabilidad y prevalencia de
K. africana, la concentración alcanzada en UFC fue menor a la obtenida para S. cerevisiae
posiblemente por efecto de otros factores que no son estudiados en este trabajo. Algunos estudios
han reportado que la muerte de las levaduras no-Saccharomyces en la fermentación en cultivo
mixto con S. cerevisiae está asociado además de los factores estudiados en este estudio, a otros
más. Como por ejemplo, Pérez-Nevado et al. (2003) reportó que la muerte de H. guillermondii y
H. uvarum en la fermentación por lote en cultivo mixto con S. cerevisiae, es debida a la presencia
de compuestos tóxicos (además del etanol) producidos por S. cerevisiae y Nissen & Arneborg
(2003) por su parte determinó que la detención del crecimiento de K. thermotolerans y T.
delbrueckii en la fermentación en cultivo mixto con S. cerevisiae se debe a un mecanismo de
contacto entre célula y célula en presencia de altas concentraciones celulares de S. cerevisiae.
Aunque pareciera que estas explicaciones aclaran parte de estos fenómenos, se requiere más
investigación en relación a los mecanismos implicados. Asimismo, hasta el momento la mayoría
de los estudios de fermentaciones en cultivo mixto han sido realizados en cultivo por lote, donde
el microorganismo experimenta diferentes estados fisiológicos y por tanto su respuesta a las
diferentes condiciones a lo largo de la fermentación es muy cambiante. Por el contrario en las
fermentaciones en cultivo continuo, debido a que el microorganismo experimenta un mismo
estado fisiológico, es posible asociar causa-efecto y asegurar en todo momento el 100% de
140
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
viabilidad celular. Cabe resaltar que a pesar de que la concentración celular (UFC) para K.
africana fue menor a la obtenida para S. cerevisiae, la concentración alcanzada resultó
significativa, y deja en evidencia el importante efecto de la temperatura, el oxígeno y el medio de
fermentación sobre la capacidad fermentativa de K. africana. Estudios previos efectuados en
cultivo por lote y continuo han observado similares resultados. Nagodawithana et al. (1974)
estudiaron el efecto del oxígeno disuelto (DO), la temperatura y la concentración de azúcar sobre
la viabilidad celular de S. cerevisiae en cultivo continuo. Encontrando que bajo condiciones de
aerobiosis (13% DO), altas concentraciones de azúcar (25ºBx) y bajas temperaturas (15ºC), S.
cerevisiae mejora significativamente su supervivencia y viabilidad celular (conservando
alrededor del 94%), produciendo además altas concentraciones de etanol (9.5 % (w/v)). Por otro
lado Valle-Rodríguez et al. (2011) determinó los requerimientos de aminoácidos que precisa K.
africana en la fermentación de jugo de agave en cultivo continuo, para lograr una fermentación
completa con alta producción de etanol. Encontrando que en presencia de asparagina K. africana
mejora significativa su capacidad fermentativa, consume completamente su fuente de azúcares y
alcanza altas concentraciones de etanol, pudiendo influir en el bouquet de la bebida por la gran
variedad de compuestos volátiles sintetizados. Asimismo Hernández-Cortés et al. (2009) estudió
el efecto del pH y la aireación en la fermentación en continuo del jugo de agave empleando dos
cepas de levaduras de S. cerevisiae (S1 y S2). Encontrando que bajo condiciones de
microaireación y D = 0.12 h-1 se mejora la producción de biomasa y el consumo de azúcares
reductores y amonio en ambas cepas. Incrementandose además la producción de etanol, pero
solamente en los cultivos de S1.
Estos reportes aunados a los resultados de este estudio, sugieren la importancia de estos factores
sobre el mejoramiento de las capacidades de fermentación de todas las especies participantes. Sin
embargo poca información asociada con mecanismos bioquímicos y moleculares implicados a
estos fenómenos está disponible, particularmente en cultivo mixto. No obstante el papel del
oxígeno y la temperatura en las fermentaciones alcohólicas ha sido previamente estudiada. Se ha
reportado que en presencia de oxígeno, el flujo de carbono en las levaduras es orientado a la
producción de biomasa por activación de las enzimas involucradas en la respiración celular
(Hernández-Cortés et al., 2009). Adicionalmente se ha asociado al oxígeno como un factor de
crecimiento que promueve la sintesis de ácido oleico y ergosterol en la membrana plasmática,
141
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Asimismo la temperatura es otro factor que parece estar asociado al mecanismo de tolerancia a
etanol, debido a que a temperaturas bajas (< 20ºC) se ha logrado aumentar significativamente el
crecimiento y supervivencia de levaduras no-Saccharomyces como K. apiculata y C. stellata
durante la fermentación en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae (Chongxiao & Fleet. 1988;
Bilbao et al., 1997; Erten, 2002). Sin embargo hasta el momento no existe una relación entre el
contenido de lípidos en la membrana plasmática y la temperatura de fermentación, que pudiese
dar explicación a la mayor viabilidad y actividad fermentativa de las levaduras no-
Saccharomyces. No obstante a pesar de no existir estudios previos en este rubro, por los
resultados obtenidos en este estudio se deduce la importancia del suministro de oxígeno y la
temperatura de fermentación sobre el crecimiento y la capacidad fermentativa de K. africana al
trabajar en cultivo mixto con S. cerevisiea durante la fermentación del jugo de agave.
142
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por otro lado en relación al etanol, el medio de fermentación y la temperatura fueron los
principales factores en presentar un efecto significativo sobre su producción (P< 0.05).
Observándose la mayor concentración de etanol en las condiciones efectuadas en medio
reformulado (Condiciones 1, 2, 3, 4 y 9) (Tabla 3.16). El oxígeno no mostró tener un efecto
significativo sobre la producción de etanol (P> 0.05). Es importante resaltar que indistintamente
de la condición de cultivo, la concentración producida de etanol fue alta, debido a la presencia y
mayor dominio de S. cerevisiae durante la fermentación. La alta concentración de etanol
presentada, se reflejó en los rendimientos de etanol (Yp/s), a través de éste es posible definir la
capacidad fermentativa del microorganismo, particularmente cuando se compara contra el valor
teórico (0.51), encontrándose que todos los cultivos en medio basal y reformulado mostraron una
alta eficiencia fermentativa (rendimientos muy cercanos al valor teórico).
De igual modo se observó el efecto de los factores estudiados, sobre otros metabolitos producidos
durante la fermentación tales como: ácido succínico, glicerol, ácido acético, diacetilo, 2-3-
butanediol y acetoína (Tablas 3.17 y 3.18). Para el ácido succínico, el ácido acético y la acetoína,
la temperatura, el oxígeno y el medio de fermentación tuvieron un efecto significativo sobre su
producción (P< 0.05). Encontrándose la mayor concentración de ácido succínico en los cultivos
aireados (Condiciones 2, 3, 6, 7) posiblemente por la activación de la enzimas involucradas en la
143
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
respiración celular (Pretorios et al., 2000). La mayor concentración de ácido acético se presentó
en la primera, séptima y octava condición y de acetoína se obtuvó en la séptima condición
(Tablas 3.17 y 3.18). En trabajos efectuados en vinos, se ha reportado la importancia de la
acetoína, debido a que un compuesto clave en el bouquet del vino y en la síntesis de diacetilo y 2-
3-butanediol, siendo un metabolito producido en grandes cantidades por las levaduras apiculata
(Kloeckera/Hanseniaspora). Los factores que afectan su producción son el tipo de levadura, la
temperatura de fermentación, la aireación, la composición del medio, el tamaño de inóculo y el
pH (Romano et al., 1996). Estas observaciones se corroboran con los resultados obtenidos. Sin
embargo para el diacetilo y el 2-3-butanediol el oxígeno y el medio de fermentación fueron los
únicos factores en mostrar un efecto significativo sobre su producción (P< 0.05). El diacetilo fue
detectado únicamente en la primera condición (35ºC y 0 vvm en medio reformulado), siendo en
las demás condiciones no detectado, posiblemente por su conversión a acetoína ó 2-3-butanediol.
Por su parte el 2-3-butanediol, presentó la mayor concentración en la quinta y séptima condición.
Por otro lado, la composición del medio y la temperatura fueron los principales factores en
afectar la producción de glicerol (P< 0.05); presentándose la mayor concentración en la primera,
cuarta, quinta y séptima condición respectivamente (Tablas 3.17 y 3.18). Por estudios en vino y
tequila se ha reportado que el glicerol conjuntamente al etanol, juegan un papel importante en la
fijación de aromas contribuyendo a la viscosidad y al sabor de la bebida. En vino, su contribución
está relacionada a la dulzura de la bebida (Díaz-Montaño et al., 2009; Swiegers et al., 2005).
De igual manera el efecto de los factores nutrimentales y operacionales sobre los parámetros
cinéticos fueron estudiados. Para las velocidades de producción de etanol (rp) y consumo de
azúcares (rs), la temperatura y el medio de fermentación fueron los únicos factores en presentar
un efecto significativo (P< 0.05), contrariamente para la velocidad de producción de biomasa (rx),
los tres factores evaluados mostraron un tener efecto significativo (P< 0.05). Las mayores
velocidades de producción de biomasa (rx), etanol (rp) y consumo de azúcar (rs) fueron obtenidas
en la tercera condición a 25ºC y 0.03 vvm en medio reformulado. Con respecto a las velocidades
específicas de producción etanol (qp) y consumo de azúcares (qs) diferencias significativas fueron
observadas por efecto del oxígeno, la temperatura y el medio de fermentación (P< 0.05). Las
mayores velocidades específicas de producción etanol (qp) y consumo de azúcares (qs) se
presentaron en la quinta condición a 35ºC y 0 vvm en medio basal y en la sexta condición a 35ºC
y 0.03 vvm en medio basal, debido a que en estas condiciones se presentó la menor concentración
144
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
de biomasa (Tabla 3.18). Finalmente para los rendimientos de producción de biomasa y etanol
(Yx/s y Yp/s) diferentes comportamientos fueron observados (Tabla 3.19). Por un lado el oxígeno,
la temperatura y el medio de fermentación, mostraron tener un efecto significativo sobre el
rendimiento de producción de biomasa (Yx/s), presentándose el mayor rendimiento en la tercera
condición a 25ºC y 0.03 vvm en medio reformulado. Por otro lado con respecto al rendimiento de
producción de etanol (Yp/s), ninguno de los factores evaluados mostró tener un efecto
significativo (P> 0.05). El mayor rendimiento de producción de etanol (Yp/s), se presentó en la
novena condición 30ºC y 0.015 vvm en una mezcla equitativa de medio basal y reformulado. Sin
embargo, es importante mencionar que para todas las condiciones el rendimiento de producción
de etanol (Yp/s) fue alto, muy cercano al valor teórico (0.51), debido a la presencia y dominio de S.
cerevisiae durante la fermentación.
Durante la fermentación alcohólica las células de levaduras son expuestas a diferentes clases de
estrés que pueden resultar adversas para el crecimiento (estrés oxidativo, estrés osmótico y estrés
a etanol entre otros) y pueden causar cambios en su estado fisiológico, metabólico y bioquímico;
manifestándose en pérdida de viabilidad, actividad metabólica y fermentativa, así como en
cambios morfológicos entre otros (Pretorius 2000; Zuzuarregui & Del Olmo 2004). De esta
manera durante las condiciones de cultivo estudiadas en la fermentación en continuo de K.
africana y S. cerevisiae en cultivo mixto, debido al efecto de las condiciones operacionales y
nutrimentales diferentes cambios morfológicos en las células de las levaduras fueron observadas.
La Figura 3.14 muestra las diferentes morfologías adquiridas por K. africana y S. cerevisiae en la
fermentación en continuo en cultivo mixto. Por un lado se observa que bajo condiciones de
microaireación (0.03 vvm) y bajas temperaturas (25ºC), indistintamente del medio de cultivo
(condiciones 3 y 7), la morfología de las células adquirió una conformación alargada muy
semejante a la observada en los bacilos, posiblemente por la reducción parcial del oxígeno
durante la respiración celular, lo cual produce un incremento en la concentración intracelular de
especies reactivas de oxígeno (ROS) que ocasiona estrés oxidativo en la célula de levadura (Zuin
A. 2009). Sin embargo en los cultivos operados bajo las mismas condiciones de temperatura
(25ºC), pero en anaerobiosis (condiciones 4 y 8) este fenómeno no fue observado. Por último en
relación a las condiciones efectuadas en aerobiosis y anaerobiosis en medio basal y reformulado a
30 y 35ºC (Condiciones 1, 2, 5, 6 y 9), la morfología celular de las levaduras resultó en todo
145
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.17 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos obtenidos en los estados
estacionarios de las primeras cuatro condiciones probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana y S.
cerevisiae en cultivo mixto en medio reformulado.
CONDICIONES
MEDIO REFORMULADO
0 vvm 0.03 vvm 0.03 vvm 0 vvm
35ºC 35ºC 25ºC 25ºC
Concentración final de sustratos 1 2 3 4
Biomasa (gL-1) 4.13 ± 0.09 3.95 ± 0.15 5.85 ± 0.15 4.24 ± 0.06
6 -1
S1 (UFC x 10 mL ) 1724.46 ± 24.04 3737.5 ± 213.94 7855 ± 208.27 4493.17 ± 249.9
6 -1
K1 (UFC x 10 mL ) 121.3 ± 13.4 812.94 ± 26.84 1057.53 ± 43.97 463.22 ± 23.36
Azúcares reductores residuales (gL-1) 6.07 ± 0.92 3.97 ± 0.34 7.55 ± 0.59 28.47 ± 2.2
Azúcares consumidos (gL-1) 103.20 ± 0.06 89.84 ± 0.12 105.86 ± 0.39 84.30 ± 0.07
Sacarosa (gL-1) 11.17 ± 0.36 7.68 ± 1.76 11.93 ± 0.08 12.87 ± 1.50
Glucosa (gL-1) 0.30 ± 0.03 0.30 ± 0.001 0.367 ± 0.029 0.467 ± 0.058
Fructosa (gL-1) 1.72 ± 0.19 0.73 ± 0.15 1.67 ± 0.13 27.37 ± 2.34
Nitrógeno amoniacal (gL-1) 0.09 ± 0.001 0.034 ± 0.004 0.013 ± 0.004 0.016 ± 0.006
Etanol (gL-1)* 50.75 ± 0.89 39.98 ± 4.35 51.31 ± 1.13 42.08 ± 0.52
pH (su) 3.75 ± 0.047 3.80 ± 0.045 3.86 ± 0.042 3.79 ± 0.039
Producción de metabolitos (gL-1)
Ácido succínico* 0.13 ± 0.03 0.17 ± 0.06 0.37 ± 0.08 0.1 ± 0.01
Glicerol* 2.2 ± 0.10 1.28 ± 0.33 0.88 ± 0.08 2.17 ± 0.15
Ácido acético* 0.34 ± 0.01 0.1 ± 0.09 nd nd
Diacetilo* 0.07 ± 0.03 nd nd nd
2-3-Butanediol* 0.12 ± 0.03 nd 0.12 ± 0.03 0.13 ± 0.06
Acetoína* 0.65 ± 0.00 nd 0.55 ± 0.09 1.03 ± 0.15
Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cinco muestras en cinco tiempos de residencias
(5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. * representa el promedio ± la desviación
estándar de tres muestras en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición
de cultivo. nd: no detectado bajo las condiciones de análisis. su: sin unidades
146
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.18 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos en los estados estacionarios de
las últimas cinco condiciones probadas de las fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo
mixto en medio basal y el punto al centro.
CONDICIONES
MEDIO BASAL M.B+M.R
0 vvm 0.03 vvm 0.03 vvm 0 vvm 0.015 vvm
35ºC 35ºC 25ºC 25ºC 30ºC
Concentración final de sustratos 5 6 7 8 9
Biomasa (gL-1) 2.46 ± 0.08 2.28 ± 0.06 4.51 ± 0.12 3.29 ± 0.04 4.37 ± 0.04
S1 (UFC x 106 mL-1) 514.56 ± 78.19 688.76 ± 27.74 2354.02 ± 101.46 2135.77 ± 35.20 3216.51 ± 178.95
K1 (UFC x 106 mL-1) 92.20 ± 5.58 114.03 ± 10.16 155.48 ± 4.86 138.02 ± 7.62 289.65 ± 15.72
Azúcares reductores residuales
(gL-1) 21.68 ± 1.00 23.57 ± 2.39 29.48 ± 1.97 24.18 ± 1.31 7.59 ± 0.59
Azúcares consumidos (gL-1) 94.09 ± 0.76 90.83 ± 0.11 86.19 ± 0.48 75.64 ± 0.36 102.16 ± 0.09
Sacarosa (gL-1) 11.53±0.38 11.37 ± 0.06 12.67 ± 0.12 9.77 ± 1.71 12.02 ± 0.57
Glucosa (gL-1) 0.4±0 0.367 ± 0.011 0.50 ± 0.01 0.43 ± 0.012 0.33 ± 0.03
Fructosa (gL-1) 17.73± 2.3 14.9 ± 0.6 23.53 ± 0.47 20.83 ± 1.46 4.7 ± 0.94
Nitrógeno amoniacal (gL-1) 0.017±0.007 0.017 ± 0.006 0.017 ± 0.006 0.019 ± 0.006 0.018 ± 0.006
Etanol (gL-1)* 43.50 ± 0.50 40.20 ± 1.31 45.39 ± 0.79 36.81 ± 1.62 51.87 ± 1.04
pH (su) 3.39 ± 0.037 3.28 ± 0.034 3.36 ± 0.032 3.28 ± 0.030 3.54 ± 0.029
Producción de metabolitos (gL-1)
Ácido succínico* 0.13 ± 0.06 0.28 ± 0.03 0.3 ± 0.1 0.10 ± 0.00 nd
Glicerol* 2 ± 0.00 1.90 ± 0.10 2.03 ± 0.15 1.47 ± 0.06 1.85 ± 0.1
Ácido acético* nd nd 0.33 ± 0.06 0.33 ± 0.06 nd
Diacetilo* nd nd nd nd nd
2-3-Butanediol* 0.17 ± 0.01 0.12 ± 0.03 0.17 ± 0.06 0.1 ± 0.00 0.1 ± 0.05
Acetoína* 1.00 ± 0.10 0.93 ± 0.06 1.27 ± 0.06 0.9 ± 0.10 0.8 ± 0.09
Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cinco muestras en cinco tiempos de residencias
(5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. * representa el promedio ± la desviación
estándar de tres muestras en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición
de cultivo. nd: no detectado bajo las condiciones de análisis. su: sin unidades
147
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.19 Parámetros cinéticos obtenidos en los estados estacionarios de las diferentes condiciones probadas de las
fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto.
Parámetros cinéticos
Condición rx (gL-1-h-1) rs (gL-1-h-1) rp (gL-1-h-1) qp (g/g h-1) qs (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
1 0.17±0.0 4.15±0.04 2.03±0.04 0.49±0.003 1.005±0.022 0.040±0.001 0.489±0.007
2 0.16±0.006 3.59±0.014 1.60±0.174 0.41±0.035 0.91±0.033 0.044±0.002 0.446±0.046
3 0.23±0.006 4.23±0.023 2.08±0.048 0.37±0.014 0.74±0.016 0.054±0.001 0.489±0.013
4 0.17±0.002 3.42±0.088 1.68±0.021 0.40±0.015 0.81±0.021 0.050±0.001 0.481±0.013
5 0.01±0.003 3.76±0.04 1.74±0.02 0.69±0.02 1.53±0.055 0.026±0.001 0.464±0.009
6 0.09±0.002 3.50±0.09 1.61±0.05 0.69±0.04 1.53±0.06 0.026±0.001 0.472±0.009
7 0.18±0.005 3.55±0.08 1.82±0.03 0.41±0.004 0.79±0.03 0.051±0.002 0.501±0.012
8 0.13±0.002 3.09±0.05 1.47±0.06 0.45±0.02 0.94±0.02 0.043±0.001 0.472±0.024
9 0.17±0.03 4.10±0.02 2.07±0.04 0.48±0.01 0.94±0.01 0.043±0.001 0.503±0.01
Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cinco muestras en cinco tiempos de residencia
(5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. rx: velocidad de formación de biomasa; rs:
velocidad de consumo de sustrato; rp: velocidad de formación de etanol; qs: velocidad específica de consumo de
sustrato; qp: velocidad específica de producción de etanol; Yx/s y Yp/s: rendimientos de biomasa y etanol.
148
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONDICIONES DE CULTIVO
1) 35ºC, 0 vvm y Medio Reformulado 2) 35ºC, 0.03 vvm y Medio Reformulado 3) 25ºC, 0.03 vvm y Medio Reformulado
4) 25ºC, 0 vvm y Medio Reformulado 5) 35ºC, 0.00 vvm y Medio Basal 6) 35ºC, 0.03 vvm y Medio Basal
7) 25ºC, 0.03 vvm y Medio Basal 8) 25ºC, 0 vvm y Medio Basal 9) 30ºC, 0.015 vvm y Medio Ref + Basal
Figura 3.14 Morfología al microscopia (40×) de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto bajo diferentes
condiciones de cultivo, en las fermentaciones del jugo de agave en cultivo continuo.
149
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La composición química del mosto de cada condición de cultivo fue analizada por cromatografía
de gases-FID acoplada a un head-space (CG-FID-HS). Los compuestos volátiles cuantificados
fueron: acetaldehído, acetato de etilo, metanol, n-propanol, isobutanol, acetato de isoamilo, n-
butanol, alcohol isoamílico, hexanoato de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, acetato de
fenetilo y 2-fenil etanol (Tablas 3.20 y 3.21). Las Tablas 3.20 y 3.21 muestran la concentración
de compuestos volátiles en las nueves condiciones de cultivo analizadas. Durante las condiciones
de cultivo en medio reformulado y basal diferentes concentraciones de los compuestos volátiles
fueron observadas. En la primera condición (35ºC y 0 vvm) se presentaron las mayores
concentraciones de 2-fenil etanol, decanoato de etilo y n-butanol, en la segunda condición (35ºC,
0.03 vvm) se presentó la mayor concentración de isobutanol y alcohol isoamílico, en la tercera
condición (25ºC, 0.03 vvm) se presentó la mayor concentración de n-propanol y en la cuarta
condición (25ºC y 0 vvm) se observó la mayor concentración de metanol, acetato de isoamilo,
hexanoato de etilo y octanoato de etilo; estas condiciones de cultivo fueron efectuadas en medio
reformulado. Por su parte en la quinta condición (35ºC, 0 vvm) se presentó la mayor
concentración de acetato de fenetilo, en la sexta y octava condición (35ºC, 0.03 vvm; 25ºC, 0
vvm) se presentó la mayor concentración de acetato de etilo y durante la séptima condición (25ºC,
0.03 vvm) se observó la mayor concentración de acetaldehído y acetato de etilo; estas
condiciones de cultivo fueron efectuadas en medio basal. Con respecto a la novena condición
(30ºC, 0.015 vvm) presentó sólo una alta concentración de acetaldehído (Tablas 3.20 y 3.21). La
alta concentración de n-propanol, isobutanol, n-butanol, alcohol isoamílico y 2-fenil etanol
(alcoholes superiores) presente en la primera y segunda condición en medio reformulado, podrían
explicarse por el efecto de la alta temperatura de fermentación (35ºC) y el medio de fermentación
(aminoácidos y vitaminas), que estimularon la producción de alcoholes superiores. Algunos
autores han reportados que la concentración de aminoácidos en el mosto influye sobre la
producción de alcoholes superiores, incrementándose conforme se incrementa la concentración
de aminoácidos en el medio (Swiegers et al., 2005; Valle-Rodríguez et al., 2011). Asimismo la
temperatura de fermentación es otro factor importante en la producción de alcoholes superiores,
presentándose las mayores concentraciones conforme se incrementa la temperatura de
150
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
fermentación (Erten et al., 2002). Sin embargo además de la temperatura y la composición del
medio, el aumento en la concentración de etanol y la microaireación del medio incrementan la
producción de alcoholes superiores (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova,
2009; Morán-Marroquí et al., 2011). En relación al acetaldehído su concentración resultó
afectada por la composición del medio y las condiciones de aireación; presentándose las mayores
concentraciones en las condiciones en medio basal (5 - 8), sin embargo el mayor contenido se
presentó en la séptima condición, debido posiblemente a la baja temperatura de fermentación
(25ºC), la microaeración y la composición del medio de fermentación que fuertemente
estimularon su producción. Con respecto al metanol, su producción ha sido asociada a la etapa de
cocimiento en la elaboración de Tequila (Cedeño, 1995), sin embargo durante los cultivos en
medio basal y reformulado diferentes concentraciones de metanol fueron observados, debido
posiblemente a la síntesis de la enzima metil pectin esterasa en las levaduras durante la
fermentación. Los ésteres son compuestos que marcadamente afectan la composición aromática
de las bebidas alcohólicas, por la aportación de sabores y olores especiales (Romano et al., 2003;
Díaz-Montaño et al., 2008; Pretorius et al., 2000; Rojas et al., 2003 ). Se ha reportado que el
género de levadura es el principal factor que afecta la producción de ésteres, asociándose
principalmente a las levaduras no-Saccharomyces. Sin embargo otros estudios han sugerido que
un alto contenido de ácidos grasos insaturados en el medio de cultivo resultan en una reducción
en la producción de ésteres, mientras que una elevada temperatura de fermentación resulta en un
incremento de octanoato y decanoato de etilo, y en decremento de ésteres de acetato. Asimismo
un mayor contenido de C ó N en el medio está correlacionado con un incremento en la
producción de ésteres de acetato. Sin embargo el factor limitante en la producción de ésteres de
acetato es el nivel de precursores de ácidos grasos insaturados contenidos en el medio de cultivo
y las condiciones de cultivo altamente aireadas que inhiben la síntesis de la acetyltransferasa
(AATasa) (Saerens et al. 2008; Rojas et al. 2003). La mayor concentración de acetato de etilo se
presentó en la quinta y sexta condición en medio basal, de acetato de isoamilo en la cuarta
condición y de acetato de fenetilo en la quinta y octava condición de cultivo, debido a que no
existen una relación entre condiciones para los ésteres de acetato no es posible establecer el
principal factor que afecta su producción. Para los ésteres de etilo la mayor concentración se
presentó en las condiciones no aireados en medio basal (primera y cuarta condición).
151
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A través del análisis de componentes principales (PCA) se analizó la variabilidad entre los
compuestos volátiles debidas a las condiciones de cultivo estudiadas en las fermentaciones en
continuo en cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae (Figura 3.15). A partir del PCA realizado
sobre las concentraciones de compuestos volátiles de los cultivos mixtos, se obtuvieron tres
componentes principales (PC) con un Eigen-valor mayor a 1, los cuales explican el 82.33 % de la
variabilidad de los datos originales (Tabla 3.23).
Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: el alcohol isoamílico, 2-fenil
etanol con pesos negativos y el acetato de etilo, el metanol y acetaldehído con pesos positivos.
Mientras que para PC-2 fueron: el isobutanol con pesos negativos y el hexanoato de etilo y el
octanoato de etilo con pesos positivos y en el PC-3 fueron: el acetaldehído con pesos negativos y
el acetato de fenetilo con pesos positivos (Tabla 3.22).
El medio de fermentación resultó ser el factor de mayor peso sobre la síntesis de compuestos
volátiles en mosto, debido a que fue el factor en permitir una completa separación de las
diferentes condiciones experimentales, esto es posible observarlo en la Figura 3.15-B del análisis
de componentes principales (PCA).
152
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.20 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio reformulado de las fermentaciones en cultivo
mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1).
153
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.21 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio basal y punto al centro de las fermentaciones
en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1).
154
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
hex-et
A oct-et
0.40 acet-iso
dec-et
met
0.30
but
0.20
acet-et
fen-acet
0.10
p[2]
acet
0.00 fen-alc prop
isom
-0.10
-0.20
isob
-0.30
-0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
p[1]
5
4
B 4
4
4
3 1
1
2 1
0 8
t[2]
33 88
3 69 55
9 6956
-1 7 77
-2
-3 22
2
-4
-5
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
t[1]
Figura 3.15 PCA de (A) compuestos volátiles de los (B) mostos obtenidos de las diferentes condiciones de cultivo
probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en cultivo mixto. acet:
acetaldehído; met: metanol; acet-et: acetato de etilo; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom:
alcohol isoamílico; fen-alc: 2-fenil etanol; fen-acet: acetato de fenetilo; isom-acet: acetato de isamilo; hex-et:
hexanoato de etilo; oct-et: octanoato de etilo; dec-et: decanoato de etilo. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2
(35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm),
7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al
centro).
155
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.22. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
Tabla 3.23. Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes principales (PC) de los cultivos
mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio de fermentación.
Los mostos obtenidos de cada condición experimental fueron destilados bajo las condiciones de
destilación mencionadas en la sección 2.4.4 y analizados por cromatografía de gases con
detección de ionización de flama (FID). Además de las condiciones operacionales, nutrimentales
156
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
157
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2008; Palmsvist et al., 1998). Sin embargo debido a que el furfural puede ser consumido por
ciertas cepas levaduras, la alta concentración presente en este estudio puede deberse a otros
factores que requieren mayor investigación.
Por otra parte con respecto al acetato de etilo, el factor que más influye en su producción es el
tipo de levadura empleada, sintentizando las mayores concentraciones las levaduras no-
Saccharomyces (Romano et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2008; Rojas et al., 2001). En este
estudio, el medio de fermentación fue el único factor de mayor peso en afectar su concentración
(P< 0.05). Encontrándose la mayor concentración en la sexta condición (35ºC, 0.03 vvm y medio
basal). Nuevamente se observa un patrón semejante al presentado en la sexta condición en mosto,
confirmando con ello que la alta concentración de acetato de etilo en esta condición puede
deberse a otros factores que no son estudiados en este trabajo de tesis, debido a que por estudios
previos, se ha reportado que en presencia de oxígeno inhibe el gen ATFI que codifica la
acetyltransferasa, enzima responsable de la síntentis de ésteres de acetato (Saerens et al., 2008).
Para el lactato de etilo, solamente el oxígeno mostró tener un efecto significativo sobre su
formación (P< 0.05). La mayor concentración de lactato de etilo se presentó en la primera
condición (35ºC, 0 vvm y medio reformulado).
158
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
159
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Por medio del análisis de componentes principales (PCA) se analizó la variabilidad entre los
compuestos volátiles debidas a las condiciones experimentales probadas para los cultivos mixtos
(Figura 3.16). A partir del PCA realizado sobre las concentraciones de compuestos volátiles
obtenidos de los destilados de los cultivos mixtos, se obtuvieron tres componentes principales
(PC) con un Eigen-valor mayor a 1, los cuales explican el 84.87% de la variabilidad de los datos
originales (Tabla 3.27).
Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: isobutanol, alcohol
isoamílico con pesos negativos y ácido acético, furfural y acetato de etilo con pesos positivos.
Mientras que para PC-2 fueron: ácido acético con pesos negativos y el alcohol isoamílico, n-
propanol y n-butanol con pesos positivos. Para el PC-3 fueron: lactato de etilo con pesos
negativos y el acetato de etilo y acetaldehído con pesos positivos (Tabla 3.26).
160
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.24: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio reformulado de las
fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
(mg/100 mL de alcohol
NOMa
anhidro) 1 2 3 4
ΣAldehídos 16.09 ± 0.24 6.30 ± 0.30 12.90 ± 0.01 12.90 ± 0.03 0 - 40
Acetaldehído 16.09 ± 0.24 6.30 ± 0.30 12.90 ± 0.01 12.90 ± 0.03
ΣÁcidos orgánicos 4.71 ± 1.79 1.74 ± 0.18 1.56 ± 0.18 5.92 ± 0.80 Cn
Ácido acético 4.71 ± 1.79 1.74 ± 0.18 1.56 ± 0.18 5.92 ± 0.80
Σ Ésteres 12.75 ± 0.78 4.50 ± 0.19 9.05 ± 0.19 14.34 ± 0.20 2 – 200
Acetato de etilo 10.93 ± 0.18 3.68 ± 0.16 7.83 ± 0.12 12.80 ± 0.19
Lactato de etilo 1.82 ± 0.60 0.81 ± 0.03 1.22 ± 0.07 1.54 ± 0.02
Σ Alcoholes 192.78 ± 1.20 178.92 ± 1.32 181.68 ± 1.16 207.12 ± 2.60 30 – 300
Metanol 192.78 ± 1.20 178.92 ± 1.32 181.68 ± 1.16 207.12 ± 2.60
Σ Alcoholes superiores 370.18 ± 2.43 489.74 ± 3.89 346.60 ± 0.27 233.48 ± 2.36 20 - 500
n-Propanol 118.88 ± 0.39 145.09 ±1.78 116.93 ±0.19 80.16 ±0.91
Isobutanol 72.84 ± 0.27 128.58 ± 0.17 51.84 ± 0.02 24.58 ± 0.27
n-butanol 2.09 ± 0.12 1.11 ± 0.001 0.84 ± 0.01 1.15 ± 0.001
Alcohol isoamílico 176.38 ± 1.65 214.95 ± 1.95 176.98 ± 0.06 127.59 ± 1.19
Σ Furfural 5.57 ± 0.41 2.99 ± 0.07 4.06 ± 0.09 6.28 ± 0.12 0-4
Cada valor representa representan el promedio ± la desviación estándar de dos muestras obtenidas de la destilación
de los mostos en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. a:
NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílico.
Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm) y 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado
161
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.25: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio basal y en el punto al centro de
las fermentaciones en cultivo mixto de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en reactor continuo.
Cada valor representa representan el promedio ± la desviación estándar de dos muestras obtenidas de la destilación
de los mostos en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. a:
NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílico.
Condiciones de cultivo: Condiciones de cultivo: 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0
vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
162
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A prop
but
alc-isom
0.40
isob
0.30 met furf
lac-et
0.20
p[2]
0.10 acet
et-acet
0.00
acet-ac
-0.10
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40
p[1]
4 B
3
1
1
2
2 66
1 2 4
4
3
3
0
t[2]
5
-1 5
8
78
7
-2 9
9
-3
-4
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
t[1]
Figura 3.16 PCA de (A) compuestos volátiles mayoritarios de los (B) destilados obtenidos de las diferentes
condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en
cultivo mixto. acet: acetaldehído; met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob:
isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico; et-acet: acetato de etilo; lac-et: lactato de etilo y furf: furfural. Condiciones
de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC,
0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio
basal y reformulado (Punto al centro).
163
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.26. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
Tabla 3.27. Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes principales (PC) de los cultivos
mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio de fermentación.
164
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
quince compuestos identificados y cuantificados que incluyen ésteres de etilo, metilo, isoamilo y
feniletilo entre otros; siendo el 9-hexadecenoato de etilo el compuestos producido en mayor
concentración (Tablas 3.28 y 3.29). Estos compuestos son producidos por el metabolismo de la
levadura durante la fermentación, aunque otros pueden formarse durante el añejamiento de la
bebida (Romano et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2009; Swiegers et al., 2005). Los Furanos
representan otro grupo de compuestos, con siete compuestos identificados y cuantificados que
incluyen al 5-metil furfural, acetyl furan y 2-fenil etanol entre otros; siendo el 5-metil furfurl el
compuestos producido en mayor concentración en este grupo. Estos compuestos además de los
aldehídos y cetonas pueden ser producidos durante las etapas de comiento y/o la destilación en la
elaboración de Tequila (Cedeño, 1995; Mancilla-Margalli & López, 2002; Benn & Peppard,
1996). Los terpenos representan otro grupo de compuestos identificados y cuantificados en los
destilados con cinco compuestos que incluyen al cis-óxido de linalol, α-terpineol, trans-nerolidol,
dihidrofarnesol y trans-Farnesol, los cuales fueron detectados en bajas concentraciones en la
mayoría de las condiciones probadas. Los terpenos provienen en su mayoría de la planta del
agave ó pueden ser liberados por las levaduras no-Saccharomyces por medio de enzimas
específicas como β−glucosidasas (Cordero et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2009). Para los
acetales sólo fue identificado y cuantificado el furfural dietil acetal, siendo no detectado en las
condiciones en medio reformulado. En el grupo de los ácidos cuatro compuestos fueron
identificados y cuantificados, siendo el ácido hexadecanoico el compuesto producido en mayor
concentración. Para los alcoholes cinco compuestos fueron cuantificados, representando el 2-fenil
etanol el compuesto en mayor concentración. En el grupo de las cetonas se identificaron y
cuantificaron cuatro compuestos siendo la acetoína el compuesto en mayor concentración (Tablas
3.28 y 3.29). Igualmente que los ésteres, la mayoría de ácidos, acetales y alcoholes son
producidos durante la fermentación alcohólica, aunque también pueden provenir del cocimiento,
la destilación o el añejamiento en la elaboración de Tequila (Cedeño, 1995).
165
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
sobre la síntesis de furanos, cetonas, terpenos y acetales (Figura 3.17-A). Estas diferencias son
debidas en su mayoría al medio de fermentación ya que es el factor de mayor peso en la mayoría
de los compuestos volátiles evaluados y el que permite una completa separación de las
condiciones experimentales. Además otra explicación a este fenómeno podría ser que en la
mayoría de las condiciones estudiadas en medio reformulado, la cantidad de azúcares residuales
fue menor a 10 gL-1, lo que garantiza una alta conversión de azúcar a etanol y por lo tanto de
otros metabolitos como alcoholes superiores y ácidos orgánicos. Este mismo mecanismo podría
explicar lo que ocurre con los ésteres, es decir al aumentar la presencia de alcoholes superiores y
ácidos orgánicos en el medio, se podría favorer la esterificación y por tanto el aumento en la
concentración de ésteres (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño et al., 2009). No obstante a pesar
de que estás pudiesen ser explicaciones preliminares de lo que ocurre dentro de la célula, otros
mecanismos más de tipo bioquímico y molecular convergen.
Igualmente que con los compuestos volátiles mayoritarios, por medio del análisis de
componentes principales (PCA) se analizó la variabilidad entre los compuestos volátiles debidas
a las condiciones experimentales (Figura 3.17). A partir del PCA realizado sobre las
concentraciones de compuestos volátiles minoritarios de los destilados de los cultivos mixtos, se
obtuvieron cuatro componentes principales (PC) con un Eigenvalor mayor a 1, los cuales
explican el 79.23 % de la variabilidad de los datos originales (Tabla 3. 31).
Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: trans-nerolidol, 5-metil-2-
(5H)-furanona y trans-Farnesol con pesos negativos y el decanoato de isoamilo, ácido
hexadecanoico y oleato de etilo con pesos positivos. Mientras que para el componente PC-2
fueron: dihidrofarnesol con pesos negativos y 5-metil furfural, el linoleato de etilo, tetradecanol,
166
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
167
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.28: Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio reformulado de las
fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
168
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.29: Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio basal y punto al centro de las
fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
169
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
170
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Esteres Furanos
0.50
A
Cetonas
Acidos
0.40
0.30
p[2]
0.20
0.10 Terpenos
Alcohole
0.00
Acetales
3
B
2
4
4
6
1
1
6
3 5
1 5
3
0
t[2]
77
88
-1
9 9
-2 2
-3
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
t[1]
Figura 3.17 PCA de (A) familias de compuestos volátiles minoritarios de los (B) destilados obtenidos de las
diferentes condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae
(S1) en cultivo mixto. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0
vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio
basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
171
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0.30 tet-et
A acf
hexd-et
ttdol
dod-et
5mf lin-et
terp dec-et
0.20 dca mttona linto-et
oct-etocdec-et
pol ciona
mfne linox dod-isom
0.10 mboct
fda
tner ac cidna
tfar hyona
mfona lev-et fen-ac ocol
p[2]
0.00 alc-fuf
hxa
dec9-et
ole-et
etol
alc-fen
-0.10
oca
9-hexdec
-0.20 isa
mttfona
dhfar
8
B
6
4 4
5
6 5
2 6 88
1
0 1
t[2]
7
-2 7 33
9 9
-4
2
-6 2
-8
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
t[1]
Figura 3.18 PCA de (A) compuestos volátiles minoritarios de los (B) destilados obtenidos de las diferentes
condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en
cultivo mixto. fda: furfural dietil-acetal; isa: ácido isobutírico; oca: ácido octanoico; dca: ácido decanoico; hxa: ácido
hexadecanoico; alc-fen: 2-fenil etanol; pol: 4-Penten-1-ol; etol: 3-etoxipropan-1-ol; ocol: octan-3-ol; ttdol:
tetradecanol; ac: acetoína; hyona: 1-hidroxi-2-propanona; ciona: ciclopent-2-en-1-one; cidna: ciclopent-4-ene-1,3-
dione; oct-et: octanoato de etilo; lev-et: levulinato de etilo; dec-et: decanoato de etilo; mboct: 3-metilbutil octanoato;
dec-9-et: dec-9-enoate de etilo; fen-ac: acetato de fenetilo; dod-et: dodecanoato de etilo; dod-isom: decanoato de
isoamilo; tet-et: tetradecanoato de etilo; hexd-et: hexadecanoato de etilo; 9-hexdec-et: 9-hexadecenoato de etilo;
ocdec-et: octadecanoato de etilo; ole-et: oleato de etilo; lin-et: linoleato de etilo; linto-et: linolenato de etilo; mttona:
2-metil tetrahidro-3-furanona; mfona: 5-metil-2(3H)-furanona; acf: 2-acetylfuran; mttfona: 2-metil tetrahidrotiofene-
3-ona; 5mf: 5-metil-furfural; alc-fuf : alcohol furfurílico; mfne: 5-metil-2(5H)-furanona; linox: cis-óxido de linalol;
terp: α-Terpineol; tner: trans-nerolidol; dhfar: dihidrofarnesol y tfar: trans-farnesol. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC,
0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC,
0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y
reformulado (Punto al centro).
172
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.30. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
173
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.31. Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes principales (PC) de los cultivos
mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio de fermentación.
174
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de los niveles de aceptación obtenidos de los destilados para los atributos
sensoriales evaluados se muestran en la Figura 3.19. El análisis de varianza mostró que no
existen diferencias significativas entre los destilados con respecto al olor y las sensaciones
táctiles (P> 0.05), pero si se presentaron diferencias estadísticas entres los destilados con respecto
al aroma (P< 0.05). Adicionalmente por medio del análisis de rangos múltiples (95% LSD) fue
posible determinar el nivel de agrado de los destilados en los atributos evaluados. Con respecto al
olor los destilados de las condiciones tres, cuatro y cinco fueron los más agradables y en el aroma
y las sensaciones táctiles, las condiciones tres, cuatro y nueve fueron las más agradables, debido a
la mayor media obtenida en la prueba de rangos múltiples (LSD). Asimismo con la misma prueba
fue posible asociar las medias de la prueba rangos múltiples (LSD) de los niveles de agrado
promedio de olor, aroma y sensaciones táctiles a los compuestos volátiles mayoritarios y
minoritarios de los destilados evaluados por medio de la prueba de cuadrados mínimos parciales
(PLS) (Figura 3.20 y Tabla 3.32). De igual manera por medio de la prueba de preferencia se
generó una lista de frecuencias mencionadas de descriptores en olor, aroma y sensaciones táctiles
de los destilados, los cuales nuevamente fueron asociados a los compuestos volátiles mayoritarios
y minoritarios por medio de la prueba de cuadrados mínimos parciales (PLS), donde los datos de
las frecuencias de los niveles de agrado promedio de olor, aroma y sensacionales fueron
175
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
ordenados en el eje “Y” y los compuestos volátiles en el eje “X” del análisis (Figura 3.21 y Tabla
3.33).
El modelo obtenido del análisis PLS aplicado a las medias de los niveles de agrado promedio de
olor, aroma y sensaciones táctiles y los compuestos volátiles explicó el 42% de la varianza de los
datos en el eje “X” y el 70.8% en el eje “Y”. Los compuestos volátiles (eje “X”) que presentaron
la mayor variación entre los destilados en el primer componente (WC-1) fueron: n-butanol,
octan-3-ol y linoleato de etilo con puntos negativos y el alcohol furfurílico y ácido decanoico con
puntos positivos. Mientras que para el segundo componentes (WC-2) fueron: furfural dietil acetal
y trans-nerolidol con puntos negativos y el alcohol furfurílico, ciclopent-2-en-1-one, 9-
hexadecenoato de etilo, dec-9-enoato de etilo y decanoato de etilo con puntos positivos (Tabla
3.32). Finalmente los pesos de los componentes de los niveles de agrado promedio de olor, aroma
y sensaciones táctiles (eje “Y”) fueron distinguidos por presentar puntos positivos en ambos
componentes (Tabla 3.32).
Adicionalmente a través de la prueba PLS fueron correlacionadas las medias de los niveles de
agrado de olor con el ácido decanoico, 2-metil-tetrahidro-3-furanona y el 2-acetil furan, mientras
que las sensaciones táctiles y el aroma estuvieron asociados con el alcohol furfurílico de los
destilados tres y cuatro, debido a que fueron los destilados que más impactaron en el nivel de
agrado de los atributos evaluados (Figura 3.20).
De forma similar fue realizado el análisis de cuadrados mínimos parciales (PLS) de los
compuestos volátiles con las frecuencias de descriptores de los niveles de agrado promedio de
olor, aroma y sensaciones táctiles (Tabla 3.33 y Figura 3.21). El modelo explicó el 53.9% de la
varianza de los datos en el eje “X” de los compuestos volátiles y el 34.7% en el eje “Y” de los
descriptores sensoriales. Los compuestos volátiles (eje “X”) que presentaron la mayor variación
entre los destilados en el primer componente (WC-1) fueron: trans-farnesol con puntos negativos
y el octanoato de etilo, dec-9-enoato de etilo, 3-metilbutil octanoato, decanoato de isoamilo y 9-
hexadecenoato de etilo con puntos positivos. Mientras que para el segundo componentes (WC-2)
fueron: 5-metil furfural, α-terpineol, 4-Penten-1-ol, tetradecanoato de etilo, ácido acético y
furfural con puntos negativos y dihidrofarnesol con puntos positivos (Tabla 3.33). Finalmente los
descriptores sensoriales (eje “Y”) que presentaron la mayor variación entre los destilados en el
176
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
primer componente (WC-1) fueron: dulce con pesos negativos y astringente con pesos positivos.
Para el segundo componente (WC-2) fueron: dulce con pesos negativos y frutal con pesos
positivos (Tabla 3.33).
El análisis PLS asoció los descriptores sensoriales humo y quemante a los compuestos volátiles
ácido octanoico y 2-metil tetrahidrotiofene-3-ona. Asimismo el descriptor suavidad fue asociado
al compuesto levulinato de etilo, los descriptores madera, solvente y picante al compuesto cis-
óxido de linalol, la nota dulce al 1-hidroxi-2-propanona y trans-nerolidol, el descriptor frutal al
dihidrofarnesol, la nota amarga con el 2-fenil etanol, el descriptor caramelo se asoció con el
alcohol furfurílico, el ácido hexadecanoico y el oleato de etilo y finalmente el descriptor
astringente al octan-3-ol (Figura 3.21). Ciertamente éstas asociaciones son debidas a la influencia
de los destilados de las diferentes condiciones de cultivo, siendo los destilados de la primera,
tercera y cuarta condición caracterizados por presentar descriptores frutal, amargo, caramelo y
astringente. Por su parte los destilados de la segunda, séptima y novena condición caracterizados
por presentaron notas a humo, quemante, madera y solvente. Finalmente los destilados de las
quinta, sexta y novena condición por presentar la mayor suavidad y estar asociados a los
descriptores dulce y picante (Figura 3.21). Sin duda alguna estas características sensoriales de los
destilados son debidas en su mayoría al metabolismo asociado de K. africana y S. cerevisiae
durante la fermentación y a las condiciones de fermentación que fuertemente influyeron sobre la
síntesis de compuestos volátiles mencionado anteriormente. Adicionalmente muchas de las
propiedades del sabor en la bebida pueden ser producto de otras etapas en la elaboración del
tequila, como el cocimiento, la destilación y el añejamiento (Benn & Peppard 1996). Sin
embargo la etapa de mayor importancia es la fermentación, debido a la gran cantidad de
compuestos secundarios producidos.
177
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
18 18 18
16 16 16
14 14
14
12 12
12
Juez
10 10
10
8 8
8
6 6
6
4 4
4
2 2
2
0 0
0
-2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 3
-2 -1 0 1 2 3
Nivel de agrado Nivel de agrado Nivel de agrado
Figura 3.19. Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos de las fermentaciones en continuo de los cultivos
mixtos de S.cerevisiae (S1) y K.africana (K1). Cada destilado fue obtenidos en diferentes condiciones de cultivo:
CND 1 (35ºC, 0 vvm); CND 2 (35ºC, 0.03 vvm), CND 3 (25ºC, 0.03 vvm); CND 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado; CND 5 (35ºC, 0 vvm); CND 6 (35ºC, 0.03 vvm), CND 7 (25ºC, 0.03 vvm), CND 8 (25ºC, 0 vvm) en
medio basal y CND 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
178
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0.30 9-hexdec
ciona
ole-et alc isom dec9-et alc-fuf
0.20 prop dod-isom dec-et sens tac
lac et
oct-et
0.10 dod-et etol aroma
hxa mboct mttona
ocdec-et
alc-fen
isob met acf olor
isa
mttfona dhfar dca
linto-et lin-et furf tet-et
wc[2]
0.00
but
ocol linox
hexd-et oca fen-ac
cidna
ttdol pol
-0.10 hyona ac
acet tfar
acet et
terp
mfona
-0.20 5mf ac
acet
mfne
tner lev-et
fda
-0.30
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
wc[1]
6
3
4 4
2 1
t [2 ]
0
2
9
-2 5 7
8
6
-4
-6
-8
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
t[1]
Figura 3.20 PLS de (A) los compuestos volátiles y niveles de agrado promedio de olor, aroma y sensaciones táctiles
de los (B) destilados obtenidos de las diferentes condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo
de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en cultivo mixto. Compuestos volátiles mayoritarios: acet: acetaldehído;
met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico;
acet-et: acetato de etilo; lac-et: lactato de etilo y furf: furfural. Compuestos volátiles minoritarios: fda: furfural dietil-
acetal; isa: ácido isobutírico; oca: ácido octanoico; dca: ácido decanoico; hxa: ácido hexadecanoico; alc-fen: 2-fenil
etanol; pol: 4-Penten-1-ol; etol: 3-etoxipropan-1-ol; ocol: octan-3-ol; ttdol: tetradecanol; ac: acetoína; hyona: 1-
hidroxi-2-propanona; ciona: ciclopent-2-en-1-one; cidna: ciclopent-4-ene-1,3-dione; oct-et: octanoato de etilo; lev-et:
levulinato de etilo; dec-et: decanoato de etilo; mboct: 3-metilbutil octanoato; dec9-et: dec-9-enoate de etilo; fen-ac:
acetato de fenetilo; dod-et: dodecanoato de etilo; dod-isom: decanoato de isoamilo; tet-et: tetradecanoato de etilo;
hexd-et: hexadecanoato de etilo; 9-hexdec-et: 9-hexadecenoato de etilo; ocdec-et: octadecanoato de etilo; ole-et:
oleato de etilo; lin-et: linoleato de etilo; linto-et: linolenato de etilo; mttona: 2-metil tetrahidro-3-furanona; mfona: 5-
metil-2(3H)-furanona; acf: 2-acetylfuran; mttfona: 2-metil tetrahidrotiofene-3-ona; 5mf: 5-metil-furfural; alc-fuf :
alcohol furfurílico; mfne: 5-metil-2(5H)-furanona; linox: cis-óxido de linalol; terp: α-Terpineol; tner: trans-
nerolidol; dhfar: dihidrofarnesol y tfar: trans-farnesol. Atributos sensoriales: olor, aroma, sens tactls: sensaciones
táctiles. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC,
0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
179
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.32. PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y niveles de agrado promedio de olor,
aroma y sensaciones táctiles (variables en Y) y su varianza explicada para cada componente.
WC1 WC2
Varianza explicada (%) 20.1 Varianza explicada (%) 21.9
n-Butanol -0.2829 Furfural dietil acetal -0.2957
Octan-3-ol -0.2783 trans-Nerolidol -0.2385
Linolenato de etilo -0.2373 5-Metil-furfural -0.2230
Tetradecanol -0.2130 Levulinato de etilo -0.2130
2-Fenil etanol -0.2027 Ácido acético -0.2069
Linoleato de etilo -0.1959 5-Metil-2(5H)-furanona -0.1819
Ácido Hexadecanoico -0.1938 Octan-3-ol -0.1781
Isobutanol -0.1820 Tetradecanol -0.1633
Octadecanoato de etilo -0.1784 5-Metil-2(3H)-furanona -0.1608
Hexadecanoato de etilo -0.1409 n-Butanol -0.1439
3-Metilbutil octanoato -0.1366 Acetaldehído -0.1311
Oleato de etilo -0.1237 Acetato de Etilo -0.1267
n-Propanol -0.1184 α-Terpineol -0.1115
Ácido isobutírico -0.1067 Isobutanol -0.0975
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.1067 Linolenato de etilo -0.0852
Ácido acético -0.1028 Hexadecanoato de etilo -0.0751
5-Metil-furfural -0.0994 4-Penten-1-ol -0.0701
Furfural -0.0957 2-Fenil etanol -0.0661
Alcohol isoamílico -0.0827 Ácido isobutírico -0.0541
Tetradecanoato de etilo -0.0640 2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.0541
Decanoato de isoamilo -0.0453 1-Hidroxi-2-propanona -0.0461
Acetaldehído -0.0417 Linoleato de etilo -0.0442
α-Terpineol -0.0376 Ácido Hexadecanoico -0.0285
4-Penten-1-ol -0.0347 trans-Farnesol -0.0251
Acetato de Etilo -0.0317 Ácido octanoico -0.0162
Octanoato de etilo -0.0216 Furfural -0.0036
Dodecanoato de etilo -0.0192 3-Metilbutil octanoato 0.0053
Furfural dietil acetal -0.0191 Octadecanoato de etilo 0.0103
Metanol 0.0021 Tetradecanoato de etilo 0.0283
trans-Nerolidol 0.0085 Dihidrofarnesol 0.0361
3-Etoxipropan-1-ol 0.0215 Acetoína 0.0389
Lactato de etilo 0.0273 Ciclopent-4-ene-1,3-dione 0.0452
5-Metil-2(5H)-furanona 0.0314 Acetato de fenetilo 0.0603
Levulinato de etilo 0.0338 cis-Óxido de linalol 0.0644
Ciclopent-2-en-1-one 0.0544 Metanol 0.0689
5-Metil-2(3H)-furanona 0.0677 Octanoato de etilo 0.1042
9-Hexadecenoato de etilo 0.0728 n-Propanol 0.1076
180
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
WC1 WC2
Varianza explicada (%) 56.5 Varianza explicada (%) 14.3
Olor 0.2115 Olor 0.0877
Sensaciones táctiles 0.2619 Aroma 0.1241
Aroma 0.2978 Sensaciones táctiles 0.1709
181
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
dhfar
fru
0.20
oca
humo
que fen-ac amargo alc-fen
isa
mttfona
0.10 cidnaisob alc isom hxa
alc-fuf ole-et
linox prop
car 9-hexdec
ast
0.00 lev-et mad solv ocol
wc[2]
suavd mboct
pic
etol dec9-et
dulce hyona mttona ciona dod-isom
dec-et
-0.10 dca met lac et
ac mfona ocdec-et dod-et
tfar tner fda oct-et
but ttdol
acf lin-et linto-et
mfne acet
-0.20 hexd-et
acet et furf
acet ac tet-et
pol
terp 5mf
10
5 2
9
3
t [2 ]
0 7 1
8 4
5
-5 6
-1 0
-1 0 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10
t[1]
Figura 3.21 PLS de (A) los compuestos volátiles y frecuencias de descriptores en olor, aroma y sensaciones táctiles
de los (B) destilados obtenidos de las diferentes condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo
de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en cultivo mixto. Compuestos volátiles mayoritarios: acet: acetaldehído;
met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico;
acet-et: acetato de etilo; lac-et: lactato de etilo y furf: furfural. Compuestos volátiles minoritarios: fda: furfural dietil-
acetal; isa: ácido isobutírico; oca: ácido octanoico; dca: ácido decanoico; hxa: ácido hexadecanoico; alc-fen: 2-fenil
etanol; pol: 4-Penten-1-ol; etol: 3-etoxipropan-1-ol; ocol: octan-3-ol; ttdol: tetradecanol; ac: acetoína; hyona: 1-
hidroxi-2-propanona; ciona: ciclopent-2-en-1-one; cidna: ciclopent-4-ene-1,3-dione; oct-et: octanoato de etilo; lev-et:
levulinato de etilo; dec-et: decanoato de etilo; mboct: 3-metilbutil octanoato; dec9-et: dec-9-enoate de etilo; fen-ac:
acetato de fenetilo; dod-et: dodecanoato de etilo; dod-isom: decanoato de isoamilo; tet-et: tetradecanoato de etilo;
hexd-et: hexadecanoato de etilo; 9-hexdec-et: 9-hexadecenoato de etilo; ocdec-et: octadecanoato de etilo; ole-et:
oleato de etilo; lin-et: linoleato de etilo; linto-et: linolenato de etilo; mttona: 2-metil tetrahidro-3-furanona; mfona: 5-
metil-2(3H)-furanona; acf: 2-acetylfuran; mttfona: 2-metil tetrahidrotiofene-3-ona; 5mf: 5-metil-furfural; alc-fuf :
alcohol furfurílico; mfne: 5-metil-2(5H)-furanona; linox: cis-óxido de linalol; terp: α-Terpineol; tner: trans-
nerolidol; dhfar: dihidrofarnesol y tfar: trans-farnesol. Descriptores sensoriales: solv: solvente, amargo, ast:
astringente, car: caramelo, dulce, fru: frutal, humo, mad: madera, pic: picante, que: quemante y suavd: suavidad.
Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC,
0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
182
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.33. PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y frecuencia de descriptores sensoriales
(variables en Y) y su varianza explicada para cada componente.
WC1 WC2
Varianza explicada (%) 26.6 Varianza explicada (%) 27.3
trans-Farnesol -0.2274 5-Metil-furfural -0.2631
trans-Nerolidol -0.1981 α-Terpineol -0.2625
1-Hidroxi-2-propanona -0.1691 4-Penten-1-ol -0.2410
5-Metil-2(5H)-furanona -0.1568 Tetradecanoato de etilo -0.2366
Ácido octanoico -0.1363 Ácido acético -0.2314
4-Penten-1-ol -0.1291 Furfural -0.2274
Levulinato de etilo -0.1276 Acetato de Etilo -0.2197
Ácido isobutírico -0.1208 Hexadecanoato de etilo -0.1976
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.1208 Acetaldehído -0.1818
α-Terpineol -0.1187 5-Metil-2(5H)-furanona -0.1613
Ácido acético -0.1078 Linoleato de etilo -0.1602
Furfural dietil acetal -0.0932 Linolenato de etilo -0.1513
Ácido decanoico -0.0661 2-Acetil furan -0.1450
Acetoína -0.0650 n-Butanol -0.1417
Acetato de fenetilo -0.0563 Tetradecanol -0.1372
Hexadecanoato de etilo -0.0548 Octanoato de etilo -0.1296
Ciclopent-4-ene-1,3-dione -0.0525 Dodecanoato de etilo -0.1294
5-Metil-2(3H)-furanona -0.0510 Furfural dietil acetal -0.1195
5-Metil-furfural -0.0388 Octadecanoato de etilo -0.1183
Isobutanol -0.0298 trans-Farnesol -0.1126
2-Acetil furan -0.0208 trans-Nerolidol -0.1074
Dihidrofarnesol -0.0064 Lactato de etilo -0.1029
cis-Óxido de linalol -0.0049 Metanol -0.1025
n-Butanol -0.0004 5-Metil-2(3H)-furanona -0.1009
Acetato de Etilo 0.0063 Acetoína -0.0946
Linoleato de etilo 0.0088 Ácido decanoico -0.0875
Metanol 0.0257 Decanoato de etilo -0.0816
Alcohol isoamílico 0.0282 Decanoato de isoamilo -0.0751
Linolenato de etilo 0.0405 Ciclopent-2-en-1-one -0.0716
Tetradecanoato de etilo 0.0444 2-Metil tetrahidro-3-furanona -0.0657
Octadecanoato de etilo 0.0607 1-Hidroxi-2-propanona -0.0625
3-Etoxipropan-1-ol 0.0682 Dec-9-enoate de etilo -0.0472
2-Fenil etanol 0.0732 3-Etoxipropan-1-ol -0.0440
Tetradecanol 0.0735 3-Metilbutil octanoato -0.0239
n-Propanol 0.0809 Octan-3-ol -0.0063
Acetaldehído 0.1037 Levulinato de etilo 0.0076
Dodecanoato de etilo 0.1115 9-Hexadecenoato de etilo 0.0417
183
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
WC1 WC2
Varianza explicada (%) 19.9 Varianza explicada (%) 14.8
Dulce -0.2201 Dulce -0.0772
Humo -0.1761 Picante -0.0376
Quemante -0.1618 Suavidad -0.0048
Suavidad -0.1428 Madera -0.0040
Picante -0.0612 Solvente 0.0012
Madera -0.0584 Astringente 0.0187
Solvente -0.0259 Caramelo 0.0481
Frutal 0.0161 Quemante 0.1299
Amargo 0.0369 Amargo 0.1389
Caramelo 0.1640 Humo 0.1475
Astringente 0.1791 Frutal 0.2377
184
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.5.6 Conclusiones
185
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
análisis de cuadrados mínimos parciales (PLS) fue posible asociar los compuestos volátiles de los
destilados con los niveles de agrado promedio de olor, aroma y sensaciones táctiles. Los
destilados de las primera, tercera y cuarta condición se distinguieron por influir sobre las notas
frutal, amargo, caramelo y astringente; los destilados de la segunda, séptima y novena condición
por presentar descriptores a humo, quemante, madera y solvente y los destilados de la quinta,
sexta y octava condición por presentar la mayor suavidad y estar asociados a las notas picante y
dulce.
186
DISCUSIÓN GENERAL
DISCUSIÓN GENERAL
DISCUSIÓN GENERAL
Del presente estudio de investigación, una serie de resultados fueron obtenidos, los cuales
explican el efecto del oxígeno, la temperatura y algunos factores de crecimiento (vitaminas y
aminoácidos) en la fermentación del jugo de agave en cultivo por lote y continuo para lograr una
mayor prevalencia y capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces del género
Kloeckera al trabajar en cultivo mixto con levaduras del género Saccharomyces. Para lograr este
objetivo diferentes cinéticas de fermentación en cultivo por lote y continuo fueron llevados a
cabo. En cultivo por lote se probó el efecto del medio de fermentación sobre la capacidad
fermentativa y aromática de las levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces en mosto y
producto. Por su parte en las cinéticas de fermentación en cultivo continuo se observó el efecto
además del medio de fermentación, de las condiciones operacionales específicamente del flujo de
oxígeno y la temperatura sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana al
trabajar en cultivo mixto con S. cerevisiae. De los resultados en cultivo por lote se observó que el
medio de fermentación es un factor que impacta en el crecimiento de las levaduras del género
Kloeckera, debido a que en medio basal éstas levaduras presentaron un bajo crecimiento y
capacidad fermentativa en cultivo puro; en cultivo mixto este mismo fenómeno se observó con
mayor detalle, debido a que ambas levaduras tanto Saccharomyces como Kloeckera redujeron
drásticamente su crecimiento en comparación con las cinéticas de fermentación efectuadas en
cultivo puro en medio basal. Por el contrario en medio reformulado un comportamiento diferente
fue observado, favoreciéndose el crecimiento y la capacidad fermentativa en ambos cultivos
(puro y mixto) de Kloeckera y Saccharomyces. Por ejemplo, K. africana en medio reformulado
aumentó 2.16 veces su población celular (UFC), 1.2 veces su formación de biomasa y 4.27 veces
su producción de etanol que en medio basal, consumiendo en todo momento los azúcares del
medio. En relación a S. cerevisiae indistintamente del medio de fermentación presentó una alta
eficiencia fermentativa, produciendo altas concentraciones de biomasa, UFC, etanol y un
completo consumo de azúcares. Con respecto a la síntesis de compuestos volátiles, de igual
manera que con las cinéticas de fermentación entre levaduras y cultivos, diferentes
comportamientos fueron observados. Por un lado las levaduras del género Kloeckera en cultivo
puro y mixto se caracterizaron por producir la mayor concentración de acetato de etilo, acetato de
fenetilo y acetato de isoamilo que las levaduras del género Saccharomyces que produjeron la
188
DISCUSIÓN GENERAL
del cultivo mixto, existen diferencias significativas (P< 0.05), mientras que entre el destilado del
cultivo puro de K. africana y el destilado del cultivo puro de S. cerevisiae no se encontraron
diferencias significativas (P> 0.05). Asimismo a través de esta prueba, fue posible asociar
determinados descriptores en olor, aroma y sensaciones trigeminales a los destilados evaluados,
distinguiéndose el destilado de K. africana por presentar notas a dulce, fermentado, frutal y
quemante y el destilado de S. cerevisiae por presentar descriptores a frutal, madera, fermentado,
humo, dulce y quemante y el destilado del cultivo mixto, por su parte por presentar notas a nuez,
dulce, salado, madera, frutal y quemante.
189
DISCUSIÓN GENERAL
Una vez concluida la etapa de fermentaciones por lote, a partir de la selección de levaduras en
cultivo mixto, se realizaron fermentaciones en continuo empleado las cepas de levadura K.
africana y S. cerevisiae, con la finalidad de observar el efecto de las condiciones operacionales y
nutrimentales. Durante las condiciones estudiadas, en medio reformulado K. africana presentó la
mayor concentración de biomasa y viabilidad celular en comparación con las cinéticas efectuadas
en medio basal. Además del medio de fermentación, la temperatura y el oxígeno, mostraron ser
factores determinantes en el crecimiento de K. africana, favoreciéndose el mayor crecimiento en
la tercera condición (25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado). Sin embargo a pesar de que K.
africana logró aumentar significativamente su crecimiento bajo estas condiciones de cultivo, S.
cerevisiae fue la levadura dominante durante todo el cultivo en las nueve condiciones probadas.
Asimismo que K. africana, la tercera condición de cultivo significativamente estimuló el
crecimiento de S. cerevisiae. La alta formación de biomasa y UFC de S. cerevisiae y K. africana
puede explicarse porque en presencia de oxígeno, una parte del flujo de carbono en la célula es
orientado a la producción de biomasa por activación de las enzimas involucradas en la
respiración celular y el transporte de electrones. Además el oxígeno actúa como factor de
crecimiento en la célula al estimular la síntesis de ácidos grasos insaturados (ácido oleico) y
esteroles (ergosterol) en la membrana plasmática, compuestos que están directamente
relacionados con la capacidad de la célula a tolerar altas concentraciones de etanol (Pina et al.
2004). En adición al oxígeno, las bajas temperaturas igualmente favorecen el crecimiento y
supervivencia de las levaduras particularmente de las no-Saccharomyces como K. africana
(Bilbao et al., 1997; Erten, 2002).
190
DISCUSIÓN GENERAL
191
DISCUSIÓN GENERAL
nutrimentales, sin embargo no hay que dejar de lado las características aportadas por las
levaduras participantes, como son la alta eficiencia fermentativa característica de S. cerevisiae
(Swiegers et al., 2005) y la alta producción de compuestos sensorialmente importantes como
acetato de etilo, acetoína y acetato de fenetilo de K. africana (Romano et al., 1996; Romano et al.,
2003; Díaz-Montaño et al., 2008).
192
CONCLUSIONES
GENERALES
CONCLUSIONES GENERALES
CONCLUSIONES GENERALES
Se identificó que las levaduras del género Kloeckera presentan un menor crecimiento (UFC y
biomasa) y capacidad fermentativa que las levaduras del género Saccharomyces en la
fermentación del jugo de agave en medio basal, debido a una limitación nutricional. Durante
estas fermentaciones, K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) fueron seleccionadas como las
mejores levaduras, debido a que presentaron las mejores cinéticas de fermentación y la menor
concentración de alcoholes superiores y acetaldehído en cultivo mixto. Posteriormente se estudió
el efecto de ciertos factores de crecimiento en la fermentación del jugo de agave sobre el
crecimiento y la capacidad fermentativa de K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae.
Encontrándose que K. africana en medio reformulado aumentó 1.2 veces la formación de
biomasa, 2.16 y 15 veces la formación de UFC en cultivo puro y mixto, 4.27 veces la producción
de etanol y agotó completamente los azúcares del medio en comparación con las cinéticas de
fermentación obtenidas para la misma cepa en medio basal. Con estos resultados se confirma que
el limitado crecimiento y capacidad fermentativa de K. africana esta asociado principalmente a la
baja disponibilidad de nutrientes del jugo de agave. En relación a S. cerevisiae indistintamente
del medio de fermentación presentó una alta eficiencia fermentativa con altas producción de
alcoholes superiores y acetaldehído. K. africana en medio basal y reformulado presentó la mayor
concentración de ésteres de acetato, n-butanol, ácido acético, acetoína, 2-acetil furan y 5-metil
furfural, diferenciándose entre medios en la concentración de acetato de isoamilo, ácido
hexanoico, propanoico, octanoico, decanoico, hexadecanoico, acetaldehído, 1-hidroxy-2-
propanona, levulinato y decanoato de etilo. En cultivo mixto la aportación de ambas levaduras
fue evidente, debido a la presencia de compuestos volátiles característicos de cada cepa. En
medio basal el cultivo mixto se caracterizó por presentar concentraciones similares de alcoholes
superiores, acetaldehído y ésteres de etilo a las producidos por S. cerevisiae en cultivo puro y por
producir concentraciones intermediadas de ésteres de acetato, debido a la presencia de K.
africana durante la fermentación y por producir la mayor concentración de ácido isobutírico y
octanoico. En medio reformulado por su parte se distinguieron concentraciones similares de
acetato de isoamilo y 2-fenil etanol a las producidas por S. cerevisiae y concentraciones de n-
propanol, isobutanol, alcohol isoamílico y 2-acetil furan similares a las producidas por K.
africana, adicionalmente se produjeron concentraciones intermedias de ésteres de acetato, etilo y
194
CONCLUSIONES GENERALES
Debido a que K. africana declinó su concentración celular en las fermentación por lote en medio
reformulado en cultivo puro y mixto, se analizó el efecto de los factores operacionales (oxígeno y
temperatura) y nutrimentales sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana en
la fermentación en continuo en cultivo mixto con S. cerevisiae. El medio de fermentación fue el
factor de mayor peso sobre la capacidad fermentativa y aromática de los microorganismos
estudiados en cultivo mixto, debido a que durante las condiciones en medio reformulado (1, 2, 3,
4 y 9) se presentó la mayor prevalencia y capacidad fermentativa de K. africana y S. cerevisiae
por un aumentó de 1.45 veces mayor en la formación de biomasa, 3.13 y 4.9 veces mayor en la
formación de UFC en S. cerevisiae y K. africana respectivamente, 1.12 veces mayor en la
producción de etanol y alrededor del 90% de consumo de los azúcares en comparación con las
condiciones en medio basal (5, 6, 7 y 8). Sin embargo la condición que favoreció el mayor
crecimiento y capacidad fermentativa de K. africana y S. cerevisiae fue la tercera condición
(25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado), donde se alcanzaron concentraciones de biomasa de 5.85
gL-1, de UFC de 1057.53 y 7855×106 UFC mL-1 para K. africana y S. cerevisiae respectivamente,
de etanol de 51.31 gL-1 y se consumieron completamente los azúcares reductores, debido a la
presencia del oxígeno que estimuló la síntesis de ácido oleico y ergosterol (compuestos asociados
a la estabilidad de la membrana), lo que permitió mantener la viabilidad y actividad fermentativa
de K. africana aumentando la tolerancia al etanol. En la composición aromática durante las
condiciones en medio reformulado (1, 2, 3, 4 y 9) se observaron las mayores concentraciones de
alcoholes superiores, ésteres de etilo de cadena larga como el 9-hexadecenoato de etilo y en las
195
CONCLUSIONES GENERALES
Los resultados del presente trabajo dan evidencia de que bajo las condiciones adecuadas de
fermentación y en presencia de un medio rico en nutrientes, K. africana es capaz de aumentar su
prevalencia y capacidad fermentativa durante la fermentación del jugo de agave en cultivo mixto
con S. cerevisiae, por lo que su contribución en la composición aromática y sensorial de la bebida
podría resultar una ventaja en el mercado de nuevas marcas de Tequila por la incorporación de
olores y sabores especiales. Asimismo la implementación del sistema en continuo en la
fermentación del jugo de agave en cultivo mixto podría representar una alternativa tecnológica
por el aumento en la productividad y por la incorporación de compuestos volátiles importantes
como los ésteres, debido a que durante éstos cultivos más de 41 compuestos volátiles
minoritarios fueron identificados y cuantificados en comparación con los sistemas por lote donde
se identificó una menor cantidad (cerca de 24 compuestos), sin embargo, son necesarios un
mayor número de estudios en torno a la utilización de otras fuentes de crecimiento que garanticen
un proceso más económico y rentable.
196
PERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
De los resultados y conclusiones del presente trabajo de investigación se pueden señalar las
siguientes perspectivas:
198
BIBLIOGRAFÍA
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208
ANEXOS
ANEXOS
ANEXOS
ANEXO 1
Ingredientes gL-1
Hidrolizado enzimático de caseína 5
Extracto de levadura 4
Destroza 50
Monopotasio de fosfato 0.55
Cloruro de potasio 0.425
Cloruro de calcio 0.125
Sulfato de magnesio 0.125
Cloruro férrico 0.0025
Sulfato de manganeso 0.0025
Verde de bromocresol 0.022
Agar 20
pH final 5.5±0.2 a 25ºC
210
ANEXOS
ANEXO 2
211
ANEXOS
212
ANEXOS
ANEXO 3
Instrucciones:
Esporádicamente _______
213
ANEXOS
5. Mencione la(s) propiedad(es) sensoriales que consideró para determinar el nivel de agrado de
las muestras
_________________________________________________________________
_____________________________
FIRMA
214
ANEXOS
ANEXO 4
Instrucciones:
1.- Antes de tomar la prueba, familiarícese con el olor, aroma y gusto de las muestras “A” y “No
– A” que están disponibles.
2.- Pruebe las muestras de izquierda a derecha. Después de cada muestra, anote su respuesta en la
tabla de abajo, enguaje su paladar con agua y espere un momento entre muestra y muestra.
Muestra Código A No A
1
2
3
4.- Como dato adjunto encontrará una lista de descriptores, trate en la medida de lo posible de
identificar aquellos que están presentes en las muestras codificadas y anótelos en la tabla de abajo.
5.- Asimismo si percibe algún otro descriptor en la muestra que no se encuentre en la lista, por
favor anótelo en la hoja mencionando si lo percibe en: olor, aroma, gusto y/o sensaciones
trigeminales.
_____________________________
FIRMA
215
ANEXOS
DESCRIPTORES
Olor Aroma Gusto S. Trigeminales
Agave Cocido Aceituna Ácido Picante
Almendra Anís Amargo quemante
Anís Astringente Dulce Metálico
Barniz Barniz Salado Astringente
Café Caramelo
Caramelo Eucalipto
Ciruela Fenólico
Cítrico Fermentado
Coco rancio Frutal
Fermentado avinagrado Humo
Floral Madera
Fruta descompuesta Madera resinosa
Fruta Fermentada Mantequilla artificial
Fruta Seca Mentol
Frutal Paja húmeda
Madera Picante
Madera resinosa Pino
Manzana Roja Plátano
Nuez Plátano fermentado
Paja húmeda Resina de pino
Picante Salado
Piloncillo Soda
Trapo húmedo solvente frutal
Vainilla Vinagre
Vinagre
216
ANEXOS
ANEXO 5
𝑑𝑥 𝑋
= 𝜇! 𝑋(1 − )
Logístico 𝑑𝑡 𝑋!
Marquard (Quimiad) 𝑑𝑥 𝑆
= 𝜇! 𝑋
𝑑𝑡 𝐾! + 𝑆
Grompertz 𝑑𝑥 !!"# )
= 𝑋! 𝑏𝜇! 𝑒 !(!! !!!"
𝑑𝑡
Morgan-Mercer-Flodin (MMF) 𝑎𝑏 + 𝑐𝑡 !
𝑋=
𝑏 + 𝑡!
Richards 𝑋!
𝑋= !!!"#
(1 + 𝑒 )!/!
Weibull
!
𝑋 = 𝑋! − 𝑏𝑒 !!"!
! 𝜇! 𝑡 !
Cúbico 𝑋 = (𝑋𝑜 ! + )
3
217
ANEXOS
218
ANEXOS
ANEXO 6
219
ANEXOS
220
ANEXOS
221
ANEXOS
222