Bioetanol Tallos Maiz

OBTENCION DE BIOETANOL A
PARTIR DE TALLOS DE MAIZ
OLMEDO JESÚS CUASPUD CÁLIZ
Universidad Nacional de Colombia

Sede Medellín
Facultad de Ciencias
Medellín, Colombia
2017
OBTENCION DE BIOETANOL A
PARTIR DE TALLOS DE MAIZ
Olmedo Jesús Cuaspud Cáliz

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias-Biotecnología
Director:
Mario Arias Z., Ph.D.
Co-Director
Héctor Jairo Correa, Ph.D.
Línea de Investigación: Energías Alternativas

Grupo de Investigación: Biotecnología Industrial

Sede Medellín
Facultad de Ciencias
Medellín, Colombia
2017
Maestría en Ciencias - Biotecnología
A Dios por ser mi compañía y sus palabras:

“Esfuérzate y sé valiente. No temas ni desmayes, […],
estaré contigo por donde quiera que vayas (Josué 1:9).
A mis padres por apoyarme en todo momento,

a mi hermana Liliana por sus consejos y apoyo,
a mi hermana Sandra por su cariño,
A Adriana por su decisión de amarme.

Contenido V
Agradecimientos
Agradezco al profesor Mario Arias, Director del Área Curricular de Biotecnología y del
grupo de Investigación Biotecnología Industrial de la Universidad Nacional de Colombia
sede Medellín, por su acompañamiento y apoyo en la elaboración de esta investigación.
Al profesor Héctor Jairo Correa, profesor del Departamento de Nutrición Animal de la

Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, por su asesoría y tutoría durante la
primera parte de esta investigación.
A mis compañeros del grupo de investigación Biotecnología Industrial por colaborarme en

este proyecto con sus habilidades en el laboratorio.
A la Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín por su colaboración y facilidad de

instalaciones, equipos y asesorías.
VI
Resumen
El residuo lignocelulósico tallo o rastrojo de maíz producto de la cosecha de este cereal es
una fuente de biomasa accesible y de bajo costo. El objetivo de esta investigación es
estudiar la obtención de azúcares reductores y su fermentación a etanol a partir de este
residuo agroindustrial. Para ello se sometió el material a un proceso de hidrólisis ácida con
ácido sulfúrico diluido para evaluar efectos de la concentración del ácido, carga del sólido
y tiempo de contacto sobre la producción de azúcares reductores. Se utilizó el modelo de
superficies de respuesta Box Behnken para obtención de las condiciones óptimas de
hidrólisis ácida y determinar las posibles interacciones entre las variables concentración
del ácido, tiempo y carga del sólido, con tres repeticiones. Además se plantea un modelo
cinético para el proceso de hidrólisis basado en dos semi-reacciones de primer orden. Los
datos se analizaron con el Statgraphic Centurion XI. El modelo propuesto se ajustó a los
resultados del proceso de producción de azúcares reductores. Los resultados fueron
estadísticamente significativos para el efecto de la concentración del ácido y la carga del
sólido. Además se pudieron fijar parámetros (6% ácido, 30% sólido y 41 min) para obtener
una concentración máxima de 124 g/L de azúcares reductores. Posteriormente se evalúan
dos métodos de detoxificacion del hidrolizado, overliming y adición de carbón activado,
para disminuir la concentración de inhibidores de la fermentación, obteniendo mejores
resultados con el carbón activado el cual removió un 45% de HMF, 25% de ácido acético
y hasta un 95% de compuestos fenólicos. Finalmente se llevó a cabo la fermentación del
hidrolizado detoxificado y se evaluó crecimiento de biomasa, consumo de azúcares
reductores y concentración de etanol durante la fermentación a escala de matraz agitado,
obteniéndose una concentración máxima de etanol de 24 g/L de, al cabo de 18 horas, con
2.5 g/L de biomasa inicial en el hidrolizado tratado con carbón activado
Palabras clave: Residuo lignocelulósico, hidrólisis ácida, detoxificación, fermentación,

bioetanol.
Abstract
The lignocellulose residue from the Zea mays is a low-cost and accessible source of
biomass. The objective of this research is analyze the production of reducing sugars
fermentable from this type of bagasse. The hydrolysis process is carried out with the dilute
sulfuric acid to evaluate the effect of substrate loading, acid concentration and time
measuring the concentration of reducing sugars by the 3, 5-dinitrosalicylic acid method
(DNS method). Use of the surface response model Box Behnken, was fitted to the
production process of reducing sugars, the results were statistically significant for the effect
of the acid concentration and the substrate load could also be set parameters (6% acid,
30% w / w substrate and 52 min) to obtain a maximum concentration of 124 g / L reducing
sugars. Activated detoxification methods are then evaluated to decrease the concentration
of inhibitors in the hydrolyzate, obtaining better results with the activated carbon which
eliminated 45% HMF, 25% acetic acid and up to 95% phenolic compounds. Carried out the
fermentation of the hydrolyzate with all treatments and evaluated the growth of biomass,
the consumption of reducing sugars and the concentration of ethanol during fermentation
at the scale of shaken flask, obtaining a maximum concentration of ethanol of 20,54 g/L inf
18 hours, with 2.5 g / L of initial biomass in the hydrolyzate treated with activated carbon
Keywords: Lignocellulosic residues, acid hydrolysis, detoxification, fermentation,

bioethanol.
VII
I
Contenido
Pág.
1. Marco Teórico ........................................................................................................ 14

1.1 Características del Material Lignocelulósico...................................................... 14
1.1.1 Celulosa, Hemicelulosa y Lignina .................................................................. 14
1.1.2 Material lignocelulósico como fuente de energía ........................................... 16
1.1.3 Pretratamientos del material lignocelulósico .................................................. 19
1.2 Hidrólisis ácida diluida ...................................................................................... 20
1.2.1 Concentración del ácido ................................................................................ 22
1.2.2 Carga de Solido............................................................................................. 22
1.2.3 Tiempo y temperatura ................................................................................... 23
1.2.4 Tamaño de partícula ..................................................................................... 24
1.3 Formación de inhibidores .................................................................................. 24
1.3.1 Ácido acético ................................................................................................. 25
1.3.2 5-Hidroximetilfurfural y 2-Furfural .................................................................. 26
1.3.3 Compuestos fenólicos ................................................................................... 27
1.3.4 Otros ácidos .................................................................................................. 28
1.4 Detoxificación del hidrolizado ............................................................................ 29
1.4.1 Overliming ..................................................................................................... 30
1.4.2 Carbón activado ............................................................................................ 30
1.4.3 Combinación de overliming y carbón activado ............................................... 31
1.5 Fermentación alcohólica de hidrolizados .......................................................... 31
2. Materiales y Métodos ............................................................................................. 35

2.1 Material lignocelulósico ..................................................................................... 35
2.1.1 Tratamiento material lignocelulósico .............................................................. 35
2.1.2 Análisis de componentes estructurales ......................................................... 36
2.2 Hidrólisis con ácido diluido ................................................................................ 36
2.2.1 Optimización de hidrólisis ácida .................................................................... 36
2.2.2 Cinética de hidrólisis ácida ............................................................................ 38
2.3 Preparación de reactivos .................................................................................. 39
2.3.1 Preparación del reactivo ácido 3,5 dinitrosalicílico en caliente....................... 39
2.4 Detoxificación con carbón activado ................................................................... 40
2.5 Detoxificación por overliming ............................................................................ 40
2.6 Tratamiento de carbón activado + overliming .................................................... 41
2.7 Medición de inhibidores .................................................................................... 41
2.7.1 Evaluación de concentración de ácido acético y HMF ................................... 41
2.7.2 Evaluación de fenólicos totales ..................................................................... 41
2.8 Fermentación con Saccharomycces cerevisiae ................................................ 41
2.8.1 Preparación medio YPG líquido .................................................................... 41
2.8.2 Preparación medio YPG sólido ...................................................................... 42
2.8.3 Obtención del inóculo .................................................................................... 42
2.8.4 Adaptación de S. cerevisiae al hidrolizado .................................................... 42
2.8.5 Fermentación del hidrolizado ......................................................................... 43

2.8.6 Evaluación de concentración de etanol en los hidrolizados ........................... 43
3. Resultados y Discusión ......................................................................................... 44

3.1 Análisis de Componentes Estructurales ........................................................... 44
3.2 Hidrólisis con ácido diluido ............................................................................... 45
3.2.1 Optimización de Hidrólisis Ácida .................................................................... 45
3.2.2 Superficies de Respuesta .............................................................................. 48
3.2.3 Condiciones óptimas para obtención de azúcares reductores ....................... 53
3.2.4 Cinética de Hidrólisis Ácida ........................................................................... 55
3.2.5 Cálculo de Parámetros de Severidad............................................................. 57
3.2.6 Medición de Glucosa bajo Hidrólisis Ácida..................................................... 59
3.3 Tratamientos de detoxificación ......................................................................... 63
3.3.1 Medición de azúcares reductores y glucosa .................................................. 63
3.3.1 Evaluación de concentración de ácido acético y HMF ................................... 65
3.3.2 Evaluación de Compuestos Fenólicos Totales ............................................... 67
3.3.3 Inhibidores en Hidrolizados ............................................................................ 69
3.3.4 Adaptación de S. cerevisiae al Hidrolizado .................................................... 70
3.4 Fermentación del Hidrolizado ........................................................................... 71
4. Conclusiones .......................................................................................................... 79
4.1 Recomendaciones............................................................................................ 79
Contenido X
Lista de Figuras
Pág.
Figura 1-1. Conformación de la estructura de una pared vegetal (Adaptación de U.S.

Department of Energy Offices of Science, 2014) ............................................................. 15
Figura 1-2. Estructura esquemática de las cadenas de celulosa (Cortínez, 2010) ......... 15
Figura 1-3. Hectáreas de diferentes tipos de maíz en los 8 mayores departamentos
productores a abril de 2016 (Fenalce, 2016). .................................................................. 17
Figura 1-4. Mecanismo para la hidrólisis del enlace glicosídico hemicelulósico catalizada
por protones. ................................................................................................................... 20
Figura 1-5. Comportamiento típico de obtención de azúcares vs tiempo de hidrólisis ácida
a diferentes temperaturas (Modificada de Liu et al., 2012). ............................................. 23
Figura 1-6. Productos y subproductos que se obtienen de la hidrólisis ácida de residuos
lignocelulósicos (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b). ................................................... 25
Figura 1-7. Representación esquemática de la fermentación 1:Hexocinasa; 2:fosfoglucosa
isomerasa; 3:Fosfofructocinasa-1; 4:Aldolasa; 5:Piruvatocinasa; 6:piruvato descarboxilasa;
7:Alcohol deshidrogenasa (Escalante et al., 2011). ........................................................ 33
Figura 2-1 Ubicación Geográfica y Relieve del Municipio de Sonsón en Antioquia (IGAC,
2016). ............................................................................................................................. 35
Figura 2-2 Reacción de reducción del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Southgate, 1991)... 39
Figura 3-1. Concentración de Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en bagazo de maíz
reportada por diferentes autores. .................................................................................... 45
Figura 3-2. Gráfica de los valores observados vs. valores estimados por el modelo de Box-
Behnken.......................................................................................................................... 48
Figura 3-3. Superficies de Respuesta obtenidas bajo el modelo de Box-Behnken de
Azúcares Reductores (g/L) a diferentes cargas de sólido. A. 10% p/v; B. 20% p/v; C. 30%
p/v. .................................................................................................................................. 49
Figura 3-4. Diagrama de Pareto estandarizado para azúcares reductores ..................... 51
Figura 3-5. Superficie de respuesta estimada al tiempo óptimo de 40,89 min para azúcares
reductores. ...................................................................................................................... 53
Figura 3-6. Concentración de Azúcares Reductores en hidrólisis ácida (g/L) a una
concentración de H2SO4 6% v/v. ..................................................................................... 55
Figura 3-7. Gráfico de Ln(CAR) vs tiempo, para calcular k. ............................................. 56
Figura 3-8. Influencia del factor severidad sobre la concentración de azúcares reductores,
en una reacción de hidrólisis. Carga de Solido: 30 %p/v (■), 20 %p/v (▲), 10 %p/v (○). . 58
Figura 3-9. Superficies de Respuesta obtenida bajo el modelo de Box-Behnken de
obtención de Glucosa (g/L) a diferentes cargas de solido. A. 10% p/v, B. 20% p/v, C. 30%
p/v. .................................................................................................................................. 60
Figura 3-10. Formación de ácidos levulínico y fórmico durante hidrólisis ácida diluida. .. 61
Figura 3-11. Superficie de respuesta estimada al tiempo óptimo de 52,00 min, para glucosa
(g/L). ............................................................................................................................... 62
Figura 3-12. Medición de azúcares reductores y glucosa en los tratamientos de

detoxificación. ................................................................................................................ 64
Figura 3-13. Concentración de ácido acético en las muestras antes y después de los
tratamientos de detoxificación, CMI: concentración mínima inhibitoria. .......................... 66
Figura 3-14. Concentración de 5-HMF antes y después de los tratamientos de
detoxificación ................................................................................................................. 67
Figura 3-15. Tratamiento con carbón activado. A. Hidrolizado sin detoxificar, B. Hidrolizado
luego de tratamiento de detoxificación. C. Hidrolizado filtrado y centrifugado. ................ 67
Figura 3-16. Concentración de compuestos fenólicos después de tratamientos de
detoxificación ................................................................................................................. 68
Figura 3-17. Crecimiento de biomasa en hidrolizado tratado con carbón activado. ....... 73
Figura 3-18. Medición de etanol y azúcares reductores durante la fermentación en
hidrolizado tratado con carbón activado. ........................................................................ 74
Figura 3-19. Crecimiento de biomasa en hidrolizado tratado por overliming. ................. 77
hidrolizado tratado por overliming. .................................................................................. 77
XII
Lista de Tablas
Pág.
Tabla 1. Composición del material lignocelulósico de maíz según otras investigaciones. 16

Tabla 2. Rangos de las tres variables independientes usadas en el modelo de Box-
Behnken.......................................................................................................................... 37
Tabla 3. Plan experimental de optimización para obtención de azúcares reductores usando
el diseño de Box-Behnken. ............................................................................................. 37
Tabla 4. Adaptación de S. cerevisiae al hidrolizado variando la concentración del
hidrolizado ...................................................................................................................... 42
Tabla 5. Análisis de muestra de bagazo de maíz ............................................................ 44
el diseño de Box-Behnken. ............................................................................................. 46
Tabla 7. Datos resumidos de análisis de varianza (ANOVA) de los modelos empíricos
obtenidos para el rendimiento de azúcares reductores. .................................................. 47
Tabla 8. Respuesta óptima, condiciones a las cuales el modelo estima mayor obtención de
azúcares reductores........................................................................................................ 54
Tabla 9. Valores parámetros cinéticos calculados para concentración y carga de solido
óptima. ............................................................................................................................ 57
Tabla 10. Respuesta óptima, condiciones a las cuales el modelo estima una mayor
concentración de glucosa. .............................................................................................. 62
Tabla 11. Concentración de azúcares reductores y glucosa después de los tratamientos de
detoxificación. ................................................................................................................. 65
Tabla 12. Concentraciones de Inhibidores en Hidrolizado con distintos tratamientos de
detoxificación .................................................................................................................. 70
hidrolizado ...................................................................................................................... 71
Tabla 14. Concentraciones máximas de etanol logradas con tratamientos de detoxificación
....................................................................................................................................... 72
Tabla 15. YP/S reportado por otros investigadores de fermentaciones de Hidrolizados ácido
diluido (H2SO4). ............................................................................................................. 73
Contenido 13
Lista de Símbolos y Abreviaturas
Símbolos con letras latinas
Símbolo Término Unidad SI

2-F 2-Furfuraldehido g/L
AC Ácido Acético g/L
CA Carbón Activado 1
CAR Concentración Azúcares Reductores g/L
CMI Concentración Mínima Inhibitoria g/L o mmol/L
HMF 5-Hidroximetilfurural g/L
IC50 Concentración Inhibitoria 50 g/L
OV Tratamiento por Overliming 1
CF Compuestos Fenólicos 1
Símbolos con letras griegas

Símbolo Término Unidad SI
α Orden de la Reacción 1
β Enlaces Beta Glucosídicos 1

14 Maestría en Ciencias - Biotecnología
1. Marco Teórico
1.1 Características del Material Lignocelulósico

El material lignocelulósico consiste en residuos productos de la agricultura; luego de
cosechar un cierto cultivo quedan rastrojos sobre la superficie compuestos de hojas, tallos
y raíces (Alzate et al., 2005). En el caso particular de cultivos de cereales, se retira el grano
y el tallo y hojas son utilizados como alimento para el ganado. A nivel molecular, las
paredes vegetales de este material están compuesta por tres tipos de estructuras: celulosa,
hemicelulosa y lignina (Figura 1-1).
1.1.1 Celulosa, Hemicelulosa y Lignina

La celulosa es el principal polímero estructural de las paredes celulares de las plantas, que
de manera organizada compone la parte fibrosa de la planta. Tal polímero lineal consta de
subunidades de glucosa unidas entre sí por enlace β-1-4 glucosídicos y se han establecido
como la unidad de repetición de cadenas de celulosa. Azúcares fermentables como la
glucosa pueden ser producidas rompiendo los enlaces β-1-4 glucosídicos por uso de algún
ácido o enzima (Cortínez, 2010).
A diferencia de la celulosa, la hemicelulosa consiste de diferentes unidades de

monosacáridos, tales como pentosas (xilosa, ramnosa y arabinosa), hexosas (glucosa,
manosa y galactosa) y ácido urónico. La columna vertebral de la hemicelulosa puede ser
homopolímero o heteropolímero con ramas cortas en, por ejemplo, β- (1,4) - y en ocasiones
enlaces β-1-3 glucosídicos (Cortinez, 2010).
Maestría en Ciencias - Biotecnología 15
Figura 1-1. Conformación de la estructura de una pared vegetal (Adaptación de U.S.

Department of Energy Offices of Science, 2014)
Figura 1-2. Estructura esquemática de las cadenas de celulosa (Cortínez, 2010)
La hemicelulosa es un grupo de polisacáridos heterogéneos insolubles en agua; plantas

de cereales como trigo, arroz, maíz y cebada pueden contener entre 30 y 40% de
hemicelulosa y sus residuos agrícolas entre 40 y 50%. La hemicelulosa de la pared celular
está dispuesta por una cadena principal de β-(1,4) xilopiranosil con α-L-arabinofuranosa
en las ramificaciones. En plantas de cereales se alternan los enlaces β-(1→4) con β-(1
→3) (Cortínez, 2010). Una considerable fracción de hemicelulosa se hidroliza a
oligosacáridos solubles líquidos, mientras que una pequeña fracción se hidroliza a
azúcares monoméricos, impidiendo la formación de inhibidores derivados del furano (El-

Zawawy et al., 2011; Kim et al., 2016).
La lignina constituye entre 10 y 15 % de la biomasa de los cereales; se encuentra como

láminas en las capas de la pared celular; se ocupa del transporte de agua, nutrientes y
metabolitos y cumple funciones estructurales por su alta capacidad de entrecruzamiento;
protege los polisacáridos y contrarresta la despolimerización (Cortínez, 2010).
La composición química de la lignina consiste principalmente en tres tipos de unidades

repetitivas: cumaril (H), guaiacil (G) y siringil (S). Se diferencian en la sustitución con el
grupo metoxilo (-OMe) en las posiciones 3 y 5 de la unidad aromática confiriéndole una
estructura amorfa con alta heterogeneidad; son importantes en la recalcitrancia y se
convierten en barrera protectora de la biomasa contra ataques de microorganismos o
degradación por químicos (Kotarska et al., 2015).
Es necesario aclarar que el porcentaje de hemicelulosa, celulosa y lignina varía de acuerdo

con la edad y tipo de planta. Para una planta adulta de maíz, por ejemplo mayor de ocho
meses, se han reportado valores de 30, 35 y 45%, respectivamente (Lloyd & Wyman,
2005), mientras que otros autores han reportado porcentajes diferentes.
Tabla 1. Composición del material lignocelulósico de maíz según otras investigaciones.
Composición %
Referencia
Hemicelulosa Celulosa Lignina
(Nag, 2008) 45,0 35,0 15,0
(Torget et al., 1991) 42,4 40,9 16,7
(Lee et al., 1994) 37,7 39,0 23,3
(Esteghlalian et al., 1997) 44,3 36,0 19,7
(Tucker et al., 2003) 42,0 38,0 20,0
(Liu et al., 2009) 37,9 40,8 21,3
1.1.2 Material lignocelulósico como fuente de energía

En la actualidad la necesidad de alternativas a los combustibles fósiles y el aumento en el
consumo energético crecen a pasos agigantados. Hidalgo et al. (2006) estimaron un
aumento del 35% en el consumo de energía mundial los próximos años. Entre las fuentes
alternativas de energía que cobran mayor fuerza están las destinadas a los automotores ,
además del impacto sobre el medio ambiente, estimula la producción, investigación y uso
de bioetanol, más aun que se puede obtener a partir de la fermentación de los azúcares
reductores que forman parte del material lignocelulósico (Hidalgo et al., 2006).
Aunque la biomasa cuenta con mayor proyección, los residuos que la conforman han sido
considerados de bajo valor económico (Fuentes et al., 2001) siendo incorporados al suelo
como fuente de materia orgánica o utilizados como alimento para rumiantes mediante la
extracción total el rastrojo (Velásquez et al., 2002). En ocasiones los productores prefieren
quemar tal rastrojo para “limpiar” las parcelas (Sole & Flotats, 2004). Esta forma de
disposición del material, que además trae consigo ciertos problemas ambientales,
desaprovecha el valor agregado de una biomasa susceptible de ser transformada en un
biocombustible.
En Colombia el cultivo de maíz está presente en gran parte del territorio nacional,
especialmente en el centro y noroccidente del país; los principales departamentos
productores, entre los cuales se cuenta Córdoba, Tolima, Huila, Meta y Antioquia, aportan
el 85% de la producción nacional del maíz (Figura 1-3). La generación de bagazo ocupa
grandes volúmenes, y aunque la importación de maíz ha crecido en los últimos 5 años
hasta cubrir un 70% de la demanda nacional, existen cerca de 180.000 hectáreas
sembradas en todo el país, lo cual se traduce igualmente en altas cantidades de residuo
lignocelulósico (Fenalce, 2016), residuo susceptible de convertirse en bioetanol,
significando una respuesta a la gran demanda de biocombustibles que cada año crece en
el país y en el mundo.
Figura 1-3. Hectáreas de diferentes tipos de maíz en los 8 mayores departamentos

productores a abril de 2016 (Fenalce, 2016).
12000
Amarillo Tecnificado
10000 Amarillo Tradicional

Blanco Tecnificado
Hectáreas de Cultivos
8000 Blanco Tradicional
6000
4000
2000
0
Huila
Meta
Cundinamarca
Antioquia
Córdoba
Santander
Tolima
Valle del Cauca

Departamentos de Colombia
Se ha planteado que el bioetanol elaborado a partir de cereales utilizados en alimentación

humana y animal produce escasez del grano y que no se ha tenido en cuenta el material
lignocelulósico residual en procesos de mayor provecho; en esta misma línea, se ha
determinado que la miel extraída de la caña de maíz es rica en azúcares, los cuales se
fermentan o se usan en el consumo animal y humano (Fuentes et al., 2001). Los ensayos
y trabajos académicos demuestran que cerca del 42% de la celulosa contenida en el
bagazo puede ser hidrolizada para extracción de azúcares fermentables (Prado et al.,
2012).
En tales estudios cobra importancia el tratamiento por hidrólisis ácida de bagazo de caña
de maíz, obteniéndose azúcares reductores de 5 y 6 carbonos. La glucosa obtenida con
ácidos orgánicos aproximadamente ha sido de 18 g/L (Teixeira et al., 1999). En trabajos
más actuales como el realizado por Rodríguez et al. (2004), quienes utilizaron ácido nítrico
para romper los enlaces de la lignina presente y obtener xilosa, se demostró que bajo este
proceso se pueden obtener eficiencias cercanas al 30% en la extracción de azúcares a
partir de la celulosa presente en el material. Estos azúcares obtenidos son adicionales a
los ya obtenidos por el jugo de la caña. Por otra parte, son reconocibles los resultados de
la hidrólisis ácida implementada en biomasa lignocelulósica de cascarilla de arroz o en
rastrojo de banano, alcanzando valores de conversión de hasta 45% (El-Zawawy et al.,

2011).
1.1.3 Pretratamientos del material lignocelulósico

Los diferentes tipos de pretratamiento pueden dividirse en tres grupos: biológicos,
químicos y físicos. En los primeros se utilizan microorganismos o enzimas capaces de
degradar la estructura del material lignocelulósico; entre los microorganismos más usados
se encuentran los hongos de podredumbre marrón los cuales atacan la celulosa, los de
podredumbre blanca atacan tanto celulosa como lignina, siendo estos últimos más eficaces
en la degradación a azúcares (Fan et al., 1987); sin embargo se ha reportado también que
la tasa de hidrólisis es muy lenta, y en algunos casos ha sido necesario suplementar el
medio para mantener a estos microorganismos hidrolizando.
Los pretratamientos físicos involucran cambios físicos en el material lignocelulósico; se

usa frecuentemente la elevación de temperatura para romper los enlaces 1,4 B-
glucosídicos que mantienen la integridad de la hemicelulosa; la desventaja de este tipo de
pretratamiento radica en la formación de inhibidores como ácidos que intervienen en vías
metabólicas de las levaduras (Gregg & Saddler, 1996). Por su parte, la molienda es un
pretratamiento físico que reduce el tamaño de la partícula aumentando la probabilidad de
hidrólisis en el material (Rodrıg
́ uez et al., 2004; Sun & Cheng, 2002).
Entre los pretratamientos químicos se destaca el uso de ácidos o bases capaces de romper
los enlaces de los polímeros de las paredes vegetales para obtener azúcares reductores
como pentosas y hexosas (Loow et al., 2016). En la hidrólisis ácida se pueden emplear
ácidos orgánicos o inorgánicos entre los que se destacan el sulfúrico, clorhídrico, sulfuroso,
fosfórico, nítrico y fórmico (Galbe & Zacchi, 2002), siendo el sulfúrico y clorhídrico los
únicos usados a nivel industrial por su bajo costo y efectividad; se ha demostrado inclusive
hasta un 80% de hidrólisis de la hemicelulosa y 45% de la celulosa, usando ácidos
concentrados (10-30%) a temperaturas de 170-190ºC pero con un mayor tiempo de
residencia; por otro lado se pueden usar ácidos diluidos (1-5%) a temperaturas más altas
(120-240ºC) y tiempos de residencia inferiores a 1 hora (Riaño et al., 2010). El uso de este
tipo de hidrólisis ha sido ampliamente empleado con diversos tipos de materiales
lignocelulósicos debido a que se usa poco ácido, se logran eficiencias superiores al 70%,
es rápido y fácil de controlar (Sun & Cheng, 2002).
1.2 Hidrólisis ácida diluida

La hidrólisis ácida es un proceso que mediante el uso de solución ácida rompe la
hemicelulosa y celulosa. Se pueden utilizar ácidos orgánicos e inorgánicos, siendo más
utilizados los últimos por su mayor efecto sobre estructuras cristalinas del material
lignocelulósico combinado con temperaturas mayores a 180°C (Banerji et al., 2013;
Rodrıg
́ uez et al., 2004). Este proceso se realiza en agua, la cual cumple la doble función
de ser medio de contacto entre el material y el ácido y de receptor de los hidrogeniones de
ácidos orgánicos contenidos en la hemicelulosa, los que finalmente incrementan la acidez
de la solución y dan lugar al hidrolizado (Fontecha, 2011). El mecanismo de la reacción ha
sido planteado por Harmsen y colaboradores, explicando que tal reacción ocurre por la
capacidad del ácido de protonar el átomo de oxígeno glicosídico o el oxígeno del anillo
para la formación del catión carbonado (Figura 1-4). Por tanto, el grupo cargado abandona
la cadena polimérica, permitiendo que el grupo hidroxilo del agua reemplace el enlace y
libere el protón conduciendo finalmente a la degradación de los polímeros a azúcares
reductores como glucosa, xilosa y arabinosa, y en algunos casos fragmentos de lignina
(Harmsen, 2010).
Figura 1-4. Mecanismo para la hidrólisis del enlace glicosídico hemicelulósico catalizada
por protones.
Así pues, con el rompimiento de la hemicelulosa se pueden obtener hexosas y pentosas,

y se disminuye la cristalinidad de la celulosa. Esto último se logra rompiendo los puentes
de hidrógeno presentes en la celulosa con el uso de ácidos inorgánicos fuertes, siendo una
de las más comunes tecnologías en el tratamiento del material lignocelulósico debido a su
bajo costo y efectividad a la hora de hidrolizar la fracción hemicelulolitíca y celulolítica en
componentes monoméricos o azúcares de 5 y 6 carbonos que se pueden usar como
sustrato en procesos fermentativos o enzimáticos (Zheng et al., 2009).
La obtención de azúcares por hidrólisis ácida es una técnica ya conocida, usada como
pretratamiento para la fermentación de material lignocelulósico en bioetanol cuyos
azúcares se obtienen en el hidrolizado, facilitando la subsiguiente fermentación (Kristiani
et al., 2013). En cuanto fue aplicada a la paja de arroz para la producción de xilosa y furfural
arrojó un 70% de conversión del material lignocelulósico en xilosa (Liu et al., 2012). En
bagazo de maíz pretratado con ácido nítrico HNO3 diluido 0,6% p/p durante un minuto, se
obtuvieron hasta 27 g/L de azúcares reductores (Zhang et al., 2011), y con HCL en este
mismo material lignocelulósico se logró una conversión a azúcares reductores de hasta 22
g de azúcares/kg de biomasa (Zu et al., 2014).
En cuanto a las condiciones requeridas por la hidrólisis ácida, varían en tiempo, tipo y
concentración del ácido, así como con la relación sólido/líquido (Sun & Cheng, 2002). De
aquí la necesidad de elaborar una serie de experimentos para poder optimizar las
condiciones para cada tipo de ácido y residuo lignocelulósico.
Los tratamientos de hidrólisis ácida son eficientes tanto si se operan a altas temperaturas
y bajas concentraciones de ácido, como a bajas temperaturas y altas concentraciones del
ácido; pero comúnmente se trabaja con bajas concentraciones para evitar los impactos de
la alta corrosividad (Banerji et al., 2013). Además el ácido sulfúrico es uno de los más
utilizados en esta clase de procesos debido a su bajo costo, no requiere uso de equipos
sofisticados y en proceso bien controlado tiene bajo impacto en el medio ambiente
(Jacobsen & Wyman, 2000) siendo además mucho más rápido que la hidrólisis enzimática
(Nag, 2008).
1.2.1 Concentración del ácido

Está dada por la cantidad de ácido en su forma pura que se diluye en agua para formar
una disolución la cual se agrega al residuo lignocelulósico para iniciar la hidrólisis ácida;
aunque los ácidos inorgánicos resultan más eficientes, es de anotar que el ácido oxálico
presentó una hidrólisis mayor que el ácido sulfúrico cuando el material lignocelulósico tiene
proporciones similares de hemicelulosa y celulosa (Lee & Jeffries, 2011). No obstante, el
ácido sulfúrico es el comúnmente utilizado para la hidrólisis ácida diluida, por su bajo costo,
en concentraciones de 0,5% a 8% (Banerji et al., 2013; Esteghlalian et al., 1997; Liu et al.,
2012; Lloyd & Wyman, 2005).
También han sido usados los ácidos nítrico y clorhídrico obteniéndose concentraciones de
glucosa entre 3,5 y 10,1 g/L (Rodrıg
́ uez et al., 2004). Nuevamente, relucen las ventajas del
ácido sulfúrico por su bajo costo y alta eficiencia en la recuperación de azúcares por
hidrólisis de la hemicelulosa; además el daño químico causado a la pared celular es mayor,
se facilita así el acceso a microorganismos o enzimas para la conversión en etanol (Lloyd
& Wyman, 2005).
1.2.2 Carga de Solido

La carga del solido se refiere a la fracción porcentual en peso de material lignocelulósico
sólido sobre la cantidad de ácido diluido líquido que se utiliza en la hidrólisis. La proporción
entre el material y la fase líquida debe ser tal que garantice que el ácido haga contacto con
la totalidad de aquél y así cubrir una mayor zona de reacción. Se recomienda usar una
carga no superior al 30% por la dificultad de obtención del hidrolizado liquido; proporciones
más altas reducen el rendimiento tanto de la fracción líquida como de la sólida;
alternativamente esta última puede ser usada como alimento de ganado o combustible en
calderas (Banerji et al., 2013).
1.2.3 Tiempo y temperatura

El tiempo en la obtención de azúcares reductores determina la accesibilidad del ácido al
material. El rendimiento de azúcares reductores se vuelve proporcional hasta un
determinado tiempo que varía de acuerdo al material lignocelulósico y la naturaleza del
ácido que se use. En la Figura 1-5 se esquematiza un comportamiento típico de hidrólisis
ácida llevada a cabo en material lignocelulósico; se puede observar que si se lleva a una
temperatura típica de autoclave de 120°C, después del minuto 60 viene el decrecimiento
de azúcares; esto se debe a que se están degradando a otros compuestos como HMF,
furfural o compuestos fenólicos (Liu et al., 2012).
Figura 1-5. Comportamiento típico de obtención de azúcares vs tiempo de hidrólisis ácida

a diferentes temperaturas (Modificada de Liu et al., 2012).
En contraste, a medida que la hidrólisis se hace a temperaturas mayores el tiempo de

máxima concentración de azúcares reductores disminuye. La desnaturalización de dichos
azúcares ocurre igualmente en menor tiempo, debido a que éstos se transforman en
inhibidores de crecimiento de microorganismos, haciendo del proceso aún más delicado si
la temperatura aumenta. El tiempo óptimo para cada tipo de material varía de acuerdo con
la especie vegetal, su edad, tipo y concentración del ácido utilizado. De aquí la importancia
de conocer cuál es el tiempo óptimo para la mayor obtención de azúcares sin que éstos se
conviertan en inhibidores de crecimientos de los microorganismo (Kristiani et al., 2013;
Fontecha, 2011).
1.2.4 Tamaño de partícula

El tamaño de partícula determina el área de contacto que tiene el ácido con el material
lignocelulósico. Cuando el tamaño de partícula es inferior a 1,4 mm se obtuvo un
incremento del 20% en obtención de azúcares (Banerji et al., 2013), comparado con los
azúcares reductores obtenidos si el tamaño de partícula es de 1,4 mm. El tamaño de
partícula del material afecta notablemente la porosidad del mismo lo cual se convierte en
causa anterior a la maximización del contacto entre ácido y material, facilitando así el
proceso de degradación y su posterior conversión en azúcares fermentables (Kristiani
et al., 2013). Se especifica que para esta investigación se fijó el tamaño de partícula entre
1 y 3 mm y a partir de aquí hallaron los valores óptimos de las variables anteriores.
1.3 Formación de inhibidores
La hidrólisis ácida es capaz de romper los enlaces que permiten tener estabilidad a la
celulosa y hemicelulosa; no obstante, los azúcares obtenidos pueden seguir siendo
degradados por el efecto del ácido y obtenerse así productos que inhiben el crecimiento
de microorganismos en etapas siguientes; estos inhibidores puedes ser ácidos débiles,
furanos y compuestos fenólicos (Loow et al., 2016). A partir de la hidrólisis de la
hemicelulosa se pueden obtener xilosa, manosa, ácido acético, galactosa y glucosa;
mientras que de la celulosa se obtiene glucosa. Si la xilosa y la glucosa se someten a altas
temperaturas se degradan a furfural y 5-hidroximetilfurfural, respectivamente (HMF).
Existen además otros inhibidores que pueden formarse a partir de la degradación de éstos
últimos como los ácidos fórmico o levulínico (Figura 1-6). Por su parte, compuestos
fenólicos pueden formarse por hidrólisis de la lignina (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b).
Figura 1-6. Productos y subproductos que se obtienen de la hidrólisis ácida de residuos

lignocelulósicos (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b).
1.3.1 Ácido acético

El ácido acético es un ácido débil que comercialmente es utilizado como conservante de
alimentos ya que impide el crecimiento celular de un amplio espectro de microorganismos
(Russell & Gould, 2012). Los ácidos débiles no disociados son liposolubles por lo que
pueden difundirse a través de la membrana plasmática. El efecto inhibitorio resulta como
producto de la entrada del ácido no disociado en el citosol, donde se disocia debido a que
el pH intracelular es neutro, lo que causa una disminución en el pH citosólico. Aunque a

concentraciones pequeñas, por debajo de 10 g/L, no causa muerte celular, sí causan
efecto de retardo o fase lag de crecimiento en levaduras fermentativas (Palmqvist & Hahn-
Hägerdal, 2000b; Mohammad et al., 1997). Además se ha observado que la viabilidad
disminuye debido a la existencia de un mayor gradiente de protones a través de la
membrana plasmática, lo que resulta en un aumento en la tasa de absorción pasiva de
protones (Verduyn et al., 1990). Si el incremento del pH es debido a la formación de ácidos
como levulínico se puede inhibir el proceso de la glicólisis en levaduras por el mismo
mecanismo que lo hace el ácido acético (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b).
El crecimiento de S. cerevisiae ha sido detectado a un pH tan bajo como 2,5 en ausencia

de ácido acético, para algunos tipos de fermentación; mientras que, en presencia de ácido
acético a 10 g/L, el pH mínimo para el crecimiento debe ser al menos de 4,5 (Mohammad
et al., 1997). Por otro lado, estos mismos investigadores pudieron comprobar que
concentraciones de ácido por debajo 100 mmol/L aumentan el rendimiento de etanol
comparado con hidrolizados libres de ácido acético.
1.3.2 5-Hidroximetilfurfural y 2-Furfural

El furfural es metabolizado por S. cerevisiae bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas o
cuando el oxígeno es limitado. Por ejemplo, durante la fermentación anaeróbica, el furfural
se reduce a alcohol furfuril (Taherzadeh et al., 1999), y puede potenciarse este efecto como
resultado de que la cepa haya sido previamente adaptada a un medio con concentraciones
conocidas de este inhibidor durante al menos 780 generaciones (Qureshi et al., 2015). En
condiciones aeróbicas, ocurre la oxidación de furfural a ácido furoico, un producto que
puede bajar el pH del medio y causar inhibición de crecimiento de microorganismos
(Taherzadeh et al., 1999).
En investigaciones previas, la reducción en la concentración de furfural se ha relacionado

con el incremento de la tasa de crecimiento celular específico de levaduras en cultivos tipo
batch (Boyer et al., 1992); aún más, se halló que a concentraciones mayores de 84 mmol/g
aumenta considerablemente la muerte celular (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b).
Se ha planteado que la inhibición causada por el furfural actúa sobre las enzimas alcohol
deshidrogenasa (ADH) y aldehído deshidrogenasa (AIDH), las cuales normalmente actúan
sobre el acetaldehído (Modig et al., 2002). Levaduras como S. cerevisiae tienen la
capacidad de hacer menos tóxico este compuesto, reduciéndolo a alcohol furfuril
empleando NADH como cofactor (Liu et al., 2005). Así pues, la enzima ADH cumple esta
nueva función en lugar de reducir el acetaldehído a etanol por vía glucolítica; como
consecuencia final disminuye la producción de etanol y explica además el incremento de
acetaldehído en algunos experimentos de fermentación cuando se añade furfural o
hidroximetilfurfural (Azhar et al., 1981).
Algunos autores han propuesto el glicerol como otro metabolito afectado por el furfural y
5-HMF y cuya función es mantener el equilibrio redox intracelular, produciendo NAD+ a
partir de NADH citosólico; demostraron que éste posee una mayor afinidad por la enzima
ADH (responsable de reducir el furfural a alcohol furfurílico) que por la enzima glicerol-
3-fosfato deshidrogenasa (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b; Taherzadeh et al.,
1999).
También se ha podido corroborar la síntesis de nuevas enzimas y coenzimas que ayudan

a la reducción del furfural bajo actividad anaeróbica, como en la investigación reportada
por Banerjee y colaboradores. Ellos lograron un incremento en el rendimiento de alcohol
del 78% después de 48 horas de fermentación cuando la concentración de furfural inicial
es inferior a los 2 g/L (Banerjee et al., 1981).
El efecto sobre el crecimiento celular por parte del 5-HMF ha sido reportado en menor
proporción debido a que la permeabilidad de la membrana causa una menor transferencia,
pero causa una fase lag más larga (Larsson et al., 1999). El principal producto del
metabolismo de este inhibidor es el alcohol 5-Hidroximetilfurufal. Taherzadeh y
colaboradores sugieren que sigue el mismo mecanismo de inhibición que el furfural
(Taherzadeh et al., 1999).
1.3.3 Compuestos fenólicos

Son los compuestos que poseen grupos fenol unidos a estructuras aromáticas o alifáticas.
Los tres grupos más importantes son los flavonoides, los ácidos fenólicos y los polifenoles.
Los compuestos fenólicos, metabolitos secundarios de plantas, actúan como fitoalexinas,

sustancias que son secretadas cuando la planta es herida para defenderse de ataques
fúngicos o bacterianos (Creus, 2004).
Se ha planteado el efecto inhibitorio de los compuestos fenólicos en fermentaciones de

hidrolizados de origen lignocelulósico, los de más bajo peso molecular son los más tóxicos
(Clark & Mackie, 1984). Los mecanismos por el cual inhiben el crecimiento de
microorganismos ha sido modelado usando medios sintéticos a base de ácido 4-
hidroxibenzoico por su abundancia en hidrolizados de madera joven (Jönsson et al., 1998),
con concentraciones muy superiores a las encontradas en hidrolizados, por lo cual no
existe unanimidad sobre el mecanismo de acción inhibitoria (Palmqvist & Hahn-Hägerdal,
2000b). Además se detectó la presencia de vainillina y catecol como otros constituyentes
del hidrolizado (Ando et al., 1986). Se ha reportado además una disminución del 30% en
el rendimiento de etanol cuando se tiene una concentración de 1g/L de ácido
hidroxibenzoico, mientras que con la misma concentración de vainillina hay una inhibición
del 25%; para el catecol no se reportó inhibición de crecimiento de S. cerevisiae (Ando
et al., 1986; Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000b).
1.3.4 Otros ácidos

El crecimiento celular en los hidrolizados también está limitado por la concentración de
hidrogeniones producto de ácidos débiles disueltos en el mismo. En hidrolizados de origen
ácido se ha observado la disminución de la producción de biomasa, causada por la
presencia de ácidos débiles no disociados como ácido fórmico y ácido levulínico que por
su naturaleza lipofílica tienen la capacidad de atravesar la membrana plasmática; éstos se
disocian debido al pH neutro del citoplasma y disminuyen el pH intracelular; esta caída en
el pH se neutraliza por la acción de la ATPasa de la membrana plasmática, que bombea
protones fuera de la célula mediante la hidrólisis de ATP; en condiciones anaerobias la
capacidad de obtención de ATP disminuye y con ello la capacidad de bombeo de protones
lo que conlleva a la inhibición de la replicación celular (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000c).
1.4 Detoxificación del hidrolizado

Es bien conocido que los hidrolizados lignocelulósicos poseen compuestos inhibitorios del
crecimiento microbiano, los cuales se forman durante los pretratamientos a altas
temperaturas y pH bajos. Estos inhibidores incluyen furanos aldehídos, como furfural y 5-
hidroximetil-furfural, ácidos alifáticos, como ácido acético, y compuestos fenólicos
(Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000a).
Varios métodos químicos, físicos y biológicos han sido empleados para detoxificar estos
hidrolizados. Entre los químicos se incluyen los tratamientos alcalinos usando NaOH o
Ca(OH)2, conocidos como overliming, o el uso de agentes reductores como sulfito de sodio,
que causan una desestabilización de los inhibidores los cuales terminan precipitándose en
forma de sal. No se necesita el uso de equipos sofisticados, sólo de agitación rotatoria;
debido a esto y sumado a su bajo costo el uso de estos tratamientos se ha extendido
(Riaño et al., 2010).
También existen métodos físicos capaces de captar los inhibidores o adsorberlos como el
uso de carbón activado o de membranas, aunque estas últimas son más costosas y menos
masificadas. El primero es un mineral de amplio uso comercial y de relativo bajo precio en
el mercado, pero en ocasiones su uso se ha visto limitado, pues el mineral no es selectivo
y adsorbe inclusive cantidades altas de azúcares reductores (Riaño et al., 2010).
Por último, los métodos biológicos tienen que ver con el uso de enzimas (lacasas y
peroxidasas). Se fundamentan en el uso de microorganismos productores de dichas
enzimas o su empleo en forma aislada, las cuales actúan sobre los inhibidores
transformándolos en otros compuestos que pierden su efecto sobre el crecimiento celular.
Entre las enzimas más utilizadas están las peroxidasas las cuales son capaces de
transformar los fenoles y aminas aromáticas en compuestos incapaces de inhibir el
crecimiento de los microorganismos; entre éstas se incluyen la lignina peroxidasa (LiP) y
la manganeso peroxidasa (MnP) (Jönsson et al., 2013) las cuales son producidas
principalmente por microorganismos de tipo fúngico (Hamid & Rehman, 2009), entre los
que se encuentra Coniochaeta ligniaria utilizada para detoxificar hidrolizado ácido diluido
de material lignocelulósico de maíz (Nichols et al., 2008). El principal inconveniente es su
alto costo debido al uso de microorganismos, los cuales no producen estas enzimas en
grandes cantidades. De los tres tipos de detoxificación esta técnica ha sido la menos usada
pero uno de las más efectivas por su alta especificidad al no disminuir la concentración de
azúcares (Riaño et al., 2010).
1.4.1 Overliming
Es un proceso que consiste en adicionar hidróxidos hasta llegar a un pH de 10; a estas
condiciones los inhibidores no son estables y forman precipitados los cuales pierden su
toxicidad o son retirados por decantación o centrifugación antes de iniciar la fermentación.
Luego el pH se ajusta con ácido sulfúrico (H2SO4) hasta un pH óptimo que permita el
crecimiento celular (Cantarella et al., 2004). También puede ser realizado a altas
temperaturas y variando el tiempo de exposición (Hodge et al., 2009). Este método se ha
reportado como capaz de reducir concentraciones altas de ácido acético y compuestos
fenólicos; sin embargo, también se relaciona con una disminución de hasta 30% de
azúcares reductores (Hodge et al., 2009). Entre los hidróxidos más utilizados están el
hidróxido de calcio Ca(OH)2 por su efectividad y el hidróxido de sodio NaOH por su bajo
costo (Coz et al., 2016).
El overliming no ha sido capaz de remover ácidos alifáticos completamente, en parte

debido a que este tratamiento induce la degradación alcalina de los azúcares
convirtiéndolos en inhibidores, mientras que a compuestos fenólicos es capaz de
removerlos hasta en 28%, sin dejar de apuntar que demuestra una disminución de 35-
45% en la concentración de furanos (Guo et al., 2013).
1.4.2 Carbón activado

En este tipo de métodos no se involucra una reacción química, sino que se aprovechan
propiedades del compuesto para separarlos como el tamaño de la molécula, su carácter
iónico o su afinidad por el agua; su efectividad varía de acuerdo con el hidrolizado donde
es usado (Hodge et al., 2009).
El uso de carbón activado para adsorber los inhibidores es un procedimiento usado

comercialmente para mejoramiento de sirope obtenido a partir de maíz y así ser utilizado
como fuente de carbono para producción industrial de biomasa por Gluconacetobacter
xylinus, adsorbiendo principalmente furano aldehídos, disminuyendo su concentración

hasta en un 94%, compuestos fenólicos hasta un 88% y ácido acético en un 28% (Guo
et al., 2013). En otras investigaciones, como la de Hodge, si bien no se pudo logar las
mismas cantidades de remoción, se pudo adecuar el hidrolizado ácido de madera joven
para una fermentación con E. coli para producir ácido succínico (Hodge et al., 2009).
El uso de carbón activado está ampliamente generalizado porque, además de su bajo

costo, existen métodos para regenerarlo, siempre y cuando la reacción de adsorción no
sea con compuestos aromáticos ya que ésta es irreversible (Grant & King, 1990). Sin
embargo su uso sigue en auge porque ya existen métodos para su fácil obtención y es un
subproducto de la conversión termoquímica de biomasa por pirólisis (Dąbrowski et al.,
2005).
1.4.3 Combinación de overliming y carbón activado

Se suelen realizar combinaciones de tratamientos para realizar una detoxificación que
combine las ventajas de varios métodos y obtener una detoxificación más eficiente,
mostrando mejores resultados que si se los evalúa de manera individual (Guo et al., 2013).
En algunos casos inclusive el efecto es sinérgico. En otras investigaciones se ha
demostrado que el uso combinado de overliming y carbón activado conlleva a una
disminución de azúcares fermentables ya que éstos son inestables a pH tan básicos y la
otra parte de las que quedan son adsorbidas por el carbón activado (Hodge et al., 2009).
1.5 Fermentación alcohólica de hidrolizados

Las levaduras son organismos unicelulares que se han clasificado en el reino fungi al cual
pertenecen los Ascomicetos y los Basidiomicetos (Uribe, 2007). Estos últimos son hongos
que producen basiodiosporas, esporas sexuales que se encuentran externamente en una
estructura llamada basidio. Las esporas son dispersadas en el aire por el hongo durante
períodos de gran humedad. Los Ascomicetos, como S. cerevisiae, se caracterizan por
producir esporas sexuales en sacos o ascos (Campbell & Reece, 2007).
Varias especies del género Saccharomycess se han implementado en la producción de

bebidas alcohólicas. S cerevisiae posee formas variadas: esférica, elipsoidal, cilíndrica o
alargadas, agrupadas en dos células, cadenas cortas o racimos o bien sin agruparse. La
apariencia de las colonias también es diversa, de color crema o ligeramente café, lisas o
rugosas, brillantes u opacas; esporulan formando de una a cuatro ascoesporas de forma
redonda o ligeramente elipsoidal (Garibay et al., 1993).
En S. cerevisiae, al igual que otros organismos heterotróficos, la oxidación de moléculas

orgánicas permite la obtención de ATP que posteriormente es utilizado en las vías
anabólicas para obtener moléculas vitales. Las fuentes de carbono principalmente
utilizadas son monosacáridos, como glucosa, fructosa, galactosa o manosa, y disacáridos
como maltosa o sacarosa (Rosa & Peter, 2006).
Una de las vías metabólicas por la que son catabolizados estos compuestos es la glicólisis
que utiliza como sustrato inicial la glucosa, que una vez ingresa a la célula es convertida a
piruvato por reacciones enzimáticas consecutivas. La obtención de metabolitos a partir del
piruvato depende de las concentraciones de oxígeno del medio. Cuando el oxígeno está
presente se denomina glucólisis aerobia; en estas condiciones el piruvato se convierte en
dióxido de carbono y agua; en ausencia de oxígeno ocurre glucólisis anaerobia y a partir
de piruvato se obtiene etanol y dióxido de carbono. (Baynes, 2015).
En la Figura 1-7 se describe el proceso de fermentación; la glucosa se convierte en

glucosa-6-fosfato, por la actividad catalítica de la hexocinasa, que a su vez es transformada
por la fosfoglucosa isomerasa a fructosa-6-fosfato, la cual es sustrato de la
fosfofructocinasa-1 que la convierte en fructosa-1,6 bisfosfato que es escindida a
dihidroxicetona fosfofato y gliceraldehído-3-fosfato por la aldolasa. Tras sufrir varias
reacciones enzimáticas de gliceraldehído-3-fosfato se obtiene fosfoenolpiruvato, que
finalmente produce piruvato en una reacción catalizada por la piruvatocinasa; este
metabolito en condiciones anaerobias se convierte en acetaldehído por la piruvato
descarboxilasa, y luego es reducido a etanol por la alcohol deshidrogenasa (Baynes,
2015).
Se ha demostrado que S. cerevisiae es una de las levaduras de mayor capacidad para

convertir azúcares de 6 carbonos, como glucosa y manosa, en etanol. También se ha
evaluado tal capacidad en hidrolizados lignocelulósicos por ser tolerante a concentraciones
altas de inhibidores como furfural y 5HMF. (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000a). En
investigaciones previas de Purwadi y colaboradores, se encontró que con S. cerevisiae

después de 48 horas de fermentación se pueden alcanzar concentraciones de etanol de
hasta 18 g/L a partir de hidrolizado ácido producto de material lignocelulósico de Abeto, un
árbol de la familia de la pináceas (Purwadi, 2004). Olsson & Hahn-Hägerdal evaluaron el
mismo microorganismo en hidrolizados enzimáticos de arbustos Salix caprea y obtuvieron
una concentración de etanol de 10,7 g/L al cabo de una semana (Olsson & Hahn-Hägerdal,
1993).
Figura 1-7. Representación esquemática de la fermentación 1:Hexocinasa; 2:fosfoglucosa

isomerasa; 3:Fosfofructocinasa-1; 4:Aldolasa; 5:Piruvatocinasa; 6:piruvato descarboxilasa;
7:Alcohol deshidrogenasa (Escalante et al., 2011).
2. Materiales y Métodos
2.1 Material lignocelulósico

El bagazo de maíz se obtuvo de una finca mixta del Municipio de Sonsón, el cual está
ubicado en el suroriente de Antioquia (Colombia) sobre la Cordillera Central a unos 2475
msnm. Con una extensión de 1323 km² abarca todos los pisos térmicos, llegando a la
región del Magdalena Medio por el Este y a la ribera del río Cauca por el Oeste.
Anualmente, en la segunda semana de agosto se celebra la Fiesta del Maíz, manifestación
cultural y de tributo al cereal, que reconoce su presencia económica y sociocultural en el
municipio (“Alcaldia de Sonsón - Antioquia”, 2016).
Figura 2-1 Ubicación Geográfica y Relieve del Municipio de Sonsón en Antioquia (IGAC,
2016).
2.1.1 Tratamiento material lignocelulósico

El bagazo de maíz fue secado en horno a 65ºC durante 48 horas reduciendo el contenido
de agua a valores por debajo del 1%. Luego fue procesado en un molino de martillos hasta
reducir su tamaño a 1-3 mm y se tamizó a tamaño de partícula 2,00 mm ± 0,18 mm;
finalmente se sometió nuevamente a secado durante 12 horas.
2.1.2 Análisis de componentes estructurales

La caracterización de la biomasa se llevó a cabo siguiendo el procedimiento del
Laboratorio Nacional de Energía Renovable (NREL) sobre determinación de carbohidratos
estructurales y lignina en biomasa NREL/TP-510-42618 (NREL, 2008). El análisis del
material se realizó en el laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Minas, de la
Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín.
2.2 Hidrólisis con ácido diluido

Para el tratamiento con ácido diluido se tomaron 100 mL de ácido con concentraciones del
2, 4 y 6% v/v; la carga del sólido se varió en 10, 20 y 30%, es decir, un 20% de solido
significa que por cada 20 g de material lignocelulósico se utilizaron 80 mL de ácido diluido.
En un Erlenmeyer de 250 mL se hizo reaccionar la mezcla en el autoclave a 121°C durante
0.5, 1 y 1.5 horas. Los reactivos empleados en la hidrólisis así como el ácido sulfúrico
(H2SO4) fueron Sigma-Aldrich. El residuo sólido se separó por filtración y a la fase líquida
o hidrolizado se le midieron los azúcares reductores por el método DNS (Miller, 1959) y
glucosa por HPLC.
2.2.1 Optimización de hidrólisis ácida

La obtención de azúcares reductores a partir del material lignocelulósico de maíz se llevó
a cabo por hidrólisis con ácido sulfúrico (H2SO4) diluido en tres niveles; de igual forma, se
varió la carga del solido y el tiempo en tres niveles (Tabla 2). Los valores fueron
determinados de acuerdo con la revisión bibliográfica sobre hidrólisis ácida diluida
teniendo en cuenta los valores máximos y mínimos en cada investigación (Banerji et al.,
2013; Esteghlalian et al., 1997; Kristiani et al., 2013; Lee & Jeffries, 2011; Liu et al., 2012;
Lloyd & Wyman, 2005; Loow et al., 2016; Rodrıg
́ uez et al., 2004; Tucker et al., 2003).
Tabla 2. Rangos de las tres variables independientes usadas en el modelo de Box-

Behnken.
Niveles
Factor Nombre Rango
(-) (0) (+)
Cácido Concentración Ácido (% v/v) 2-6 2 4 6
Scarga Carga de Solido (% p/v) 10-30 10 20 30
thidrólisis Tiempo de Hidrólisis (min) 30-90 30 60 90
El modelo de Box-Behnken es utilizado para obtención de condiciones óptimas realizando

un número de experimentos menor al de diseños factoriales; este diseño es multifactorial
de superficie de respuesta y es una herramienta estadística con la que se determina la
influencia que pueden tener las variables independientes (Cacido, Scarga, thidrólisis) sobre una
variable respuesta, en este caso, concentración de azúcares reductores. Esta metodología
permite llegar a la ecuación que genera una superficie de respuesta y con el máximo
resultante alcanzar los valores de las condiciones óptimas (Box et al., 2008). El número de
experimentos que el modelo necesita para predecir el comportamiento son 15 corridas;
para esta investigación, cada corrida se realizó por triplicado (ver Tabla 3). Así, el método
de superficie de respuesta por Box Behnken fue usado para obtener el diseño de
experimentos, el cual se corrió en el software Statgraphic Centurion XVI.
Después de haber realizado las corridas se ingresaron los datos al diseño planteado en
Statgraphic Centurion XVI y se obtuvieron los valores F y p para su análisis estadístico.

el diseño de Box-Behnken.
Azúcares
Reductores
Corrida Cácido Scarga thidrólisis Estimados (g/L)
1 2 10 60 79.5
2 6 10 60 70.1
3 2 30 60 93.9
4 6 30 60 135.5
5 2 20 30 88.1
6 6 20 30 117.0
7 2 20 90 81.4
8 6 20 90 84.7
9 4 10 30 60.0
10 4 30 30 81.2
11 4 10 90 21.7
12 4 30 90 80.5
13 4 20 60 69.4
14 4 20 60 69.4
15 4 20 60 69.4
2.2.2 Cinética de hidrólisis ácida

El estudio de la cinética de la hidrólisis ácida se realizó con las condiciones óptimas
obtenidas, del modelo de Box Behnken, en matraces de 100 mL utilizando el 30% de su
volumen; se hicieron mediciones de la concentración de azúcares por el método DNS a
intervalos de 15 min, y para cada uno se montó un experimento independiente.
2.3 Preparación de reactivos
2.3.1 Preparación del reactivo ácido 3,5 dinitrosalicílico en

caliente
Se pesaron 2 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico junto con 60 g de tartrato de Na-K y 3,2 g de
NaOH. Se disolvió el NaOH en 80 mL de agua y al tiempo se añadió el tartrato de Na-K
mezclando en plancha térmica con agitación por uso de magneto. Se agregaron 80 ml de
agua adicional y se comenzó a añadir lentamente el ácido 3,5 dinitrosalicílico. Se mantuvo
en agitación 20 min a una temperatura de 80°C y se completó con agua hasta llegar a los
200 mL, finalmente se filtró. Se dejó enfriar a temperatura ambiente y se envasó en
recipiente ámbar para mantenerse refrigerado (Miller, 1959).
Los azúcares reductores poseen un grupo carbonilo libre formando otro hemiacetal que le
confiere la característica de poder reaccionar con otros compuestos. El DNS, ácido
dinitrosalicílico, tiene la capacidad de oxidar los azúcares reductores mostrando un
comportamiento diferencial entre mono y disacáridos, dando un cambio de coloración
detectable a 540 nm. La disolución alcalina de azúcar se hidroliza produciendo un
compuesto por reducción del grupo nitro del DNS para dar el producto monoamino
correspondiente, dando tonalidad amarilla oscura (Nielsen, 2010).
Figura 2-2 Reacción de reducción del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Southgate, 1991)
2.4 Detoxificación con carbón activado

El hidrolizado obtenido bajo las condiciones óptimas para una mayor obtención de glucosa,
se coloca en un Erlenmeyer de 500 mL; se colocaron 200 mL del hidrolizado filtrado para
retirar trazos de lignina. Al hidrolizado se le agrega carbón activado previamente molido
hasta una concentración de 2,5 % (p/v), luego se colocó en agitación a 200 rpm durante
60 minutos a 25°C. Luego se filtra en papel filtro para retirar el carbón activado, para luego
ser centrifugado a 4000 rpm para retirar residuos del carbón; se toma el sobrenadante y
se ajusta el pH a 5,5 con hidróxido de sodio 3,0 N y finalmente se esteriliza.
2.5 Detoxificación por overliming

El hidrolizado obtenido se coloca en un matraz, sin ocupar más del 40% del volumen del
mismo, se adiciona hidróxido de sodio NaOH en perlas hasta ajustar su pH a 10. Se deja
en reposo durante 60 minutos. Luego se centrifuga el medio durante 25 minutos, a 4000
rpm y temperatura ambiente, se toma el sobrenadante y se ajusta el pH a 5,5 con ácido
sulfúrico al 96%, se deja reposar por 60 minutos y luego se centrifuga de nuevo durante
15 minutos a 4000 rpm. Finalmente se esteriliza en autoclave durante 20 minutos y 15 psi
de presión.
2.6 Tratamiento de carbón activado + overliming

Se realizó el tratamiento por overliming siguiendo el protocolo en 4.3, luego se continuó
realizando el tratamiento con carbón activado como se muestra en 4.2, para finalmente
esterilizarlo durante 15 minutos a 121°C y 15 psi en autoclave.
2.7 Medición de inhibidores
2.7.1 Evaluación de concentración de ácido acético y HMF

La concentración de los inhibidores en el hidrolizado lignocelulósico fue determinada por
HPLC usando un cromatógrafo Shimatzu con una columna Aminex HPX-87H (Biorad,
Hercules, California) a 65°C. Se utilizó ácido sulfúrico 5mM ultra puro como fase móvil a
una tasa de flujo de 0,6 mL/min. Todos los inhibidores fueron detectados con un detector
de índice de refracción UV a 210 nm.
2.7.2 Evaluación de fenólicos totales

Para medir compuestos fenólicos se utilizó el método Folin-Ciocalteu. Se tomaron 2 mL de
la muestra y se incubaron con 2.5 mL del reactivo de Folin, previamente preparado al 10
%v/v en una solución metanol-agua, 1:1. Luego de 2 minutos se agregaron 2 mL de
Na2CO3 al 7.5 %v/v y se colocó en baño María a 38°C durante 15 minutos; posteriormente
se mide la absorbancia a 765 nm (Keskin-Sasic et al., 2012).
2.8 Fermentación con Saccharomycces cerevisiae
2.8.1 Preparación medio YPG líquido

Para preparar 1 litro de medio, se agregan 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona
y 50 g glucosa a 1 L de agua destilada. Se agita durante 10 minutos hasta que se disuelvan
todos los componentes a temperatura ambiente.
2.8.2 Preparación medio YPG sólido

Si se requiere el medio sólido se pesan 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, y
50 g de glucosa y, se disuelve en 1 L de agua; se agrega un agente solidificante (agar-
agar), se calienta el preparado sin dejar ebullir con agitación constante y hasta asegurar
una completa disolución del agar, luego se esteriliza la solución durante 20 min en
autoclave, finalmente se sirven 20 mL aprox. en cajas de Petri de 15 cm y luego de 10
minutos se almacena a 4°C.
2.8.3 Obtención del inóculo

Se pesó 1 g de levadura comercial Levapan® y se disolvió en 20 mL de medio líquido YPG.
Se mezcló en matraz de 100 mL durante 15 minutos calentándolo a 37°C hasta observar
burbujas en la superficie. Luego se inoculó en las cajas de Petri 100 µL de esta solución y
con un rastrillo se esparció, se selló la caja de Petri con vinilpel y se dejó en incubadora a
30°C durante un día; luego se observaron formación de colonias que presenten color beige
característico de esta levadura; a continuación de manera estéril y tomando dos asadas
se inocularon en 20 mL de medio liquido YPD estéril y se mantuvo en agitador a 100 rpm,
cambiando de medio cada tres días, y se mantuvo este inóculo como un stock para
fermentaciones subsiguientes.
2.8.4 Adaptación de S. cerevisiae al hidrolizado

El proceso de adaptación se realizó de manera gradual, utilizando inicialmente medio YPD
al 100% para después de 24 horas ir incrementando la concentración del hidrolizado en
10%, sucesivamente hasta llegar a un medio de 100% de hidrolizado (Tabla 4)

hidrolizado
Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
YPD (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Hidrolizado (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
2.8.5 Fermentación del hidrolizado

La concentración del inóculo se midió por el método de peso seco relacionándolo con la
absorbancia a 540 nm. La curva obtenida se muestran en el Anexo A. Se tomaron 20 mL
del hidrolizado en un Erlenmeyer de 100 mL. De antemano con 100 µL del inóculo
adaptado se mide su absorbancia y con la relación lineal se determina la concentración de
biomasa y así realizar los cálculos respectivos para conocer cuánto inóculo habría que
agregar al hidrolizado tratado para iniciar con la concentración deseada de biomasa. Se
realizó este mismo proceso en 12 matraces más por duplicado, los cuales se colocaron en
el agitador a 25°C, y cada 2 horas se toma un matraz al azar para medir biomasa por peso
seco y se guardan 5 mL del hidrolizado para posteriores mediciones de azúcares
reductores, glucosa y etanol.
2.8.6 Evaluación de concentración de etanol en los hidrolizados

La evaluación de la producción de etanol se llevó a cabo mediante cuantificación por
HPLC, con una columna de separación Biorad Aminex HPX-87H, de 300 x 7.8 mm en un
equipo Shimatzu; las condiciones de la columna fueron: una fase móvil de 5 mM de ácido
sulfúrico, una tasa de inyección de 0,60 mL/min, a 35°C. El equipo tenía incorporado un
sistema de detección IR, UV 210 nm (Biorad Laboratories Inc, 2001).
3. Resultados y Discusión
3.1 Análisis de Componentes Estructurales

Los resultados del análisis del material que se realizó de acuerdo con la norma NREL/TP-
510-42618, se muestran en la Tabla 5, en esta parte solo se muestran los componentes
estructurales el resto de componentes se encuentran consignados en el Anexo B.
Tabla 5. Análisis de muestra de bagazo de maíz
Componente Valor (%) Desviación Estándar
Celulosa 26,52 1.432
Hemicelulosa 42.89 0.755
Lignina Insoluble 30,59 1.280
La Tabla 5 muestra que el contenido de hemicelulosa es superior al de celulosa, propio de

una planta joven, más específicamente de 122 días de edad que tenía el ejemplar. El
contenido de la hemicelulosa disminuye a medida que la planta crece, pues parte de los
glúcidos van a los granos en forma de almidón y una menor proporción pasa a constituir la
pared celular (Treviño et al., 1980). Estos datos concuerdan con los reportados por varios
autores como se observa en la Figura 3-1 y en la Tabla 1. Las pequeñas diferencias se
deben al periodo de corte de la planta; los autores analizaron plantas en varios estados de
madurez.
Esto resultado muestra que el bagazo de tallo de maíz puede ser utilizado no sólo para
producción de bioetanol, vía fermentación de la glucosa, sino también para la producción
de metabolitos de mayor valor agregado como el xilitol por fermentación de las pentosas
obtenidas a partir de la hidrólisis de fracción hemicelulósica, dentro de una estrategia de
biorrefinería.
Figura 3-1. Concentración de Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en bagazo de maíz

reportada por diferentes autores.
100
Contenido en Porcentaje (%)
90
80
70
60
50
40
30 Lignina
20
Celulosa
10
0 Hemicelulosa
3.2 Hidrólisis con ácido diluido
3.2.1 Optimización de Hidrólisis Ácida

La obtención de azúcares reductores a partir del material lignocelulósico de maíz se llevó
a cabo por hidrólisis con ácido sulfúrico (H2SO4) diluido en tres niveles; de igual forma, se
varió la carga del solido y el tiempo en tres niveles (Tabla 2). Así, el método de superficie
de respuesta por Box Behnken fue usado para obtener el diseño de experimentos, el cual
se corrió en el software Statgraphic Centurion XVI. La concentración de azúcares
reductores (variable respuesta) para cada caso se muestra en la Tabla 6.

el diseño de Box-Behnken.
Cácido Scarga thidrólisis Azúcares Reductores (g/L)

Corrida
(%v/v) (%p/v) (min) Observado Estimado
1 2 10 60 71.1 77,95
2 6 10 60 60.1 69,02
3 2 30 60 97,8 88,88
4 6 30 60 139,6 132,75
5 2 20 30 87,5 85,16
6 6 20 30 121.7 117.28
7 2 20 90 76.8 81,21
8 6 20 90 81.7 84,03
9 4 10 30 65.4 60,88
10 4 30 30 68.1 79,36
11 4 10 90 34.7 23,43
12 4 30 90 75.1 79,61
13 4 20 60 68,3 68,33
14 4 20 60 63,6 68,33
15 4 20 60 73,1 68,33
Después de haber realizado las corridas se ingresaron los datos al diseño planteado en
Statgraphic Centurion XVI y se obtuvieron los valores F y p, como se observa en la Tabla
77. El valor p para la carga del solido es inferior a 0,05 lo que indica que este factor es
altamente significativo sobre la variable respuesta, mientras que el tiempo y la
concentración del ácido se consideran no significativos, dentro del rango ensayado, con
una probabilidad del 95%.
Tabla 7. Datos resumidos de análisis de varianza (ANOVA) de los modelos empíricos

obtenidos para el rendimiento de azúcares reductores.
Fuente Razón-F Valor-p
A:Concentración Ácido (%v/v) 4,75 0,0811
B:Carga de Solido (%p/v) 21,68 0,0056
C:Tiempo (min) 5,38 0,068
AA 21,66 0,0056
AB 5,42 0,0637
AC 1,67 0,2528
BB 0,38 0,5641
BC 2,76 0,1572
CC 0,43 0,5412
Si se grafican los datos observados con los datos estimados por el modelo, deberían
mostrar una tendencia lineal si el método es capaz de modelar el comportamiento. En la
¡Error! La autoreferencia al marcador no es válida., se muestran los puntos obtenidos
en la experimentación, se le asignaron colores oscuros a los puntos mas lejanos del
modelo y colores claros a los que el modelo es capaz de predecir con mayor exactitud
además se observa que efectivamente existe una tendencia lineal (R2=0,93) por lo tanto
se puede concluir que el modelo escogido si es capaz de modelar y predecir la
concentración de azucares reductores en función de la concentración del acido, carga del
solido y tiempo de residencia
Figura 3-2. Gráfica de los valores observados vs. valores estimados por el modelo de Box-
Behnken.
140
120
100
CAR Estimados
80
60
R2=0,9315
40
20
20 40 60 80 100 120 140
CAR Observados
3.2.2 Superficies de Respuesta

En las superficies de respuesta logradas con Statgraphics Centurion XVI se utilizaron
colores oscuros para indicar las regiones que encerraban las condiciones óptimas de
mayor obtención de azúcares reductores (Figura 3-3).
La Figura 3-3A muestra que cuando se usó una carga de solido de 10% (p/v) la
concentración de azúcares aumentó hasta los 45 minutos; a partir de aquí se redujo en un
60% con respecto a su máxima cantidad alcanzada. Esto se debió a que la baja carga del
solido en relación con el ácido, permite que el ácido hidrolizara los azúcares hasta
convertirlos en inhibidores, algo que logró fácilmente ayudado por las altas temperaturas
(Alvira et al., 2010; Palmqvist & Hahn, 2000a). En el gráfico de una carga de solido del
30% (Figura 3-3C), a medida que pasó el tiempo el comportamiento fue creciente y la
pendiente que mostraba la disminución de azúcares después de los 45 minutos no se
acentuó, indicando que los azúcares no se encontraban tan expuestos al ácido lo que
reducía su conversión a inhibidores (Heredia et al., 2012).
Figura 3-3. Superficies de Respuesta obtenidas bajo el modelo de Box-Behnken de

Azúcares Reductores (g/L) a diferentes cargas de sólido. A. 10% p/v; B. 20% p/v; C. 30%
p/v.
A.
B.
C.
El mayor aporte de azúcares reductores lo hizo la hemicelulosa, con el 42% de presencia

en el material lignocelulósico frente al 26,5% de celulosa (véase Tabla 5) y que al ser
hidrolizada contribuyó con gran cantidad de pentosas que probablemente sean y un
porcentaje menor de glucosa. La concentración de otros azucares reducidos presentes
puede estimular futuros proyectos sobre utilización de este azúcar como sustrato, su
presencia en el hidrolizado se basa en la alta proporción de hemicelulosa en el bagazo de
maíz, generando un valor económico adicional a dicho hidrolizado (Loow et al., 2016).
En cuanto al ácido sulfúrico, los datos más altos de azúcares se dieron con los niveles más
concentrados del ácido, resultado que concuerda con una igualmente alta concentración
de reactivo, tornando una reacción favorecida hacia los productos. Sin embargo, tales
concentraciones de ácido pueden producir inhibidores de crecimiento para levaduras,
como ácido acético y furfural; que mas adelante en esta investigación se cuantificaran y se
trataran, si el objetivo final es fermentar los azúcares este sería un limitante (Cuzens &
Miller, 1997; Kumar et al., 2015).
La correlación matemática que representa el modelo de respuesta considerando todos los

términos lineales, cuadráticos y los términos de interacción lineal-lineal es
Ecuación 1
𝑌 = 𝛽0 + ∑ 𝛽𝑖 𝑥𝑖 + ∑ 𝛽𝑖𝑖 𝑥𝑖𝑖 2 + ∑ 𝛽𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 + 𝜖
Donde 𝛽0 es el término compensatorio; 𝛽𝑖 es el término dependiente o el efecto lineal del

factor de entrada 𝑥𝑖 , 𝛽𝑖𝑗 es el efecto de interacción lineal entre el factor de
entrada 𝑥𝑖 y 𝑥𝑗 . La ecuación obtenida es la siguiente:
Ecuación 2
𝑔
𝐶𝐴𝑅 ( 𝐿 ) = 173,1 − 56,4𝐶𝐴𝐶 − 1,20𝐶𝑆𝑈𝑆 + 0,066𝑡 + 6,86𝐶𝐴𝐶 2 − 0,66𝐶𝐴𝐶 𝐶𝑆𝑈𝑆 −
0,1221𝐶𝐴𝐶 𝑡 − 0,0364𝐶𝑆𝑈𝑆 2 + 0,0314𝐶𝑆𝑈𝑆 𝑡 − 0,00043𝑡 2
Donde CAR es la concentración de Azúcares Reductores (g/L), CAC es concentración del

ácido (%v/v), Csus es carga del solido (%p/v) y t es tiempo.
El coeficiente de determinación R2 para la concentración de azúcares reductores en

función de las tres variables fue de 0.9315, así pues con la correlación lineal hallada
(Ecuación 2), se puede explicar el 93,15% de la variabilidad en Azucares Reductores
obtenidas por hidrolisis acida de tallos de maíz.
En la Figura 3-4 se muestra la influencia que tuvieron las variables independientes sobre
la variable respuesta. Con una significancia de 0,05 se pudo concluir que la carga de solido
es la variable que contribuyó de manera positiva y significativa, es decir, que entre mayor
carga de solido se utilice mayor será la concentración de azúcares reductores. Mientras la
variable tiempo a medida que crecía tenía efecto negativo sobre la variable respuesta; no
obstante, puede asegurarse, con una confianza del 95%, que no es una variable
significativa. Banerji y colaboradores realizaron un experimento por diseño factorial 3 3
variando la temperatura, la concentración del ácido y el tamaño de partícula; la carga de
solido fue sorgo dulce y encontraron que la carga de solido y el tamaño de partícula eran
los factores determinantes (Banerji et al., 2013).
Figura 3-4. Diagrama de Pareto estandarizado para azúcares reductores

El tiempo resultó ser un factor no significativo sobre la producción de azúcares reductores;

esto no quiere decir que no influya del todo sino que bajo el índice de significancia de 0,05
no se evidencia el efecto, en pruebas realizadas con un nivel de confianza del 90% no
mostradas aquí se observó que los tres factores son significativos sobre la concentración
de azucares reductores. La explicación está dada por la presencia de los enlaces α y β
glucósidos de la hemicelulosa que forman una estructura amorfa, que a su vez impide la
transferencia de masa y no permiten una efectiva actuación del ácido sobre la fibra vegetal
(Banerji et al., 2013).
El valor p calculado para la influencia del tiempo sobre la variable respuesta fue mucho
mayor que 0,05; por lo que se consideró una variable no significativa pero que en
comparación con la concentración del ácido, influye más sobre la variable respuesta. En
estudios realizados por Lloyd y colaboradores, quienes realizaron un pretratamiento con
ácido diluido sobre bagazo de maíz, se encuentra que después de 45 minutos de reacción
la producción de azúcares reductores varía poco o nada (Lloyd & Wyman, 2005); mientras
que los valores más bajos se dieron cuando el tiempo de hidrólisis fue de 30 minutos, pues
de acuerdo con la cinética de la mayoría de hidrólisis ácidas obtenidas para materiales
lignocelulósicos, a los 30 min apenas inicia la fase creciente y el punto más alto se obtiene
cerca a los 60 min (Aguilar, 2010; El-Zawawy et al., 2011). Después de cumplido este
tiempo los azucares reductores son convertidos en inhibidores tanto por su degradación o
por la protonacion causada por la concentración de acido.
3.2.3 Condiciones óptimas para obtención de azúcares reductores

El modelo Box-Behken maximiza la correlación matemática anterior (Ecuación 2) y arroja
los valores de las condiciones óptimas para una mayor obtención de azúcares reductores
(Figura 3-5). De acuerdo con el modelo, la hidrólisis ácida a esas condiciones estima una
concentración de 132,8 g/L de azúcares reductores.
Figura 3-5. Superficie de respuesta estimada al tiempo óptimo de 40,89 min para azúcares
reductores.
Tabla 8. Respuesta óptima, condiciones a las cuales el modelo estima mayor obtención de
azúcares reductores.
Factor Bajo Alto Óptimo
Concentración Ácido (% p/p) 2,0 6,0 6,0
Carga Solido (% p/v) 10,0 30,0 30.0
Tiempo (min) 30,0 90,0 40,9
La Figura 3-5 muestra que para las condiciones 40,89 minutos, concentración de ácido del
6% v/v y carga de solido entre 10 y 30%, la carga del sólido fue directamente proporcional
a la cantidad de azúcares reductores, dado que el ácido tiene la posibilidad de romper
mayor número de enlaces debido a una mayor cercanía entre el ácido y el material
lignocelulósico.
El tiempo de residencia óptimo de 40,89 minutos está dentro del rango menor a 1 hora,
determinado en investigaciones previas de hidrólisis ácidas, lo cual evita la conversión de
azúcares a inhibidores, si la temperatura oscila entre los 120 y 210°C (Xu & Huang, 2014).
Para este trabajo se cumple para una temperatura de 121°C.
Los resultados son acordes con la cinética propuesta para la hidrólisis ácida y demostrada
por Aguilar y colaboradores, que recomienda detener la reacción cumplidos los 50 minutos,
punto en el que se entra a una fase estacionaria donde la obtención de azúcares no varía
pero la producción de inhibidores como furfural aumenta gracias a una mayor extensión en
el tiempo de contacto entre xilosa y/o glucosa con el ácido (Aguilar, 2010). Esta
investigación pretende demostrar además el potencial que se tiene en este hidrolizado el
cual, además de poseer cantidades de glucosa, en reportes de otros autores cuantifican
xilosa en este tipo de hidrolizados la cual puede ser fermentada y convertida en xilitol como
ya lo han realizado otros investigadores con otros residuos como cascarilla de arroz
(Villalba et al., 2009).
3.2.4 Cinética de Hidrólisis Ácida

La Figura 3-6 muestra que la máxima concentración de azúcares reductores (CAR), con
una concentración de ácido de 6%, se alcanza aproximadamente a los 40 minutos,
manteniéndose en torno a este valor hasta aproximadamente los 70 minutos, tiempo a
partir del cual empieza a disminuir debido a la degradación de los azúcares produciendo
HMF, furfural y ácido acético (Mosier et al., 2005). La prueba ANOVA simple aplicada a las
medias de la concentración de azúcares reductores de los dos puntos máximos da para
afirmar que, con una significancia de 0,05, no existe diferencia estadísticamente
significativa entre la media de las concentraciones a los 45 y a los 75 minutos, lo cual
corrobora el valor cercano hallado por el modelo de Box-Behken de 40,89 minutos.
Determinar este valor óptimo de tiempo de hidrólisis es importante con miras al escalado
del proceso, pues representa un importante ahorro energético frente a mantener un tiempo
de hidrólisis de 75 min.
Figura 3-6. Concentración de Azúcares Reductores en hidrólisis ácida (g/L) a una

concentración de H2SO4 6% v/v.
180
160
140
120
CAR(g/L)
100
80
60
40 y = 3,358x + 8,866
R² = 0,978
20
0
0 50 100
Tiempo (min)
Un parámetro importante de una reacción es su velocidad con respecto a la obtención del

producto; un esquema de la reacción de hidrólisis es:
k1
Biomasa Azúcares Reductores
La ecuación de velocidad de la reacción podría expresarse en forma general como una

reacción de orden α con respecto a la concentración de azúcares reductores. Asumiendo
que la reacción es de orden 1, la expresión cinética estaría dada por la Ecuación 3:
Ecuación 3.
𝑑𝐶𝐴𝑅
= 𝑘𝐶𝐴𝑅
𝑑𝑡
𝑑𝐶𝐴𝑅
= 𝑘𝑑𝑡
𝐶𝐴𝑅
𝑑𝐶𝐴𝑅
∫ = ∫ 𝑘𝑑𝑡
𝐶𝐴𝑅
𝐿𝑛(𝐶𝐴𝑅 − 𝐶𝐴𝑅𝑜 ) = 𝑘𝑡
𝐿𝑛(𝐶𝐴𝑅 ) = 𝑘𝑡 + 𝐿𝑛(𝐶𝐴𝑅𝑜 )
Donde CAR es la concentración de azúcares reductores, k es la constante de velocidad y t

es el tiempo de residencia. Un gráfico de Ln(CAR) vs. t correspondería a una línea recta en
los primeros 40 minutos del proceso y cuya pendiente sería k.
Figura 3-7. Gráfico de Ln(CAR) vs tiempo, para calcular k.

5,2
Ln (CAR) 4,8
4,6
4,4
y = 0,0307x + 3,7194
4,2 R² = 0,91
3,8
10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)
Tabla 9. Valores parámetros cinéticos calculados para concentración y carga de solido

óptima.
Carga del Solido Concentración Ácido k (min-1) R2
30 %p/v 6 %v/v 0,0307 0,91
Por su parte, Kumar y colaboradores, quienes realizaron un estudio cinético de la hidrólisis

ácida con bagazo de caña de azúcar, encontraron que durante los primeros 30 minutos el
ácido hacía contacto básicamente con las fibras externas del material, como la lignina que
al ser una estructura cristalina amorfa fuerte es difícil que se hidrolice, mientras que la
hemicelulosa, que rodea la celulosa la protege haciendo que la hidrólisis de celulosa en
glucosa inicie una vez transcurrido este tiempo (Kumar et al., 2015).
3.2.5 Cálculo de Parámetros de Severidad
Este factor facilita la comparación de un amplio rango de tratamientos donde variables

como temperatura, pH y tiempo de residencia determinan la obtención de azúcares
reductores (Pedersen & Meyer, 2010). Para comparar el efecto de temperatura y tiempo
se calculó el factor de severidad (R0) y para considerar el efecto del ácido se calculó el
factor de severidad combinada (CS), que fue definida como (Chum et al., 1988):
Ecuación 4. Ecuaciones para calcular factores de Severidad
𝑇 − 100
𝑅0 = 𝑡 ∙ 𝑒𝑥𝑝 ( )
14,75
𝐶𝑠 = 𝑙𝑜𝑔𝑅0 − 𝑝𝐻
Donde t es el tiempo de residencia (min), T es la temperatura de reacción (°C), 100 es la

temperatura de referencia, y el pH es el de la solución ácida antes de iniciar el proceso de
hidrólisis.
La Figura 3-8 representa el rendimiento de azúcares reductores como función del factor
de severidad combinado. Hubo un incremento de la CAR desde un Cs de 1.6; antes el
cambio no fue visible. Con una carga de solido del 10% la máxima concentración de
azúcares reductores es de 75 g/L; mientras que si se utiliza un 30% de carga de solido se
incrementa hasta en un 280% la obtención de azúcares reductores con respecto a la carga
de solido al 10 %p/v, indicando una fuerte dependencia de la carga del solido, mientras
que el tiempo de residencia contribuye de manera positiva en la obtención de azúcares;
resultados similares obtuvieron otros investigadores, quienes demostraron que factores de
severidad entre 1.9-2.7 fueron óptimos para una mayor CAR (hexosas y pentosas), mientras
que a valores por encima de 2,7 observaron una menor CAR, posiblemente por su
conversión a inhibidores como 5-HMF, y 2-Furfuraldehido (Dumitriu, 2004; Esteghlalian
et al., 1997; Liu et al., 2012).
Figura 3-8. Influencia del factor severidad sobre la concentración de azúcares reductores,
en una reacción de hidrólisis. Carga de Solido: 30 %p/v (■), 20 %p/v (▲), 10 %p/v (○).
160
140
Azucares Reductores (g/L) 120
100
80
60
40
20
0
0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 2,8
Severidad Combinada (Cs)
3.2.6 Medición de Glucosa bajo Hidrólisis Ácida

La pared celular del residuo de la planta de maíz que se está analizando está compuesta
por un 33% de celulosa, una estructura parcialmente cristalina y resistente, inclusive en
sus regiones amorfas, a ser hidrolizada para obtenerse unidades de glucosa (Ovando &
Waliszewski, 2005; Béguin & Aubert, 1994); esta última es la principal fuente de carbono
para microorganismos como S. cerevisiae para iniciar el proceso de glucólisis y finalmente
obtener bioetanol. Así, la medición de la concentración de glucosa obtenida permite
evaluar la efectividad de la hidrólisis ácida dirigida a formación de bioetanol bajo las
condiciones óptimas.
A pesar que la glucosa es capaz de resistir temperaturas moderadamente altas, 146°C, se

observa en los diagramas de superficies de respuesta mostrados en la Figura 3-9A, que
cuando se usa una carga de solido de 10%p/v, después de 50 minutos de hidrólisis, su
concentración disminuye. Algunos autores explican este hecho en que por la baja carga
del solido el ácido puede acceder a la estructura cristalina tempranamente, convirtiendo la
glucosa en inhibidores 5-hidroximetilfurfural (Palmqvist & Hahn, 2000b), así como también
ya lo habían demostrado Ulbritch y colaboradores quienes propusieron un mecanismo de
reacción (Figura 3-10) por el cual se explica que por un ataque nucleofílico la β-D-glucosa
puede degradarse a 5-HMF, para seguidamente convertirse en ácido levulínico y ácido
fórmico (Ulbricht et al., 1984).
Figura 3-9. Superficies de Respuesta obtenida bajo el modelo de Box-Behnken de

obtención de Glucosa (g/L) a diferentes cargas de solido. A. 10% p/v, B. 20% p/v, C. 30%
p/v.
A.
B.
C.
Figura 3-10. Formación de ácidos levulínico y fórmico durante hidrólisis ácida diluida.
En contraste con el comportamiento de la concentración del ácido, cuando se utilizó una

carga de solido de 10% se observa que la concentración de la glucosa aumenta conforme
la concentración del ácido sube, aunque la velocidad es menor comparada con la velocidad
de porcentaje de solido 30%, evidenciando en el primer caso el agotamiento del sustrato
(Heredia et al., 2012).
Las condiciones óptimas para una mayor concentración de azúcares reductores

determinan concentraciones altas de todos los productos de hidrólisis ácida como glucosa,
xilosa, arabinosa, etc. Se optó, entonces, por correr un diseño de Box-Behnken que fuera
destinado a obtención máxima sólo de glucosa, siendo esta última medida por HPLC; los
datos hallados se consignan en la Tabla 10. Los valores para la concentración del ácido y
la carga del solido fueron similares a los hallados para azúcares reductores; en cuanto al
tiempo, es necesario adicionar 3 minutos a la predicción hecha para azúcares reductores
y lograr, según el modelo, una concentración de 25,22 g/L de glucosa.
Tabla 10. Respuesta óptima, condiciones a las cuales el modelo estima una mayor
concentración de glucosa.
Factor Bajo Alto Óptimo
Concentración Ácido (% p/p) 2,0 6,0 6,0
Carga Solido (% p/v) 10,0 30,0 30.0
Tiempo (min) 30,0 90,0 52,0
Figura 3-11. Superficie de respuesta estimada al tiempo óptimo de 52,00 min, para glucosa
(g/L).
En la Figura 3-11 se observa que a los 52 minutos, el comportamiento de la carga del

solido vs concentración de glucosa se convierte en lineal, indicando que en este tiempo,
entre mayor sea la carga del solido mayor es la obtención de glucosa; por otro lado la
concentración de ácido es una variable que afecta poco o casi nada a la concentración de
glucosa, cuando el tiempo es cercano a los 60 minutos. Pedersen y Meyer realizaron una
revisión exhaustiva de investigaciones acerca de hidrólisis ácida encontrando que existe
una fuerte dependencia entre la CAR y la concentración del ácido, si el tiempo de residencia
es inferior a 40 minutos, mientras que si es mayor la CAR tiende a volverse sólo dependiente
del tiempo de residencia y la temperatura (Pedersen & Meyer, 2010).
3.3 Tratamientos de detoxificación
3.3.1 Medición de azúcares reductores y glucosa

Después de realizar los tratamientos de detoxificación, como de describió en el capítulo de
Materiales y Métodos, se midieron los azúcares reductores por el método de DNS y
glucosa por HPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3-12.
Figura 3-12. Medición de azúcares reductores y glucosa en los tratamientos de

detoxificación.
160
140
*
120 *
Concentracion (g/L)
100 **
80
60
40
20
0
No Tratado CA OV CA + OV
Glucosa (g/L) Azucares Reductores (g/L)
En la Figura 3-12 se observa que la concentración de azúcares reductores en hidrolizado

sin tratar es superior a los 140 g/L. Con una significancia del 5%, se pudo confirmar que la
concentración de azúcares luego del tratamiento con carbón activado es diferente,
disminuyendo su concentración en un 24%, mientras que con overliming disminuye en un
29%; cuando se combinan ambos tratamientos la disminución es aún más alta (43%).
Hodge y colaboradores encontraron que la disminución en azúcares reductores fue del
11% para tratamientos con overliming y para el tratamiento de carbón activado la cantidad
de azúcares retenidas fue despreciable (Hodge et al., 2009). La remoción de AR no es
deseable debido a que una proporción de estas azúcares son de glucosa y afectaría la
fermentación subsiguiente (Pereira et al., 2015).
Tabla 11. Concentración de azúcares reductores y glucosa después de los tratamientos de

detoxificación.
Compuesto Medido NT CA OV OV + CA
Azúcares Reductores (g/L) 144,0 ± 10 109,6 ± 9 102,2 ± 12 82,2 ± 5
Reducción (%) 0 24 29 43
Glucosa 26,8 ± 1,0 24,1 ± 0,6 19,4 ± 2,0 17,93 ± 1,7

Reducción (%) 0 10 28 33
Investigaciones como las llevadas a cabo por Miyafuji y colaboradores, quien realizaron un
tratamiento detoxificando hidrolizado ácido diluido con CA proveniente de madera de Picea
abis, hallaron que la disminución de azúcares hexosas como glucosa y manosa es inferior
al 1%, concluyendo que el carbón activado es una material bastante selectivo a la hora de
ser usado como agente detoxificante (Miyafuji et al., 2003). Parte de este comportamiento
también se evidenció en el tratamiento de este hidrolizado de bagazo de maíz, donde la
disminución de glucosa es tan sólo del 10%, quedando en evidencia que el carbón activado
es el mejor método en conservar la concentración de glucosa; este hallazgo se corrobora
en investigaciones como la de Guo y colaboradores que obtuvieron una disminución del
11% de azucares reductores, usando el overliming, y no reportaron disminución cuando
usaron carbon activado. Hodge por su lado reporto una disminución de glucosa de 19,87
a 17,28 g/L, lo que representa un disminución del 13% cuando se uso Overliming mientras
que cuando uso carbón activado la disminución fue de tan solo 4% (19,07 g/L). (Guo et al.,
2013; Hodge et al., 2009)
3.3.1 Evaluación de concentración de ácido acético y HMF

Como se observa en la Figura 3-13, la concentración de ácido acético en el hidrolizado
sin tratamiento es casi el doble de la concentración mínima inhibitoria de 5 g/L (CMI)
reportada por Taherzadeh y colaboradores (Taherzadeh et al., 1997). Esto es clara
indicación de la necesidad del uso de un tratamiento de detoxificación. El carbón activado
disminuye la concentración del ácido acético hasta 7,25±1,52 g/L siendo el tratamiento
menos adecuado para este efecto; esto se debe en gran parte a la naturaleza anfipática
del ácido acético, que posee un grupo acetil que es hidrofílico el cual no es capturado por
el carbón activado para su retención (Chang & Goldsby, 2015). Por otro lado el overliming
es mucho más eficiente reduciendo la concentración del ácido acético hasta en un 91%
debido a que el ácido acético se disocia, y el grupo acetil se une con el sodio del hidróxido
formando acetato de sodio el cual luego es precipitado; la disociación del ácido acético
ocurre conforme el grupo acetil se va agotando, hasta el punto de terminarse el ácido
acético (Mathews et al., 2012). Cuando se combinan ambos tratamientos se observa que
la disminución en ácido acético es del 95%, demostrando que el efecto final sobre los
inhibidores se potencializa por el uso de carbón activado; este resultado es similar al
encontrado por Hodge y colaboradores; 91±1,2% (Hodge et al., 2009).
Figura 3-13. Concentración de ácido acético en las muestras antes y después de los
tratamientos de detoxificación, CMI: concentración mínima inhibitoria.
12
10 *
Acido Acetico (g/L)
6 MIC
2
**
**
0
La concentración de 5-HMF en el hidrolizado sin tratamiento es inferior a la IC50 de S.

cerevisiae reportada por Banerjee (Banerjee et al., 1981); el tratamiento con CA retira un
96% de 5-HMF, siendo un valor bastante considerable; por otro lado OV ha demostrado
que es un tratamiento eficiente a la hora de precipitar el 5-HMF. Esto se debe en parte a
que el 5-HMF se encuentra en su forma ionizada cuando se disuelve en soluciones ácidas,
por lo tanto disminuye su afinidad electrónica con el carbón activado el cual se comporta
como ácido, resultando así en una disminución en la capacidad de adsorberlo (Mussatto &
Roberto, 2004)
Figura 3-14. Concentración de 5-HMF antes y después de los tratamientos de

detoxificación
2,50
IC50
2,00
1,50
5-HMF
1,00
0,50
0,00
3.3.2 Evaluación de Compuestos Fenólicos Totales

En las muestras de hidrolizados pretratados con carbón activado se observa un cambio de
coloración, pasando de un color amarillo a un color traslúcido con alguna suave tonalidad
verde que sólo es evidente contra la luz (Figura 3-15). Este fenómeno es explicado por la
adsorción en el carbón activado de compuestos fenólicos y furanos que aportan coloración
amarillenta al hidrolizado (Miyafuji et al., 2003); sin embargo, en esta investigación se usó
el método de Folin Ciacolteau para obtener valores cuantitativos precisos de compuestos
fenólicos (Figura 3-16). El carbón activado, como se ha reportado, es más hidrofóbico si
actúa a temperaturas mayores a los 20°C y muchos de los compuestos fenólicos y furanos
igualmente son hidrofóbicos; como resultado se obtiene una alta adsorción por parte del
carbón activado (Saka & Doi, 1998).
Figura 3-15. Tratamiento con carbón activado. A. Hidrolizado sin detoxificar, B. Hidrolizado
luego de tratamiento de detoxificación. C. Hidrolizado filtrado y centrifugado.
El método de Folin-Ciocalteu fue inicialmente usado para analizar proteínas, cuyo reactivo
principal reaccionaba con proteínas formando un complejo con residuos como la tirosina
que contiene un grupo fenol (Singleton, Orthofer, & Lamuela-Raventós, 1999). Tiempo
después su uso se extendió al análisis de compuestos de plantas vegetales y ha sido
reportado como un buen método para determinar compuestos fenólicos en hidrolizados
(Hodge et al., 2009; Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000c).
El reactivo de Folin Ciocalteu se vale de un mecanismo de reacción de

oxidación/reducción, que es específico para fenoles, el cual mide la capacidad de reducir
el reactivo de ácido fosfomolibdico/fosfotungstico a un complejo azul que es medido
espectrofotométricamente, ya que el molibdeno es reducido en el complejo por parte del
compuesto fenólico que se oxida, ocurriendo la transferencia de electrones. El método
implica la oxidación de fenoles en solución alcalina por el heteropolianión
molibdotungstofosfórico amarillo y la medición colorimétrica del molibdotungstofosfato azul
resultante (Huang et al., 2005).
Figura 3-16. Concentración de compuestos fenólicos removidos después de tratamientos

de detoxificación
4,5
Compuestos Fenolicos (g/L) 4,0
3,5
3,0
2,5
IC50
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
No tratado CA OV OV+CA
Como se puede apreciar el tratamiento con carbón activado es más efectivo para disminuir
la concentración de compuestos fenólicos, reduciendo su concentración en 79,3%,
mientras que overliming no es capaz de disminuir la concentración de compuestos
fenólicos por debajo de la IC50, reduciéndolo sólo un 18%; la combinación de ambos
tratamientos resultó en una disminución del 40%, resultando en un hidrolizado bastante
negro y espumoso seguramente por la degradación de los azúcares porque presentaba un
fuerte olor a quemado. Autores como Convertí y colaboradores han demostrado que la
combinación de estos métodos conlleva un costo económico adicional ya que es necesaria
una purificación del hidrolizado la cual puede ser por evaporación, para devolverle la
naturaleza al hidrolizado. Además, si se requiere concentrar los azúcares fermentables
este proceso es indeseable si se piensa en un escalamiento a nivel industrial (Converti et
al., 1999).
3.3.3 Inhibidores en Hidrolizados

En la Tabla 12, queda en evidencia que el tratamiento con carbón activado es mucho más
efectivo en la retención de inhibidores furanos, como 5-HMF, y compuestos fenólicos; a
pesar de que no adsorbió en su mayor proporción el ácido acético. Estudios como el de
Taherzadeh demuestran que influye sobre vías metabólicas de glucólisis que ya se han
explicado; por otro lado S. cerevisiae también tiene vías regulatorias que metabolizan ácido
acético (Taherzadeh et al., 1997). El overliming reduce concentraciones de ácido acético

y furanos mejor que el CA; sin embargo no actúa de igual manera sobre compuestos
fenólicos. A esta misma conclusión llegaron Miyafuji y colaboradores, quienes sólo
evaluaron concentración de furanos y compuestos fenólicos, y el tratamiento con CA
resultó mejor reteniendo un 51 ±9% y 41 ±6%, respectivamente (Miyafuji et al., 2003). Por
otro lado la combinación de ambos tratamientos no resultó en un efecto sinérgico
obteniéndose valores de eliminación entre los logrados con carbón activado y los logrados
con overliming; en parte esto se explica porque el tratamiento con carbón activado se
realizó luego del overliming, estando el hidrolizado a un pH básico, y se ha reportado que
la capacidad adsorbente disminuye en medios altamente básicos ya que los iones
hidroxilos poseen mayor afinidad por el carbón activado saturándolo de manera
competitiva y no permiten que adsorba los inhibidores de interés (Mussatto & Roberto,
2004). Finalmente, la fermentabilidad del material detoxificado puede incrementarse
mediante la estrategia de adaptar previamente el microorganismo al mismo.
Tabla 12. Concentraciones de Inhibidores en Hidrolizado con distintos tratamientos de

detoxificación
No Tratado CA OV OV+CA
Ácido Acético (g/L) 9,69±1,6 7,25±1,5 0,86±0,45 0,46±0,13
%Eliminación 0,0 25,2 91,2 95,2
5-HMF (g/L) 1,51±0,32 0,07±0,06 0,00±0,00 0,00±0,00

%Eliminación 0,0 95,6 100,0 100,0
Comp. Fenólicos (g/L) 3,75±0,22 0,77±0,11 3,07±0,37 2,22±0,14

%Eliminación 0,0 79,4 18,3 40,7
3.3.4 Adaptación de S. cerevisiae al Hidrolizado

Algunos autores reportan que en hidrolizados que contengan inhibidores en
concentraciones cercana a la IMC (2.28 g/L of acetic acid, 0.36 g/L of furfural, and 0.21 g/L
of HMF, es posible adaptar la cepa, cambiando la relación de la concentración del
hidrolizado con un medio enriquecido (Qureshi et al., 2015). Por lo que el proceso de
adaptación se realizó de manera gradual, utilizando inicialmente medio YPG al 100% para
después de 24 horas ir incrementando la concentración del hidrolizado en 10%, y así

sucesivamente hasta llegar a un medio de 100% de hidrolizado (véase Tabla 13).

hidrolizado
Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
YPD (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Hidrolizado (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
El anterior proceso se realizó con en el hidrolizado sin tratamiento y al cabo del sexto día,
cuanto la relación de medio YPD e Hidrolizado fue 1:1, la biomasa decreció en un 75%
comparada con la obtenida en el día quinto indicando que la cepa no era capaz de resistir
cantidades de inhibidores como ácido acético 9,69±1,6g/L, 5-HMF: 1,51±0,32 g/L y
compuestos fenólicos 3,75±0,22 g/L; para futuras investigaciones se podría llevar a cabo
la fermentación con medio: 60% YPG, y 40% Hidrolizado, realizando un proceso de
adaptación de una manera más sensible.
El mismo procedimiento se llevó a cabo pero con hidrolizados tratados con los métodos de
detoxificación carbón activado y overliming, se observó en ambos casos que al cabo del
día 11 el decrecimiento de la biomasa era inferior al 25%. Resultados similares obtuvieron
Qureshi y colaboradores quienes utilizaron un hidrolizado ácido de bagazo de maíz para
obtener una cepa adaptada a cantidades altas de inhibidores a la que llamaron S.
cerevisiae DQ1 adaptandola por mas de 3 meses pero realizando cambio de medio cada
12 horas (Qureshi et al., 2015).
3.4 Fermentación del Hidrolizado

Como ya se dijo antes la concentración del inóculo se midió por el método de peso seco
relacionándolo con la absorbancia a 540 nm; los datos obtenidos se presentan en el anexo
A. Las cinéticas de la fermentación se llevaron a cabo en los hidrolizados tratados tanto
con carbón activado como por overliming y sometidos a dos regímenes de agitación: 100
y 200 rpm, que son velocidades de agitación típicas para llevar a cabo fermentaciones
alcoholicas a escala de matraz agitado de 250 mL con 100 mL de medio. En la Tabla 14

se presenta un resumen de los datos hallados en las fermentaciones.
Tabla 14. Concentraciones máximas de etanol logradas con tratamientos de detoxificación
Carbón Activado (CA) Overliming (OV)

100 rpm 200 rpm 100 rpm 200 rpm
Máxima Conc. de Etanol (g/L) 10,27 8,00 3,32 2,90
Tiempo (h) 18 18 10 18
Concentración Biomasa (g/L) 14,08 18,01 10,05 12,90
Consumo del Sustrato (g/L) 24,10 28,00 18,00 21,60
Yp/s 0,426 0,286 0,184 0,134

Yx/s 0,584 0,643 0,558 0,597
%Rendimiento Etanol 83,56 56,02 36,17 26,33
La capacidad de poseer un mejor crecimiento celular cuando el hidrolizado fue tratado con
CA, se evidencia por la concentración que se obtiene de biomasa y etanol de manera que
la concentración de HMF de 0,3 g/L que es inferior a la MIC: 2,0 g/L que no fue retirada
por el CA no afecta de manera significativa la obtención de etanol; esto se debió a que
bajo condiciones aeróbicas S. cerevisiae es capaz de reducir el 2-F, y 5-HMF a alcohol
furfuril y alcohol hidroximetilfurfuril siendo estos últimos menos tóxicos (Guo et al., 2013).
Se nota un incremento en la producción de Biomasa de 28%, cuando el régimen de

agitación es de 200 rpm respecto a cuándo es de 100rpm, puesto que existe mayor
aireación del medio, por lo cual la concentración de oxigeno es alta, y la levadura S.
cerevisiae se ocupa en multiplicarse y no fermentar ya que la glicolisis ocurre en
condiciones anaeróbicas (Leveau & García, 2000).
En cuanto a la producción de alcohol obtenida a partir de la biomasa pesada se obtuvo un

buen rendimiento comparado con los reportados por algunos investigadores, véase Tabla
15. El YP/S de esta investigación se encuentra entre los tres más altos, indicando que es un
proceso potencial de ser escalado a nivel industrial para próximas investigaciones.
Tabla 15. YP/S reportado por otros investigadores de fermentaciones de Hidrolizados ácido
diluido (H2SO4).
Residuos de Yp/s Fuente

Alcachofa de Jerusalén 0,370 (Szambelan, Nowak, & Czarnecki, 2004)
(Helianthus tuberosus)
Arroz (Oryza sativa) 0,400 (Srilekha Yadav, Naseeruddin, Sai
Prashanthi, Sateesh, & Venkateswar Rao,
2011)
Pino (Picea abies) 0,400 (Larsson et al., 1999)
Maiz (Zea Mays) 0,426 Esta Investigacion
Algodon (Gossypium 0,450 (Yu & Zhang, 2003)
herbaceum)
En la Figura 3-17, a partir de una concentración de inóculo de 2,4 ± 0,5 g/L, se observa el
crecimiento exponencial con una fase lag muy corta debido a que el inóculo fue
previamente adaptado durante 11 días en un hidrolizado con condiciones similares (véase
2.8.4). Se ha demostrado que S. cerevisiae es un microorganismo que tiene la capacidad
para metabolizar cantidades mínimas de inhibidores, pero esta capacidad se puede
potenciar si se inicia su multiplicación en medios con concentraciones controladas de
inhibidores, obligando así a la levadura a activar vías alternativas de metabolismo y cuya
información será heredada a su descendencia (Qureshi et al., 2015). Es sabido que el
ácido acético usado como única fuente de carbohidratos activa el ciclo glioxilado
anaplerótico y la vía de la glucólisis, ambos regulados por represión de glucosa (Casal et
al., 1996); en presencia de glucosa, la formación de acetato deja libre protones que pueden
atravesar el citosol e incrementar el pH intracelular inhibiendo su crecimiento; sin embargo,
una concentración de ácido acético de 7,25 g/L como la que presenta el hidrolizado tratado
con carbón activado, aunque no alcanza a ser inhibitoria, investigaciones como la de
Taherzadeh y colaboradores demostraron que si se agrega ácido acético hasta 3,3 g/L,
acelera la glicólisis porque interviene en vías metabólicas para dar inicio al metabolismo
de la glucosa (Taherzadeh et al., 1997).
Figura 3-17. Crecimiento de biomasa en hidrolizado tratado con carbón activado.

18,0
16,0
14,0
12,0
10,0
Biomasa (g/L) 8,0
6,0
4,0 200
rpm
100
2,0 rpm
0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
También se observa que existe un crecimiento elevado de biomasa que se mantiene hasta
la decimocuarta hora a 100 rpm, llegando a una concentración de 15,33 g/L, mientras que
a 200 rpm el crecimiento se extiende hasta las 28 horas con un máximo de 14,35 g/L,
indicando que la velocidad de crecimiento es mayor a 100 rpm, su explicación gira en torno
al daño sufrido por el estrés hidrodinámico que bien puede causar un daño letal que
provoca la muerte por lisis celular o bien daños subletales que se manifiestan en
alteraciones metabólicas en los cultivos (Trujillo & Valdez, 2006).
Después del máximo es evidente el descenso en la biomasa debido al agotamiento de la

glucosa, como lo reportan otros autores quienes obtuvieron un comportamiento similar.
Por otra parte también se ha reportado un descenso en la producción de la biomasa por
inhibición del propio etanol.

hidrolizado tratado con carbón activado.
Etanol 100 rpm Etanol 200 rpm

Azu. Red. 100 rpm Azu. Red. 200 rpm
25 130
Azucares Reductores (g/L)

125
20
120
Etanol (g/L)
15 115
10 110
105
5
100
0 95
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
La producción más alta de etanol medida fue de 22g/L (Figura 3-17), cuando sucede la
fermentación a 100 rpm lograda a las 18 horas; por otro lado a 200 rpm en este mismo
tiempo se logra la concentración de 16 g/L, este último dato podría no concordar con la
disminución de las azúcares que como se observa a 200 rpm es mayor que a 100 rpm;
esto fue debido a que la concentración de etanol sólo se midió en 6 puntos; por lo tanto es
muy posible que entre la décima hora y decimoctava exista un máximo de etanol que no
fue medido. Además se observa que el HMF no fue retirado.
En la Figura 3-19 se muestra el crecimiento de la biomasa en el hidrolizado tratado con

overliming con una fase lag que se extiende hasta la hora 6 en ambos casos (100 y 200
rpm) indicando que el inóculo inicia en fase de adaptación lo que evidencia que la
adaptación previa que se hizo de 10 días no fue suficiente, aun así el crecimiento de
biomasa llega a 5,6 y 8,1 g/L muy inferior al logrado en el hidrolizado tratado con CA,
indicando un mayor grado de inhibición. Con miras a un escalado industrial esta fase es
indeseada ya que acarrea costos económicos adicionales para obtención de etanol (El-
Mansi et al., 2006). Este fenómeno puede ser explicado por la concentración de
compuestos fenólicos que no fueron reducidos por overliming y que aun en bajas
concentraciones pueden inhibir el crecimiento celular de S. cerevisiae (Hodge et al., 2009)
y en algunos casos extender la fase lag porque intervienen en rutas metabólicas como la
glucólisis en levaduras. (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000c) dando como resultado bajos
rendimientos de etanol. Otra explicación del bajo rendimiento de etanol se apoya en
investigaciones dirigidas a la osmotolerancia de S. cerevisiae sobre concentraciones altas
de sodio donde se demuestra que es capaz de soportar concentraciones hasta de 1.5 M
de NaCl considerándolo por los autores como un microorganismo altamente
osmotolerante; sin embargo en el hidrolizado que se evaluó en esta investigación se
agregó aprox 90 g de NaOH por litro de hidrolizado resultando una concentración que
pudo afectar directamente de manera negativa en la cepa de S. cerevisiae (Wadskog &
Adler, 2003).
La concentración de etanol que se obtiene en hidrolizados tratados con overliming a 100

rpm y 200 rpm es de 3,32 g/L a la décima hora, y de 2,9 g/L a las 18 horas. Se sabe que
debido una mayor agitación, a 200 rpm existe mayor aireación y S. cerevisiae es un
microorganismo facultativo que en presencia de oxígeno incrementa su biomasa y detiene
otros procesos metabólicos, en este caso la vía de la glucólisis; por lo tanto la
concentración de etanol se ve reducida (véase Figura 3-20) (Mesas & Alegre, 1999).
Si se comparan las Figura 3-18 y 3-20, se puede observar la importancia de usar un

determinado método de detoxificación, el cual puede afectar notablemente la
fermentabilidad de los medios. En este estudio, la detoxificación por overliming reduce
cantidades considerablemente mayores de ácido acético y 5-HMF que el carbón activado,
mientras que compuestos fenólicos son resistentes a este tratamiento, y como se observa
en la gráficas indica que los compuestos fenólicos son inhibidores muy importantes en la
fermentación para obtención de etanol con S. cerevisiae, mientras que los aldehídos
furanos y ácidos alifáticos probablemente juegan un papel menos importante en la
fermentación. Esta observación también ha sido corroborada por Hong y colaboradores,
quienes además demostraron que los compuestos fenólicos de menor peso atómico son
los más tóxicos (Guo et al., 2013; Hong et al., 2011; Klinke et al., 2004).
Figura 3-19. Crecimiento de biomasa en hidrolizado tratado por overliming.
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
Biomasa (g/L)
5,0
4,0
3,0
100 rpm
2,0
200 rpm
1,0
0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)

hidrolizado tratado por overliming.
Etanol 100 rpm Etanol 200 rpm

Azu. Red. 100 rpm Azu. Red. 200 rpm
3,5 125
3,0
Azucares Reductores (g/L)

120
2,5
Etanol (g/L)
2,0 115
1,5 110
1,0
105
0,5
0,0 100
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (h)
4. Conclusiones
 El residuo lignocelulósico bagazo de maíz mostró ser un substrato potencial para
la obtención de bioetanol de segunda generación utilizando una cepa comercial de
Saccharomyces cerevisiae previamente adaptado al bagazo hidrolizado.
 El uso de hidrólisis ácida del bagazo de maíz permite obtener concentraciones altas
de azúcares reductores en miras a ser utilizados para obtención de bioetanol y otros
productos de interés vía fermentación. Las condiciones óptimas de dicho proceso
a escala de matraz agitado son concentración ácido 6% v/v, tiempo de hidrólisis
40.8 min, carga del solido 30% p/v.
 El tratamiento del hidrolizado ácido con carbón activado al 2.5 %p/v mostró ser el
mejor método de detoxificación, dentro de los métodos ensayados, al remover un
96% de 5-HMF, 58% de ácido acético, 79,3% de compuestos fenólicos; mientras
que el overliming aunque fue capaz de reducir mayores cantidades de 5-HMF y
ácido acético, redujo concentraciones de compuestos fenólicos en tan sólo 18% y,
como se observó en la fermentación de dichos hidrolizados, estos compuestan
afectan de manera negativa la producción de bioetanol.
 Las mejores condiciones de fermentación a escala de matraz agitado para
obtención de etanol, a partir del hidrolizado de bagazo de maíz detoxificado con
carbón activado, son agitación de 100 rpm y temperatura de 25°C.
4.1 Recomendaciones
 El hidrolizado obtenido por hidrólisis ácida de bagazo de maíz posee altas
concentraciones de azúcares reductores diferentes a glucosa que alcanzan 80 g/L, los
cuales pueden ser aprovechados para obtención de xilitol por fermentación de xilosa
dentro de una estrategia de biorrefeniría; también se puede realizar un cocultivo de S.
cerevisiae y P. stipitis; este último microorganismo es capaz de convertir azúcares
pentosas en etanol.
 Realizar investigaciones destinadas a la adaptación, de S. cerevisiae en hidrolizados
sin tratamiento, ya que de acuerdo a otros investigadores si se realizan periodos de
más de 2 meses de adaptación inclusive se puede obtener una cepa capaz de realizar
sus procesos metabólicos en hidrolizados con concentraciones altas de inhibidores y
esto disminuiría claramente costos de producción.
 Monitorear la formación de inhibidores a través del tiempo, para incluir esta variable a
la hora de optimizar la condiciones que permitan obtener una alta concentración de
azucares reductores y una baja concentración de inhibidores.
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Anexo A: Curvas de Calibración de

Espectrofotometría
 Medición de Azúcares DNS
La solución de DNS, para medición de azúcares reductores se preparó de acuerdo a la

metodología mostrada en 2.2.1, utilizando una solución patrón con concentración de
glucosa de 490 mg/L para luego iniciar diluciones como se muestra a continuación.
Absorbancia
Volumen de Volumen de Concentración Réplica Réplica Desviación

Tubo Patrón (mL) Agua (mL) (mg/L) 1 2 Estándar
1 0 10 490 1,526 1,498 0,0198
2 2 8 392 1,342 1,366 0,0170
3 4 6 294 0,990 0,895 0,0672
4 6 4 196 0,668 0,701 0,0233
5 8 2 98 0,377 0,365 0,0085
6 10 0 0 0,160 0,150 0,0071
1,600
1,400
1,200
Absorbancia
1,000
0,800
0,600 y = 0,0029x + 0,1262
R² = 0,9936
0,400
0,200
0,000
0 100 200 300 400 500
Concentracion Glucosa (mg/L)
 Medición de Compuestos Fenólicos
La curva de calibración se realizó con ácido gálico para medir compuestos fenólicos. El
procedimiento se realizó como se muestra en 2.7.2 , concentraciones de la solución patrón
fueron entre 0 y 0,08 g/L, como se muestra a continuación.
Absorbancia
Concentración
Ácido Gálico Réplica 1 Réplica 2 Media DE
Tubo (ug/mL)
1 80 3,039 3,006 3,023 0,023
2 40 1,636 1,681 1,659 0,032
3 20 0,889 0,844 0,867 0,032
4 10 0,437 0,430 0,434 0,005
5 5 0,225 0,231 0,228 0,004
6 0 0 0 0,000 0,000
3,5
3,0
Absorbancia (765nm) y = 37,724x + 0,0603
2,5 R² = 0,9972
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0 0,02 0,04 0,06 0,08
Acido Galico (mg/mL)
Cambio de coloración Azul, en presencia de Compuestos Fenólicos

 Medición de Biomasa vs Absorbancia
1,000
0,800
Absorbancia 540nm
0,600
0,400
0,200
0,000
0,00 0,04 0,08 0,12 0,16
Biomasa (g/L)
Realizando el ajuste de la curva lineal se obtuvo el siguiente modelo:
𝐴𝑏𝑠540𝑛𝑚 = 5,621 × 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎(𝑔) + 0,1328
El ajuste obtenido con 𝑟 2 = 0.9825 , muestra que hay una dependencia lineal entre la
biomasa y la absorbancia medida a 540nm. Es necesario realizar un prueba estadística
para conocer si el modelo es adecuado para describir los datos puesto que la prueba se
realiza comparando la variabilidad de los residuos del modelo actual con la variabilidad
entre observaciones hechas en valores repetidos de la variable Biomasa.
Desafortunadamente, la prueba no puede ejecutarse debido a que no hay observaciones
replicadas en los mismos valores de Absorbancia
Anexo B: Caracterizacion de Análisis de Tallos de

Maiz.
Caracterización de la muestra Bagazo de Maiz (Zea mays)
Componente Método Valor (%) Desviación

estándar
Humedad NREL/TP-510-42621 8,4023 0,0893
Cenizas NREL/TP-510-42622 3,9596 0,0540
Extractivos con agua NREL/TP-510-42619 27,026 0,0970
Extractivos con etanol NREL/TP-510-42619 8,0560 0,1510
Humedad después de extractivos NREL/TP-510-42621 83,125 0,4352
Cenizas después de extractivos NREL/TP-510-42622 1,2840 0,5438
Lignina insoluble NREL/TP-510-42618 30,597 1,2806
Lignina soluble (197 nm) NREL/TP-510-42618 3,4019 0,2434
Celulosa NREL/TP-510-42618 26,520 1,4321
Hemicelulosa NREL/TP-510-42618 42,8993 0,7551

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Judul Asli

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OBTENCION DE BIOETANOL A

PARTIR DE TALLOS DE MAIZ

OLMEDO JESÚS CUASPUD CÁLIZ

Universidad Nacional de Colombia

Olmedo Jesús Cuaspud Cáliz

Línea de Investigación: Energías Alternativas

Universidad Nacional de Colombia

A Dios por ser mi compañía y sus palabras:

A mis padres por apoyarme en todo momento,

A Adriana por su decisión de amarme.

Al profesor Héctor Jairo Correa, profesor del Departamento de Nutrición Animal de la

A mis compañeros del grupo de investigación Biotecnología Industrial por colaborarme en

A la Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín por su colaboración y facilidad de

Palabras clave: Residuo lignocelulósico, hidrólisis ácida, detoxificación, fermentación,

Keywords: Lignocellulosic residues, acid hydrolysis, detoxification, fermentation,

1. Marco Teórico ........................................................................................................ 14

2. Materiales y Métodos ............................................................................................. 35

2.8.5 Fermentación del hidrolizado ......................................................................... 43

3. Resultados y Discusión ......................................................................................... 44

Figura 1-1. Conformación de la estructura de una pared vegetal (Adaptación de U.S.

Figura 3-12. Medición de azúcares reductores y glucosa en los tratamientos de

Tabla 1. Composición del material lignocelulósico de maíz según otras investigaciones. 16

Lista de Símbolos y Abreviaturas

Símbolos con letras latinas

Símbolo Término Unidad SI

Símbolos con letras griegas

β Enlaces Beta Glucosídicos 1

1.1 Características del Material Lignocelulósico

1.1.1 Celulosa, Hemicelulosa y Lignina

A diferencia de la celulosa, la hemicelulosa consiste de diferentes unidades de

Figura 1-1. Conformación de la estructura de una pared vegetal (Adaptación de U.S.

Figura 1-2. Estructura esquemática de las cadenas de celulosa (Cortínez, 2010)

La hemicelulosa es un grupo de polisacáridos heterogéneos insolubles en agua; plantas

azúcares monoméricos, impidiendo la formación de inhibidores derivados del furano (El-

La lignina constituye entre 10 y 15 % de la biomasa de los cereales; se encuentra como

La composición química de la lignina consiste principalmente en tres tipos de unidades

Es necesario aclarar que el porcentaje de hemicelulosa, celulosa y lignina varía de acuerdo

Tabla 1. Composición del material lignocelulósico de maíz según otras investigaciones.

1.1.2 Material lignocelulósico como fuente de energía

Figura 1-3. Hectáreas de diferentes tipos de maíz en los 8 mayores departamentos

10000 Amarillo Tradicional

8000 Blanco Tradicional

Valle del Cauca

Se ha planteado que el bioetanol elaborado a partir de cereales utilizados en alimentación

rastrojo de banano, alcanzando valores de conversión de hasta 45% (El-Zawawy et al.,

1.1.3 Pretratamientos del material lignocelulósico

Los pretratamientos físicos involucran cambios físicos en el material lignocelulósico; se

1.2 Hidrólisis ácida diluida

Así pues, con el rompimiento de la hemicelulosa se pueden obtener hexosas y pentosas,

1.2.1 Concentración del ácido

1.2.2 Carga de Solido

1.2.3 Tiempo y temperatura

Figura 1-5. Comportamiento típico de obtención de azúcares vs tiempo de hidrólisis ácida

En contraste, a medida que la hidrólisis se hace a temperaturas mayores el tiempo de

1.2.4 Tamaño de partícula

1.3 Formación de inhibidores

Figura 1-6. Productos y subproductos que se obtienen de la hidrólisis ácida de residuos

1.3.1 Ácido acético

el pH intracelular es neutro, lo que causa una disminución en el pH citosólico. Aunque a

El crecimiento de S. cerevisiae ha sido detectado a un pH tan bajo como 2,5 en ausencia

1.3.2 5-Hidroximetilfurfural y 2-Furfural

En investigaciones previas, la reducción en la concentración de furfural se ha relacionado

También se ha podido corroborar la síntesis de nuevas enzimas y coenzimas que ayudan