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edição

H Hernandes F. Carvalho
Shirlei M. Recco-Pimentel

rt
A
É
Manole
A Célula
2a edição

Hernandes F. Carvalho

Shirlei Maria Recco-Pimentel

Departamento de Biologia Celular


Instituto de Biologia
UNICAMP

Manol<
Copyright & Editora Manolc Ltda., 2007,
por meio dc contrato com os autores

Capa: Departamento de Arte da Editora Manolc

Editoração Hletrõnica: Drcampix Comunicação

Projcto gráfico: Cláudio Queiroz

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)


(Câmara Brasileira do Livro, SP. Brasil)

Carvalho. Iicrnandes F.
A Célula / 1Icrnandes R Carvalho, Shirlei Maria Rccco-Pimentel. - 2. ed. -
Barucri, SP :Manolc, 2007.

Vários colaboradores.
ISBN 978-85-204-2543-5

I. Células 2. Biologia celular I. Recco-Pimentel. Shirlei Maria. II.Titulo.

06-881 I Cl>1 >-574.87

índices para catálogo sistemático:


I. Biologia celular 574.87

Todos os direitos reservados.


Nenhuma parte deste livro poderá ser reproduzida, por qualquer
processo, sem a permissão expressa dos editores.
f. proibida a reprodução por xerox.
A Pditora Manole é filiada à ABDR - Associação Brasileira de Direitos Rcprográficos
-
Ia edição 2001
2' edição - 2007
Reimpressão da 2' edição - 2009

Direitos adquiridos pela:


Editora Manole I.tda.
Avenida Ceci. 672 - Tamboré

_ 11 4 - -
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Impresso no Brasil
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Colaboradores
Ana Cristina Prado Veiga- Menoncello Maria LOcia Furlan Wada
Departamento de Biologia Celular Departamento de Biologia Celular
Universidade Estadual de Campinas Universidade Estadual cie Campinas
Ana Paula Lepiquk Maria Luiza Silveira Mello
Instituto I.udwig de Pesquisa sobre o Câncer Departamento de Biologia Celular
São Paulo Universidade Estadual de Campinas
Angelo Luiz Cortelazzo Maria TercIlia Vilela de Azfredo-Oliveira
Departamento de Biologia Celular Departamento de Biologia
Universidade Estadual de Campinas UniversidadeEstadual Paulista - São José do Rio Preto
Arnaldo Rodrigues dos Santos Junior Marlene Benchimol
Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária Laboratório de Microscopia
Universidade Estadual Paulista - Jaboticabal Universidade Santa Úrsula - Rio de Janeiro
Benedictto df. Campos Vidal Odair Aguiar Junior
Departamento de Biologia Celular Campus Baixada Santista
Universidade Estadual de Campinas Universidade Federal de São Paulo
Carla Beatriz Collares-Buzato Patrícia Simone Leite Vilamaior
Departamento de Histologia e Embriologia Centro Universitário de Rio Preto
Universidade Estadual de Campinas São José do Rio Preto
Christian? Bertachini-Lombello Rejane Maira Góes
Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento Departamento de Biologia
GMReis - Campinas UniversidadeEstadual Paulista - São José do Rio Preto
Cristiana de Noronha Begnami Roger Frigerio Castilho
Colégio Dom Barreto Departamento de Patologia Clínica
Campinas Universidade Estadual de Campinas
Edson Rosa Pimentel Sebastião Roberto Taboga
Departamento de Biologia Celular Departamento de Biologia
Universidade Estadual de Campinas Universidade Estadual Paulista - São José do Rio
Preto
Helena Lobo Borges
Departamento de Anatomia Selma Candei aria Genari
Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Ciências Biológicas
Centro Universitário de Espírito Santo do Pinhal
Jose Lino Neto
Departamento de Biologia Geral Sérgio Luis Felisbino
Universidade Federal de Viçosa Departamento de Morfologia
Universidade Estadual Paulista - Botucatu
Laurecir Gomes
Departamento de Biologia Celular Stevens Kastrup Rehen
Universidade Estadual cie Campinas Departamento de Anatomia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Luciana Bolsoni Lourenço
Departamento de Biologia Celular
Universidade Estadual de Campinas
Luisa Lina Villa
Instituto I.udwig de Pesquisa sobre o Câncer
São Paulo

V
Agradecimentos
Aos colaboradores desta edição, pela análise cuidadosa dos
capítulos anteriores e confecção dos capítulos novos.
A João R. L. Menezes, Daniela D. de C. Neves e Cláudio Masuda
por contribuírem na elaboração dos quadros explicativos I, II e
III, respectivamente, do capítulo Controle do Ciclo Celular e a
Cláudio Masuda e Mariana Silveira pelas críticas e
comentários ao mesmo capítulo.
A Sérgio Siqueira Júnior e Ricardo A. Lombello pela
confecção de várias figuras e esquemas, em especial
dos capítulos Mitose e Meiose.
A Edson Delgado Rodrigues pela confecção de figuras e esquemas
do capítulo Ribossomos e do item Proteoglicanos
do capítulo Matriz extracelular.
A Alícia Kowaltowski e Cláudia Campos pelas sugestões e
comentários ao capítulo Morte Celular.
A Alberto S. Moraes e Flávia de Paoli por revisarem o texto dos
capítulos Cromatina e Cromossomos e Nucleolo.
A Carmen S. Busin e Gabriel T.B.T. do Egito pelos comentários
ao texto do capítulo Mitose.

Aos pesquisadores que contribuíram com imagens originais


utilizadas na ilustração dos capítulos.
A todos aqueles que nos enviaram sugestões de correções,
alterações ou inclusões à primeira edição, contribuindo muito
para a melhoria deste livro.

VI
Capítulo 9
Resumo Nucléolo
Maria Lui/a Silveira Mello
144

Prefácio XIII
Capítulo 10
Matriz Nuclear, Domínios Nucleares c
Capítulo 1 Territórios Cromossòmicos 155
Aspectos Gerais de Estrutura Celular 1 Sebastião Roberto Taboca
Maria Lui/a Silveira Mello Patricia Simone Leite Vilamaior
Capítulo 2 Capítulo 11
Moléculas Importantes para a Compreensão Ribossomos e Síntese Protéica 161
da Célula e do seu Funcionamento 7 Laurecir Gomes
Angelo Luiz Cortelazzo Edson Rosa Pimentel
Shirlci Maria Recco-Pimentel
Capítulo 3
Microscopias 29 Capítulo 12
Sebastião Roberto Taboca Retículo Endoplasmático 172
Patricia Simone Leite Vilamaior Christiane Bertachini-Lombello
Capítulo 4 Hernandes F. Carvalho
Métodos de Estudo da Célula 38 Capítulo 13
Preparações Citológicas Complexo de Golgi 185
Sebastião Roberto Taboca e Christiane Bertachini-Lombello
Patricia Simone Leite Vilamaior Luciana Bolsoni Lourenço
Citoquímica Ilernandes F. Carvalho
Sebastião Roberto Taboca e
Patricia Simone Leite Vilamaior Capítulo 14
Lisossomos 199
Iniunocitoquímica Maria LereiliaVilela de Azcredo-Olivcira
Ilernandes F. Carvalho
Fracionamento Celular
Hernandes F. Carvalho
Edson Rosa Pimentel Capítulo 15
Cromatografia Líquida c Eletroforcse Mitocóndria 211
Laurccir Gomes Edson Rosa Pimentel
Técnicas de DNA Recombinante
Luisa Lina Villa e Ana Paula Lepiquc Capítulo 16
Cultura de Células Animais Peroxissomos 226
Selma Candelária Genari Luciana Bolsoni Lourenço
Sérgio Luis Felisbino
Ilernandes F. Carvalho
Capítulo 5
Capítulo 17
Biomembranas 74
Hidrogenossomos 236
Arnaldo Rodrigues dos Santos Júnior Marlene Benchimol
Hernandes F. Carvalho
Capítulo 6 Capítulo 18
Junções Celulares 92
Cloroplastos 242
Cristiana de Noronha Begnami
Carla Beatriz Collares-Buzato
Capítulo 19
Capítulo 7 Citoesqueleto 258
Envoltório Nuclear 113 José Lino Neto
Hernandes F. Carvalho Rejane Maira Góes
Capítulo 8 Hernandes F. Carvalho
Cromatina e Cromossomos 128 Capítulo 20
Maria Luiza Silveira Mello Matriz Extracelular 276
Benedicto de Campos Vidal Colágenos
Edson Rosa Pimentel

A Célula VII
Prolcoglicanos Capítulo 24
Laurccir Gomes Meiosc .332
Sistema Elástico Shirlei Maria Recco- Pimentel
Hcrnandes F. Carvalho Odair Aguiar Junior
Capítulo 21 Capítulo 25
Paredes Celulares .295 Diferenciação Celular .348
Angelo Luiz Cortelazzo Arnaldo Rodrigues dos Santos Júnior
Maria Lúcia Furlan Wada
Capitulo 22 Hernandes F. Carvalho
Mitose .304
Shirlei Maria Recco-Pimentel Capítulo 26
Ana Cristina P. Veiga- Menonccllo Morte Celular 364
Odair Aguiar Junior Maria Luiza Silveira Mello
Roger F. Castilho
Capítulo 23
Controle do Ciclo Celular .318 índice Remissivo 375
Helena Lobo Borges
Stevens Kastrup Rchcn
- Análise integrada dc técnicas citoquimicas
Sumário às microscopias especiais 47
- Implicações clinicas c patológicas 48

- Citoquimica ultra-estrutural 48
Prefácio XIII Imunocitoquimica
- Anticorpos polidonais x anticorpos monoclonais ...50
Capítulo 1 - Imunocitoquimica direta x
imunocitoquimica indircta 51
Aspectos Gerais de Estrutura Celular I
- Imunofluorcsccncia x imunoperoxidase 51
- Formasc tamanhos celulares 3
- Imunocitoquimica ultra-estrutural
- Generalidades sobre o núcleo interfásico 3
Fracionamcnto Celular
52

- Interaçócs núclco-citoplasmáticas 4
Cromatografia Líquida e Elctroforcsc
- O sucesso da clonagem de primatas comprometido
por perda de estruturas citoplasntáticas criticas 5 • F.letroforesc 55
Técnicas de DNA Recombinantc
Capítulo 2
Moléculas Importantes para a Compreensão - Preparo das moléculas dc DNA recombinantc 58
da Célula c do seu Funcionamento 7 - Introdução e ampliação do DNA
recombinantc na célula hospedeira 60
-Agua 7
- Moléculas e ions inorgânicos 8 -Caracterização de genes c seus transcritos 60

- Moléculas orgânicas 9 - Técnicas dc hibridação molecular 61


• Carboidratos 9 - Hibridação cm filtros {Southern c Northern "blots") .61
-Lipídios 13 - Hibridação in situ (HIS) 62
- Proteínas 18 - Rcação cm cadeia da polimerase (PGR) 62
- Ácidos nucléicos 23 - PGR in situ 65
Capítulo 3 - Sequencia men de DNA
to 65

Microscopias 29 Cultura de Células Animais


- Microscopia dc luz 29 - Tipos de cultura celular 68

- Microscopia de contraste de fase 30 - Cultura primária - células dependentes c


- Microscopia de contraste interferencial 31 independentes dc ancoragem 68
- Microscopia de polarização 31 - Biologia das células in vitro e sua
- Microscopia de campo escuro 32 adaptação às condições de cultura 68
- Microscopia de fluorescência
- Microscopia confocal a laser
32
33
-- Fases do crescimento celular
Transformação celular
70
71
Aplicações da microscopia de luz nas análises

quantitativas e de padrões texturais 34


- O ambiente das células cm cultura:
substrato, atmosfera, meio c temperatura 71
- Microscopia dctrónica 34
- Contaminação 73
- Microscopia cletrônica dc transmissão 35
- Crioprescrvaçào c banco de células 73
- Microscopia cletrônica dc alta voltagem 35
- Microscopia cletrônica de varredura 36
- Microscopia de tunelamento Capítulo 5
quântico e de força atómica 36 Biomemhran.is 74
Capítulo 4 -Estrutura das membranas biológicas 74
Métodos de Estudo da Célula 38 -Composição química 75
Preparações Citológicas - Aspectos funcionais 83

- Coleta do material biológico 38 - Modulando a composição e fluidez das membranas .83


- Fixação biológica c agentes fixadores - Domínios dc membranas 84

-
40
- Receptores 8-1
Preparação do material para microscopia - Permeabilidade 85
cletrônica dc transmissão
Citoquimica
42
- Aspectos patológicos 88

- Reaçôcs citoquimicas mediadas por Capítulo 6


Junções Celulares 92
ligações cletrostáticas 43
- Reaçôcs citoquimicas mediadas por - lunçôcs intcrcclulares 92
- Junção de oclusão 93
ligações covalentes
• Reaçóes citoquimicas mediadas por
44
-- Junção aderente
Dcsmossomo
97
99
intcraçóos hidrofóbicas 47
- |unçáo comunicante 100
- Citoquimica enzimática 47 - lunções célula-matriz 103

A Célula IX
• (unção dc adesão focal 103 - Ultra-cstrutura 185
- Hemidesmossonto 107 - Métodos de estudo 187
• Conclusões 108 • Composição química 187
- Aspectos funcionais 187

----
Capítulo 7
• O CG durante a mitose 198
Envoltório Nuclear 113
- As membranas nucleares c o espaço perinuclear 113 Capítulo 14
- Os complexos dc poros e a permeabilidade nuclear .114 Lisossomos 199
- O transporte através dos complexos de poro 117 - Estrutura 199
- As lamelas aneladas 121 - A formação dos lisossomos e a segregação
• A lâmina nuclear e a reorganização do das enzimas lisossomais 199
núcleo ao final da divisão celular 1 22 - Origem e destino do material
- A desestruturação do envoltório nuclear digerido nos lisossomos 203
no inicio da divisão celular 126 -Crinofagia 204

Capítulo 8 -Endocitose 204

Cromatina e Cromossomos 128


-Autofagia 206
-Doenças relacionadas aos lisossomos 206

----
- Composição química 1 28
-Organclas relacionadas aos lisossomos 209
- Estrutura da cromatina 131
-Lisossomos dc células vegetais 210
• Níveis hierárquicos dc organização cromaiinica 132
- Os cromossomos metafásicos 133 Capítulo 15
.
- Os cromossomos gigantes: plumosos e politénicos .137 Milocôndria 211
• Heterocromatina e eucromatina 140 - Ultra-cstrutura 212

Capítulo 9 - Composição química 213

Nucléolo 14-1
- Fisiologia 213
- Biogénese 222
- Ultra-cstrutura e classificação dosnucleolus
• Composição química
144
146
- Defeitos mitocondriais 224
-Origem 225
- Organização molecular e papel fisiológico
Capitulo 16
na biogénese de ribossomos 148
• Expressão morfológica da transcrição c Peroxissomos 226
de eventos pós-transcricionais de RNAr 150 • Composição química c aspectos funcionais 227
• O nucléolo durante a mitose 152 -- Biogénese
Importação de proteínas
230
231

Capítulo 10
- Doenças peroxissomais 232

Matriz Nuclear. Domínios Nucleares e Territórios Capítulo 17


Cromossómicos 155 Hidrogcnossomos 236
- Histórico 155 - Distribuição na célula 236

-
Definição
Métodos de estudos
. 155
1 55
- O envoltório do hidrogenossomo
- A vesícula periférica
237
237
- Composição química 156 - A matriz dos hidrogcnossomos 237

- Aspectos funcionais 157 - Semelhanças com mitocóndrias 237


-Patologias 160
• Diferenças das mitocóndrias 238
- Aspectos funcionais 238
Capítulo 11
Ribossomos c Síntese Proteica 161
- Biogénese
- Variações
240
240
•Oribossomo 163

A síntese proléica 164
Capítulo 18
Cioroplastos 242
Polissontos 170
-

Histórico 242
- Bloqueadores da síntese proléica 170
- Ultra-cstrutura 243
Capítulo 12 - Composição química 243
Retículo Endoplasmático 172 - Aspectos funcionais 246
- Métodos de estudo 172 - Fluxo acíclico de elélrons com produção
de ATP. NADPH e fotólise da água
- Composição química 174
- Fluxo cíclico de elétrons
247
248
- Aspectos funcionais 175
• Biogénese 183 - Fotofosforilação 249

Capítulo 13
- Fase bioquímica da fotossíntese 249
- Conversão do carbono fixado em
Complexo de Golgi 185 sacarose e cm amido 250
• Histórico 185

X A Célula
- Ciclo C4 dc assimilação do carbono (CAM)

-
-

-
-

-
-
-
Metabolismo ácido das Crassuláccas
- Folorrcspiração
- Biogenese
- Origem

Capítulo 19
Citoesquelcto
- Actina
- Propriedades funcionais
- Filamentos intermediários
- Composição química
- Propriedades funcionais
- Microtúbulos
- A estrutura dos microtúbulos
- A polimerizado dos microtúbulos

-
Ahidrólise de OTP tem papel importante 11a
instabilidade dinâmica dos microtúbulos
- O centrossomo é o principal centro organizador de
microtúbulos na maioria das células animais
A reorganização dos microtúbulos durante a mitose
• Alguns produtos secundários dc plantas

-
afeiam a polimerizado dos microtúbulos
A estabilizado de microtúbulos pelas proteínas
associadas aos microtúbulos (MAP)
Proteínas motoras são responsáveis pelo transporte
intracelular ao longo dos microtúbulos
- Cílios e flagelos
- Corpos basais
Capítulo 20
Matriz F.xtracclular
Colágenos
Características bioquímicas e estruturais
• Síntese de colágeno

- Fibrilogéncsedas moléculas de colágeno


- Nomenclatura
- Tipos dc colágenos
Protcoglicanos
- Clicosaminoglicanos: os açúcares ácidos da
matriz extracclular

Protcoglicanos da membrana

A formação de uma fibra elástica


basal
Protcoglicanos da superfície celular
Sistema Elástico
- A fibrilina é a principal proteína das microfibrils
do sistema elástico
-
- F.lastina características fundamentais que
garantem sua função elástica

Alguns aspectos da interação entre o sistema elástico


c outros componentes da matriz extracclular

Capítulo 21
Paredes Celulares
- Parede celular de bactérias
Parede celular dc protistas
Parede celular dc fungos
Parede celular dc plantas
250
250
253
255
256

238
258
259
263
265
266
267
268
268

269

270
270

271

271

272
272
274

276

276
277
278
279
279

280
A ligação dos gl icosu111inogl icanos á proteína central 283
- Os protcoglicanos do espaço intercclular 283
286
286

288

289
290

293

295
295
295
296
296
- Parede celular secundária
- Análise microscópica
Capítulo 22
Mitose
- Intérfase
-
Introdução

- Mitose
Capítulo 23
Controle do Ciclo Celular
- Células embrionárias
- Composição química
Capitulo 24
Meiosc
- As fases da meiosc
- Controle molecular da meiosc
• Consequências genéticas da meiosc
- A localização da meiosc nos ciclos de vida
dos cucariotos dc reprodução sexuada
- Consequência da não-disjunção dos
cromossomos na anáfasc
Capítulo 25
Diferenciação Celular
- Inicio da diferenciação celular: a embriogenese
- Os morfógcnos c a indução embrionária
- Determinaçãonocelular
- Modificações estado diferenciado da célula
- Interaçóes entre núcleo e citoplasma
- Diferenciação c proliferação celular

- Transdução de sinais cxtracelularcs


- Controle da diferenciação celular

Capítulo 26
Morte Celular
- Aspectos genéticos c bioquímicos
- Identificação da morte celular
índice remissivo
.
A Célula
300
301

304
304
305
308

318
319
319

332
332
337
338

340

346

348
348
349
351
352
352
355
- A matriz extracclular c a diferenciação da célula . ...356
357
358

36-1
365
368

375

XI
ASPECTOS GERAIS DE
ESTRUTURA CELULAR

Maria Luiza S. Mello

A célula é a unidade básica da vida em que existe uma complementaridade entre estrutura e função.
Essa afirmativa faz parte de uma teoria, denominada teoria celular, estabelecida por Schleiden e
Schwann, em 1838-39. A primeira observação de uma célula, no entanto, já havia ocorrido em 1665,
ocasião em que, ao examinar cortes de cortiça em um microscópio rudimentar, Hooke dera o nome de
célula aos inúmeros compartimentos que observara nesse material. Esses compartimentos, na realida¬
de, representavam espaços (celas) ocupados por unidades mortas.

Apesar dos fragmentos celulares poderem até desen¬


volver algumas atividades importantes, somente a célu¬
la tem a capacidade de manter vida e de transmiti-la.
Pode-se, pois, concluir que os vírus não são unidades
de vida, porque não podem manter-se independente¬
mente da célula que infectam.
As células surgem apenas de outras células pre¬
existentes. As formas mais simples de vida são células
solitárias (organismos unicelulares), enquanto as for¬
mas superiores contém associações de células, consti¬
tuindo colónias de organismos unicelulares ou consti¬
tuindo organismos multicelulares, mais complexos. Os
organismos unicelulares podem ser estrutural e fun¬
cionalmente mais simples, como bactérias, ou mais
complexos, como protozoários. Nas associações de
células com diferentes especialidades ou divisão de tra¬
balho estará ocorrendo uma contribuição para a sobre¬
vivência do indivíduo. O que diferencia colónias de
unicelulares de organizações multicelulares é que, nas
últimas, as células de mesmo tipo podem se apresentar
ligadas por uma matriz extracelular, adesões entre
membranas ou, ainda, pontes citoplasmáticas.
O biologista celular atua identificando tipos
celulares e seus componentes, compreendendo a orga¬
nização estrutural desses elementos e de suas respecti¬
vas funções. Visualiza a célula não apenas como uma
entidade individual completa, mais simples ou comple¬
xa, mas também como parte de suas associações. Figura 1.1 Algumas formas celulares: a. Amoeba proteus (cortesia de
O avanço do conhecimento no campo da biologia Marlene Ueta). b Óvulo de rata corado com hematoxàna férrica. c.
Células vegetais de Lyeopodium sp coradas com safranina e fast green
celular dependeu, e ainda depende, de progresso d. Acetabularia catycutus, cada haste com chapéu é uma célula (cortesia
metodológico e instrumental. Como os diversos compo- de Marlies Sazimaj.

A Célula 1
Capitulo 1 ASPECTOS GERAIS DE ESTRUTURA CELULAR

Figura 1.2 Formas celulares irregulares.


a. Hefeozoàrio (cortesia de Marlene Ueta).
b. Trypanosoma cruzi (seta) em meio a eritró-
otos (cortesia de Martene Ueta).
c. Espermatozóides de touro em microscopia
de contraste de fase
d. Astrócitos (setas) impregnados por prata
(cortesia de Iara M. Silva de Luca).
e. Célula calioforme (sela) de intestino grosso
de rato. corada por PAS-bematoxilma. com seu
núdeo (n) na porção celular basal.

nentcs celulares apresentam índices de refraçào próxi¬ de DNA do que as de procariotos. Células humanas, por
mos entre si, a observação de células em um microscó¬ exemplo, contém cerca de 1.000 vezes mais DNA do que
pio de luz comum se torna dificultada, questão que pas¬ células bacterianas. 1'or outro lado, nas células eucario¬
sou a ser resolvida quando os materiais biológicos tas, dada a sua complexidade, o material genético requer
passaram a ser fixados c evidenciados por meio de rea- uma regulação (controle) muito mais complexa do que
çòes com um produto final corado e/ou examinados a das células procariotas.
com outros tipos de microscopia, mais complexos. A fi¬ Entre o núcleo e o plasmalema existe uma subs¬
xação ideal é aquela que melhor preserva a estrutura e tancia aparentemente amorfa e homogénea, se exami¬
a composição da célula. As reaçòes de coloração podem nada em microscópios mais simples, na qual se distri¬
destinar-se a evidenciar aspectos morfológicos celulares buem corpúsculos de diversas formas e tamanhos,
ou a identificar componentes químicos celulares. Os compartimentalizados por membranas lipoprotéicas, as
detalhes ultra-estruturais e citoquímicos das organelas organelas citoplasmáticas. Como já mencionado ante¬
celulares tornaram -se particularmente acessíveis com o riormente, foi apenas com o advento do microscópio
advento da microscopia eletrónica, a partir de 1950. eletrónico e de metodologias bioquímicas e fisiológicas
As células são revestidas por uma membrana que o conhecimento da subestrutura dessas organelas e
plasmática, também denominada plasmalema, de cons¬ de seus atributos funcionais pode ser estabelecido. Ao
tituição lipoprotéica. Células mais simples não apresen¬ microscópio de luz, no entanto, podem ser evidencia¬
tam núcleo (procariotos), enquanto as mais complexas das, com metodologia apropriada, regiões ocupadas por
contém um ou vários núcleos (eucariotos). Células mitocôndrias, lisossomos, peroxissomos, cloroplastos,
eucariotas são produtos posteriores da evolução, tendo complexo de Golgi, centríolos, vacúolos e grânulos de
desenvolvido compartimentalizaçào do material genéti¬ secreção. Os componentes que são encontrados nas
co no núcleo, separado dos constituintes citoplasmáti- células podem até ser catalogados como comuns a mui¬
cos. As células de eucariotos contém maior quantidade tas delas, mas sua estrutura varia conforme cada tipo

2 A Célula
particular de célula. Embora células animais e vegetais Muitas vezes a forma celular pode auxiliar em um
tenham muitas características em comum, uma diferen¬ diagnóstico. Ex.: os eritrócitos humanos, normalmente
ça fundamental é a presença de cloroplastos em células discos bicòncavos em sua porção central, tornam-se lai¬
vegetais, o que lhes permite realizar a fotossíntese. Além cizados (forma de foice) em condições de baixa tensão de
disso, células vegetais são revestidas por uma rígida pa¬ oxigénio, em portadores de anemia falciforme (Figuras
rede contendo celulose e outros polímeros. 1.3a e 1.3b). Outro exemplo é a diversidade de formas
As particularidades estruturais e fisiológicas das dos protozoários e de bactérias, que pode fazer com que
diversas organelas celulares, bem como os processos se identifiquem e até se classifiquem diferentes géneros.
metodológicos para o seu estudo, serão abordados em O tamanho celular oscila entre amplos limites. A
diversos capítulos deste livro. maioria das células atinge poucos pm de diâmetro ou
comprimento. Há, no entanto, células muito maiores,
como o óvulo humano, com 0,2 mm de diâmetro, e
óvulos de aves, com vários milímetros de diâmetro.
Formas e tamanhos celulares Dentre as células gigantes, a Acctabularia, alga verde
As células podem apresentar estrutura e forma variadas, marinha unicelular, pode atingir 10 a 12 cm de altura
geralmente associadas a especializações funcionais. As (Figura I.Id ) e 110 homem, as fibras nervosas da medu¬
células contém muitas moléculas diferentes que intera¬ la espinhal que enervam os músculos do pé podem
gem em ambiente aquoso e que são compartimentaliza- atingir cerca de 1 m. No outro extremo, os microrganis¬
das por membranas lipoprotéicas. No estabelecimento mos causadores da pleuropneumonia (PPEO) atingem
de uma forma celular, a organização de um componente, 0,25 a 0,10 pm de diâmetro.
o citoesqueleto, composto por redes de fibras 011 filamen¬
tos protéicos, exerce um papel preponderante. De modo
geral, as formas celulares dependem da tensão superfi¬
cial. da viscosidade do protoplasma, da ação mecânica Generalidades sobre o
que exercem as células contíguas, da rigidez da membra¬ núcleo interfásico
na plasmática e da especialização funcional da célula.
A maioria das células, especialmente de organis¬ O núcleo, sendo mais facilmente corável do que os ou¬
mos muit iceiulares (metazoários), exibe uma forma fixa tros componentes celulares e, também, graças a seu ta¬
e típica. Há, no entanto, células com forma mutável, manho. foi descoberto mais cedo, como parte integran¬
como vários protozoários (Figura 1.1a) e leucócitos. te das células eucariotas, tendo sido descrito em 1833,
Dentre as células de forma fixa, existem aquelas em que por Brown. O estudo do citoplasma foi posterior, pelas
a forma é regular, seja esférica (ex., óvulo (Figura 1.1b) dificuldades técnicas já mencionadas.
ou linfócito humano (Figura 1.4d)l, prismática (ex., A medida que as técnicas de estudo foram se apri¬
células vegetais (Figura 1.1c)) ou irregular típica [ex., morando, foi sendo estabelecida a importância vital do
alguns tipos de células vegetais (Figura 1.1d), protozoᬠnúcleo para a vida celular, culminando-se com a com¬
rios (Figuras 1.2a e 1.2b), espermatozóides (Figura 1.2c), provação de que suas principais funções seriam a de
neurónios, astrócitos (Figura 1 .2d), células caliciformes transmissão de caracteres hereditários e a de supervisão
(Figura 1.2e) e células descamadas da mucosa bucal e da atividade metabólica da célula. O núcleo se forma a
vaginal |. partir de outro núcleo preexistente, por divisão, que po¬
de ser sincronizada ou não com a divisão celular.
O núcleo se acha presente em todas as células dos
eucariotos, à exceção daquelas que o perderam em algu¬
ma etapa de sua vida (ex.: eritrócitos de mamíferos).
Nos procariotos, embora não ocorra um núcleo típico,
, 00C0 OOcc "< o DNA se distribui numa região bem definida, com
morfologia característica, denominada nucleóide.
rÁC0Ot 'Ô 0
0So<2o0<?>r. <
- Tanto a forma como a posição do núcleo são in¬
fluenciadas pela própria forma da célula e pelas condições
morfológicas e funcionais do citoplasma. Nas células esfé¬
ricas e cúbicas, o núcleo apresenta forma geralmente esfé¬
rica (Figuras 1.1b e 1.4d), nas prismáticas e fusiformes, é
elipsoidal ou alongado e, cm ambos os casos, está posicio¬
nado 110 centro da célula (Figuras 1.4a, c, d). Nos leucóci¬
Figura 1.3 Formas celulares irregulares, a. Eritrócitos humanos normais
tos, pode ter forma bastante irregular (Figura 1.4c). Nos
vistos ao nwoscopio de polarização, b. Eritrócitos humanos em anemia
falciforme. As setas indicam eritrócitos falcizaóos. espermatozóides, a forma nuclear pode ser alongada ou

A Célula 3
Capitulo 1 ASPECTOS GERAIS DE ESTRUTURA CELULAR

'/
i

i
c
. — ÿ
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vLa
•w
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e
B
Figura 1.4 Forma e posição de núcleos de alguns tipos
celulares.
a. Fibroblastos com respectivos núcleos fusiformes
(seta) em feixes de cOágeno de tendão de rato. após
coloração com azul de tofukína.
b. Núcleos multiestrelados em células glandulares de
uma Ogarrinha-das-pastagens.
c. Eritrootos elipsoidais com núcJeo central em sangue
de pombo corado com Giemsa.
d. linfóoto humano corado com Giemsa.
e. Neutrófilo humano corado com Giemsa, sai-entando
núcleo multóobado.
f. Células epiteliais de glândula submaxilar de rato
mostrando núcleos deslocados para a porção basal da
célula, após coloração com hematoxilina-eosina.
g. Células adiposas de coelho, mostrando núcleo deslo¬
cado para o bordo celular (seta), após coloração com
hematoxiiina-eosina.
então ser irregular, variando conforme o grupo animal. que o mesmo não estava se dividindo, havia presença em
Em lepidópteros e em cigarrinhas-das- pastagens, as célu¬ seu interior de um ou mais corpos bem evidenciáveis
las glandulares apresentam núcleos estrelados (Eigura (nucléolos), de um componente filamentoso ou granu-
1.4b). Em células glandulares de outros organismos, loso (cromatina), onde se situa o DNA, e de um compo¬
geralmente, o núcleo se localiza na porção basal celular nente fibroso ou de aparência amorfa (matriz nuclear).
(Eiguras 1.2c e 1.4f).Em células adiposas de vertebrados, Comprovou-se ser o núcleo revestido por um envoltório
o núcleo é alongado c deslocado pelos vacúolos de gordu¬ nuclear membranoso. Durante a divisão celular, a cro¬
ra para a periferia celular (Eigura 1.4g). matina aparece sob a forma de unidades mais individua¬
A maioria das células é mononucleada, porém, lizadas, que são então denominadas cromossomos.
em hepatócitos, músculo estriado, células somáticas
de muitas espécies de insetos e células em cultura, po¬
de ocorrer mais de um núcleo (Figuras 1.5a e 1.5b). Interações
O tamanho do núcleo também pode ser variado,
correlacionado ao seu conteúdo de DNA e ao grau de núcleo-citoplasmáticas
ploidia da célula, bem como à sua atividade funcional, A importância do núcleo no comando do metabolismo
que implica em conteúdos variáveis de RNA e proteí¬ celular é bem salientada com as experiências de mero-
nas nào-histônicas (Eigura 1.5c). tomia, em que algumas partes celulares são removidas.
Desde as primeiras observações do núcleo lixado Balbiani, utilizando técnicas de micromanipulaçào, sec¬
e corado, comprovou-se que, durante a intérfase, fase em cionou um protozoário ciliado do género Slenlor em

4 A Célula
« .• •
• •• .•
4 génio, o que não acontecia na porção anucleada, na qual

••• • •• .A* >• i


o glicogênio permanecia acumulado e não era utilizado,
pois faltava o comando para o consumo de energia.
No sentido inverso, o citoplasma é importante para
o metabolismo nuclear. Isso pode ser bem exemplificado
•• •
Ba quando se considera a ação de hormônios na regulação
génica de organismos superiores. Alguns exemplos são
\\ •* V» citados a seguir. Corticosteróides induzem à síntese de
muitas enzimas no fígado, aumentando a síntese de RNA
nos núcleos de suas células. O fornecimento de 50 pg de

>5% %• \ estradiol a ratas induz um aumento de até 342% no volu¬


me nuclear das células epiteliais do útero. Nas células vege¬
tais, o volume nucleolar é maior no fim do dia, mostran¬
do que a produção de energia cm nível dos cloroplastos
•• no citoplasma pode influenciar o metabolismo nucleolar.
Experiências de transplante de núcleos de células
• • diferenciadas (ex., células epiteliais de intestino e eri-
trócitos nucleados em anfíbios, e células epiteliais mamá¬
ffi&BãHH ÿSSwEifii
I- 1 ÿflvlyy I rias em maniiferos), por micromanipulaçào para óvulos
ou zigotos anucleados com a produção final de uma
ficrSe** certa porcentagem de indivíduos completos normais
S$5Í®
-i". hp (clonagem), seja de rãs, ovelhas (Dolly) ou macaco (um
.- único relato de sucesso), indicam a potencialidade nucle¬
ar de retorno a expressões anteriores do desenvolvimento,
.

sob influência do citoplasma hospedeiro. Afetada pela


atuação citoplasmática, a própria duração do ciclo celular
muda tie mais lenta, nas células somáticas de onde foram
retirados os núcleos, para muito mais rápida no zigoto.

a
Nos vegetais, também é bastante comum a obtenção de
uma planta inteira a partir de culturas de células de raiz ou
folha, uma prática muito disseminada com vistas a pro¬
gramas de melhoramento e produtividade.

Figura 1.5 Número e tamarvho <Je núcleos celulares, a. Células mooo e bi-
nucleadas (sela) em hepaiõotos de rato. após coloraçãocom hematoxfcna-
eosna b. Células mooo e bmucleadas (sela) em cultura celular de Triatoma O sucesso da clonagem de primatas
infestans corada com Giemsa. Os diferentes tamanhos nucleares se refe¬
rem a diferentes graus de picada, c. Núcleos de diferentes tamanhos cor¬
comprometido por perda de estruturas
respondentes a diferentes graus de picada (d. rfcplóxfe; p, poliplóide: hp, citoplasmâticas críticas4
aíamente poliplóide) em Triatoma infestans. após reaçào de Feulgen. A transferência de núcleos de células somáticas para
Fotografa captada da tela de um video-ana&sador de imagem após pseudo-
cQonzaçào (Maria luza S. Mello & Beoedicto de Campos Vidal). óvulos anucleados em primatas nào-luimanos foi
inicialmente admitida como instrumento para acele¬
diversas parles, algumas tendo ficado com partes do rar a pesquisa no campo médico, contribuindo para
núcleo e outras não. Verificou, então, que as partes anu- a produção de animais idênticos destinados á investi¬
cleadas degeneravam, enquanto as nucleadas davam gação e para o entendimento do potencial das célu¬
origem a uma nova célula. Experiências semelhantes, las- tronco.
em que se seccionavam as células em duas partes, uma No entanto, relatos recentes' apontam para sérias
contendo o núcleo e a outra não, foram realizadas em dificuldades nesse campo. Quando se inseriram núcleos
alguns outros organismos, particularmente em amebas, de células somáticas em oócitos anucleados de macacos
por Brachet. Este verificou que, na porção anudeada rhesus, removendo-se nesse procedimento o fuso meióti-
das amebas, cessava a emissão de pseudópodos, dada a co, manifestaram-se alterações nas fases de divisão celular
alteração na viscosidade do citoplasma, havendo uma que se seguiram. lais alterações passam a se processar
tendência de que esse corpo celular anucleado se tor¬ durante a formação dos fusos mitóticos, que se tornam
nasse esférico, seguindo-se a sua degeneração. Por outro desarranjados por falhas ao nível de alguns tipos de cine-
lado, a porção que permanecia com o núcleo utilizava sinas nos centrossomos (ver Capítulo 19). As anomalias
rapidamente as reservas celulares sob a forma de glico- surgidas nos fusos mitóticos levam a um mau alinhamen-

A Célula 5
Capitulo 1 ASPECTOS GERAIS DE ESTRUTURA CELULAR

to cromossòmico e a uma segregação cromossômica desi¬


gual, sendo produzidos embriões aneuplóides c inviáveis.
Essesachados estão levando os autores a serem pes¬
simistas quanto à clonagem de primatas não-humanos em
futuro breve.

Referências bibliográficas

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Molecular biology of the cell. 4' ed. New York: Garland
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In: Biologia celular. Vidal BC, Mello MLS. Rio de Janeiro:
Livraria Atheneu, 1987. p. 53-62.
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Gosman G, Chong K-Y, Takahashi L), Chace C, Compton
1). Hcwitson L, Schatten G. Molecular correlates of pri¬
mate nuclear transfer failures. Science 2003: 300: 297.

6 A Célula
MOLÉCULAS IMPORTANTES PARA A COMPREENSÃO
DA CÉLULA E DO SEU FUNCIONAMENTO

Angelo Luiz Cortelazzo

A análise e a compreensão da célula e de todo o seu funcionamento vêm ganhando importância nas mais
diferentes áreas do conhecimento.Todas as formações da área biológica e da saúde requerem, como ponto de
partida, essa compreensão. Além destas, o avanço da ciência, a crescente importância da biologia molecular e
a necessidade de um entendimento interativo dos fenómenos da natureza tem agregado a esse grupo profis¬
sionais das áreas de engenharia, química, física, jornalismo, direito etc. Essa agregação, cada vez mais
numerosa, faz com que deva existir um conhecimento da célula como uma estrutura dinâmica, fisiologica¬
mente ativa, organizada e funcional.
Deste modo, inicia-se o estudo da célula a partir de seus constituintes químicos, principalmente aqueles
com organização macromolecular e que exercem papéis fundamentais nasua estrutura e funcionamento.
Não foi objetivo deste capítulo esgotar o assunto, muito menos ser uma referência bioquímica para os
estudantes e os professores que se valerem do presente livro. Antes de tudo, o que se pretendeu foi apresentar
as principais moléculas que têm função biológica e recordar algumas de suas características. A idéia foi cons¬
truir um texto que sirva para a compreensão dos demais capítulos e que seja a base para leituras mais apro¬
fundadas, estas sim, feitas em livros de química e bioquímica que tratam do assunto.

Agua for novamente disponibilizada, germinar e originar


Formada por dois átomos de hidrogénio e um de oxigé¬ um novo individuo.
nio, trata-sc de molécula imprescindível para a vida em Em termos químicos, o oxigénio (número atómi¬
nosso planeta. Fm alguns organismos, ela pode repre¬ co 8 - ls\ 2s\ 2p\ ou K = 2 e L = 6) necessita de dois
sentar quase 100% da massa da matéria fresca <98% nas elétrons para adquirir sua estabilidade. O hidrogénio
águas-vivas) e chega, no ser humano, a cerca de 65% da (número atómico 1 - ls', ou K = 1 ), de apenas um elé-
massa corpórea do indivíduo adulto. tron para completar sua subcamada ls. Deste modo,
A simples presença da água garante que as de¬ dois átomos de hidrogénio são necessários para estabi¬
mais moléculas formem o fluido celular e atinjam seus lizar um átomo de oxigénio e, dado que na subcamada
destinos, seja de forma casual, seja de forma mediada "p" os ângulos entre os orbitais são de 90', esperar-se-ia
por receptores ou outras maneiras de reconhecimento que as moléculas de água fossem angulares e com essa
e de movimentação. A troca gasosa nas células animais abertura. Entretanto, o ângulo correio entre as ligações
só se dá a partir da dissolução de oxigénio e gás car¬ é de 104,5 graus (Figura 2.1 ).
bónico no sangue e no citosol. Fm plantas, a água é
responsável pela pressão de turgor que viabiliza o cres¬
cimento celular e, por meio de sua maior ou menor
disponibilidade no vacúolo, pode participar de fenó¬
menos mais complexos, como a abertura e o fecha¬
mento das células-guarda dos estòmatos. Normal¬
mente, uma redução em 20% de seu conteúdo pode
provocar a morte celular. Fm contrapartida, em muitas
sementes, seus níveis atingem valores inferiores a 10% Molécula Forma teórica Forma real
e isso possibilita que tais estruturas de propagação per¬ de água (90') (104-30 )
maneçam em um estado denominado quiescente, com
baixíssimo metabolismo, e que possam, quando a água Figura 2.1 Características estruturais da molécula de água.

A Célula 7
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

Essa "deformação" pode ser explicada pelo fato tância entre elas se torna pequena o bastante (entre 0,2 e
de que o oxigénio, muito mais eletronegativo que o 0,3 nm) para originar as chamadas ligações (pontes) de
hidrogénio, acaba tendo uma maior atração pelos elé- hidrogénio e todas as consequências fisico-quimicas que
trons do compartilhamento e, com isso, se torna "nega- isso representa. As ligações de hidrogénio também ocor¬
tivado". Do mesmo modo, os hidrogénios acabam se rem entre moléculas que contenham hidrogénio ligado
tornando "positivados", criando uma repulsão que os covalentemente a átomos fortemente eletronegativos
afasta do ângulo teórico de 90" para a situação real de (em geral, biologicamente, oxigénio ou nitrogénio), com
104 30'. átomos muito eletronegativos da mesma molécula ou de
Em consequência dessa polaridade, as moléculas outra que esteja próxima.
de água se atraem umas às outras, criando novas intera- Utilizando a mesma lógica, pode-se concluir que
ções presentes tanto no estado sólido quanto no líquido. as moléculas apoiares não são atraídas pela água e, por
Essas interações, denominadas ligações ou pontes de isso, elas são, em geral, insolúveis. Ror não se misturarem
hidrogénio, dificultam a separação entre as moléculas e à água, elas são ditas hidrofóbicas.3 As interações hidro¬
fazem com que haja a necessidade de uma maior quan¬ fóbicas são importantes na determinação da estrutura
tidade de energia para que ocorra essa separação. Em de muitas moléculas biologicamente importantes.
outras palavras, isso determina que o seu ponto de fusão Einalmentc, pode-se classificar um tipo dt* molé¬
e de ebulição seja muito superior ao de outras molécu¬ culas que apresenta duas regiões distintas: uma hidro-
las cuja massa é maior ou que apresentam a mesma fóbica e outra hidrofilica (sabões, por exemplo, como
forma geométrica, como mostra a Tabela 2.1. será visto mais adiante). Essas moléculas são denomi¬
Devido a sua natureza polar, a água pode atrair nadas antipáticas. Sua região polar pode interagir com a
regiões também polares de outras moléculas e isso resul¬ água e a apolar, apenas com outras moléculas apoiares.
tarem uma separação dessas moléculas, com consequente
dissolução das mesmas. De forma simplificada, imagine
isso quando uma colher de sal de cozinha (Na Cl ) é colo¬
cada em um copo com água: os íons Na são atraídos pelo
Moléculas e íons inorgânicos
oxigénio e os íons Cd , pelos hidrogénios, havendo assim a A exemplo da água, outras moléculas inorgânicas e íons
dissociação do sal. Raciocínio semelhante pode ser feito fazem parte dos organismos vivos, além do mundo
para o açúcar, que apresenta ligações covalentes, mas tam¬ mineral. Esse grupo de substâncias, chamado generica¬
bém é uma molécula polar e, desse modo, também é mente de sais minerais, apresenta múltiplas funções:
atraída pelos pólos opostos da molécula de água e dis¬ quando insolúveis, podem ter função estrutural (p. ex.:
solvido na mesma. Desse modo. substâncias polares são cálcio e fosfato nos ossos de vertebrados); podem se
também denominadas hidrofilicas.a associara moléculas maiores, como pigmentos (magné¬
Em muitos casos, a atração entre a molécula de sio na clorofila) e proteínas (ferro na hemoglobina; fer¬
água ou uma hidroxila pertencente a uma molécula qual¬ ro e enxofre nos citocromos); podem exercer papel
quer e a outra molécula polar é de tal ordem que a dis¬ tamponanteÿ (bicarbonatos no sangue, fosfato no cito-

Tabela 2.1 Características de algumas moléculas em comparação com a água.

Fórmula Forma Massa Ponto Ponto de


Molécula molecular geométrica Molecular de fusão' ebulição'

Água "2° I angular 0 100


Gás HjS j angular 34 -83 -60
sulfídrico-
Metanol ~CH3ÕH™ tetraédrica 32 -98 65
Clorofórmio CHjCI 'tetraédrica 50.5 •63 61
-J

Benzeno c6h6 cíclica (plana; 78 1 80


Pressão de atmosfera: ' o enxofre é um elemento da mesma fami&a que o
oxigénio, mas menos eletronegativo.
J Do grego: filia- afinidade por; fobia - «mio por. ojeri/a por.
Kxereer papel lamponanic: funcionar como solução tampão. Solução tampão t aduela que tem veu ptl mars ou menos constante mesmo quando se adiciona
certa quantidade de Acido forte ou de base forte.

8 A Célula
sol), na transferencia de energia química (fosfato do
ATP), nos impulsos nervosos e equilíbrio osmótico das
Carboidratos
células (sódio e potássio), contração muscular (cálcio) e Carboidratos, sacarídeos ou açúcares podem ser defi¬
uma infinidade de outras funções que serão abordadas nidos quimicamente como poliidroxialdeídos ou polii-
em cada um dos capítulos que se seguem e tratam das droxicetonas. Deste modo, os mais simples possuem
organelas celulares. três carbonos, com dois grupos hidroxila e um grupo
carbonila.
Em termos de complexidade, pode-se dizer que
temos monossacarídeos que nào podem ser hidrolisa¬
Moléculas orgânicas dos4' para açúcares menores e polissacarídeos que, ao
As moléculas orgânicas que fazem parte dos organismos contrário, podem ser hidrolisados a diversos monossa¬
vivos são de natureza bastante variada. Entretanto, em carídeos. Para açúcares que podem ser convertidos em
sua maioria, são formadas apenas por seis elementos dois a até cerca de vinte monossacarídeos comumente
químicos: carbono, hidrogénio, oxigénio, nitrogénio, dá-se o nome de oligossacarideos e, conforme o núme¬
fósforo e enxofre (CHONPS). Esses elementos, associa¬ ro de monòmeros originados, o prefixo correspondente
dos a outros que aparecem com menor frequência, for¬ (dissacarídeos, trissacarídeos etc.). Ê comum, ainda, en-
mam as substâncias necessárias para a vida no planeta, contrar-se o termo OSE para classificar monossacarí¬
juntamente com a água e os sais minerais. deos e OSÍDEO para oligo e polissacarídeos.
Dentre os compostos orgânicos, a associação de
moléculas para a formação de polímeros ou outras molé¬ Monossacarídeos
culas maiores é comum e as principais classes de substân¬ Biologicamente, encontra-se monossacarídeos com 3 a
cias dessa natureza sào os carboidratos, os lipídios, as pro¬ 7 átomos de carbono que, segundo sua origem aldeidi-
teínas c os ácidos nucléicos que serão, juntamente com ca ou cetónica, podem ser classificados em aldoses ou
seus monòmeros formadores, tratados em separado. cetoses. Podem também receber o prefixo que corres¬
As demais moléculas, a exemplo do que ocorre ponde à quantidade de carbonos da molécula (trioses,
com os sais minerais, podem ter natureza diversa e exer¬ tetroses, pentoses, hexoses e heptoses).
cer múltiplas funções. Mesmo para os seres heterotró- Na Figura 2.2 são apresentadas as fórmulas estru¬
ficos,c grande parte delas pode ser sintetizada pelo turais planas de alguns desses açúcares.
próprio organismo ou serem incorporadas na dieta. A exceção da diidroxicetona, todos os demais
Como exemplos de importância, principalmente para o monossacarídeos apresentam pelo menos um Carbono
homem, podem ser citados alguns aminoácidos nào- quiral (assimétrico) e, portanto, são opticamente ativos.0
protéicos como a carnitina (que auxilia a entrada de Açúcares com 5 ou mais átomos de carbono sào
ácidos graxos nas mitocôndrias) e a ornitina (participa mais estáveis em sua forma cíclica (há equilíbrio entre
no ciclo da uréia); as vitaminas (a maioria delas neces¬ a forma alifática (aberta 1 e a forma cíclica, mas com
sária na dieta) e os hormônios (sintetizados pelo pró¬ forte predominância da segunda) e ela se desenvolve a
prio organismo). partir da reaçào entre o grupo carbonila e a hidroxila
As vitaminas sào necessárias em pequenas quanti¬ do último carbono quiral (a ligação é denominada
dades e auxiliam em inúmeros processos metabólicos. hemiacetal).
Podem ser subdivididas em hidrossolúveis ou solúveis Veja o exemplo:
em água (vitaminas do complexo B (BI ou tiamina, B2
ou riboflavina, niacina, piridoxina, ácido pantoténico,
biotina, ácido fólico e B12 ou cobalamina| e a vitamina
C) e lipossolúveis ou solúveis em lipídios (vitamina A, 1), H H
E e K). Má ainda outras substâncias relacionadas às vi¬ I I
taminas, como a colina, o ácido p-aminobenzóico, ácido R-C-Q + R'— OH R-C- OH
lipóico e inositol.Muitas destas serão lembradas ao longo I
dos capítulos, ao abordar a fisiologia das diferentes ir-o
organelas celulares.

cOrganismos incapazesde sintetizar todas as moléculas no.css.uus ao seu metabolismo, necessitando ingerir essas moléculas em sua dieta.Ao contrário, os seres
autotróficos sJo capa/es de sintetizar o próprio alimento.
''Hidrólise: rots áo cm que umcomposto é quebrado cm dois outros, menores, com a adiç-So de uma molécula de Jgua (etimologicamente: quebra com a agua).
c Substâncias que apresentam isomer ia óptica. Deste modo. haserá pelo menos um par de enantiómeros (um dextro-rotatório e um levo-rotatórm).

A Célula 9
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

Trioses Tetroses Pentoses Hexoses


Aldoses

"s? 9 9
H-C-OH
9 9
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH 1 H-Ç-OH HO-Ç-H
CH.OH
H— Ç— OH H-Ç-OH
H-Ç-OH
CH.OH
CH.OH H-Ç-OH
CH.OH
GliceraJdeido Entrose Ribose Glicose

Figura 2.2a. Atgumas aldoses.

Cetoses
CH.OH
CH.OH
CH.OH
CH.OH
9m° 9~°
ǻ0 H-C-OH
9.0 H-C-OH
1
HO-C-H

CH.OH H-C-OH H-Ç-OH


CH.OH
CH.OH H-Ç-OH
CH.OH
Diidroxtcetona Entrutose Ributose Frutose
Figura 2.2b. Ak)umas cetoses.

E agora com a glicose: A seguir, são listados alguns monossacarídeos

--
bastante abundantes e comuns nos organismos vivos,
H-C: o sua ocorrência e importância celular:
H-C; oh a) Pentoses:
O OH • ribose e desoxirribosc (aldoses) - importantes
HO-C - H
constituintes dos ácidos nucléicos (RNA e DNA respec¬
H~C:- oh OH HOl
OH H
f H tivamente).
H-C - OH H H ÔH •xilosc e arabinose (aldoses) - presentes em gli-
H-C oh coproteínas e em paredes celulares de muitas plantas.
H • ribulose (cetose) - importante na incorporação
Forma aberta da glicose u-glicose (Vglicose de CO. na fotossíntese.

b) Hexoses:
Em termos de representação plana, normalmente • glicose (aldose) - também conhecida como dex¬
coloca-se a hidroxila para baixo (a) ou para cima (|i) trose, é bastante abundante. Única fonte de energia uti¬
do ciclo formado pela ligação hemiacetal. lizável pela maior parte dos organismos anaeróbios e
Em termos espaciais, a hidroxila na posição a também por alguns órgãos e tecidos de animais mesmo
está situada em um plano perpendicular à parte fecha¬ em aerobiose (cérebro humano, por exemplo). É pro¬
da da molécula, enquanto a denominada forma [5, duto primário da fotossíntese dos vegetais e está pre¬
ocupa praticamente o mesmo plano. sente em abundância em muitas frutas onde forma,
juntamente com a frutose, o dissacarideo sacarose. É
encontrada na corrente sanguínea, na qual se mantém
em concentração mais ou menos constante (glicemia,
que no homem varia de -65 a 1 10 mg/dl de sangue).
Como não requer digestão, pode ser iniciada direta-
mente de maneira intravenosa. Sua presença na urina
humana (glicosúria) é indicativa da diabetes mellito. É o
monômero que origina importantes polissacarídeos
como celulose, amido e glicogénio.

10 A Célula
•frutose (cetose) - também conhecida como levu- dação da hidroxila do Carbono 6 das hexoses, forman¬
lose, é o mais doce dos açúcares (quase duas vezes mais do ácidos urónicos, nome genérico dado ao produto
que a glicose) e está fortemente presente em frutas e no dessa oxidação. Assim, glicose pode se transformar em
mel, muitas vezes ligada á glicose para formar o dissaca- ácido glicurónico, galactose em ácido galacturònico e
rídeo sacarose. Apresenta a mesma fórmula molecular assim por diante (Figura 2.3).
que a glicose (C6Hl206), mas sua estrutura em anel é É também comum a formação de ésteres de fos-
pentamérica (como as aldopentoses). fato& a partir da reaçáo das hidroxilas do açúcar com
•galactose (aldose) - difere da glicose apenas pela grupamentos fosfato livres ou provenientes de molécu¬
posição da hidroxila do Carbono -1 (por isso denomina¬ las de ATP (Figura 2.4).
da epimero1 da glicose) e seu metabolismo no fígado Também ocorrem reações de aminaçâo e/ou aceti-
origina esse açúcar. Está presente em muitas glicoproteí- lação, que podem resultar na formação de aminoaçúcares
nas, glicolipídios e em muitas paredes celulares vegetais. (Figura 2.5), importantes em muitos polissacarídeos.
Os grupamentos carbonila dos açúcares lhes Finalmente, há açúcares modificados que são
conferem caráter redutor (reduzem o outro composto importantes componentes da matriz extracelular e do
que com eles reage). Pode haver também a oxidação das sistema nervoso dos animais, como é o caso do ácido
hidroxilas presentes e a mais comum se refere à oxi¬ siálico, por exemplo, ou do ácido murámico que é um

Oil OH Oft

OH

OH OH OH OH
HO OH HO OH OH
OH H OH H OH
Glicose Ácido Ghcurôn>co Galactose Ácido Galacturònico

Figura 2.3 A gbcose e alguns de seus derivados.

GitceraWeido-3-fosíalo
Figura 2.4 Exemplos de açúcares fosforilados.

OH OH

HO

OH OH OH
HO OH OJt

NH

Glicosamina Galactosamwa N-AceM-Gtaosamina


Figura 2.5 Exemplos de aminoaçúcares.

'-I.O.
punem nome dado a
oo dos,açúcares «)ue diferem apenas na posiçio da hidroxila de um de seus átomos de carbono ( galactose e glicose - (M; glicose e manose

sfto exemplo» de epimeros).


s Reaçáo de esteritkaçio: álcool (do açúcar) + ácido (fosfórico) = cSter (de fosfato) ÿ
água.

A Célula II
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

componente das paredes celulares de bactérias. Do rídeo de reserva nas plantas é o amido, enquanto nos
mesmo modo, vitamina C (ácido ascórbico) e mio-ino- animais, é o glicogénio, exemplos de homopolissaca¬
sitol (hexa-álcool derivado do ciclo-hexano) também rideos da a-glicose.
podem ser considerados derivados das OSliS. O amido apresenta dois polímeros de glicose: a
amilose, linear e apenas com ligações al—>4; e a ami-
Dissacaridcos lopectina, com glicoses ligadas al—>4 e com ramifi¬
Ligação de dois monossacarideos ocorre entre suas hi- cações formadas por ligações al—>6 que ocorrem a
droxilas, com formação de água. É chamada ligação gli- cada 20 a 30 glicoses.
cosídica e forma os dissacaridcos (Figura 2.6). O glicogénio é formado apenas por um único
Os mais comuns são: polímero semelhante ã amilopectina, mas mais rami¬
a) celobiose, cuja fórmula foi usada no exemplo (duas (5- ficado que esta (ramificações a cada 8 a 12 resíduos de

glicoses com ligação |5 1 >4 ) J.
b) maltose [duas glicoses (normalmente uma a e uma P
glicose).
For se tratar de ligação formada por monòmeros
com ligação «l->4)[. em sua forma a, esses polímeros têm uma conformação
c) lactose [uma [5-glicose e uma p-galactose, com liga¬ espacial mais helicoidal, formando grãos ou estruturas

ção (51 >4 1.
d) sacarose [uma a-glicose e uma [i-frutose com liga¬
globulares e permitindo a existência de espaços intra-
moleculares vazios que facilitam o acesso das enzimas
ção ol —>2)[. digestivas (amilases por exemplo) (Figura 2.7). íi tam¬
bém nessa característica que se baseia a reação com io-
Oligossacartdeos do/iodeto que serve para identificar essas reservas.
Nome dado a moléculas que apresentam até cerca de 20 Ainda como homopolissacarídeo, há a celulose
resíduos de monossacarideos quando hidrolisadas (polímero linear de ÿ-glicoses ligadas Pl—>4) e a quiti-
totalmente. na, formada por monòmeros de N-acetilglicosamina
Muitas moléculas de glicoproteínas e glicolipidios também ligados pl—>4 e formadora do exoesqueleto de
têm sua porção glicfdica composta por oligossacarídeos. diferentes animais e da parede celular de alguns fungos.
For se tratar de estrutura formada por monòmeros
Polissacarídeos em sua forma (5, em termos espaciais o resultado dessas
Muitas vezes formados por milhares de unidades ligações será uma longa cadeia fibrilar, com a maior parte
monossacaridicas, os polissacarídeos são importantes dos monòmeros formando um único plano, o que con¬
macromoléculas para os seres vivos de todos os reinos fere a tais polímeros as suas propriedades fisico-quimicas
biológicos. São classificados em homopolissacarideos associadas a funções estruturais (grande resistência à rup¬
ou hcteropolissacarídeos, segundo o produto de sua hi¬ tura, por exemplo) e contribui para que haja a formação
drólise total ser apenas um tipo de monossacarideo ou de feixes e fibras associadas e fortalecidas por ligações de
mais de um. Podem ainda apresentar uma estrutura li¬ hidrogénio das hidroxilas de fibras adjacentes.
near (sem contar os monòmeros das extremidades, Os heteropolissacarídeos são comumente en¬
todos os demais estão ligados a dois outros), ou estru¬ contrados na formação do material estrutural e extra-
tura ramificada (alguns monòmeros ligados a três ou¬ celular de organismos de todos os reinos. Há inúme¬
tros monòmeros), independente de tratar-se de um ros exemplos, como o peptideoglicano das paredes de
homo ou heteropolissacarídeo. bactérias, até importantes componentes da matriz
Os polissacarídeos mais conhecidos têm papel extracelular animal, como será visto no Capitulo 20.
de reserva energética e são importantíssimos na ali¬ Como exemplo, pode ser citado o ácido hialu-
mentação dos organismos heterotróficos. O polissaca- rônico, formado por unidades diméricas de ácido

OH o. oh t»

OH + OH OH + H,0
HO

OH H OH OH
ÿ

Figura 26A ligação g-cosidica. Como exemplo, apresenta-se a formação da cetotxose.

12 A Célula
CH;OH

Figura 2.7 Arranjos espacia<s dos polissacarideos formados por ligações do tipo a (arranjos helicoidais) e do tipo |) (arranjos lineares).

glicurónico ligado |Jl—>3 a N-acetilglicosamina. Cada predominantes aqueles com 14 a 22 átomos de carbono
uma dessas unidades liga-se a sua subjacente por meio em cadeia que pode ser saturada (só simples ligações) ou
de ligação [51—>4. Pode ainda ser citado o condroitim insaturada (uma ou mais duplas ligações) (Figura 2.8) e
sulfato, também presente em proteoglicanos da matriz com número par de carbonos (sua síntese acontece com a
extra-celular de animais e formado por unidades repe¬ adição de 2 em 2 átomos). Possuem caráter antipático, ou
titivas e ligadas (51—>4, de ácido glicurónico e N-acetil- seja, uma região polar (do grupo carboxila, que pode se
galactosamina-4 ou 6-sulfato. ionizar), e uma região apolar ou hidrofóbica, representada
pela porção hidrocarboneto (apenas Ce H) da molécula.
Como pode ser observado na Tabela 2.2, o ponto
de fusão aumenta com o aumento do tamanho da ca¬
Lipídios deia (maior peso molecular, maior necessidade de ener¬
Contrariamente aos carboidratos, não há nenhum gru¬ gia para a movimentação das moléculas) e com o grau
pamento químico característico para todos os lipídios. de saturação (maior interaçào entre as moléculas decor¬
Não formam polímeros e a característica que os une é a rente de sua forma espacial).
sua pequena solubilidade em água. Dadas algumas seme¬ Essas características, sem dúvida, ajudam a deter¬
lhanças estruturais, pode-se classificá-los em diferentes minar o grau de fluidez das membranas biológicas, como
grupos, dos quais se destacam:

- Possuidores de ácidos graxos: Ácidos graxos saturados Ácidos graxos insaturados


a) Ceras.
b) Gorduras neutras.
c) Fosfolipídios.
d) Esfingolipídios.
- Esteróides - derivados do ciclopentanoperidro-
fenantreno.
f>>
\(
Max*** (McukfcK** ò*
ir*crmotocU*

- Terpenóides - derivados do isopreno.


C
Possuidores de ácidos graxos
Ácidos graxos são ácidos carboxílicos com 4 ou mais
átomos de carbono. Em termos biológicos, são Figura 2 8 Efeito da presença de insaturaçôes na aproximação entre as
cadeias acil dos âcxJos graxos

A Célula 13
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

Tabela 2.2 Ácidos graxos mais comuns e suas principais características.

Nome oficial N' de carbonos Fórmula Exemplos de


Nome comum Ponto fusão ocorrência'

Ácido Cáprico Ácido Decanóico 10:0 CH3(CH2)sCOOH 31=0 Óleo de coco.


palmeira
Ácido Láurico Ácido Dodecanõico 12:0 CH3(CH2)i0COOH 44=0 Coco. louro.
Palmeira
Ácido Miristico Acido 14:0 CH3(CH2)12COOH 54=0 Manteiga, coco
Tetradecanóico

Ácido Palmítico Ácido 16:0 CH3(CH2),.COOH 63=0 Palmeira, animais


Hexadecanóico
Acido CH3(CH2)i6COOH
Ácido Esteárico Octadecanóico 18:0 70=0 Cacau, animais

Ácido Araquidico Ácido Eicosanòico 20:0 CH3(CH2)i8COOH 77=0 Amendoim

Ácido Beénico Ácido Docosanóico 22:0 ch3(ch2)20cooh 80=0 Amendoim

Acido CHÿCHÿCOOH
Ácido Lignocérico Tetracosanóico 24:0 86=0 Ébano
Acido 9 CH3(CH2)5CH = CH(CH2),COOH Alguns peixes.
Ácido Palmitoléico
Hexadecenõico 16:1A* -0.5=0 carne bovina
Ácido Oleico Acido 9 Octa- 18:1A* CH3(CH2),CH = CHICHÿCOOH 13=0 Oliva, canola
decenóico
Acido 9. 12 CH3(CH2)4CH = ch-ch2ch=ch Sementes de
Ácido Linoléico
Octadecadienóico
18:2A#,Í
(CH2)7COOH -5=0 oleaginosas
Ácido «-linolénico Acido 9. 12.15 ISÿA""5 -14=0 Sementes de
Octadecatrienóico (CH-CH2CH =)2CH(CH2);COOH oleaginosas
Acido 5.8,11.14 20:4A'",M
CH3(CH2)4CH = Banha de porco.
Ácido Araquidõnico -50=0
Eicosatetraenóico (CH-CH2CH =)3CH(CH2)3COOH óleo de linhaça
' Apenas ilustrativos. Não sigrvficam obrigatoriamente os mais adequados para cada ácido graxo ou onde eles ocorrem em maior quantidade.

será visto posteriormente. Apenas a titulo ilustrativo, uma essenciais, devendo ser ingeridos na alimentação. O ácido
membrana hipotética formada somente por lipídios que linoléico (0)6) é precursor de algumas prostaglandinas e
contenham ácido palmítico (16:0) será mais rígida de leucotrienos, moléculas importantes em diferentes
(menos fluida) a uma dada temperatura, do que outra processos metabólicos, como a ativaçáo da cont ra¬
que contenha apenas ácido palmitoléico (16:1). ção/relaxamento da musculatura lisa, ativaçáo de pro¬
Para os ácidos graxos insaturados tem sido cada cessos inflamatórios, agregação de plaquetas do sangue
vez mais comum a utilização das letras n e o para deter¬ (aspirina é um inibidor de etapa da síntese de prostaglan¬
minar a localização da primeira dupla ligação. Nessa dinas). permeabilidade vascular, regulação da síntese de
forma de expressão, a dupla é localizada a partir do últi¬ cAMP" e liberação do suco gástrico. Em contrapartida,o
mo carbono da molécula (grupo metil). São encontradas ácido a-linolcnico e outros da família 0)3 têm ação anti-
diferentes famílias de ácidos graxos com duplas em n-3 inflamatória, diminuem a produção de plaquetas, e há
ou 0)3, n-6 ou (06, n-7 ou 0)7 e n-9 ou 0)9. Isso significa estudos recentes que demonstram uma ação protetora
que a primeira dupla está no terceiro, sexto, sétimo ou em pacientes com câncer e doenças do coração e um pos¬
nono carbono contado a partir do grupo metil. sível efeito na atividade de enzimas anti-oxidantes.
O ser humano não consegue sintetizar ácidos Por apresentarem duplas ligações, os ácidos graxos
graxos 0)3 ou o>6 e, por isso, os ácidos linoléico (o>6) e a- apresentam as formas isoméricas cisc trans. Na natureza,
linolénico (co3), com 18 átomos de carbono e duas ou sào mais abundantes as configurações do tipo eis.
trés duplas ligações, respectivamente, sào chamados

cAMP - AMP cklao. moMcula participante >!<» pnxísw» dc regulado hormonal.

14 A Célula
ii. Ceras Quando há apenas dois ácidos graxos ligados ao
São esteres de ácidos graxos e álcoois graxos.1 glicerol, o composto é um diacilglicerol e, do mesmo mo¬
do, monoacilgliceróis apresentam apenas um ácido graxo
R,-COOH + HO-CH2-R2 -> R,-COO-CH2-R2 + H20 ligado. Ambos apresentam caráter antipático decorrente
- da(s) hidroxila(s) do glicerol que não reage(m).
Ácido graxo ÿ álcool graxo éster
* água
Km que R, e R. são cadeias de hidrocarboneto (C c. Fosfolipidios
e II) com 14 a 36 átomos de carbono. São moléculas resultantes da ligação de um diacilglicerol
As ceras são bastante apoiares e importantes reser¬ e um grupo fosfato. Com isso, o caráter apolar apresen¬
vas de organismos marinhos, protetoras da pele c anexos tado pelos triacilgliceróis é perdido e volta-se ao caráter
de muitos vertebrados (pêlos e penas de animais aquáti¬ antipático: uma região hidrofóbica (apolar) representa¬
cos, por exemplo), da superfície das folhas de muitas espé¬ da pelos dois ácidos graxos esterificados no glicerol e
cies, protegendo-as inclusive do ataque de patógenos. uma região hidrofílica (polar) do grupo fosfato.
Outros exemplos bem conhecidos são a cera tie abelhas
(CHj(CH2)m.COO-CH>(CM,)28CH3), a cera de carnaú¬ CH,(CH2)hCOO-CH2 CHj(CH2)mCOO-CH2
ba (Cl lj(CI!2)24-COO-CH2(CH2)28CH3),a lanolina (on¬ I I
de o álcool é um esteróidej o lanosterol) e muitos outros CH,(CH,),6COO-CH + HI'-POj -ÿ CH,(CH,)lfrCOO-CH + H,0
compostos usados na indústria de cosméticos. I I
H»C-OH H2C-0-PO,
b. Gorduras neutras Diacilglicerol Acido foslatidico
Correspondem à classe mais abundante de lipídios, (palmitoil.otc.uoil glicerol) (fosíatidato)
normalmente presentes como a principal fonte de ener¬
gia a ser utilizada pelos organismos animais. Um ho¬ A região hidrofílica ou polar do fosfolipidiocstá salientada
mem adulto, via de regra, tem gorduras neutras sufi¬ em vermelho.
cientes para ser suprido de energia (ATP produzido na
respiração aeróbica) por várias semanas enquanto a Devido ao seu caráter antipático, os fosfolipidios
reserva de açúcar (glicogènio) supre o organismo por podem interagir com moléculas apoiares ou hidrofóbi¬
cerca de um dia. cas e com moléculas polares ou hidrofilicas. Desse mo¬
Quimicamente, as gorduras neutras são ésteres do, eles têm, assim como os sabões em geral (sal de só¬
formados a partir da ligação de um glicerol (triálcool) dio ou potássio de um ácido graxo), a capacidade de for¬
com 3 ácidos graxos (que podem ser iguais ou não) e, mar micelas quando em solução aquosa de tal sorte que
por esse motivo, também recebem o nome de as suas regiões polares ficam em contato com a água e as
triglicerideos, triacilgliceróis, triglicérides ou, generica¬ apoiares se "protegem" no interior da micela (Figura
mente, glicerideos. 2.9). Os ácidos graxos e sabões, que contêm apenas uma
Kxemplo de triacilglicerol: "cauda" hidrofóbica, favorecem a formação de micelas
pequenas e sem conteúdo aquoso interno. Os fosfolipi¬
CH,(CH2)mCOOH HO-CH, CHt(CH,)MCOO-CH, dios, com formato mais uniforme (cilíndrico), têm
Acido palmítico maior facilidade de formar micelas em dupla camada
CH3(CH,)l6COOH + HO-CH — » CHi(CH,),6COO-CH + 3H>0 (vesículas ou lipossomos) (Figura 2.9), com conteúdo
Acido csteirico aquoso interno. Essa propriedade possibilita a formação
CH3(CH,),6COOH HO-CH, CH,(CH2)16COO-CH2 das membranas biológicas e dos lipossomos, impor¬
Acido olcirKo (ilxctol Trucil glkctol (palnutoil.
tantes, por exemplo, na condução de medicamentos a
Jioccjiuil glktroll
regiões específicas do organismo.
A Figura 2.10 apresenta alguns exemplos de fos¬
Apesar do caráter polar do grupo carboxila dos folipidios.
ácidos graxos e da hidrofilia do glicerol (molécula po¬ Normalmente, um dos oxigénios do grupo fosfa¬
lar), após a reação, eles são transformados em ésteres e, to está esterificado com a hidroxila de um aminoálcool,
portanto, as gorduras neutras são insolúveis em água de um açúcar ou derivado, ou do aminoácido serina. A
(hidrofóbicas), pois perderam o caráter antipático apre¬ fosfotidilcolina recebe o nome de Lecitina.
sentado pelos seus ácidos graxos formadores e o caráter Lecitinas são encontradas em abundância na
polar apresentado pelo glicerol. gema do ovo e em sementes de soja; como os demais

1
Álcoois graxo, apresentam cadeia com 16 a 30 .nomo, de carbono.
1 Ksterhide: composto formado por quatro anéis, como o colesterol, por exemplo. Serio definido, com mais detalhes adiante.

A Célula 15
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

d. Esfingolipidios
São formados pela ligação de um ácido graxo com o
grupo amina do amino-álcoo! esfingosina (que tem
uma cadeia com 18 átomos de carbono e uma dupla
ligação), formando uma amida (Figura 2.1 1).
Na dependência da natureza do grupamento
substituinte, tem-se a formação de diferentes classes de
esfingolipidios. Se ele corresponde a um II (hidrogé¬
nio), o esfingolipídio é denominado ceramida. A cera-
mida está presente em pequenas quantidades em euca-
Figura 2.9 Tipos de m«eias e vesículas formadas por sabões (a) e fos- riotos e em procariotos. Se ele é uma fosfocolina (tri-
íobpídtos (b), que formam bicamadas com água em seu interior. metil-etil-aniina-fosfato, como nos fosfolipídios), os
esfingolipidios recebem o nome de esfingomielinas e.
lipídios, cias são insolúveis cm água, mas são boas como o nome sugere, estão presentes em grandes quan¬
cmulsificantcs, servindo na indústria dc produtos tidades na bainha de mielina, mas também nas demais
derivados do leite e da maionese. Auxiliam também 110 membranas celulares, principalmente na membrana
transporte das demais gorduras, na aderência das plasmática. Se o grupamento X corresponde a um açú¬
superfícies internas dos pulmões e têm papel estrutural car, o esfingolipidio é chamado genericamente de gli-
importante nas membranas biológicas (sua destruição, coesfingolipidio ou cerebrosídeo. Como o nome
catalisada pela lecitinase A encontrada no veneno de sugere, eles ocorrem principalmente 110 tecido ner¬
cobras, provoca a hemólise). voso, mas também estão presentes em outros tecidos,

Figura 2.10 Alguns fosfolipídios.

16 A Célula
Esfingosina

r... H, H, H, H, H, H,
.C" C C C Ç" £ ÇM,
I

X-O-C-CH
H"
l~H =S/ X</ X(/ X</ X</H> H> H' H-' H*
0
'-
H, II II
N— C— (CH,) — CH,
ÿ Ácido graxo

Figura 2.11 Estrutura geral dos esfingolipfdios. O grupamento X pode representar diferentes átomos, moléculas ou compostos, e é essa variabilidade que
determina as diferentes ciasses de esfingolipidios.

como nos rins de mamíferos c também outros verte¬


brados. Caso o açúcar seja uma galactose, pode-se dar
o nome de galactocercbrosídeos, presentes em ÇH.
abundância no cérebro; se glicose, glicocerebrosídeos, HC-CH,
presentes em tecidos nào-neurais. Os cerebrosídeos
I
também podem ser formados por oligossacarideos (4 ÇH,
a 5 unidades de monossacarídeos, geralmente glicose, ÇH,
galactose e ácido neuraminico ou ácido siálico), ÇH,
importantes na superfície das membranas celulares. HC-CH,
Esteróides CH,
Derivados do ciclopentanoperidrofenantreno, que tem
uma estrutura cíclica composta por 4 anéis (um com CH,
cinco átomos de carbono e os demais com seis). Cornu-
mente apresentam pelo menos uma hidroxila (R-OH)
e, muitas vezes, grupo(s) carbonila (R-C=0).
O colesterol, molécula anfipática em decorrência HO
da presença de uma hidroxila (Figura 2.12), é encontra¬
do na membrana plasmática e na maioria das mem¬
branas celulares internas de todas as células animais Figura 2.12 Estrutura do colesterol.
(nào encontrado apenas na membrana interna das mi-
tocóndrias). É particularmente abundante no cérebro. Os níveis normais de colesterol (150 a 200 mg/dl
Pode ser ingerido na alimentação e também ser sinteti¬ de sangue no homem) são hoje uma meta constante de
zado pelo próprio organismo humano. grande parte da população de nações desenvolvidas ou
Enquanto componente das biomembranas de de pessoas bem nutridas. Seu acúmulo pode provocar a
animais, devido a sua estrutura cíclica (e mais rígida aterosclerose, diminuindo assim a vasào do sangue
que a dos fosfolipídios, por exemplo), é responsável por pelas artérias, principalmenteaquelas de menor calibre.
uma diminuição na fluidez destas. Óleos usados na alimentação e que se encontram nas
Além de componente de membrana, o colesterol prateleiras de supermercados reforçam o fato de não
é precursor de uma série de hormônios (sexuais e da apresentarem colesterol: nào poderia ser diferente, a
glândula supra-renal) e sais biliares. menos que essa molécula fosse adicionada ao produto,
O ergosterol, outro esterol importante (se asse¬ cuja origem é vegetal.
melha ao colesterol e é encontrado em fungos), é
transformado em vitamina D2 quando irradiado com Terpenóides
luz ultravioleta. Grupo de lipídios derivados do isopreno:
As plantas apresentam o sitosterol, substância
muito semelhante ao colesterol (um radical etil a mais),
mas que é pouco absorvido pelo homem.

A Cé u a 17
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

Proteínas
CH,
/ São polímeros de aminoácidos que têm função bioló¬
H,C=C gica.
\
C=CH. Aminoácidos
I Há vinte aminoácidos que podem participar da for¬
H mação das proteínas e serem incorporados durante a
sua síntese nos ribossomos (ver Capítulo 11). Todos
Os carotenóides são os representantes mais co¬ eles, são a-aminoácidos' e se apresentam na forma L (o
muns desse grupo. Dentre eles, a vitamina A, presente carbono « é assimétrico).
em pequenas quantidades no organismo humano e o |i-
caroteno, presente nos cloroplastos das células vegetais H<b°
C
ou acumulado como reserva em algumas plantas (ce¬
noura, por exemplo) são os mais abundantes e repre¬ h2n-c-h
1
I
sentativos. R
Os carotenóides, dada a grande quantidade de Ria parte variável da molécula
duplas ligações de suas moléculas, apresentam cor mar-
rom-alaranjada. Quando nos cloroplastos, participam Hm pH ácido (menor que 7), o grupo carboxila
da membrana dos tilacóides, como será visto no se ioniza, ou seja, perde seu próton (em pi I2 a 2,5, 50%
Capítulo 18, interagindo com a porção hidrofóbica dos deles já se encontram ionizados), enquanto o grupo
demais lipídios ou das moléculas de clorofila. amina está protonado (tem fraco caráter ácido1" e a
maioria fica ionizada apenas em pH acima de 9).

I___ I L _I
__
R-COOH = H + R-COO R-C-NH, + H = R-C-NH,*

Par conjugado Par conjugado


ácido-base base-ácido
Vitamina A
Deste modo, os L-a-aminoácidos podem apre¬
sentar caráter ácido (até diácido, pois podem perder o
próton da carboxila e o próton da amina), ou caráter
básico (podem receber prótons). Essa característica
dupla de um composto (funcionar como ácido e base)
o classifica como composto anfótero.
Ji-caroieno Hm solução, teremos as seguintes possibilidades:

Cabe destacar, ainda, os álcoois derivados de iso- HO O -O O -O O


preno (isoprenóis), moléculas anfípáticas que estão pre¬ \ / \ II \ //
sentes nas membranas celulares. Nestas, assumem c c c
maior importância em bactérias. Podem formar éteres i i T
com glicerol e resultarem compostos anfipáticos muito
comunsem membranas de arqucbactérias. Há casos em
"H,N — C— H *H,N-C-H H,N-C-H

que tais isoprenóis possuem grupamento alcoólico em R R R


suas duas extremidades e podem, com isso, formar pH baixo ponto isoelélnco (pt)
éteres com o glicerol nessas duas partes. Nesse caso, po¬ pH alto
dem participar da composição de membranas, forman¬ Os aminoácidos podem ser agrupados segundo a
do monocamadas lipídicas (duas porções hidrofilicas natureza de seu grupo R em pH 7. Na Tabela 2.3, os 8
voltadas para o exterior, como nos demais casos). primeiros aminoácidos listados são classificados como
tendo grupo R apolar (hidrofóbico); os aminoácidos de

'Carbono u c o primeiro carbono ligado a carboxila. ou seja, o segundo carbono da molécula. A partir dele. sio nomeados os carbonos {S. y. ô. t etc.
m Peloconceito de Bronsted. acido í a substancia que podedoar próton» e base ia que pode leccbcr prótons. Como isto depende do pi I( rique/a maior ou nu-nor

em prótons |H j no meio) |hx1csc falar em cariler icído forte (perda de protons em pH baixo) ou mai.% fraco (perda em pll mais alto) c. com a morna lógica.
bates fortes (ganha prótom mesmo em pll altos) ou fracas (ganha prótons apenas em pll mais baixos).

18 A Célula
número 9 a 15 têm grupos R polares, mas não carregados;
no ácido aspártico e glutàmico (16 e 17), R é negativo; O O"
arginina, histidina e Usina ( 18 a 20) são positivos em pH 7.
Ácido aspártico e ácido glutàmico são também I // VI
chamados aminoácidos ácidos, pois tem outro grupo H— C— C +

_
carboxila que pode se ionizar e, com isso, pl em pH bem
•H,N— C — R2
\
abaixo de 7. Arginina, histidina e lisina são chamados R, O" H
aminoácidos básicos, pois têm outro grupo amina (ou
imina) ionizável e pi em pH acima de 7. nh; o O O"
Pepiideos H-C—C V
A ligação entre o grupo carboxila de um aminoácido
(aa) e o grupo amina de outro é denominada ligação K N
I
— 6— r2
I
+ h2o
peptidica e forma dipeptídeos (2 aa), tripeptídeos (3 H H
aa), oligopeptideos (vários aa) e polipeptfdeos (dezenas
a centenas de aminoácidos). .. . ...
Ligação peptidica

Tabela 2 3 0$ vinte aminoácidos que participam da estrutura de proteínas e algumas de suas características.

Aminoácido Código 3 Código 1 Grupo R pl'


letras letra
1 Alanina Ala A -ch3 6.0
2 lsoleucina; He I •CH(CH3)-CH2CH3 6.0
3 Leucina- Leu L •CH2-CH(CH3)-CH3 6.0
4 Metionina- Met M -ch2-ch2-s-ch3 5.7
5 Fenilalanina; Phe F -CH2(C6Hs) 5.5
6 Prolina Pro P -(Ch2)3 6.3
7 Triptofano- Trp W -CH2.(C8H6N) 5,9
8 Valina; Val V -CH(CH3)-CH3 6.0
9 Asparagina Asn R •ch2-conh2 5.4
10 Cisteina Cys C •ch2-sh 5.1
11 Glutamina Gln 0 -ch2-ch2conh2 5.7
12 Glicina Giy G •H 6,0
13 Serina Ser S -CH2-0H 5.7
14 Treonina- Thr T -CH2-CH(OH)-CH3 5.6
15 Tirosina Tyr Y •CH2(CéH4OH) 5.7
16 Ácido Aspártico Asp D -ch2-coo_ 3.0
17 Acido Glutàmico Glu E -ch2-ch2coo~ 3.2
18 Arginina-' » Arg R •CH2-CH2-CH2-NH-C(NH2)=NH2+ 10,8
19 Histidina- ' His H -CH2-(C3H4N2)+ 7.6
20 Lisina-* Lys I K -CH2*CH2-CH2-CH2-NH3+ 9.7
"
Valor pH em que a soma das cargas é zero. ; Aminoácidos essenciais para o homem: sào produzidos apenas pelos organismos autotróficos e necessários
na dieta. 'Atauns autores náo consideram Arg e His essenciais. De 1 a 8: grupos R hidrofóbicos; de 9 a 15: grupos R hidrofibeos; de 16 a 17: aminoácidos
ácidos; de 18 a 20: aminoácidos básicos.

A Célula 19
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

Com a formação da ligação pcptídica, a amida ganhando importância cada vez maior a análise pro-
não possibilita a protonaçáo do nitrogénio que dela teômican do material genético que consiste justamente
participa. Deste modo, as propriedades referentes ao no estabelecimento da estrutura primária das proteínas.
comportamento ácido-básico passam a ser da amina Na natureza, uma proteína nativa terá outras
do primeiro aminoácido que não foi utilizada (região interaçòes e ligações além das ligações peptídicas. Essa
amino-terminal ou N-terminal), da carboxila do últi¬ estrutura tridimensional é que lhe confere e possibilita
mo aminoácido, também não utilizada (porção car- a função desempenhada. Assim, as proteínas estruturais
boxiterminal ou C-terminal) e dos grupos R de todos são mais fibrilares que proteínas de reserva, ou de enzi¬
os aminoácidos pertencentes ao peptídeo (exceçào mas, por exemplo.
dos peptídeos cíclicos que não têm as porções C e N O primeiro tipo de interaçào que ocorre é decor¬
terminais). rente da própria ligação peptídica, que possui um
caráter de dupla ligação estendida entre os átomos de
Proteínas oxigénio e nitrogénio (Figura 2.13).
São as mais abundantes moléculas presentes nos organis¬ Todos os átomos estão espacialmente no mesmo
mos vivos ã exceçào da água, podendo perfazer 50% da plano e ocorre rotação apenas no carbono tetraédrico
matéria seca deles. No ser humano, por exemplo,cerca de (carbono a, que só tem simples ligações, ou seja, hibri¬
15% da massa corpórea vêm das proteínas. dação sp ). Deste modo, os carbonos a ocupariam dois
As proteínas exercem inúmeras funções biológi¬ dos quatro vértices do retãngulo hipotético formado e
cas: há toda uma classe de hormónios proteicos (insuli¬ a abertura desses dois ângulos (T [psi| para a ligação
na, glucagon, hormónios de crescimento), há proteínas Ca-C e 0 |fij para a ligação N-Ca) dependerá essen¬
relacionadas a mecanismos de defesa (anticorpos, vene¬ cialmente do tipo de grupo R associado ao Ca. Note
nos de serpentes), ao transporte (hemoglobina), ã re¬ que o núcleo do átomo dos dois carbonos a se encon¬
serva nutritiva (ovoalbumina, globulinas de sementes tra no mesmo plano dos átomos da ligação peptídica
de leguminosas), movimentação (actina, actina-miosi- (CHON), o que não ocorre com os demais três átomos
na nos músculos). Talvez as funções mais conhecidas a ele ligados.
refiram-se às desempenhadas pelas proteínas estrutu¬ Em decorrência, à medida que novos aminoáci¬
rais (colágeno, proteoglicanos e queratina nos animais, dos são incorporados à molécula de proteína que está
extensina nos vegetais, fibroína do bicho-da-seda etc.) e sendo sintetizada, começará a haver a at ração entre o
às enzimas, que exercem função catalítica e conseguem oxigénio e o H de ligações peptídicas distintas. Essas in¬
aumentar em milhões e até bilhões de vezes a veloci¬ teraçòes determinam uma estrutura espacial caracterís¬
dade das reações do metabolismo. tica, que é denominada estrutura secundária da proteí¬
Grande parte das proteínas é formada apenas por na. Assim, estrutura secundária de unia proteína é a
aminoácidos e, por isso, elas recebem o nome de proteí¬ forma que ela toma em decorrência das pontes de
nas simples. Entretanto, há proteínas denominadas pro¬ hidrogénio entre oxigénio e hidrogénio ligado ao nitro¬
teínas conjugadas, pois possuem outras moléculas ou génio de ligações peptídicas distintas.
átomos (grupo prostético), além dos seus aminoácidos Há várias estruturas possíveis, segundo o valor
formadores. A maioria dos autores classifica as proteí¬ dos ângulos fi e psi já citados. Uma bastante comum,
nas conjugadas segundo seu grupo prostético em glico- denominada a-hélice ( Figura 2.14), ocorre quando esses
proteínas (açúcares como grupo prostético), lipoproteí- ângulos se situam em valores entre -45 e -60°. Consiste
nas (lipídios), metaloproteinas (metais), fosfoproteínas de uma estrutura helicoidal (como o nome salienta) de
(fosfato) e assim por diante. tal sorte que ocorre uma volta completa sobre um eixo
As propriedades fisico-quimicas e as funções das imaginário a cada 3,6 a 3,7 aminoácidos e cada novo
proteínas têm relação direta com a sua composição em turno da hélice se inicia a cerca de 0,54 a 0,56 nm de dis¬
aminoácidos. Por esse motivo, é de extrema importân¬ tância do anterior. Os grupos R nessa estrutura ficam
cia o conhecimento da sequência com que eles são in¬ voltados para o exterior da coluna cilíndrica, formada
corporados à molécula durante a síntese protéica para pelos átomos das ligações peptídicas e pelos Ca. A
formar a estrutura tridimensional do polipeptídeo. Di- existência e estabilidade da a-hélice é dependente, por¬
daticamente, a seqúéncia de aminoácidos de uma pro¬ tanto, dos grupos R dos aminoácidos (aa) da estrutura
teína é denominada estrutura primária da proteína. íi primária: aminoácidos adjacentes com grupos R car¬
bastante comum a utilização do código de 3 letras, ou regados (como os aa ácidos Asp e Glu e os básicos Arg e
mais intensamente o de uma letra, para a apresentação Lys) dificultam ess;» estabilidade, pois tendem a se
da estrutura primária das proteínas. Nesse sentido, vem repelir e alterar os ângulos possíveis para garantir a
n A análise genômica tem possibilitado a protcómica, que se refere ao material protíko originado a partir da.» diferentes sequíneias gínkas obtidas para os geno-

ma» dos diferentes organismo» nupeadov

20 A Célula
ligações peptídicas. posiciona os grupos R dos diferen¬
tes aminoácidos, de tal modo que pode provocar novos
tipos de interação. Assim, a estrutura tridimensional
total da molécula, agora com a somatória dessas intera¬
çòes, denomina-se estrutura terciária da proteína.
Imaginemos, por exemplo, que exista a proximi¬
dade de grupos R de aa ácidos (Glu, por exemplo) e bási¬
cos (Lys, por exemplo). A um determinado pl I (pl 1 fisio¬
lógico, por exemplo), a carboxila do grupo R do glutama-
to estará desprotonada (e assim, negativa) e a amina do
grupo R da lysina, ao contrário, ainda estará positiva.
Deste mcxlo, haverá atração eletrostática entre esses gru¬
pos, alterando a conformação espacial da molécula e
determinando a sua estrutura tridimensional.
As interaçòes mais comuns entre os diferentes
grupos R, são:
a) Ligação ou interação eletrostática: um grupo R
carregado com carga contrária a outro grupo R o atrai;
Figura 2.13 As características da l>gaçáo peptídsca e da mobòidade dos b) Ligação ou interação covalente: específica da
aminoácidos ao redor do carbono (x cisteina, cujo grupamento sulfidrila (-S-1I) é facilmente
oxidado com outro grupamento S-H de outra cisteina
prolina é outro exemplo de aminoácido que
estrutura; formando pontes -S-S- (pontes dissulfeto) e dando
não permite a estrutura em cx-hélice devido ao fato de origem ao conjunto chamado cistina (duas cisteinas li¬
possuir grupo R ciclizado com o grupo amino, o que gadas por uma ponte dissulfeto);
provoca verdadeiras "dobras" na estrutura espacial; e c) Ligações de hidrogénio: ocorrem entre um
assim por diante. O exemplo mais conhecido de proteí¬ átomo muito eletronegativo de um grupo R e outro
na em a -hélice é o da a-queratina (presente no cabelo e átomo eletronegativo ligado a hidrogénio de um
pêlos de mamíferos, penas das aves e unhas). outro grupo R;
Outro tipo frequente de estrutura secundária, d) Ligação ou interação hidrofóhica: realizada
mais flexível que a anterior, é denominada estrutura [5 entre grupos R apoiares. Geralmente, os aminoácidos
pregueada (Figura 2.14) ou em folhas-P. Na confor¬ portadores de grupos R apoiares ocupam a região mais
mação [5, as ligações de hidrogénio entre o oxigénio e o interna da proteína e interagem seus grupos R. Os
grupo N de ligações peptídicas distintas podem ser aminoácidos com grupos R polares ocupam a porção
feitas intra- ou inter-cadeia polipeptídica. Podem ainda mais exterior da molécula, na qual podem interagir
ser feitas no sentido N-terminal —> C-terminal para os com a água.
dois participantes (paralela) ou entre ligações peptídi¬ fi a precisão dessas interaçòes que faz com que
cas de uma sequência N -> C e outra C -» N-terminal sempre a estrutura terciária de uma dada proteína seja
(antiparaleia). Nesse tipo de estrutura os grupos R a mesma numa dada condição de temperatura e pH.
ficam posicionados fora do plano ziguezague formado. Com isso, há a possibilidade de certas regiões intera¬
Aminoácidos como glicina e alanina, com grupos R girem com outras moléculas (por qualquer tipo de in¬
pequenos, facilitam a formação dessa estrutura, bem teração. inclusive as já citadas), formando as proteínas
como a interação entre as diferentes folhas- p formadas. complexas, ou possibilitando interaçòes específicas,
Os exemplos mais citados para estrutura protei¬ como é o caso do sítio ativo das enzimas. Nesse caso, a
ca [J- pregueada são a fibroína (proteína fabricada pelo afinidade pelo(s) substrato(s) que essa enzima tem pos¬
bicho-da-seda) e as p-queratinas (teias de aranha, por sibilitara a formação de um complexo que se transfor¬
exemplo). mará, posteriormente, no produto da reação (catálise
Há outras estruturas secundárias, destacando-se enzimática - esquema tipo chave-fechadura tão difundi¬
aquela da hélice tripla do colágeno (que não forma fx- do nos livros). Ilá diversos mecanismos celulares, inclu¬
hélice. pois dentre outros fatores, é rica em prolina e sive algumas proteínas denominadas chaperones, que
hidroxiprolina), além de co-existirem em uma mesma participam dessa etapa pós-traducional da síntese pro-
molécula, porções em a-hélice, porções p pregueadas téica e contribuem para a garantia da estrutura terciária
e porções cm que nenhuma dessas organizações está correia. Cada vez mais se conhecem exemplos de
presente. mecanismos de reparo, de reconhecimento e de destru¬
A estrutura secundária, resultante das interaçòes ição de proteínas que não tiveram sua estrutura ter¬
por ligações de hidrogénio especificas dos átomos das ciária correta atingida.

A Célula 21
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

Estrutura em a-helice Estrutura P pregueada

a) Vista de lado

0.54 nm (3.7 resíduos de


aminoácido por volta)

Hi £ X
Os grupos R estão
ligados aos CH. vol¬
tados para o extenor
da héfcce. e não fo¬
ram colocados no
esquema
Esquemas de cadeias

-ooc paralelo

b) Vista de cima
Angulo de 80® entre os
planos de bgaçào peptití«ca

antiparalelo

Figura 2.14 A estrutura secundária das proteínas.


As diferentes interaçòcs podem ser afetadas pelo funcional, que conta com as estruturas terciárias de dois
pH (protonando ou desprotonando grupos ácidos e ou mais poiipeptideos unidos, geralmente, a um grupo
básicos e. com isso, eliminando uma eventual atraçào prostético, dá-se o nome de estrutura quaternária da
eletrostática antes existente: por exemplo, se diminuir¬ proteína. O exemplo mais conhecido de proteína que
mos o pi Ido meio, o grupo R de um ácido aspártico tem estrutura quaternária é a hemoglobina, formada
pode se protonar (e com isso, deixar de ser negativo por 4 cadeias (duas denominadas a e duas (J),cada uma
(COO) para se tornar neutro (COOU) e não atrair delas envolvendo um grupo heme contendo ferro.
mais alguma amina protonada (NH3). Do mesmo mo¬ Em termos metabólicos, as atividades das enzi¬
do, um aumento de temperatura pode romper ligações mas requerem a estrutura tridimensional correta para
de hidrogénio e outras interações mais fracas (hidro¬ a molécula (e portanto as enzimas tem um pH ótimo e
fóbicas). Essas alterações farào com que haja mudança uma temperatura ótima de atuaçào) e, além do pH e
na estrutura terciária e, via de regra, afetarão a função temperatura, pode-se diminuir ou inibir totalmente a
da proteína. Com essa perda de atividade ou função, atividade enzimática por meio de compostos que alte¬
será dito que a proteína se desnaturou0 (perdeu seu ram essa sua estrutura, principalmente no sítio ativo,
estado natural ou nativo). ou se ligam de forma a impedir que o substrato atinja
Ilá uma série de outros compostos que desnatu¬ a região necessária para que ocorra a catálise. Há inibi¬
ram ou coagulam muitas proteínas. Pode-se citar o álcool dores irreversíveis (por exemplo,os inseticidas organo-
(inclusive utilizado por esse motivo como agente de higi- fosforados afetani de forma irreversível a enzima acetil
enizaçào), ácidos e bases concentrados, raios X etc. colinesterase, impedindo a transmissão de impulsos
Algumas proteínas, para adquirirem seu estado nervosos; a aspirina afeta a enzima ciclogenase na sín¬
funcional, necessitam mais de uma cadeia polipeptídica tese de prostaglandinas, atenuando o efeito inflama¬
(com sua estrutura tridimensional definida). Ao estado tório dessas substâncias; penicilina e outros antibióti-

° A desnaturando pode ser reversível se. retornadas a\ condições iniciais, ji proteína conseguir recuper.tr .seu estado nativo (sua forma tridimensional original)
ou irreversível, se isso nio for mais possível.

22 A Célula
coo

NH

Figura 2.15 Algumas características das interaçóes entre as cadeias laterais dos aminoácidos que
contribuem para a formação da estrutura terciária das proteínas.

cos inibem a síntese de proteínas de procariotos,


servindo, assim, para combatê-los), ou reversíveis, por Nucleosícieos
exemplo, quando o inibidor se assemelha ao substrato Os nucleosídeos podem ser hidrolisados em uma pen¬
verdadeiro da enzima (azt, usado no combate à AIDS tose e uma base heterocídica.
e semelhante à desoxi-timidina: assim, a enzima não A pentose é a ribose para os nucleosídeos de RNA
incorpora essa base nitrogenada para replicar o DNA ou a desoxir ribose para os chamados desoxirribonucleo-
virai, retardando o seu desenvolvimento no orga¬ sideos, e tem como diferença o carbono 2 do açúcar não
nismo). Outro exemplo de inibição ê o da enzima hidroxilado:
rubisco (ribulose bisfosfato carboxilase e oxigenasc),
responsável pela catálise da reaçáo de incorporação de
HOCH, o oh
gás carbónico pelas plantas na fotossíntese. A enzima é
inibida pelo oxigénio e a sua incorporação (oxige¬ HOC1i ° \OH
y
nação), ao invés do gás carbónico (carboxilaçáo),
diminui o rendimento da fotossíntese. P1 OH H
OH OH
Ribose Desoximbose
Ácidos nucléicos
São polímeros de nucleotídeos que, por sua vez, são As bases heterocíclicas podem ser derivadas de
moléculas formadas por uma base nitrogenada hete- dois compostos: purina e pirimidina. Segundo essa ori¬
rocíclica,'' uma pentose (açúcar) e um fosfato. A junção gem. tem-se as bases púricas (adenina e guanina) e as
da base com o açúcar (sem o fosfato) dá-se o nome de bases pirimídicas (citosina, uracila e timina).
nucleosídeo. Outras purinas comuns são o ácido úrico (2,6,8-
Segundo o tipo de açúcar formador, tem-se o trioxipurina), a cafeína ( I,3,7-trimetil-2,6-dioxipurina)
ácido ribonucleics (RNA ou ARN) ou o ácido desoxir- e a teofilina (l,3-dimetil-2,6-dioxipurina). A vitamina
ribonucléico (DNA ou ADN). BI ou tiamina é um derivado da pirimidina.

P Composto ckiico: honuxidko possui ixi and apenas átomo*de caitwno: heterocidko powui algum heteroátomo (átomo diferente de carbono) como parte do cicia

A Célula 23
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

O açúcar se liga à base por seu carbono anoméri- adicionar um (nucleosídeo monofoslâto),dois (nucleo-
co (Carbono f')- As bases pirimídicas se ligam ao açú¬ sídeo difosfato) ou três fosfatos (nucleosídeo
car pela amina referida como átomo 1 do ciclo; as púri- trifosfato). O fosfato é adicionado ao carbono 5' do
cas, na amina 11 9 e, em ambos os casos, há formação de açúcar, com liberação de água.
água (hidroxila do açúcar com o hidrogénio da base). Há a possibilidade do grupo fosfato se ligar aos
Deste modo, teremos os seguintes nucleosideos: dois outros carbonos possíveis da pentose: o C2' para a
ribose, ou o C3' para a ribose ou desoxirribose, mas
Base Nucleosídeo Desoxinucleosideo
nesses casos, não há formação de di ou trifosfatos.
Adenina Adenosma Desoxiadenosma
Ácido desoxirribonucléico - DNA ou ADN
Guanina Guanosma Desoxiaguanosma Polímero formado por monòmeros dos nucleotídeos
Citosma CitkJina Desoxiatidina
dAMP, dGMP (originários de bases púricas) e dCMP
e dTMP (ou TMP), de bases pirimídicas. É o respon¬
Uraola UrkJma Desoxiuridma' sável pela informação genética contida nos organis¬
Desoxiumfdma (ou mos vivos e pela sua transmissão às células-filhas. Em
Timina Timina ribosideo; Timidina) eucariotos está presente no núcleo (delimitado pelo
' Nào faz parte <Jo DNA Nào faz parte do RNA envoltório nuclear), além de existir em pequena
quantidade nas mitocòndrias e cloroplastos. Nos pro-
cariotos, ocupa preferencialmente uma região deno¬
Nucleotídeos ou nucleosídeos-fosfato minada nucleóide, apesar de nào estar fisicamente de¬
A adição de fosfato ao nucleosídeo origina um nucleo¬ limitado por membrana.
tideo ou um nudeosídeo-fosfato (Tabela 2.4). Pode-se A polimerização dos desoxinucleotideos se dá
entre a hidroxila do Carbono 3' da desoxirribose e o
grupo hidroxila do fosfato de outro nucleotideo. Na cé¬
lula, ela ocorre com os nucleotídeos trifosfato e a que¬
bra da ligação fosfato produz a energia necessária para
a reação de polimerização. Deste modo, o polinucleo-
tídeo alterna uma desoxirribose e um fosfato em toda a
Pirimidina Purina
sua extensão e as bases nitrogenadas ficam como rami¬
ficações, penduradas ao Cl' do açúcar (em termos figu¬
rativos. seria como um pente, no qual cada dente seria
uma base nitrogenada e o corpo, a alternância açúcar-
fosfaio). A seqíléncia de bases é característica e é nela
que reside a informação genética carregada pelo DNA.
O polinucleotídeo de DNA pode receber comumente o
nome de fita de DNA. O Carbono 3' do primeiro açú¬
Citosina car adicionado não está ligado a nenhum fosfato e rece¬
Adenina be o nome de extremidade 3'. Analogamente, no último

Ò
nucleotideo adicionado, o fosfato ligado ao C5" é termi¬
nal e por isso esta extremidade é denominada 5'.
No DNA, há o pareamento de uma fita com
outra, formando uma dupla fita ou dupla hélice (Figu¬

H ra 2.16). Essa interaçào, estável apenas quando no sen¬


Uracila tido antiparalelo (uma fita 5'—>3* e a outra no sentido
3'—>5'), é feita por meio de ligações de hidrogénio entre
Guanina uma base púrica com uma pirimídica. O pareamento se
dá entre uma Adenina e uma Timina (duas pontes de
hidrogénio) ou entre uma Guanina e uma Citosina
(três pontes de hidrogénio). Deste modo,as bases nitro¬
genadas se empilham umas sobre as outras e se apre¬
sentam perpendiculares ao eixo da hélice formada que
Timina tém cerca de 2 nm de diâmetro. A distância entre cada

'I A numeraçio do «{úcar. para nio confundir com a da biic. leva 11111.1 apóstrofe (linha) c assim, chanu-se de carbono de uma até 5 linhas os átomos de car¬
bono da pentose.

24 A Célula
Nucleosideos-fosíato da adenina NH,

N
I
O O O V. J CH
III
"O — P -O-P -O-P
II :
o
II
o
II
-0-CH> °
o !
OH OH
- AMP - adeoosma monoíosfato
••ADP - adenosine drfosfato
- ATP - adeno&na tnfosíato
Tabela 2.4 Exemplos de nudeotideos. formadas. O processo de síntese de DNA a partir do
DNA já existente na célula é denominado replicação e
Nucleotideo1 Abreviatura ocorre em quase sua totalidade em uma etapa da intér-
fase do ciclo celular denominada "fase S".s
Ácido adenilico ou adenosina-5'-monofosfato AMP Existem outras possibilidades estruturais para a
Ácido guanilico ou guanosina-5'-monofosfato GMP molécula de DNA, além daquelas salientadas pelas di¬
mensões citadas e decorrentes da fornia descrita por
Ácido dtidílico ou citidina-5-monofosfato CMP Watson e Crick, lai forma estrutural recebe hoje a de¬
nominação de fornia "B" do DNA. Além dela, outras
Ácido uridilico ou uridina-5-monofosfato UMP formas mais comuniente descritas são a forma "A", que
pode ser obtida pela desidratação moderada da forma
Ácido timidilico ou (desoxi)timidina-5'-monofosfato dTMP "B", contendo uma anguiação menor entre as bases
(32") em relação ao eixo da hélice e, com isso, uma
Ácido 2'adenilico ou adenosina-2"-monoíosfato 2-AMP quantidade de 11 bases por turno. Finalmente, a forma
Adenosina 3 .5 monoíosfato cíclico ou cAMP "Z" é descrita coniumente, como tendo 12 bases por
AMP cíclico turno e uma rotação para a esquerda e não para a direi¬
Para os desoximbooudeotideos, cotoca-se o prefixo desoxi antes do ta, de -30°. Acredita-se que a transição entre as formas
nome e d ames da abreviatura Ex.: ácido desoxiadenífaco. desoxi- de DNA desempenhe um papel importante na regu¬
adenosine monoíosfato. dAMP. lação da expressão gênica.
Unia maior riqueza em bases Guanina e Citosina
par de bases no bDNAr é de 0,34 nm. Tendo em vista na molécula de DNA dificulta a sua desnaturação (rom¬
que há uma rotação de cerca de 36° a cada novo nucleo- pimento das pontes de hidrogénio para a separação das
tideo da molécula, cada volta ou passo da hélice com¬ duas fitas), tendo em vista que ocorrem 3 ligações de
preende 10 pares de bases e tem cerca de 3,4 nm de hidrogénio entre essas bases e apenas duas entre A e T.
comprimento. Para se ter uma ideia, supondo que os 46 A análise da seqiiéncia de nucleotídeos do DNA
cromossomos humanos tem cerca de 3,2 bilhões de vem constituindo importante etapa para a compreen¬
bases (1,6 bilhões pareadas), a colocação de todos eles são da origem da vida e da transmissão dos caracteres
em um único filamento originaria cerca de 55 cm de hereditários e poderá ser de extrema valia na predição e
comprimento, mas uma largura de 0,2 milhonésimos cura de inúmeras das doenças hoje existentes (terapia
de cm. Há autores que colocam mais de 1,5 metros para génica e outros modernos métodos ligados à biologia
o genonia humano distendido. molecular).
A reação de polimerização do DNA é complexa e
envolve muitas enzimas, com destaque para as DNA Ácido ribonucléico - RNA ou ARN
polimerases. Se dá sempre no sentido 5 ->3> da molécu¬ Polímero formado por monòmeros dos nucleotídeos
la mãe c é semi-conservativa,ou seja: cada fita da molé¬ AMP, GMP, CMP e UMP. Sua síntese ocorre a partir da
cula original serve de molde para as novas moléculas molécula de DNA que lhe serve de molde e se dá no

'O bDNA c a forma descrita pelo modelo de Watson e Crick, lia muitas outras formas, com diferenças importantes no diâmetro, numero de bases por turno,

distincia entre das etc.


s Para detalhes, ver
Capitulo 23.

A Célula 25
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

O"
I .
0=P-0
NH
o'
1 £p
O"
lo- 0=P-0"

tLoJ>A, ÇH,
OH OH
I .
>=P-0
+ h2o
OH OH OH OH

Íh
OH OH

sulco
menor

sulco
maior

sequência de
ligações
açúcar-fosfato

par de bases

Figura 2.16 A estrutura do DNA.

26 A Célula
sentido 5'—>3' dessa molécula. Assim, pode-se encon¬ RNAt relacionado e, por isso, são códons de termi¬
trar RNA no núcleo dos eucariotos, onde ocorre a sua nação. Tendo em vista que o tamanho da maioria das
transcrição a partir do DNA. proteínas varia de 100 a 500 aminoácidos, é de se espe¬
O DNA pode transcrever três diferentes famílias rar que o RNAm tenha pelo menos entre 300-350 e
de RNA. 1 .500- 1 .600 bases nitrogenadas.
O RNA transportador (RNAt) é responsável pelo Finalmente, o DNA transcreve RNA ribossomal
reconhecimento, ligação e transporte dos aminoácidos (RNAr) que, juntamente com dezenas de proteínas, for¬
presentes no citoplasma para a síntese proteica ( tra¬ ma o ribossomo de procariotos ou de eucariotos. O
dução). Possui entre 70 e 90 bases dispostas de forma RNA ribossomal é sintetizado em região repetitiva do
não usual para RNA, pois com muitas bases pareadas DNA (que tem bases suficientes para transcrever simul¬
(A=U e (i = C) e três alças principais, uma das quais taneamente dezenas de moléculas desse RNA), deno¬
apresenta uma sequência de três bases, denominada minada região organizadora do nucléolo (ver Capítulo 9)
anti-códon e que irá determinar o aminoácido a ser (RON ou NOR). Nesse local ocorre também o proces¬
transportado e ainda participar no reconhecimento do samento do RNA recém transcrito e a sua complexação
RNA mensageiro. Na extremidade 3' há em todos os com as proteínas que comporão, juntamente com as
RNAt as bases 3'A-C-C e é nessa extremidade, mais pre¬ diferentes moléculas de RNAr, as subunidades ribosso-
cisamente na adenina, que o aminoácido para aquele mais. Corresponde a até 80% do RNA da célula.
RNAt irá se ligar, com a açáo de uma enzima específica O RNA mensageiro dos eucariotos, bem como o
e gasto de energia (ver Capitulo 1 1). O RNAt corres¬ RNA transportador de eucariotos e mesmo procariotos,
ponde a cerca de 15% do total desse polinucleotídeo são transcritos com uma série de bases que não farão
presente na célula (Figura 2.17). parte de sua estrutura final. Esse transcrito, denomi¬
A outra família de RNA transcrito pelo DNA se nado transcrito primário, perderá uma série de bases
refere aos inúmeros RNA mensageiros (RNAm). Nor¬ (serão removidas enzimática e precisamente, diminuin¬
malmente fita simples, esses RNA apresentam tamanho do, acredita-se, a probabilidade de sucesso de eventuais
variado conforme a proteína que codificam para a sín¬
tese. Hm procariotos, têm uma série de bases iniciais
que os auxilia na ligação com o ribossomo e no correto
posicionamento para o início da síntese proteica. Hm
eucariotos, a síntese é mais complexa e sua extremidade
5' é protegida por uma série de proteínas (ver Capitulo
1 1 ). Muitas das bases presentes em seu inicio e final não
são utilizadas diretamente na síntese protéica, mas a CCA
partir da sequência de bases A-U-G que representa o
códon de iniciação, cada três novas bases reconhecem
um RNAt ligado a aminoácido especifico. Esse conjun¬
to de bases é denominado códon e há apenas três possi¬
Figura 2.17 O RNA transportador (RNAt).
bilidades de trincas (códons) que não têm nenhum

Gene do citocromo b

1 2 3 4 5
aj

A BCD
2.000 pb 1.900 pb 1.500 pb 750 pb

. /jJf»

\ /

Figura 2.18 Esquema mostrando a existência de


w TiViVr
introas no DNA (a), que são mantidos no transcrito Exons - 1 a 5 e Introns A-D do gene do otocromo b.
pnmáno. mas que são removidos no RNA men¬ a) Seqúénca total; b) apenas sequènoa dos exons.
sageiro (b). que preserva apenas os exons.

A Célula 27
Capítulo 2 MOLÉCULAS IMPORTANTES

erros de transcrição). As regiões do transcrito primário Referências bibliográficas


que serão clivadas são denominadas introns e as que
serão unidas para formarem a estrutura final dessas I. Buchanan BB. Gruíssem W, Jones RI.. Biochemistry &
moléculas são denominadas exons (Figura 2.18). molecular biology of plants. Am Soc Plant Physiologists
A presença de introns e exons dificulta em muito 2000. I367p.
a análise do genoma. Não basta a determinação da se¬ 2. Lehninger AL. Princípios de bioquímica. 3' ed. Sarvier,
quência do DNA, mas é necessário desvendar as se¬ 2002. 975p.
quências que efetivamente farão parte dos RNA que 3. Marzzoco A, Torres BB. Bioquímica básica. 2* ed.
participam dirctamente da síntese das milhares de pro¬ Guanabara Koogan, 1999. 360p.
teínas sintetizadas pelos organismos vivos. Esse é um
dos maiores desafios para a biologia molecular neste
momento.

Agradecimento: ao Sr. Benito Trento, pelo auxilio


na confecção das figuras.

28 A Célula
3 MICROSCOPIAS

Sebastião Roberto Taboga e Patricia Simone Leite Vilamaior

As células são pequenas e complexas, sendo difícil a observação de sua estrutura e composição macro-
molecuiar. Ainda é mais difícil elucidar como funcionam seus diversos subcompartimentos. Há uma
grande variedade de procedimentos experimentais para esse estudo, sendo que as possibilidades e limi¬
tações dessas técnicas têm determinado, em parte, nossa concepção atual da célula e dos tecidos.
Portanto, para compreender melhor a célula, é necessária a compreensão geral dos métodos que foram
desenvolvidos para o seu estudo. Neste capítulo, pretende-se mostrar como os efeitos da interaçào de
raios luminosos ou eletromagnéticos com as células, ou compostos supramoleculares, podem fornecer
informações preciosas para a compreensão da biologia celular e molecular.

Microscopia de luz zam o sistema de lentes que produzirá a imagem. A por¬


Os efeitos da interaçào da luz com o meio por ela percor¬ ção mecânica do microscópio é constituída de base ou
rido decorrem de sua natureza corpuscular ou fotônica pé, braço, platina, parafusos macrométrico e micromé-
e ondulatória (radiação eletroniagnética). Dois efeitos, trico, revólver das objetivas e canhão da ocular (Figura
absorção e refração, ocorrem como consequência da 3.1). Todos esses componentes podem variar na forma
interaçào da frente de onda, fotônica ou eletroniagnética, e isso é o que caracteriza o design dos diversos modelos
com os componentes do material a ser analisado. Pode- de microscópios. O importante a ser ressaltado é que a
se dizer que absorção e refração são duas faces do mesmo qualidade da imagem depende tanto da qualidade das
fenómeno e são importantes fatores a serem considera¬ lentes como da porção mecânica.
dos na formação das imagens aos microscópios. A teoria da formação da imagem nos microscó¬
Os microscópios são equipamentos que têm por pios é regida pelas Leis da Física que não serão aborda¬
objetivo produzir imagens aumentadas de objetos tão das neste capítulo, pois fogem dos objetivos do presente
pequenos que são indistintos à vista desarmada ou que, se livro. Entretanto, como as lentes dos microscópios com-
vistos, não revelariam aspectos texturais mais detalhados. portam-se como sistemas biconvexos, ou seja, lentes
A formação de imagens pelos microscópios funda- convergentes, a formação da imagem depende da posi¬
menta-se em um sistema de lentes combinadas, que são ção do objeto em relação ao plano focal (f ) ou ao centro
colocadas de forma a ampliar a imagem do objeto. £ focal (c) da lente. Assim, teremos imagens reais inverti¬
importante lembrar mais uma vez que, para que os obje¬ das ou virtuais direitas, de acordo com a Figura 3.2.
tos sejam vistos à microscopia, dois requisitos fundamen¬ Deve-se ainda levar em conta, no processo de
tais têm de ser cumpridos: a interaçào da luz com o espé¬ formação e na qualidade da imagem formada, o poder
cime tem de gerar absorção ou refração dos raios de luz, de resolução do microscópio. Essa grandeza pode ser
criando contrastes entre o objeto e o meio que o envolve. matematicamente entendida quando definimos o limite
Em linhas gerais, os seguintes componentes de resolução de uma lente. Essas duas grandezas definem
ópticos do microscópio participam, direta ou indire- a capacidade de uma lente, ou do própriomicroscópio,
tamente, na formação da imagem ampliada do objeto em formar imagens com detalhes mínimos do objeto.
na retina do observador: Em termos matemáticos, eles caracterizam a distância
mínima entre dois pontos distintos do objeto, os quais
Fcotedeka tente ccrKJcnsaòcra lentes objo&vas lenteoatef poderão ser individualizados na imagem final. O po¬
der de resolução e o limite de resolução são grandezas
Além do sistema óptico, o microscópio de luz é inversamente proporcionais, isto é, quanto menor o
constituído de componentes mecânicos, que estabili¬ limite de resolução de uma lente, maior será o poder de

A Célula 29
Capitulo 3 MICROSCOPIAS

resolução do microscópio que a contém. Em outras


palavras, quanto melhor for a capacidade de individua¬
lizar dois pontos distintos do objeto (menor limite de
resolução), maior será a definição da imagem a ser for¬
mada no aparelho (maior poder de resolução).
Outro fator que deve ser levado em conta para
a máxima eficiência na formação de boas imagens é a
centralização do feixe de luz para uma iluminação
perfeita. Essa centralização do feixe luminoso é conhe¬
cida por iluminação de Kohler. O significado prático
dessa iluminação é que, uma vez centralizado o feixe
de luz, há uma menor ocorrência de aberrações e irre¬
gularidades no trajeto luminoso.
Na microscopia de luz, são conhecidos muitos
tipos de aparelhos, os quais apresentam sistemas de
lentes e filtros que selecionam um ou outro tipo de
luz, para assim diversificar as imagens formadas. Esses
tipos de microscópios são enquadrados no que conhe¬
cemos por microscopias especiais. Aqui serão tratadas
as principais e mais conhecidas destas microscopias:
microscopia de contraste de fase, microscopia de contras¬
te interferência!, microscopia de polarização, microsco¬
pia de campo escuro, microscopia de fluorescência e
microscopia confocal a laser.

Figura 3.1 Representação esquemática de um microscópio de luz. Partes


mecânicas do aparelho: (1) base ou pé: (3) parafusos macro e micrométri-
Microscopia de contraste de fase
cos; (4) haste ou braço: (6) mesa ou platina; (7) charnot. (9) revólver das Esse tipo de microscopia baseia-se nos princípios da
otjetiYas; (10) canhão. Partes ópticas: (2) fonte de luz; (5) lente conden¬
sadora ou condensador; (8) lentes objetivas: (11) lente ocular (figura reti¬ difração da luz, isto é, o caminho do feixe luminoso, na
rada de Meilo e Vidal. 1980). formação da imagem por este tipo de microscópio, so-

Figura 3.2 Representação esquemática do trajeto da luz no processo de formação da imagem em um sistema óptico hipotético. Os fótons de luz são con¬
vergidos na lente condensadora (Cç) e interagem com o objeto que está posx>onado antes do plano focal (Fÿ da lente objetiva (O0). Isto. pelas lets da
óptica, produzirá uma imagem real invertida (lm|). Esta, por sua vez. servirá de objeto para a lente ocular (OcT Neste casoo objeto será lançado entre o
plano focal (FqJ e o centro focal da lente ocular, o que acarretará na formação de uma imagem virtual e direita (lm|(). Portanto, em relação ao objeto. a
imagem final será invertida. Para melhor entendimento, não se fez o traçado dos raios luminosos no processo de formação das imagens.

30 A Célula
fro um retardo óptico, permitindo assim que seja pos¬ do-se útil nos monitoramentos de culturas celulares.
sível observar materiais biológicos sem a coloração. Em parasitologia, presta-se ao estudo da morfologia e
Esse tipo de microscopia foi desenvolvido pelo holan¬ taxonomia de pequenas larvas e minúsculos ácaros ou
dês Zerniké, na década de 1950. Isso permitiu grandes outros ectoparasitos (Figura 3.4).
avanços nos estudos de células vivas pois, a partir desse
tipo de microscópio, pode-se observar preparados não
corados que, à microscopia de luz convencional, apre-
sentam-se transparentes ou com pouco contraste.
Microscopia de polarização
O microscópio de contraste de fase apresenta sis¬ O microscópio de polarização apresenta dois prismas,
temas de anéis metálicos, colocados estrategicamente ou filtros, chamados polarizador e analisador. Esses fil¬
no caminho da luz. Um deles localiza-se na lente con¬ tros estão posicionados estrategicamente entre a fonte
densadora e outro nas lentes objetivas. As objetivas de de luz e o condensador (filtro polarizador) e entre a
fase apresentam a designação "Ph", que vem da palavra objetiva e a ocular (filtro analisador).
phase. Isto serve para diferenciá-las das demais objeti¬ Na microscopia tie luz comum, os feixes de ondas
vas. Esses anéis, depois de devidamente centralizados, luminosas apresentam direção de vibração em todos os pla¬
promovem o retardo óptico, permitindo assim a visua¬ nos. Os filtros polarizadores promovem a seleçáo de apenas
lização do espécime sem coloração (Figura 3.3). um plano de direção de vibração das ondas luminosas,o
A utilização do microscópio de contraste de fase que é conhecido por plano da luz polarizada (PEE).
limita-se à análise de material sem coloração, como exa¬ As anisotropias ópticas são fenómenos de ordem
mes rápidos de culturas de células, esfregaços vaginais em espectral conhecidos por dicroismo e birrefringência.
consultórios médicos, sangue, bactérias, algas e proto¬ O dicroismo ocorre quando apenas um filtro pola¬
zoários de ambientes aquáticos. Na área ambiental, esse rizador é colocado no sistema. Ele é expresso pela diferen¬
tipo de microscopia é importante para análise do con¬ ça de absorção do objeto em duas direções de deslocamen¬
teúdo estomacal de animais. Na área das ciências dos to do feixe de luz no objeto (um perpendicular ao outro).
materiais, a microscopia de contraste de fase tem tido A birrefringência ocorre quando cruzamos perpendicular¬
importante papel na análise de materiais cerâmicos, mente os dois filtros, o polarizador e o analisador, depen¬
têxteis, emulsões, minerais e outros produtos sintéticos. dendo da diferença entre os índices tie refraçào dt» objeto.
De maneira prática e objetiva, os componentes
macromoieculares birrefringentes (anisotrópicos) apre-

Microscopia de contraste
interferencial
Esse tipo de microscopia funciona à base de prismas
ópticos posicionados no caminho da luz. Esses prismas
modificam a fase da onda luminosa, que aparecerá con-
H
trastando-se com o meio em que se encontra o material
a ser analisado. O microscópio de interferência requer
uma construção específica, diferente do microscópio de
contraste de fase, que apenas apresentava anéis no ca¬
minho da luz. Esse microscópio não requer objetivas
especiais, mas o revólver deve conter ranhuras para alo¬
jar os prismas de interferência, de modo a gerar as cores
de interferência, que promovem a visualização do mate¬
rial. A microscopia interferencial mais difundida na área
biológica é a chamada microscopia de Normarski. Esse
tipo de contraste interferencial trabalha com a defa-
sagem dos comprimentos de ondas. Os objetos defasan-
tes são aqueles que apresentam índices de refraçào dis¬ Figura 3.3 Microscopia de contraste de fase do ácaro Aponychus chiave-
tintos daqueles das regiões vizinhas. gaioi. Esse tipo de microscopia é de extrema importância na taxonomia
desse grupo animal, pois pode revelar maiores detafcesde cerdas e estru¬
Assim, essa defasagem gera uma "deformação" na turas epidérmicas nao-observáveis pela microscopia de campo claro con¬
imagem, permitindo o contraste interferencial, aumen¬ vencional. Cortesia de Remaldo F. Feres.
tando o relevo das superfícies do material analisado. Figura 3.4 Imagem do mesmo animal vista sob mcroscopia de contraste
interferencial de Normarski. Observe que estruturas que antes pareciam
A aplicação desse tipo de microscopia permite a obser¬ depressões podem na reai-dade ser detectadas como saliências (setas).
vação de materiais biológicos sem coloração, tornan¬ Cortesia de Reinaldo F. Feres

A Célula 31
Capitulo 3 MICROSCOPIAS

sentam brilho colorido ou nào, sob o efeito do PPL.


Isso promove um realce desses materiais em detrimento
a outros não-birrefringentes (isotrópicos), que ficam
indistintos em um fundo escuro.
Dentre os materiais biológicos estudados por mi¬
croscopia de polarização,pode-se citar células musculares
estriadas, espermatozóides de algumas espécies animais,
paredes celulares, amido, colágenos e DNA, dentre outros.
Os materiais biológicos podem apresentar birre¬
fringéneia, dependendo do grau de agregação e cristalini-
dade. A observação e medida das propriedades anisotró-
picas (dicroísmo e birrefringéneia) são importantes para
o diagnóstico de patologias e estabelecimento da ordem
molecular, durante os vários momentos da vida celular.
É importante lembrar que a birrefringéneia pode
ser intensificada por alguns corantes. Por exemplo, o
colágeno é uma molécula que apresenta birrefringéneia
e brilho característico á microscopia de polarização.
Entretanto, quando submetido a testes citoquímicos
pelos corantes Xylidine Ponceau ou Picrossirius (Figura
3.3), a birrefringéneia é intensificada, podendo inclusi¬
ve exibir cores de interferência, que podem auxiliar na Figura 3.5 Imagens de estruturas biológicas birrefringenies vistas ao
microscópio de polarização, a. Espermatozóides de anfíbio corados pelo
interpretação dos graus de agregação molecular e orga¬ azul de tofuidma observados sob luz polarizada. 0 arranjo da cromatina
nização dessas moléculas no tecido. Outro corante, que neste tipo celular apresenta ordem molecular, a qual sob luz polarizada
exibe torreíringéncia. b. Células cotiledonares de feijão canoqumha
se presta muito bem a estudos anisotrópicos.é o azul de coradas pelo xyfxline ponceau. Sob a luz polarizada, o arrndo (seta) e a
toluidina que,devido as suas propriedades citoquimicas parede celular (cabeça de seta) aparecem bwrefringentes. c. Corte his¬
(veja Capitulo 4), permite estudos de ordem e agrega¬ tológico de cartilagem xifóide de galinha corada pelo xylidine ponceau.
Neste corte, podem ser observadas cores de interferência devido aos
ção molecular da cromatina, da matriz extraceluiar e de componentes da cartilagem e suas mterações com o corante.
outros componentes (Figura 3.5).
mos). Uma estrutura fluorescente deverá, em última
análise, emitir brilho contra um fundo escuro.
O microscópio de fluorescência é diferente dos
Microscopia de campo escuro demais aparelhos citados até agora, por precisar de
um sistema óptico que interaja pouco com a luz. A luz
Os microscópios de campo escuro apresentam um siste¬ que alimenta seu sistema óptico é uma luz de mercú¬
ma especial de condensador. Esse condensador permite à rio de alta pressão, cujos picos mais característicos va¬
luz ficar de tal modo inclinada, nào atravessando o mate¬ riam entre 312 e 579 nm.
rial. A luz atinge o espécime a ser analisado, e somente Outra peculiaridade do microscópio de fluores¬
os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sis¬ cência são os sistemas de filtros requeridos para detectar
tema, isto é, as objetivas e as oculares, formando a ima¬ o brilho do material contra o fundo negro. São os cha¬
gem. Esse tipo de microscopia é utilizado somente para mados filtros de excitação e filtros de barragem. Os filtros
pequenos materiais, como plâncton, bactérias, pequenos de excitação localizam-se logo após a saída da fonte de
cristais, grãos de pólen e outros objetos transparentes à luz e antes do condensador, tendo como finalidade
microscopia de campo claro convencional. selecionar o comprimento de onda desejado. Os filtros
de barragem localizam-se entre a objetiva e a ocular, isto
é, após o objeto, tendo como função primordial deixar
passar somente a luz fluorescente emitida pelo espécime
Microscopia de fluorescência analisado, barrando assim a luz de excitação (Figura 3.6).
A microscopia de fluorescência está baseada na proprie¬ Assim, o material fluoresce contra um fundo escuro.
dade física de algumas substâncias absorverem a luz, em A microscopia de fluorescência tem uma ampla
um determinado comprimento de onda, e emitirem aplicação nas ciências biológicas por promover a identifi¬
luz, com comprimentos de onda maiores e níveis ener¬ cação de compostos naturalmente fluorescentes, como a
géticos mais baixos. Existem componentes celulares ou clorofila, a lignina das paredes celulares vegetais, a elasti-
moleculares naturalmente fluorescentes e outros, que na e o colágeno. dentre outros. Embora sejam muitos os
podem se ligar a substâncias fluorescentes (fluorocro- compostos fluorescentes, há ainda uma quantidade maior

32 A Célula
Fonie de luz

Figura 3.6 Representação esquemática da posição dos componentes na


microscopia de fluorescência. Os fólons partem da fonte de luz de alta
pressão e são direckmados para o filtro de excitação (E). que seleciona os
fótons de comprimento determinado ( ). e atinge o oPjeto (Ob). Este
emitirá luz fluorescente ( ). que passará peto filtro de barragem (B),
enquanto a luz de exalação é bloqueada. A imagem observada (im) será
formada peta luz que atravessa o filtro de barragem

de compostos (fluorocromos) que, combinados com es¬


truturas celulares, tornam-nas fluorescentes e permitem a
sua identificação e localização. O exemplo clássico de Figura 3.7 Observação da fluorescência da eosna em um corte histológi¬
fluorocromo é o corante chamado alaranjado de acridina, co de uma artéria muscular corado por hematoxilina e eosina. Observar a
intensa fluorescência emitida pela camada elástica interna (seta).
que se liga aos ácidos nudéicos e promove uma fluores¬
cência amarelo-esverdeada ao DNA e avermelhada ao
RNA. A eosina também se comporta como fluorocromo,
aumentando a fluorescência natural da elastina (Figura
3.7). Todos os componentes observados pela microscopia
de fluorescência podem ser quantificados pelo processo
de fluorometria, que auxilia sobremaneira os estudos na
área da citoquímica normal e patológica. Outra aplicação
da microscopia de fluorescência, que não pode ser negli¬
genciada, é a conjugação de anticorpos a fluorocromos e
a utilização destes na imunocitoquimica e nos processos
de hibridação in situ fluorescente (FISH).

Microscopia confocal a laser


Esse microscópio, desenvolvido recentemente e comer¬
cialmente disponível a partir de 1987, tem suas peculiari¬
dades, permitindo, por exemplo, a observação de mate¬ Figura 3.8 Observação da junção neuromuscular pela microscopia confo¬
cal. 0 material foi marcado com «-bungarotoxma (vermelho), que se hga
riais espessos, sem coloração prévia, vivos ou pré-fixados. aos receptores de acetilcolina e com anticorpo anti-neurofilamento 200
Esse aparelho pode obter imagens de planos focais espe¬ (verde), que marca os axôntos Após obtenção de uma série de cortes ópti¬
cíficos ou cortes ópticos. Esses cortes ópticos são, então, cos. eles foram sobrepostos, obtendo-se uma nitxJa imagem da junção e
sua relação com as fibras musculares. Cortesia de Maria Júlia Marques.
estocados em um computador e podem ser utilizados na
reconstrução tridimensional e visualização da estrutura fibrilares do citoesqueleto e elementos finos da matriz
como um todo. Desta forma, os microscópios tradicio¬ extracelular (Figura 3.8).
nais trabalham com imagens analógicas, enquanto o con¬ O funcionamento de um microscópio confocal a
focal a laser, com imagem digital. Esse aparelho trabalha laser é complexo, embora a ideia central seja bastante sim¬
com a óptica de um microscópio de fluorescência, mas ples. Esse aparelho conta com o mesmo sistema óptico da
utiliza laser como fonte de luz alimentadora do sistema. O microscopia de fluorescência tradicional, com a diferença
microscópio confocal permite o detalhamento de estru¬ de que, no microscópio a laser,a iluminação não se dá em
turas subcelulares que não apresentam limite de resolu¬ todo o campo, mas sim em pequenos pontos de ilumina¬
ção compatível ao da microscopia de luz fluorescente ção pelo laser. Além disso, acima da objetiva há um orifí¬
convencional, como microtúbulos e outros elementos cio chamado pinhole ou íris, que permite a eliminação da

A Célula 33
Capitulo 3 MICROSCOPIAS

Figura 3.9 Pares estereoscópicos da


imagem obtida pela reconstrução
tridimensional do produto de reaçào
da peroxidase, acoplada indtretamen-
te à a-bungarotoxma, que se bga aos
receptores da acetilcofina.
Os cortes ópticos obtidos por reflexão
foram sobrepostos automaticamente,
assim como a obtenção dos pares
estereoscópicos. Cortesia de Mana
Júlia Marques.
luz proveniente de objetos que estejam fora do plano Aos microscópios de luz, podem ainda ser acopla¬
focal. Desta forma, as imagens de objetos fora de foco, que dos sistemas analisadores de imagens, consistindo basi¬
contribuem para a imagem final na microscopia de fluo¬ camente de microcâmeras de vídeo que captam a ima¬
rescência, são eliminadas da imagem confocal. gem e a transferem para um terminal de computadores
Dada a sensibilidade dos detectores fotoelétricos tipo PC. Softwares específicos permitem a análise de pa¬
eo controle eletrònico da intensidade dos sinais, ima¬ drões texturais dos componentes morfológicos nos teci¬
gens pouco evidentes à microscopia de fluorescência dos, como a distribuição das massas cromatinicas em
podem ser observadas ao microscópio confocal. núcleos ou, até mesmo, padrões de arranjo das fibras da
Uma das formas de obtenção de imagens ao con¬ matriz extracelular. Essas avaliações ocorrem, basica¬
focal é a detecção de luz refletida. Nesta condição, obje¬ mente, a partir da densitomctria óptica. £ importante
tos ou substâncias refletoras podem ser visualizados com ressaltar que esses padrões texturais requerem discripto-
todas as vantagens da microscopia confocal (Figura 3.9). res matemáticos complexos, mas a associação de biolo¬
gistas celulares a cientistas da computação tem gerado
grandes progressos nessa área.

Aplicações da microscopia
de luz nas análises quantitativas Microscopia eletrônica
e de padrões texturais
O desenvolvimento da microscopia eletrônica teve inicio
Para a quantificação de elementos ou de macromolé- principalmente a partir de estudos do comportamento
culas na célula, existem vários sistemas. O principal ondulatório dos elétrons, que, como foi demonstrado,
deles c o conhecido citofotòmetro ou microespectrofo- comportam-se como fótons num sistema de vácuo. Um
tômetro. Esse aparelho comporta-se como um micros¬ dos primeirosexperimentos a respeito da óptica dos fei¬
cópio comum, em seu sistema óptico, entretanto ele xes eletrónicos ocorreu na década de 1920, a partir dos
apresenta uma fotocélula que capta os sinais luminosos achados de Busch. Esse autor provou que seria possível
e os transfere para um terminal fotométrico (à seme¬ conduzir elétrons com o uso de lentes eletromagnéticas.
lhança do espectrofotômetro utilizado nas dosagens Baseados nesses princípios, em 1931, tendo na liderança
bioquímicas), que transformará os valores absorcio- o pesquisador Ruska, foram iniciados estudos para a
mét ricos em valores quantitativos. A citofotometria construção do primeiro microscópio eletrònico.
tem tido ampla aplicação na área de biologia celular, Os princípios que regem a óptica da microscopia
principalmente para a quantificação de DNA e de pro¬ eletrônica são os mesmos descritos para a microscopia
teínas, dentre outras macromoléculas. de luz, sendo que o primeiro apresenta-se de maneira

34 A Célula
Tabela 3.1 Principais diferenças entre as microscopias de luz e eletrónica
quanto aos aspectos de funcionamento e formação da imagem (retirado
de Benchimol. 1996).

Aspectos de Microscopia de luz Microscopia eletrónica


comparação convencional de transmissão

Fonte luz visível elétrons


Lentes de vidro eletromagnéticas
Limite de
resolução 200 nm 0.2 nm
Formação absorção elétron-opacidade
da imagem

invertida, isto é, a fonte geradora dos feixes de elétrons


está na porção superior do aparelho. As principais dife¬
renças entre os dois tipos de microscopia são apresenta¬
das na Tabela 3. 1. Figura 3.10 Microscopia eletrónica de transmissão de corte uitrafmo de
mastócito em fase de degranulaçáo na próstata de rato em processo de
A microscopia eletrónica, como a microscopia de regressão após a castração experimental, Ê notável o aspecto da célu¬
luz, também apresenta vários tipos de aparelhos com la eliminando seus grânulos, os quais apresentam graus variáveis de
especificidades quanto ao funcionamento e à utilização. eletrodensidade.
Basicamente, pode-se dizer que existem duas formas de trons encontram elementos como ferro, ósmio, chumbo
microscopia eletrónica: a microscopia eletrónica de ou ouro e eletrolúcida ou clara, quando os elétrons en¬
transmissão e a microscopia eletrónica de varredura. contram elementos como hidrogénio, carbono, nitrogé¬
nio ou oxigénio. O material biológico é constituído na
grande maioria por elementos que se comportam como
elementos eletrolúcidos, de modo que é necessário con¬
Microscopia eletrónica trastar o material.Pode-se contrastar o material biológico
de transmissão com metais pesados para se conseguir um bom contraste
na imagem final (Figura 3.10).
O funcionamento do microscópio eletrônico de trans¬
missão está relacionado, principalmente, à natureza dos
feixes de elétrons, utilizados na formação da imagem.
Neste tipo de microscopia, os elétrons tem de interagir Microscopia eletrónica
com o objeto para fornecerem a imagem. O objeto deve de alta voltagem
ser extremamente fino para permitir a passagem dos
elétrons. Na microscopia eletrónica de transmissão comum, como
Hm linhas gerais, o microscópio eletrônico de já foi dito anteriormente, a aceleração eletrónica se dá
transmissão é composto por uma fonte geradora de elé¬ por volta de 100 KV. Entretanto, existem alguns tipos de
trons que caminha por um sistema de lentes eletromag- microscópios eletrónicos que aceleram seus elétrons
néticas, dispostas em uma coluna que funciona num sis¬ entre 500 e 1.000 KV. Esses microscópios são conheci¬
tema de alto vácuo na ordem de 10 Torr. Os feixes de dos como microscópios eletrónicos de alta voltagem ou
elétrons são acelerados e estes se desprendem do filamen¬ de alta aceleração. Os princípios de funcionamento e a
to por uma diferença de potencial que varia de 20 a 100 estrutura geral do aparelho se assemelham muito, com
KV num microscópio de transmissão comum, mas que a diferença de que esses aparelhos são extremamente
pode chegar até 1 .000 KV em alguns modelos especiais. grandes, chegando a ocupar edifícios de até 3 andares.
Ao saírem da fonte geradora, eles são encaminhados para A utilização do microscópio de alta voltagem veio,
a lente condensadora dos feixes, que os direciona para o de certa maneira, revolucionar a biologia estrutural, pois
espécime. O padrão de transparência aos elétrons será graças a esse aparelho, muitas estruturas subcelulares
ampliado subsequentemente pelas lentes intermediária e puderam ser descritas, como, por exemplo,a organização
projetora. Entretanto, a imagem ainda não pode ser regis¬ tridimensional dos componentes do citoesqueleto, gra¬
trada pela retina. As imagens ampliadas pela lente proje¬ ças á possibilidade de se utilizarem espécimes com espes¬
tora são projetadas sobre um anteparo fluorescente, uma sura na casa dos micròmetros e, até mesmo, células intei¬
chapa fotográfica ou um monitor de TV. ras, o que não seria possível na microscopia eletrónica de
A formação final da imagem pode ser interpretada transmissão convencional.
como sendo eletrodensa, ou seja, escura, quando os elé-

A Célula 35
Capitulo 3 MICROSCOPIAS

feixe eletrónico. Um fator que deve ser levado em conta


quando se comparam as microscopias eletrônicas de
transmissão e de varredura é a maneira de preparar as
amostras a serem analisadas. As principais diferenças
estão apresentadas na Tabela 3.2.
O microscópio eletrónico dc varredura está
constituído de um sistema de geração de elétrons que
varre a superfície do espécime; um local em que deposi-
ta-se a amostra devidamente preparada, que partirá o
sinal que dará a origem da imagem; um sistema de cap¬
tação dos elétrons secundários, que coleta o sinal e o
amplifica e, por último, um sistema para compor a
imagem final, que consiste de um monitor de vídeo.
Figura 3.11 Microscopia de varredura de sedimentos geológicos da
Formação Adamantina (município de Macedónia. SP). Os minerais de
Anatana são observados no centro do campo como estruturas poliédri¬
cas. Cortesia de Ma* Brandt Neto.
Microscopia de tunelamento
Microscopia eletrônica de varredura quântico e de força atómica
A microscopia eletrônica de transmissão fornece infor¬ Esse tipo especial de microscópio eleva a potência visual
mações a partir de cortes ultra-finos de células ou tecidos, do olho humano em I milhão de vezes. Desenvolvidos na
pois a obtenção da imagem depende da interaçào dos elec¬ década de 1980. eles multiplicam em 100 vezes a capaci¬
trons com o material, ao ser atravessado por eles ou não. dade dos microscópios eletrónicos. A concepção original
O microscópio eletrónico de varredura pode re¬ desses aparelhos resultou dos trabalhos de dois cientistas
velar feições topográficas de uma superfície com grande suíços Benning e Rohrer. que ganharam o Prémio Nobel
nitidez de detalhes. Esse aparelho fornece imagens tridi¬ de Física,em 1986. 0princípio da microscopia de tunela¬
mensionais, tanto de objetos relativamente grandes, mento parte do pressuposto de que todos os corpos têm
como vermes e insetos, quanto de células livres, como características ondulatórias e emitem energia. Assim, o
tecidos animais e vegetais ou. até mesmo, embriões e aparelho apresenta uma agulha que dista da superfície da
fragmentos geológicos em análises de granulometria e amostra em I A, ou seja, um milionésimo de milímetro.
textura dc solos (Figura 3.1 1). Essa agulha percorre a superfície da amostra e forma uma
Essas imagens tridimensionais são obtidas quan¬ corrente energética, chamada tunelamento. l*sa corrente
do não são utilizados os elétrons transmitidos, e sim os atrai os elétrons do material para a agulha, formando uma
elétrons secundários ou refletidos, que partem da su¬ espécie de túnel. Quando a agulha passa sobre um átomo,
perfície da amostra quando esta é bombardeada pelo a corrente aumenta e quando percorre sobre os espaços

Tabela 3.2 Comparação entre a microscopia eletrônica de transmissão e a de varredura quanto ao preparo das amostras biológicas
(reproduzido de Benchimo), 1996),

Microscopia eletrônica de transmissão Microscopia eletrônica de varredura

fixação pelo glutaraldeido

pós-fixação pelo tetróxido de ósmio

desidratação em série alcoólica ou acetona

material deverá ser incluído material deverá passar


em resinas especiais por uma secagem especial - "ponto crítico"

ultramicrotomia para obtenção evaporação com ouro


dos cortes ultrafinos na superfície a ser analisada

contrastação com metais pesados não necessita da contrastação

36 A Célula
entre os átomos, ela diminui. Esses sinais de aumento e sem maiores interferências com a amostra (Figura 3.12).
diminuição da corrente são transmitidos para a tela de Esse tipo de instrumento permite também a obtenção
um computador, na qual se formam as imagens que se de imagens em solução ou de sequências que represen¬
assemelham à superfície de vales e montanhas. tam reaçòes químicas ou modificações estruturais ao
O microscópio de força atómica assemelha-se ao longo do tempo. Nesse tipo de aparelho também pode
de tunelamento quântico, com a diferença de que este ser avaliada a estrutura atómica de biomoléculas.
último apresenta um microespelho e um feixe de laser
sobre a agulha. Esse fato permite uma menor agressivi¬
dade à amostra e a detecção de detalhes de superfície,
Referências bibliográficas

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8. Vidal BC. Métodos em biologia celular. In: Biologia celular.
Figura 3.12 Observação das cadeias polissacaridicas de quitma. na
concha resquicial de lulas, após remoção da porção protéica. Note a Vidal BC. Mello MIS, editors. Rio de Janeiro: Athcneu,
ondulação das fibrilas que corresponde à torção dos dimeros de quito- 1987. p.5-39.
brcse ao longo da cadeia Note também a escala da ordem de nanòme*
tros Cortesia de Hernandes F. Carvalho e Nivaldo A. Parizotto.

A Cé u a 37
MÉTODOS DE
ESTUDO DA CÉLULA

Sebastião Roberto Taboga e Patricia Simone Leite Vilamaior

Para a obtenção de um bom preparado citológico, ou histológico, que seja passível de análise ao micros¬
cópio, é imprescindível que se tome alguns cuidados durante todas as etapas do processamento. Os cui¬
dados a serem tomados vão desde a escolha e coleta do material, até a montagem do preparado perma¬
nentemente em lâmina histológica. Este tópico tem por objetivo proporcionar uma visão geral das eta¬
pas de preparo de lâminas para a análise em microscópio.

Coleta do material biológico


Essa etapa é de importância fundamental para o estudo
dos componentes celulares e subcelulares, pois nesta
fase é que são definidas as formas de análise dos prepa¬
rados citológicos. Imagine que para estudar células san¬
guíneas e células de fígado ou até mesmo espermatozói¬
des, não se pode recorrer ao mesmo método de coleta
do material. Assim, pode-se dizer que existem métodos
específicos para coleta de materiais distintos, já que, na
natureza, existem formas muito distintas de organiza¬
ção de células e tecidos.
Montagem total
Consiste em coletar o material, que deverá ser fino
ou transparente o suficiente para que o mesmo possa
ser colocado diretamente sobre uma lâmina, e, assim,
promover as técnicas subsequentes de fixação c colora¬
ção. Esse tipo de procedimento é utilizado no estudo de
órgãos de insetos, como túbulos de Malpighi, glândulas
salivares, ovaríolos ou até mesmo mesentérios e mem¬
branas fetais de vertebrados, já que essas estruturas são
ricas em células e matriz extracelular. A vantagem de se
estudar esses preparados por essa metodologia reside
no fato de se obter as células inteiras, podendo inclusi¬
Figura 4.1 a. Montagem total de túbuto de Malfxghi de Periplaneta ameri¬
ve serem feitas medidas e quantificações (figura 4.1 ). cana (barata doméstea) submetido à reaçào de Feulgen para DNA. Os
núdeos podem ser vistos com coloração intensa Note que. por este méto¬
Esfregaço do de coleta do material, pode-se ter a ideia correia da topografia dos
núdeos no órgão. b. Montagem total de mesentèòo corado pelo pkzos-
Células livres presentes nos fluidos corpóreos,como san¬ sirius. Por essa preparação, pode-se observar a trama de fibras cotágenas
gue, linfa, sémen, liquor, hemolinfa, podem ser dispostas que à luz polarizada ficam brreínngentes

38 A Célula
\

Figura 4.2 Esfregaço de sangue corado pelo método de Leishman.


>
Pelo método de coleta pelo esfregaço. uma fina camada celular pode
ser disposta sobre a lâmina, facilitando a identificação dos fenótipos
vv
celulares do sangue periférico. Nesta figura, pode ser observado um
glóbulo branco do tipo neutrófilo, com núcleo polimórfico. rodeado por
hemácias anucleadas.

sobre lâmina cm fina camada de maneira que possam ser Figura 4.4 Esmagamento de ceWas epitetiais da glândula salvar de Drosó-
observadas em microscópio de luz. O método de esfrega¬ fila submeWo à cctoraçào peto Giemsa. Os cromossomos poíiténscos das
ço consiste em colocar uma gota do material a ser anali¬ células epteiais apresentam-se altamente distendidos, podendo caracterizar
os padrões de bandas e inter bandas. Cortesia de Prof Ora. Cláudia Márcia
sado sobre uma lâmina e, com o auxilio de uma outra Aparecida Carareto
lâmina, promover o deslizamento do líquido sobre a pri¬
meira lâmina, de forma que se faça uma camada do líqui¬ Esmagamento
do com células sobre o vidro. Dessa forma, as células Esse método consiste em esmagar, entre lâmina e lami-
serão isoladas umas das outras e obter-se-á um prepara¬ nula,o material a ser analisado. Pode-se promover a colo¬
do suficientemente fino para a análise (Figura 4.2). ração concomitantemente ao esmagamento, ou promo¬
ver a retirada da lamínula com auxilio de nitrogénio liqui¬
Espalhamento do, e fazer a coloração posteriormente. O nitrogénio lí¬
O espalhamento, erroneamente chamado de esfregaço, quido congela rapidamente o material e a lamínula pode
consiste em promover uma raspagem das camadas ser retirada sem que o material esmagado seja removido
superficiais de membranas mucosas com uma pequena da lâmina. Esse método de coleta é muito eficiente para
espátula ou palitos e, posteriormente, deslizar esse ma¬ estudos de divisões celulares em tecido com alta taxa de
terial raspado sobre a superfície limpa de uma lâmina. divisão (raiz de cebola, testículos e glândulas salivares de
Esse tipo de prática é muito utilizada para a avaliação de insetos). Também, por esta maneira de coleta, pode-se
mucosas vaginais, no conhecido exame preventivo de estudar núcleos interfásicos inteiros com a vantagem de
câncer denominado Papanicolau. Pode-se eventual¬ obtenção de preparados na íntegra, podendo assim fazer
mente fazer raspagem de outras mucosas, como a quantificações de DNA e proteínas nucleares (Figura 4.4).
mucosa anal e mucosa bucal, fi importante lembrar que
nessa técnica de coleta as células espalhadas sobre as Decalque
lâminas estão inteiras, embora a forma celular nem O objetivo dessa técnica de coleta é colocar sobre uma
sempre seja preservada (Figura 4.3). lâmina, devidamente limpa, núcleos inteiros de órgãos
com relativa consistência mole, como, por exemplo, o
fígado, o baço, os rins, o timo. A técnica consiste em
retirar do animal um fragmento do órgão a ser estuda¬
do, e a face que foi cortada deverá ser lavada em solu¬
ção salina, para retirada do sangue, e secada em papel
de filtro posteriormente. Assim, com o auxílio de uma
pinça, esse órgão deverá ser pressionado, imediata¬
mente, contra uma lâmina pela sua face de corte e,
posteriormente retirado. O processo se repete como se
a lâmina fosse carimbada. Ao promover esses movi¬
mentos, os núcleos ficarão impressos na lâmina,
podendo ser feitos os passos seguintes de fixação e
Figura 4.3 Espalhamento de células da mucosa oral corados pelo verde coloração. Essa técnica relativamente simples é muito
janus. Nesta forma de coleta do material, as células pavimentosas da
superfície da mucosa estão inteiras e podem ser vistas com seus nú- útil para o estudo de quantidade de DNA, interações
deos centrais moleculares entre complexos DNA/proteína, textura

A Célula 39
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Figura 4.5 Decalque de fígado de camundongo. Os núcleos foram sub¬


metidos à reaçào de Feuigen para DNA Nesta metodologia de coJeia. os Figura 4.6 Corte histológico de mucosa estomacal de rato corado pela
núcleos interfástos dos hepatóotos aparecem inteiros, podendo indusive hematoxiiina-eosina Podemos ver com riqueza de detalhes, em cortes
facilitar os métodos quantificados de DNA. transversais, as glândulas estomacais.

cromatínica c análise de imagem dos fenótipos nuclea¬ coletados em lâmina e passar pelos métodos de coloração
res (Figura 4.5). desejados (Figura 4.6).
Corte histológico
Existem muitos estudos em que a inter- reiaç.»o entre as Fixaçào biológica e agentes fixadores
células e a topografia dos tipos celulares deve ser respeita¬
da. Assim, é necessário promover cortes extremamente A fixação constitui uma das etapas mais importantes dos
finos dos órgãos a serem analisados. Para isto, utiliza-se o processamentos citológico e histológico, pois depende
corte histológico. A técnica histológica consiste na obten¬ de processos físico-químicos nos quais os componentes
ção de cortes extremamente finos (na casa dos micrõme- macromoleculares dos tecidos e das células passam por
tros de espessura) e na sua colocação sobre a lâmina. um processo de insolubilização, que inativa os constitu¬
Entretanto, para a obtenção desses cortes, é preciso que o intes moleculares dos compartimentos teciduais ou
materiala ser analisado passe por um tratamento de inclu¬ celulares de origem. Em última análise, o processo de
são em parafina, resina ou gelatina, ou simplesmente seja fixação biológica promove uma preservação das caracte¬
congelado. Com qualquer um desses tratamentos, o mate¬ rísticas morfológicas e macromoleculares dos tecidos ou
rial ficará uniformemente duro, podendo ser facilmente células. A fixação também tem por função impedir a
cortado pelo micrótomo (equipamento utilizado na autólise ou degradação bacteriana do material biológico
obtenção dos cortes; para cortes de parafina e historresinas a ser analisado ao microscópio. Atribui-se também aos
é utilizado o micrótomo rotativo manual e para cortes agentes fixadores a função de facilitar os processamentos
ultra-finos para microscopia eietrónica é utilizado o ultra- posteriores de coloração, pois muitos corantes apresen¬
micrótomo). O meio de inclusão mais utilizado na técni¬ tam maior afinidade pelo substrato fixado, além de pro¬
ca histológica para obtenção de cortes é a parafina. Entre¬ moverem um enrijecimento dos órgãos e tecidos. A fixa¬
tanto, esse composto não é miscível em água, portanto, o ção é um passo importante da técnica citológica e histo¬
materialbiológico deverá ser desidratado. A desidratação é lógica, pois a análise satisfatória de um determinado
feita em série crescente de álcool etílico. Posteriormente, o preparado depende da preservação adequada do que se
material passará por banhos de xilol ou benzeno,para pro¬ quer analisar. Assim, numa fixação medíocre, muitas
mover o clareamento ou clarificação. Este último passo é vezes, estruturas teciduais, que seriam vistas por meio de
realizado porque a parafina também não é miscível no uma fixação adequada, aparecem obscurecidas.
álcool. Após o tratamento pelo xilol, as peças histológicas Em algumas situações, a fixação pode ser realiza¬
ficarão imersas em parafina liquida (60 C) com a finalida¬ da por agentes físicos (calor e microondas), utilizada
de de haver a impregnação ou infiltração da parafina â principalmente na fixação de bactérias. Entretanto,
medida que o xilol evapora. Após a infiltração,deposita-se usualmente é empregada a fixação por meio de subs¬
o fragmento a ser estudado no interior de uma caixinha de tâncias químicas, ditas fixadores.
papel ou plástico contendo parafina fundida e,à tempera¬ Os fixadores são agentes químicos das mais di¬
tura ambiente, formar-se-á um bloquinho, que será leva¬ versas funções orgânicas, que reagem quimicamente
do ao micrótomo para o feitio dos cortes histológicos com os componentes celulares, promovendo a sua es¬
(Tabela 4.1). Assim, os cortes histológicos poderão ser tabilização molecular. Os principais componentes ce-

40 A Célula
Tabela 4.1 PrinOpais etapas do processamento de um fragmento de órgão maciço para obtenção de cortes
histológicos de rotina.
Etapa do
processamento
Agente Tempo médio Função principal
|
Fixação Formalina a 10% 12 a 24 horas Preservação dos caracteres
(dependendo do estruturais.
material)
Lavagem Agua corrente dobro do tempo Remoção do excesso de fixador.
da fixação ÿ ÿ ÿ

Desidratação Série crescente de 1 hora em cada Retirada da água dos tecidos.


álcool etílico (70%. banho
80%. 95%. 100%)
Clarificação ou Xilol. benzeno ou
30 a 60 minutos Promover a retirada do álcool e
diafanizaçào tolueno (vários ba¬ permitir que a parafina penetre no
nhos) tecido. Remove gordura dos teci¬
dos. deixando-os translúcidos.
Infiltração Parafina liquida (60 C. 2 a 3 horas Promover a entrada da parafina
vários banhos) na intimidade dos tecidos, para
depois de solidificada, constituir o
bloco histológico.
Emblocamento Parafina pura ou alguns minutos Depois de solidificada a parafina.
acrescida de cera de facilita o corte histológico.
abelha (10:1) I
Microtomia Micrótomo indiferente Promover cortes finos do teado a
ser estudado.
Distensão Banho-maria indiferente Distensão e pesca do corte em
do corte lâmina histológica._
——— i

Secagem
ÿ » » 1—
1

_
ÿ

1 Estufa a 37°C 12 horas Adesão dos cortes na lamina.


M « A
H H ftÿft ÿk ÿk ÿk ÿk H ÿft ÿk ÿk m Hl ÿk H ft

Coloração Corantes específicos depende do pro¬ Evidenciar seletivamente as


tocolo de colora¬ estruturas teáduais e celulares.
ção a ser utilizado
Montagem Bálsamo do Canadá alguns minutos Preservação do material entre
ou resinas sintéticas lâmina e laminula.

lulares que podem ser preservados são as macromoléculas muito utilizado, juntamente com o glutaraldeido, em
(proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios). Na fixações para microscopia eletrônica); ácido pícrico,
maioria das vezes, os fixadores agem sobre essas moléculas ácido crômico e bicloreto de mercúrio (excelentes fi¬
coagulando-as ou tornando-as insolúveis e, consequente¬ xadores de proteínas).
mente, precipitando-as nos tecidos de origem. f- importante ressaltar que essas soluções podem
Existem muitos compostos químicos que po¬ ter a capacidade de fixação potencializada se associadas
dem ser utilizados como substâncias fixadoras. Den¬ umas às outras, constituindo as misturas fixadoras.
tre eles, podemos citar: acetona (excelente fixador de Classicamente, existem várias misturas fixadoras que se
espalhamentos e esfregaços celulares, muito utilizada prestam eficientemente para estudos específicos, como,
em preparados para hibridações moleculares e para por exemplo, o fixador de Carnoy (uma mistura de
microscopia confocal); álcoois etílico, metílico e terc- etanol c ácido acético), muito utilizado nos estudos de
butilico (também fixa por desidratação os compo¬ complexos DNA/proteína; o fixador de Bouin (mistura
nentes de células isoladas de esfregaços ou decalques, de ácido acético, ácido pícrico e formalina), excelente
muito bons para estudos de ácidos nucléicos e polis¬ para estudos histológicos gerais; fixadores de Ilelly e de
sacarídeos); aldeídos (formaldeido, glutaraldeido e Zenker (mistura de soluções aquosas de bicromato de
paraformaldeido), que são excelentes fixadores de potássio e bicloreto de mercúrio), excelentes fixadores
proteínas, pois promovem uma ligação cruzada entre nào-aldeídicos de proteínas, muito utilizados no estudo
as cadeias polipeptídicas ditas pontes de metileno; te- de miofibrilas.
tróxido de ósmio (eficiente na fixação de lipídios e

A Célula 41
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Preparação do material 2 - CITOQUÍMICA


para microscopia
eletrônica de transmissão
Existem diferenças fundamentais entre o processamento Sebastião Roberto Taboga e
de fragmentos de órgãos para a microscopia de luz e Patricia Simone Leite Vilamaior
para a eletrônica. Serão abordadas, neste tópico, as prin¬
cipais diferenças entre as etapas para a técnica rotineira
de obtenção de cortes ultrafinos. As diferenças no pro¬ As células e os tecidosbiológicos,assim como toda a maté¬
cessamento residem no fato de serem necessários maio¬ ria viva, são constituídos de elementos químicos de baixís¬
res cuidados com a preservação do material, visto que o simo peso molecular, como, por exemplo, o carbono, o
poder de resolução da microscopia eletrônica é muito oxigénio, o nitrogénio, o hidrogénio, dentre outros. Dessa
maior que o da microscopia de luz. Estas diferenças refe- forma, a visualização da matéria orgânica ao microscópio
rem-se ao processo de fixação, inclusão, corte e colora¬ fica comprometida devido a seu baixo contraste.Além dis¬
ção (Tabela 4.2). so, o material a ser examinado ao microscópio de luz deve,
Tabela 4.2 Comparação entre o processamento rotineiro de obtenção do em princípio, ser bem fino e transparente, para que a luz
corte histológico para análise em microscopia de luz e de corte uitraf.no possa interagir com este para a formação da imagem. Par¬
para análise em microscopia eletrônica de transmissão. tindo dessas colocações iniciais, faz-se necessário preparar
o material biológico por colorações ou rcaçòes que resul¬
Etapa do Microscopia Microscopia eletrônica tem numa resposta colorida dos elementos a serem anali¬
Processamento de luz de transmissão sados para que possamos visualizar o material com maior
Fixação em uma etapa em duas etapas (fixa¬ clareza tie detalhes ao microscópio de luz.
(formalina ou outro ção primária em A citoquímica é a área da biologia celular e estru¬
agente fixador) glutaraldeido e pós-fi- tural dedicada aos estudos dos métodos de coloração dos
xaçáo em tetróxido de tecidos e constituintes celulares ou subcelulares, preocu-
ósmio)
' álcool etílico pando-se não somente com os princípios químicos das
Desidratação álcool etílico, acetona
ou óxido de propileno reaçóes de coloração, mas também com os procedimen¬
tos protocolares para obtenção de preparados a serem
Clarificação xilol não existe esta etapa
avaliados aos microscópios. Muitos são os elementos que
Inclusão parafina resina epoxi
podem ser estudados citoquimicamente, tanto para pes¬
Corte microtomia com ultramicrotomia com quisa cientifica como para finalidade de diagnóstico
navalha de aço navalha de vidro ou
(cortes com 3 a diamante (cortes com patológico. Dentre eles, pode-se citar os ácidos nucléicos,
7 pm de espessura) 250 a 400 nm de os polissacarideos, os lipídios, as proteínas, alguns íons
_ _ [ espessura) que se associam a complexos moleculares maiores, como
Coleta do corte lâmina de vidro tela de cobre os ions Ca * no tecido ósseo, além de enzimas.
Coloração corantes metais pesados Para que uma reaçào citoquímica tenha sucesso, é
necessário que alguns princípios básicos sejam cumpri¬
dos, como, por exemplo, que se saiba previamente que os
Referências bibliográficas elementos a serem avaliados não sejam difusivos no pro¬
cessamento histológico de rotina de fixação do material e
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1987. p.5-39. pende dos passos anteriores à coloração. A coleta do mate-

42 A Célula
rial, a fixação e os fixadores usados e os agentes desidratai!- Entcnde-se por acidofilia o fenómeno cito-
tes sào fatores que influenciam sobremaneira a reação ci- quimico no qual um substrato carregado positiva¬
toquímica. A Figura 4.7 mostra um preparado com dois fi¬ mente, chamado de substrato catiónico, reage eletros-
xadores diferentes e submetidos à mesma reação citoqui- taticamente com um corante carregado negativamen¬
mica. Observe que, se não fixado adequadamente, muitos te, dito aniónico. Assim, por ligação iónica, esses dois
elementos dos tecidos podem ser extraídos e, consequen¬ elementos reagem e formam um composto colorido,
temente, a interpretação pode levar a conclusões erróneas. que será evidenciado ao microscópio de luz.
As reaçòes citoquimicas podem ser consideradas Como exemplo de corantes aniónicos temos o Xy-
de acordo com a natureza da reação química envolvida. liílinc, o Sirius Red, o Fast Green e a eosina, dentre outros
Assim, poderemos definir trés maneiras de se obter ( Figura 4.8). Esses corantes reagem com os elementos que
uma reação citoquimica: por ligações eletrostáticas, por possuem cargas positivas na célula,como por exemplo, as
ligações covalentes e por inetrações hidrofóbicas. proteínas, que podem apresentar radicais básicos de seus
aminoácidos ionizados (NHj ). Logicamente, esses gru-

Reações citoquimicas mediadas


por ligações eletrostáticas
Nestas reações, dizemos que, por afinidade eletrostática,
um corante ionizado em uma solução reage com um
substrato (nome dado ao componente a ser avaliado pela HO
reação) de carga iónica oposta. Assim, podemos enume¬
rar dois fenómenos citoquímicos: acidofilia e basofilia.

SO"

OH SO",

O" K+
K+ "°3S\/V Á. /N02

Figura 4.7 Cortes histológicos de testículo de rato submetido ao método


do fast green pH 8.1 para proteínas histônteas. Na figura (a) o material foi
fixado pela solução de formaima e na figura (b). pelo etanol: áodo acético
(3:1). Observe que ocorreu uma considerável remoção de proteínas no Figura 4.8 Fórmulas químicas de alguns corantes aniónicos. a Fast
segundo processo de fixação. Aumento de 400x. Green, b. Orange 6. c. XyixJme Ponceau, d. Amarelo de Naftol.

A Célula 43
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

pamcntos se ionizam na dependência de pl Is diferencia¬


dos, que são obtidos a partir de soluções tampão em que
os corantes são diluídos. Assim, poderemos evidenciar
proteínas totais em pH 2,5 e proteínas básicas, como as
histonas e as protaminas, em pH 8,1. Uma imagem mui¬
to elegante e didática de material corado por corante cati-
ónico é a cartilagem hialina de traqueia corada pelo
Xylidine Ponceau a pl I2,5 (Figura 4.9).
Entende-se por basofilia como o fenómeno cito-
químico no qual um substrato carregado negativamente,
chamado de substrato aniónico, reage eletrostaticamente
com um corante carregado positivamente, dito catiônico. ch3
Como exemplo de corantes catiônicos podemos ci¬
tar os corantes tiazínicos Azul de Toluidina, Azul de Me¬
tileno e Azul deAlcian (Figura 4.10). A hematoxilina, em¬
bora não seja um corante, pode ser considerada umcom¬
plexo de corantes que comportam-se como corante cati¬
ônico. Esses corantes reagem com os elementos ionizáveis
nos tecidos que apresentam cargas negativas, os grupa¬
mentos aniônicos. Dentre eles, podemos citar os grupa¬
mentos fosfato (PO., ') dos ácidos nucléicos, os grupa¬
mentos sulfato (SO., e SO3") dos glicosaminoglicanos
ácidos sulfatados da matriz extracelular e os grupamentos Figura 4.10 Fórmulas quimxas de alguns corantes catiônicos. a. Azul de
carboxila (CO» ) das proteínas e glicosaminoglicanos áci¬ Aloan. b.Azul de Toluidina.
dos carboxilados. Também é importante lembrar que a
especificidade dessas reaçòes depende do pl 1 da solução heparina, ácidos nucléicos e glicosaminoglicanos ácidos.
em que o corante foi diluído. A Figura 4.1 1 mostra algu¬ Uma maneira didática de se observar o fenómeno de me¬
mas reaçòes citoquimicas com corantes catiônicos. tacromasia é analisando-se cortes histológicos de testícu¬
Os corantes Tionina e Azul de Metileno, e em me¬ los do anfíbio Scinaxfiucovaria,onde os vários graus de
nor grau o Azul de Toluidina, devido à natureza planar de amadurecimento e maturação das células espermáticas
suas moléculas, promovem um fenómeno de ordem es¬ revelam diferenças no comprometimento do DNA nucle¬
pectral importante na citoquímica, conhecido por meia- ar com proteínas nucleares. Isso leva ao bloqueio de sítios
cromasia. Esse fenómeno foi primeiramente observado fosfato impedindo a ligação com o corante. Assim, temos
em 1875 por Ranvier et al. e a definição formal com a ter¬ células imaturas,com menor grau de compactação nucle¬
minologia inctacroniasia foi dada por Ehrlich, em 1877. ar, coradas metacromaticamente e células maduras, alta¬
Segundo a definição de Ehrlich, metacromasia indica a mente compactadas, onde o fenómeno de metacromasia
modificação 110 espectro de absorção de alguns corantes foi abolido (Figura 4.12).
básicos quando se unem a polímeros polianiónicos,como Embora o fenómeno de metacromasia seja am¬
plamente descrito para os corantes catiônicos, certos
corantes ácidos podem apresentar o referido fenóme¬
no. Um exemplo de corante aniónico que exibe esse
fenómeno é o Congo Red.

Reacões citoquíniicas
mediadas por ligações covalentes
Muitassão as reaçòescitoquimicas mediadas por ligações
covalentes, principalmente aquelas que necessitam ser
facilitadas por uma molécula de componente metálico,
que é chamado mordente. Aqui estão incluídas as colora¬
Figura 4.9 Corte histológico de cartilagem halina de cào corada pelo ções seletivas para o tecido conjuntivo, denominadas co¬
X/idine Ponceau em pH 2.5. Nesta figura pode-se observar uma pronun¬ lorações tricrómicas (Figura 4.13). Os tricrómicos são
ciada positividade à reaçào na regÿo pericoodrial (p). onde existe um
grande acúmulo de fibras cotágenas. Aumento de 350x. conhecidos como técnicas citoquimicas para demonstra-

44 A Célula
Figura 4.11 Reaçóes citoquimoas por corantes catiónicos. a. Corte histológico de cartilagem hialina de cão corada pelo azul de tQuidma pH 2,5. A reaçào
positiva se dá devido á grande quantidade de proteoglicanos sulfatados presentes na matriz cartilaginosa, principalmente na matriz temtonal dos condróa-
tos (seta), b. Núcleos (n) de células epíteliais de túbulos de Malpighi de triatomineo corados pelo azul de toluidma pH 4.0. A reaçào se dá pela presença de
orupamentos fosfatos disponíveis na cromatina. c. Cortes histológicos de intestino grosso humano corado peto azul de atcian pH 1,0. Os componentes sul¬
-
fatados constituintes da secreção mucosa sào observados por esta técnica (seta). Aumentos: a = 350x. b = I200x. c 1200x. A Figura b foi gentilmente
cedtoa por Patrícia Martins Casseb-Hassan.

çào diferencial dos tecidos conjuntivos. Essa denominação


se deu ao serem observados, nos preparados histológicos,
diferencialmente, as células musculares, o colágeno e os
vasos sanguíneos. Têm-se descrito na literatura muitas
técnicas tricrômicas. Dentre elas citam-se o tricrómico de
Masson, o tricrómico de Mallory e o tricrómico de Gò-
mõri. As diferenças residem nos tipos de corantes utiliza¬
dos e dos mordentes, que podem ser o ácido fusfotúngsti-
co ou o ácido fosfomolíbdico. Embora não se tenha ainda
descrito o princípio exato dessas reaçóes,essas técnicas sào
muito difundidas e utilizadas na histopatologia e na pes¬
quisa científica da área de biologia celular c tecidual.
Os exemplos mais clássicos de reaçóes citoquimi-
cas mediadas por ligações covalentes são, entretanto, a
reaçào de Feulgen, para DNA e o teste do Acido Perió-
dico-Schiff (PAS), para polissacarídcos neutros. Ambas
as reaçóes sào obtidas a partir de um mesmo reagente
chamado de Reativo de Schiff,que consiste num leucode-

Figura 4.13 Cortes histológicos submetidos a colorações tncrómicas a


Figura 4.12 Corte histológico de testículo de Scínax luscovaria corado Fragmento de adenocarcinoma prostático corado peto tricrómico de
peto azul de toluidina pH 4.0. Nesta figura observam-se núdeos imaturos Masson Pode-se observar, por esta técnica, o colágeno. em azul. e as
(i). com maior disponibilidade de grupamentos fosfato, pela pouca com¬ fibras musculares lisas, em vermelho, b. Corte histológico de pele humana
pactação cromatimca. corados em azul intenso (metacromaticamente) e corada peto tricrómico de Mazory. Os componentes da epiderme sào evi¬
núdeos corados em verde que. por serem de espermatozódes maduros denciados em vermetoo eos da derme em azul. c. Corte histológico de pele
(m). apresentam uma menor disponibilidade de grupos fosfato por humana corado peto tricrómico de Gomõri Por esta metodologia, também
estarem compromelidos com proteínas nucleares. Aumento de 1200x. discnmina-se a derme da epiderme. Aumentos: a = 350x, b e c = 250x

A Célula 45
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

rivado do corante Fucsina Básica. Esse reagente, quando


em presença de aldeídos livres ou combinados nos teci¬
I/' 0\l c—0
dos, promove a coloração magenta característica. i/ ÿ
\l
A reação de Feulgen tem, como pré-tratamento /í!—0- 0 C

I
do material a ser submetido ao reativo de Schiff, uma C C c c7l-o-
hidrólise ácida pelo HC1, na qual a molaridade do
ácido, o tempo e a temperatura podem variar na depen¬
A OH A A
Grupamento Ác*o
dência do material a ser estudado.* £ importante saber 1-2 glicol
periódico Ruptura do grupo 1-2
glicol e produção de
que essa hidrólise remove da molécula de DNA as bases /Hint
<h|04) aldeídos
púricas promovendo, assim, a depurinaçáo do DNA. O
ácido apurínico, assim então chamado o DNA sem as Figura 4.15 Mecanismo da reação do PAS. 0 tratamento pelo áodo perió¬
purinas, apresenta grupamentos aldeidicos, gerados a dico promove, na molécula de carboidrato neutro, uma ruptura na porção
partir da instabilidade das desoxirriboses, sendo estes 1-2 glicol, produzindo aldeídos que reagem com o reativo de Schiff.
reativos ao reativo de Schiff (Figura 4.14).
O teste do PASé muito utilizado para avaliações cito- vem conter formaldeklo, paraformaldeído ou glutaral-
químicas de polissacarideos neutros, como o glicogènio, o deido, pois esses fixadores deixam resíduos de aldeídos
amido e a celulose, além de glicoprotcínas. Baseia-se na nos tecidos, podendo resultar em coloração náo-específi-
capacidade do ácido periódico (HIO4) oxidar as ligações ca. Uma forma de evitar essa marcação inespccífica,
carbono-carbono das sequências I-2 glicol doscarboidra- quando o material foi lixado com um desses agentes fi¬
tos produzindo aldeídos ( Figura 4. 15). Após esse tratamen¬ xadores. é tratar o material com uma solução de boroi-
to prévio com o ácido periódico, o material será submetido dreto de sódio, antes da hidrólise ácida, na reação de
ao reativo de Schiff e, assim como na reação de Feulgen. os
aldeídos serão evidenciados em cor magenta (Figura 4.16).
Como o reativo de Schiff reage com aldeídos, é
importante lembrar que as fixações dos tecidos não de-

&
u
r*
Figura 4.16 Preparações histológicas submetidas ao teste óo PAS a Corte
Figura 4.14 Cortes histológicos submetidosà reação de Feulgen. a. Corte de fígado de porco mostrando os hepatòcitos com glicogènio na periferia do
de testículo de Sonax fuscovaria evidenciando as diversas (ases da ma¬ citoplasma (seta), b. Corte de intestino humano. Neste preparado, obser¬
turação espermátkca. b. Corte de células do epitélio da próstata humana. vam-se as células cataíormes (C). com o ápee repleto de gicoproteinas
Aumentos: a = 1200x. b = 400x. PAS positivas, e também a região da borda estriada (seta), fortemente mar¬
cada. c. Marcação PAS positiva da membrana basal de epitélio dos lóbulos
• Mais informações c conhecimentos sobre a Reaÿao de leulgcn podem ser renais devido à grande quantidade de gtcoproteínas nesta região. Aumento
extraídos da revisio feita por MIS Mello c BC Vidal. A reaçio de feulgen.
Cien Cult 1978: 30: 665-75.
- 1200x. Figura c cortesia de Prof' Dra. Rejane Ma*a Góes

46 A Célula
Feulgen, ou da oxidação com ácido periódico, no teste do
PAS. Esse reagente bloqueia os aldeídos livres nos tecidos.
o*-*-
Reações citoquímicas mediadas
por interações hidrofóbicas
Essas reações são especificas para lipídios não polares,
como, por exemplo, os trigliccrídeos e derivados do co¬
lesterol, sendo importante para o estudo de células adi¬
N=N
posas e de elementos do tecido adiposo ou até mesmo
para estudo dos lipídios da bainha de mielina nos nervos
e em células hepáticas (Figura 4.16).
HO
Essas colorações partem do principio que os lipí¬
Figura 4.18 Fórmulas químicas dos corantes hidrofóbicos, a. Sudan
dios nào-polares são altamente hidrofóbicos, portanto, as Black, b. Sudan III.
reações devem ser livres de água, consequentemente, os
corantes a serem utilizados devem ser diluídos em solu¬ clusòes em resinas que não necessitem de banhos cm sol¬
ções a base de álcool ou acetona. Assim, esses corantes ventes orgânicos, como o xilol e o benzeno.
interagem com os lipídios hidrofobicamente. É impor¬ Dentre os corantes específicos para lipídios, po¬
tante lembrar que os preparados histológicos tradicio¬ dem ser citados o Sudan Black, o Sudan 111 e o Azul de
nais de inclusão em parafina removem a maior parte dos Nilo (Figura 4.18).
lipídios e, portanto, para estudos dessa natureza, faz-se
necessária a utilização de cortes por congelamento ou in-
Citoquímica enzimática
Os estudos citoquímicos de enzimas baseiam-se, princi¬
palmente, na possibilidade de averiguar in situ a atividade
delas. Pira isto, são necessários alguns pré-requisitos, co¬
mo a preservação da integridade molecular da enzima,
com fixações brandas e/ou cortes por congelação,ou ainda
tratamento em bloco. Em linhas gerais, a técnica consiste
em proporcionar um ambiente de incubação (geralmente
a 37" C) onde coloca-se o fragmento de tecido ou corte his¬
tológico a ser estudado juntamente com o substrato da en¬
zima que se quer avaliar a atividade. Após a incubação, a
atividade da enzima resulta em um precipitado insolúvel
de cor conhecida, que será observado ao microscópio (Fi¬
gura 4.19). O controle do pH é condição indispensável pa¬
ra o sucesso dessas reações. Nessas reações a utilização de
controles de reação é de muita valia. Esse controle é feito
incubando-se o material sem o substratodaenzima. Dessa
forma, podem ser avaliadas as atividadesde foslatases alca¬
linas e ácidas, peroxidases,algumas enzimas mitocondriais
e muitas outras enzimas de membrana plasmática e endo-
membranas.

Análise integrada de técnicas


citoquímicas às microscopias especiais
Figura 4.17 Cofies htstoJógícos de fígado de porco corados pelos méto¬ Na interpretação dos fenómenos biológicos e clínicos,
dos do Sudan Black (a) e do Sudan III(b). Os lipídios coram-se respecti¬ muitas vezes, pode-se utilizar a análise do material pro¬
vamente em castanho escuro e escarlate.Aumento = 1200x A Figura b foi
cortesia de Prof' Dra Rejane Maira Góes. cessado pelas técnicas citoquímicas nos tipos especiais de

A Célula 47
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Figura 4.20 Reaçôes citoquimcas associadas a microscopias espe¬


ciais. a. Fibras elásticas (seta) coradas pela eosina observadas ao mi¬
croscópio de fluorescência, b. Fibras colágenas do pericôndrio (p) de
cartilagem hialina de cão coradas pelo Xylidine Ponceau pH 2.5 vistas
ao microscópio de polarização. Aumento: 350x
Figura 4.19 Citoquimica enzimática, a. Montagem total de túbulo de
Malpighi de triaiomineo submetido ã reaçáo dtoquimica para detecçáo mais acuradas para emissão de laudos histopatológicos,
de atividade da enzima fosfatase ácxJa As células estão fortemente mar¬ os testes citoquímicos são sempre utilizados. A Tabela
cadas peta alta atividade lisossomal (seta), b. Montagem total de glându¬
la salivar de larva de drosòfila submetida à reaçào otoquimica para 4.3 tem por objetivo elencar algumas técnicas utilizadas
detecção de atividade de fosfatase alcalina, que se mostra altamente na citopatologia e histopatologia para a emissão de lau¬
positiva na região da membrana plasmática (seta). A Figura a foi cortesia dos clínicos e suas principais aplicações.
de Maria Tercilia V. A Oliveira e a Figura b. de Mary Massumi Ytoyama.
Aumento = 400*.
microscópios (Capitulo 3). A análise integrada dos pre¬
parados citoquímicos com respostas citofisicas, como Ci toqu ímica ultra-estrutu ral
fluorescência e anisotropias ópticas, pode fornecer dados A microscopia eletrònica, assim como a microscopia de
muito interessantes, que indicam ordem molecular, luz, necessita da utilização de algumas técnicas que pro¬
arranjo e supra-organização macromolecular dos com¬ porcionem um aumento no contraste dos constituintes
ponentes celulares. Pode-se exemplificar aqui a análise celulares para que possam ser visualizados. Entretanto,
das fibras elásticas coradas pela eosina aliada ao uso do no microscópio cletrônico, a imagem não se forma por
microscópio de fluorescência e também as fibras de colá- feixes luminosos e, portanto, a visualização dos elemen¬
geno coradas pelo Xylidine Ponceau vistas ao microscó¬ tos celulares não é conseguida por cores, mas por meio
pio de polarização. Os fenómenos citofísicos são ineren¬ de diferenças de contraste em preto, dito eletrodenso, e
tes às moléculas em questão. A fibra elástica emite fluo¬ branco, dito eletrolúcido.
rescência e o colágeno é birrefringente, mas os corantes Esse contraste é obtido pelo tratamento do mate¬
intensificam ainda mais esses fenómenos (Figura 4.20). rial estudado com sais de metais pesados para que estes
possam interagir com os elétrons, possibilitando a for¬
mação da imagem (o tratamento com esses sais pode ser
feito antes ou depois do material ter sido seccionado).
Implicações clínicas e patológicas A quantidade de sais impregnados nos diversos
Este capítulo não tem por objetivo esgotar o tema, pois constituintes celulares é diretamente proporcional ao
muitas são as técnicas citoquímicas descritas, em com¬ contraste, de modo que componentes, como proteí¬
pêndios especializados. Vale lembrar que, nas avaliações nas, carboidratos, lipídios, ácidos nucléicos, ions (ou

48 A Célula
Figura 4.21 Algumas reaçôes otoquímicas para avaliação seletva de estruturas ceMares e de atiwJades enzimáticas ao mxroscópo eletrònico de transmis¬
são. a. Citoquimica ultra-estrutural para evxlenciação de endomembranas segundo a técnica de ZIO. pode-se observar com dareza membranas de retículo
endoplasmábco. envoltóno nuclear e complexo de Gotgi. em célula muscular tea no estroma prostábco de rato. b. Ativxlade da enzima fosfatase ácida em célu¬
las epitéiáiS de túbulo de Maipighi de Triatoma infestais. Marcação forte da atrvtíade enzimática nas invaginações da membrana plasmática da porção basal
da célula (i) e membrana basal (seta), c. Atividade da enzima ATPase dependente de magnésio em nutíéolos (seta) de células eprteliais de túbulo de MalwjN
de Triatoma infestais, a heterocromatina (h) e a eucromatina (e) não respondem à reaçào. As Figuras b e c foram cortesia de Maria Tero'ha V. A Olveira
Aumentos: a = 21600*: b = 10000*: c = 45000x.
Tabela 4.3 Técnicas histoquirmcas e otoquimicas utilizadas para estudos e diagnósticos em laudos riistopatológicos.
Técnica Especificidade Aplicações
Reaçào de Feulgen DNA Quantificação de ONA e anáhse
de imagem em células neoplásicas
Resorcina - Fibras do sistema elástico Patologias do tecido conjuntivo,
Fucsina de Weigert patologias do sistema circulatório
Impregnação pela prata Fibras reticulares Patologias do tecido conjuntivo, processos de
(reticulina de Gõmõri) fibrose e cicatrização e patologia dos tecidos
hemocitopoétkos
Impregnação pela prata NucléoJos e regiões Processos neoplàsicos e malignidade tumoral
(AgNOR) organizadoras nucleolars
Impregnação pela prata Sistema nervoso central Patologias dos elementos celulares e fibrilares
(método de Ramon & Cajal) e periférico do sistema nervoso central e periférico
-
Método de von Kossa Evidencia ions cálcio nos Processos de calcificação normal e patológica
tecidos
Azul de toluidina DNA. RNAeproteoglicanos Alterações na estrutura e fisiologia nuclear
de matriz extracelular (na Alterações nos elementos do sistema de susten¬
dependência do pH da tação. processos de artrite e artrose
solução diluente)
PAS Polissacarídeos neutros e gli- Depósito de polissacarideos nos tecidos, amiloi-
coproteinas doses e outras patologias de acúmulo de polis¬
sacarideos
Corante de Leishmann Elementos figurados do Hemogramas de rotina e diagnóstico de
11 ÿ ÿ
I
sangue leucemias
Azul de Alcian Gltcosaminoglicanos de Doenças do sistema de sustentação, ossos e
matriz extracelular cartilagens. Adenocarcinomas produtores de
mucossubstàncias
Hematoxilina-eosína Coloração geral e estudos Todo diagnóstico histopatotõgico passa pela
gerais primeira análise por esta técnica. Estudos mor¬
fológicos gerais

A Célula 49
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Tabela 4.4 Técnicas otoquimicas ultra-estruturais e suas respectivas


apticafc'KJades na identificação macromolecular nos tecidos. 3 - IMUNOCITOQUÍMICA
Técnica Especificidade

Aodo Fosfotúngstico (PTA) Proteínas básicas


Prata amoniacal Hernandes F. Carvalho
i

Osmio-imidazol Lipídios insaturados


Filipina Lipídios esterôdes
A imunocitoquímica utiliza a especificidade dos anti¬
Método de Thiery (adaptação do Carboidratos neutros corpos na localização de moléculas ou de regiões de
método do PAS)
moléculas nas células ou tecidos. A visualização dos
azul cuprolinico. azujdeAtóan _
Ferro coloidal, vermelho de rutèmo. Carboidratos âodos
(glicosaminogbcanos) anticorpos depende do acoplamento deles com marca¬
dores detectáveis que podem ser de diferentes tipos, de¬
Acetato de uranrfa Aedos nudéicos
AfcoOato de tálio DNA pendendo dos interesses específicos e dos microscópios
HAPTA ou técnica de Gautier RNA/ribonudeoproteinas disponíveis para as análises. A imunocitoquímica con¬
Piroantimoniato de potássio Cálcio siste em uma excelente ferramenta para estudos sobre a
Tetróxido de ósmio-ferrocianeto
)*
—v
''
ÿ

Visualização de
ÿ
* 1

célula, por garantir grande especificidade, associada à


de potássK) (OsFeCN) endomembranas identificação das relações estruturais entre a molécula
lodeto de zinco-tetróxido de ôsmio (ZlO) de interesse e outros componentes e/ou compartimen¬
tos celulares. Normalmente, utiliza-se marcar o núcleo
moléculas inorgânicas) e enzimas (Figura 4.21), pos¬ das células com um corante ou fluorocromo numa
sam ser visualizados. etapa final de contracoloraçào, para melhor localizar o
O principio da detecção ultra-estrutural da ativi- produto da reaçào imunocitoquímica.
dade enzimática é o mesmo do preconizado para a cito-
química enzimática em microscopia de luz. A dife¬
rença fundamental reside em se obter um produto de
reaçào eletrodenso, e não simplesmente colorido. Por¬ Anticorpos policlonais x
tanto, elementos como chumbo, cério e ferro formari¬
am compostos insolúveis e eletrodensos nessas reações.
anticorpos monoclonais
Algumas das enzimas mais estudadas ultra-estrutural- Quando uma niacromolécula isolada, ou um conjunto de
mente são as fosfatases, as desidrogenases, as peroxida¬ moléculas,é injetada em um animal, ela elicita a produção
ses, as AT Pases e as glicose-6-fosfatases. de anticorpos pelo organismo. Os anticorpos produzidos
Na Tabela 4.4, constam algumas das técnicas pelo organismo são específicos contra as diferentes molé¬
mais empregadas no estudo citoquimico ultra-estrutu¬ culas da mistura ou a diferentes regiões de uma mesma
ral de macromoléculas biológicas. macromolécula e estão todos presentes no soro. A especi¬
ficidade na utilização desses anticorpos só é garantida
quando o antígeno injetado é altamente purificado, sendo
Referências bibliográficas os anticorpos denominados monoespecíficos. Quando se
utiliza o soro do animal hospedeiro, que pode ser coelho.
1. Bancroft JD, Stevens A. Theory and pratico of histochcmical rato, camundongo, cabra, burro, cavalo, porco, macaco e,
techniques. New York: Churchil Livingstone, 1990. 726p. até mesmo, galinha, tem-se uma preparação chamada de
2. Bchmcr OA, Tolosa F.MC, Neto AGF. Manual de práticas policlonal, já que os anticorpos são produzidos por dife¬
para histologia normal c patológica. São Paulo: F.dart- rentes clones de linfócitos. Em contraste, os linfócitos B
Fdusp, 1976. 326p. dos animais utilizados podem ser isolados e fundidos a
3. Beçak YV, Paulete |. Técnicas de citologia e histologia. São células de um tipo de piasmocitoma (linfócitos B tumo-
Paulo:Livraria Nobel, 1970. 470p. rais), adquirindo, destas últimas, a grande capacidade
4. Haddad A, Sesso A, Attias M. Farina M. Meirelles MN, proliterativa. A célula híbrida formada denomina-se
Silveira M. Benchimol M, Soares MJ, Barth OM, Machado hibridoma. Após as etapas de clonagem (isolamento de
RD, Souto-Padrón T, Souza YV. Técnicas básicas de micros¬ uma única célula) e de propagação dos clones que pro¬
copia elctrônica aplicadas âs ciências biológicas. Rio de duzem o anticorpo de interesse, obtém-se uma linhagem
Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Elctrônica, celular que produz um único tipo de anticorpo, dirigido
1998. 179p. a um único antígeno que corresponde a uma molécula
5. Mello MLS,Vidal BC. A rcação do Feulgcn.Cién Cult 1978; da mistura iniciai ou a um segmento da macromolécula
30: 665-75. que serviu para imunizar o animal. Embora monoclo¬
6. Vidal BC. Métodos cm biologia celular. In: Vidal BC. Mello nais possam ser obtidos a partir de diferentes espécies, os
MLS. Biologia celular. Rio de Janeiro: Atheneu. 1987. p. 5-39. camundongos são os mais comumente utilizados.

50 A Célula
Imunocitoquímica direta x faz necessário porque o uso de anticorpos secundários,
imunoc itoquímica indircta que devem ser específicos para os anticorpos da espécie
animal em questão, reconheceria não somente os anti¬
Para serem localizados, os anticorpos precisam estar corpos empregados na reação imunocitoquímica, mas
acoplados a marcadores que permitam a sua localização, também aqueles normalmente encontrados nos tecidos.
uma vez que lenham se ligado ao antígeno específico. A imunocitoquímica direta também deve ser uti¬
Quando o anticorpo é marcado por um marcador qual¬ lizada quando são investigados dois antígenos simultanea¬
quer e pode ser observado imediatamente,o processo re¬ mente com anticorpos produzidos na mesma espécie ou
cebe o nome de imunocitoquímica direta (Figura 4.22). que pertençam a uma mesma classe de imunoglobulinas
Entretanto, o acoplamento da sonda ao anti¬ e não podem ser distinguidos por anticorpos secundá¬
corpo é feito por meio de radicais reativos com gru¬ rios. Nesse caso, cada anticorpo é marcado com um mar¬
pos químicos presentes nos anticorpos (e nas proteí¬ cador diferente e a reação é observada com diferentes
nas em geral). Quando esses marcadores são conjuga¬ combinações de filtros à microscopia de fluorescência.
dos aos anticorpos, eles podem se ligar a regiões da
molécula que sejam importantes na interação antige-
no-anticorpo, de modo a reduzir o número de molé¬
culas de anticorpos disponíveis na preparação. Imunofluorescência x imunoperoxidase
Dessa forma, a estratégia comumentc utilizada Quando o composto utilizado na marcação do anticor¬
para evitar essa perda de anticorpos, que são destinados po é um fiuorocromo, a imunocitoquímica recebe, ás
â localização dos antígenos, é utilizar um segundo anti¬ vezes, a designação imunofluorescência (Figura 4.24).
corpo (anticorpo secundário), este sim, acoplado a um Embora os fluorocromos fluoresceina (que
marcador, na localização do anticorpo primário. Nesse emite fluorescência verde) e rodamina (que emite fluo¬
caso, tem-se a imunocitoquímica indireta (Figura 4.23). rescência vermelha) sejam os mais conhecidos dos
A imunocitoquímica indireta possibilita também uma marcadores utilizados em imunocitoquímica, vários
ampliação do sinal obtido, pois, a cada anticorpo pri¬ substitutos com melhores propriedades espectrais ou
mário, podem se ligar vários anticorpos secundários. de estabilidade têm sido disponibilizados comercial¬
O emprego da imunocitoquímica direta é obriga¬ mente. No caso desses dois, o reagente utilizado na
tório quando o anticorpo disponível foi produzido na mes¬ marcação do anticorpo é o isotiocianato de fluorescei¬
ma espécie utilizada como modelo experimental. Isso se na (FITC) e o isotiocianato de tetrametilrodamina
(TRITC). Além da necessidade da utilização de um

antigeno anticorpo
.<vst microscópio de fluorescência para observação das rea-
ções obtidas com o uso de sondas fluorescentes, a
preparação obtida tem vida limitada, principalmente

Figura 4.22 Esquema ilustrando o procedimento de imunootoquimica


direta. Nesta técnica, utilizam-se anticorpos que se ligam ao antigeno e
sào localizados por uma sonda acoplada diretamente ao anticorpo

antigeno anticorpo
primáno
anticorpo
secundário

Figura 4.23 Esquema ilustrando o procedimento de imunocrioquimica Figura 4 24 Identificação imunocitoquímica da proteína S1O0, presente
indireta. Neste caso. após ligaçào do anticorpo primário ao antigeno. utili- nas células de Schwann (verde), e de macròfagos (vermelho). Os núcleos
za-se um segundo anticorpo acoplado à sonda escolhida. A ligação de foram corados com OAPI. A imagem foi obWa ao microscópio confocai A
várias moléculas do anticorpo secundário ao anticorpo primário resulta em cor atnbuída à reação para a proteína S100 é artificial, sendo que a sonda
ampiaçâo do sinal. o que favorece a identrficação de antígenos encontra¬ utilizada (Cy5) fluoresce no infravermelho, de modo que sua detecção só é
dos em baixa concentração. possível ao microscópio coofocal. Cortesia de Cnsúane de La Hoz.

A Célula 51
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

devido â destruição dos fluorocromos pela exposição ã que, por estarassociada a átomos de ferro, é ele-
luz de excitação (ou fading). trodensa), foi substituído pelo uso de partículas de ouro
Essas dificuldades podem ser superadas, ao me¬ coloidal. O preparo de ouro coloidal permite ( I) o con¬
nos em parte, pelo uso de enzimas como marcadores. trole do tamanho das partículas formadas, que é bas¬
Usualmente, utiliza-se a peroxidase do rábano silvestre tante uniforme sob cada condição (os de utilidade na
(ou horseradish peroxidase. HRP) e o procedimento imunocitoquimica ultra-estrutural têm de Ia 25 nm de
recebe, algumas vezes, a denominação imunoperoxi- diâmetro) e (2) a incorporação de proteínas diversas,
dase. Nesse caso, a enzima é acoplada a um anticorpo dentre elas, os anticorpos, à sua superfície. Os anticor¬
secundário por meio de agentes bifuncionais, como o pos incorporados à superfície das partículas de ouro são
glutaraideído. A localização dos anticorpos e seu respec¬ funcionais e se ligam aos antígenos de interesse, permi¬
tivo antígeno é feita pela visualização de um produto da tindo a sua localização ao microscópio eletrónico
reação da enzima. No caso da peroxidase, cujo substrato (Figura 4.26).
é o peróxido de hidrogénio, associa-se à reação a diami-
nobenzidina (DAB),que é reduzida e forma um precipi¬
tado castanho (Figura 4.25). Embora a diaminobenzi-
dina seja uma substância extremamente tóxica e seu
manuseio deva ser cuidadoso, o uso dessa metodologia
resulta em material permanente e que pode ser observa¬
do em microscópios de luz comuns.
Uma enzima utilizada em substituição à peroxi¬
dase é a fosfatase. Entretanto, os substratos disponíveis
comercialmente para essa enzima resultam em produ¬ Figura 4.26 Detecção por imunocitoquimica ultra-estrutural da proteína
tos que são solúveis em solventes orgânicos e, portanto, 201 em células endoteliais. As partículas de ouro cdodal restringem-se
as preparações obtidas não são permanentes. às porções da membrana plasmática que estabelecem contato entre as
duas célutas. Cortesia de Luciana Le Sueur. Carla B Cotlares-Buzato e
Mana A Cruz-Hôfling.

Imuhoc itoquímica u11ra-est rut ura1 Referências bibliográficas


As reações imunocitoquímicas obtidas por imunopero
xidase podem ser adaptadas â microscopia eletrònica. O
-
produto da reação com a DAB é relativamente eletro- 1.Alberts B, Bray D. Lewis I. Raff D, Roberts K, Watson II).
denso e, ainda, reage com o tetróxido de ósmio e com Molecular biology of the cell. 4* ed. New York: Garland,
os metais pesados utilizados na contrastaçào dos cortes 2002.
ultrafinos (ver Capítulo 2). 2. Sternbcrgcr LA. Immunocvtochcmistry. 3" cd. New York:
Entretanto, o uso de marcadores como a peroxi¬ Wiley Medical, 1986.
dase, oumesmo a ferritina (que não é uma enzima, mas

Figura 4.25 Localização de neurofilamentos em corte histológico de nervo


ciático em regeneração após secção transversal. A reação (setas) limita-
se aos axônios. Os núcleos foram contracorados com hematoxilina. Cor¬
tesia de Cristiane de La Hoz

52 A Célula
organelas celulares chama-se /racionamento celular
- FRACIONAMENTO CELULAR (Figura 4.27). Em uma primeira etapa, faz-se a homo¬
geneização do tecido, usando um homogeneizador do
tipo Poter ou do tipo Ultraturrax (Figura 4.27), ou até
Edson Rosa Pimentel mesmo um liquidificador, dependendo do tipo de teci¬
do. Para tecidos moles, como o de ligado, é utilizado
homogeneizador do tipo Poter e para tecidos mais
Hm eucariotos, grande parle das vias metabólicas está resistentes, como as cartilagens, deve ser usado o homo¬
compartimentalizada em organelas. Desse modo, se geneizador do tipo Ultraturrax. Esse procedimento
quisermos isolar uma enzima que catalisa uma reaçâo normalmente é feito em solução isotònica de sacarose,
específica, ou mesmo purificar uma determinada prote¬ que permite o rompimento da membrana plasmática,
ína que reside em determinada organela, é necessário mas evita o intumescimento das organelas. Durante os
isolar esta última das outras organelas celulares. O con¬ processos mecânicos de homogeneização, ocorre aque¬
junto de procedimentos que levam à separação das cimento, o que pode desnaturar algumas proteínas.
Além disso, também pode ocorrer degradação proteica
devido à ação de enzimas proteoliticas da própria célu¬
Motor la. Essas enzimas normalmente estão sob controle de
mecanismos regulatórios em células intactas, mas
Ultraturrax quando a célula sofre rompimento, esse controle é per¬
dido e várias proteínas e mesmo estruturas celulares
ficam vulneráveis á sua ação. Assim, durante a ação
mecânica de ext ração, é importante que a solução usada
no rompimento celular esteja a uma temperatura baixa.
O recomendado é 4 C, pois nessa temperatura as enzi¬
mas proteoliticas têm uma atividade menos intensa.
Tubo de Também é recomendado que na solução de extraçáo
Vidro estejam presentes inibidores de enzimas proteoliticas.
Após a homogeneização, os próximos passos consistem
de várias centrifugações em rotações que permitem a
Pistilo de separação de organelas (Figura 4.27). Diferentes solu¬
Teflon ções são usadas para a preparação tie diferentes organe¬
las celulares (Harris e Angal, 1989). No caso do estudo
[ruírO de componentes presentes no meio extracelular, como é
o caso de plasma sanguíneo, uma simples centrifugação
ou uma microfiltração já pode separar células do meio
/
Homogeneizado Héice
extracelular. Em alguns casos, os componentes do meio
extracelular podem estar interagindo tão fortemente
entre si, como é o caso da matriz extracelular presente
Centrifugação
600xg'10min em tecidos conjuntivos, como cartilagens e tendões, que
se faz necessária a presença de um agente caotrópico,
como o cloreto de guanidina, para que seus componen¬
I Sobrenadantes
tes sejam dissociados.
Para se estudar os componentes presentes em uma
Precipitado (mrtocôndrias. Iisosso-
(Núcleo) determinada organela, é necessário que se rompa a sua
mos. membranas)
membrana por choque osmótico, ultra-som ou passando
| 10.000xÿ10 a suspensão de organelas através de pequenos orifícios.
No caso do núcleo, pode ser usado um detergente, como
í
Precipitados
1
Sobrenadantes
Twecn ou Trilou, que, ao solubilizar os lipídios da mem¬
brana, permite a saída do conteúdo nuclear, constituído
(mitocôodnas. fcsossomos) (nbossomos. membranas) de nucléolo, ácidos nucléicos e proteínas. O tratamento
com ultra-som, além de ser utilizado para romper o enve¬
Figura 4.27 Fraoonamento celular a partir de dissociação teodual e lope nuclear, é empregado para romper mitocòndrias.
rompimento de membrana celular usando homogeneizador do tipo Poter Esse procedimento serviu para produzir vesículas submi-
ou Ultraturrax. A separação das várias organelas é feita por seguidas cen¬
trifugações em rotações crescentes Os nbossomos podem ser precipita¬ tocondriais (Figura 4.28), que foram importantes em
dos após uma centrifugação de 150.000 xgOh. estudos de fosforilaçâo oxidativa.

A Célula 53
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Mtocôodria 5 - CROMATOGRAFIA LÍQUIDA


E ELETROFORESE

Ultra-som Laurecir Gomes

O grande número de macromoléculas, a variedade de


Vesículas submitocondrias suas atividades biológicas e as diferenças químicas entre
elas em organismos diversos tornaram as técnicas bio¬
Figura 4.28 Rompimento de membrana mitocondrial por ultra-som. químicas de extração, purificação c caracterização, práti¬
Fragmentos de membrana mitocondrial interna associados a comple¬ cas comuns nas pesquisas em biologia celular.
xos ATPásicos unem-se novamente pelas suas extremidades, forman¬ Entre os processos de purificação, a cromatogra¬
do as vesículas submitocondriais. agora com o complexo enzimático
voltado para fora. fia líquida é um método de separação muito utilizado.
Diferentes métodos cromatográficos podem ser empre¬
gados, levando em consideração as características da
Referencias bibliográficas molécula de interesse. O resultado final pode ser a
obtenção de um componente com alto grau de pureza.
I. Harris HIV, Angal S. Protein purification methods. A prat¬ Na maioria das cromatografias, utiliza-se uma
icai approach. 1 cd. Oxford: 1R1. Press, 1989. coluna (cilindro) de vidro, plástico ou metal, contendo
2. Alberts B, Brav I). Lewis J, Raff I), Roberts K. Watson ID. em seu interior um suporte polimérico que apresenta
Molecular biology of the cell. 4' cd. New York: Garland. grupos reativos ou estrutura especial. Dados o tipo de
2002. interaçào e as características da resina, conseguc-se a
3. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, separação dos componentes da mistura. A qualidade da
Scott MP, Darnell IE. Biologia celular e molecular. 5' ed. separação pode ser melhorada com manipulação das
Porto Alegre: ArtMed, 2003. condições de corrida, como pressão, e neste caso são
necessários adaptações e equipamento como bomba
peristáltica. As cromatografias mais utilizadas são as de
filtração, troca iônica e a de afinidade.

Cromatografia em gel filtração. A solução con¬


tendo as moléculas a serem analisadas ou separadas é
aplicada cm uma coluna contendo a resina, composta de
esferas de polímeros (por exemplo, uma dextrana), que
possuem uma malha com porosidade bem definida (Fi¬
gura 4.29). Nesta cromatografia, as moléculas maiores
não conseguem entrar nas esferas do polímero, e por
isso são as primeiras a serem eluídas da coluna. )á as de
tamanho menor penetram nas esferas e, em consequên¬
cia, sua migração é mais lenta (Figura 4.29). As molécu¬
las pequenas atravessam várias esferas, retardando ainda
mais sua migração (Figura 4.29). Dependendo do tama¬
nho das diferentes moléculas, elas podem ser eluídas da
coluna cm momentos diferentes, possibilitando que
sejam separadas e até purificadas. No caso da análise ou
separação de proteínas, a eluição das mesmas é acompa¬
nhada pela análise da absorbáncia das frações em espec-
trofotómetro (X = 280).

Cromatografia de troca iônica. A separação nessa


cromatografia depende principalmente da carga elétrica
das moléculas. As matrizes utilizadas nessa cromatografia
são variadas (celulose, sepharose etc.) com grupos carre-

54 A Célula
Detalhe das esferas de dextram
Proteínas com baixo Mr penetram

.
Mistura de proteínas na esfera de dextram
ÿ
aplicada no
topo da coluna OO
ooc
oo
DO
Partículas
OO
hidratadas
poc
-•OO
de dextram
DOC Proteínas com alto Mr são excluídas
OO
Placa porosa

/ / 1/
6 6
A 6

Figura 4.29 Cromatografia em resma de filtração. A resina é fe.ta de polissacarideos tratados quimicamente para formar esferas
com porosidade diferente para cada tipo de resina O pofassacarideo pode ser do tipo dextram, um açúcar inerte. Observe que as
moléculas maiores passam entre as esferas, enquanto as menores penetram nessas esferas, tendo sua eluição retardada

gados positivamente, como o dietilaminoetil (DEAE), ou resina-lectina, a glicoproteína é retida pela interação de
negativamente,como carboximetil (CM) (Figura 4.30). As seu grupamento glicídico com a lectina. Para eluição da
matrizes modificadas com grupos DEAE são trocadoras glicoproteína é usada uma solução com alta concen¬
de anions, enquanto aquelas modificadas com CM são tração de açúcar que compete com a lectina.
trocadoras de cátions. Nos dois casos, as moléculas serão
cluídas (Figura 4.31 ) com um gradiente crescente de clo¬
reto de sódio. As moléculas com maior carga líquida e,
portanto, mais fortemente ligadas ã coluna, precisarão de
Eletroforese
uma concentração maior de cloreto tie sódio para serem Uma forma de se analisar as proteínas obtidas em um
dissociadas. No caso de proteínas, as fraçòes coletadas po¬ processo de extraçào ou presentes em fraçòes de uma
dem ser analisadas quanto à absorbãncia (X = 280 nm), cromatografia é pela eletroforese. Essa técnica consiste
para se saber em quais delas as moléculas foram eluídas em separar moléculas colocadas em gel submetido a uma
(Figura 4.32). No caso de outros componentes, outras for¬ diferença de potencial elétrico. As moléculas, inicialmen¬
mas de se acompanhar a eluição devem ser empregadas. te em uma mistura liquida, são separadas ou por suas
cargas ou por suas massas moleculares, ao migrarem por
Cromatografia por afinidade. Nessa cromatogra¬ uma matriz porosa. No caso das proteínas, essa matriz é
fia, a separação das moléculas (geralmente proteínas) é geralmente preparada a partir de uma mistura de acrila-
baseada em sua afinidade por um ligante. Por exemplo,
para separar uma enzima de uma mistura de proteínas,
pode ser usada uma resina que tenha em suas esferas CH2-CH3
algum componente pelo qual a enzima tenha afinidade, Dietilaminoetil (DEAE) -0-CH2-CH2-NH*
podendo ser um co-fator, ou um substrato dessa enzi¬ VCH2-CH3
ma. A enzima se ligará a esse ligante, e só será eluida
quando for aplicada à coluna alguma substância capaz
de desligá-la. Um outro exemplo é a separação de glico- Carboximetil (CM) -0-CH2-C00"
proteinas. Nesse caso, a mistura é aplicada em uma co¬
luna que contenha uma lectina específica para o carboi- Figura 4.30 Estrutura de grupos funcionais usados em resmas trocadoras
drato presente na molécula de interesse. Ao passar pela de ions.

A Célula 55
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

1. Condições iniciais 2. Ligação das pro¬ 3. Inido da eluiçào 4. Fmat da eluiçào 5. Recuperação da
teínas da amostra das proteínas com das proteínas resina
aplicação de gradi¬
ente de sal

•Tampão de equilíbrio da coluna Proteínas a serem separadas Ions do gradiente

Figura 4.31 Cromatografia de troca iônca. O esquema representa a cromatografia em DEAE. Os símbolos «e A repre¬
sentam proteínas com maior e menor quantidade de cargas negativas. Os ions Na* e Cr são representados pelos sím¬

bolos e •. respectivamente.

mida e bisacrilamida que, na presença de catalisadores, As proteinas podem ser detectadas por meio de co¬
passa por um processo de polimerização, formando uma loração do gel por Cooniassie blue (um corante que detec¬
malha para separação de macromoléculas. Esse tipo de ta 50 pg de proteína 110 gel) ou ainda por impregnação
separação é denominado eletroforese em gel de poliacri- pela prata (que detecta 10 ng de proteína) (figura 4.32b).
lamida (PAGE). Em alguns casos a eletroforese ocorre na A Massa Molecular Relativa (Mr) das proteínas
presença de SDS (dodecil sulfato de sódio - H3C pode ser estimada comparando a distância de migração
(CH2)i|0S03Na). O SDS é um detergente com uma de sua banda pelo gel, com a distância percorrida por
extensa cauda apolar e cabeça polar representada pela proteínas com Mr conhecido.
carga negativa do radical sulfato. O SDS se liga à proteína Na SDS-PAGE uma única banda pode correspon¬
( 1,4 g de SDS/g de proteína) fazendo com que elas fiquem der a mais de uma proteína, caso elas apresentem o
com carga negativa, isto é, a carga do SDS. A porção apo¬
8.11 •
lar do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da
proteína, enquanto a porção negativa fica exposta para o
solvente, formando uma verdadeira capa de cargas nega¬
tivas em torno da proteína. As moléculas de SDS também
fazem com que as proteínas se mantenham dissociadas,
de modo que as diferentes proteínas possam ser separadas
quando aplicadas em um gel e sujeitas a uma corrente elé-
trica. O SDS elimina as diferenças de carga entre as molé¬
culas proteicas, de modo que as diferenças na migração
dependerão principalmente do tamanho e da massa das
moléculas. Na eletroforese em gel de poliacrilamida na 8.08
presença de SDS (SDS-PAGE), as proteínas migrarão do 5 18 20
pólo negativo para o pólo positivo. As proteínas maiores
migrarão mais lentamente do que as menores.
_ Ff*6W_
As proteínas oligoméricas, ou seja, aquelas for¬ Figura 4.32 Cromatograma e eletroforese de proteínas, a. Perfil de
madas por mais de uma subunidade unidas por pontes eluiçào de proteínas em coluna de DEAE A eluiçào das proteinas pode
ser acompanhada pela absorbància das frações em X = 280 nm. 0
dissulfeto, poderão ser facilmente detectadas se a eletro¬ primeiro pico corresponde às proteinas não ligadas à resma. G indea a
forese ocorrer em presença de p-mercaptoetanol, um íraçáo em que se iniciou a aplicação de um gradiente de cloreto de sódio.
b. SDS-PAGE das proteinas de algumas das frações eluidas da coluna.
agente redutor que rompe as ligações dissulfeto (-S-S-), As proteinas aparecem no gel como bandas. As proteinas de menor
separando as subunidades, que então migrarão mais massa molecular (Mr) aparecem mais embaixo no gel, pos migram mais
rapidamente no gel. raptdamenle do que as de maw Mr.

56 A Célula
mesmo Mr. Neste caso o método eletroforético eficiente 6 - TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTS
para a análise é a focalização isoelétrica. Nesse método, a
mistura de proteínas é inicialmente submetida a uma
eletroforese em um tubo de pequeno diâmetro (±
2 mm), contendo gel de poliacrilamida preparado em Luisa Lina Villa e Ana Paula Lepique
um gradiente de pH, de modo que as proteínas migrarão
até encontrar uma posição no gel que tenha um valor de
pH igual ao seu ponto isoelétrico (pH em que a carga Cada vez mais estão disponíveis métodos que permitem
liquida da proteína seja nula). Esse gel será retirado do avaliar com precisão a estrutura e expressão génicas. A
pequeno tubo e submetido a uma SDS-EAGE. Após nova versatilidade e. em alguns casos, a simplicidade dessas
corrida eletroforética, as proteínas com mesma massa metodologias vem permitindo uma importante ampli¬
molecular poderão ser distinguidas. Nesse caso. temos o ação do conhecimento básico da estrutura e função gé¬
que se denomina eletroforese bidimensional. nicas, além de possibilitar o estudo de anormalidades
genéticas, podendo envolver alterações em oncogenes e
genes supressores de tumor, diagnóstico de agentes
infecciosos, identificação de indivíduos, melhoramento
animal e vegetal em biologia do desenvolvimento, evo¬
Referencias bibliográficas lução de organismos e produção de proteínas recombi-
nantes. O isolamento de um gene específico a partir do
1. Andrews AT. Elelroforesis theory, techniques and bio¬ DNA (ácido desoxirribonucléico) total de uma célula
chemical and clinical applications. 2" cd. New York: não é uma tarefa simples, mas tornou -se possível graças
Oxford University Press, 1990. ao desenvolvimento de uma série de métodos, princi¬
2. Harris ELV, Angal S. Protein purification methods a - palmente nos últimos 40 anos. O emprego dessas meto¬
practical approach. 1 " cd. New York: Oxford University dologias vem também permitindo que uma série de
Press. 1989. produtos com aplicação prática imediata, como hor-
mônios, fatores de coagulação sanguínea, citocinas,
vacinas, entre outros, estejam comercialmente disponí¬
veis. O domínio dessa tecnologia também vem contri¬
buindo para uma nova modalidade terapêutica, a tera¬
pia génica, objetivando a reversão genética do fenótipo
alterado, tanto em vegetais quanto em animais, incluin¬
do o homem. Finalmente, o desenvolvimento da tecno¬
logia para geração de organismos transgénicos é uma
aplicação direta da tecnologia do DNA recombinante.
O DNA consiste de um polímero dupla fita for¬
mado por resíduos de nucleotideos trifosfatados unidos
por ligações covalentes do tipo fosfodiéster.
A adição de um ou mais grupos fosfatos na posi¬
ção 5" ou 3' da desoxirribose origina um nudeotídeo
mono, di ou trifosfatado, dependendo do número de
fosfatos (Figura 4.33).
A determinação da quantidade de DNA em dife¬
rentes organismos mostra, em geral, uma proporciona¬
lidade entre esta, o tamanho do genoma e o estágio evo¬
lutivo.1 O ganho de DNA, entre bactérias c mamíferos,é
de três ordens de magnitude, muito além do aumento
do espectro de proteínas presentes. Isso sugere o acúmu¬
lo de DNA com funções distintas daquela de codificar
proteínas (genes estruturais). A expressão dos genes se
dá pela síntese de um RNA, ácido ribonucléico, que dife¬
re do DNA apenas por conter uracila, em vez de timina,
e ribose, em vez de desoxirribose. Entre os três tipos de
RNA sintetizados a partir do DNA, o mensageiro é o que
codifica proteína. A dupla fita de DNA é mantida por
pontes de hidrogénio entre as bases nitrogenadas adeni-

A Célula 57
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

ÿ** ucmidKit¬
s' fosfato livre
P P O CHwO

4.\ ribose <1

..K flbose 1,

riboso
4-K ilboso J|

OH
c x Ircin Idade
y Oil livre

Figura 4.33 Cada cadeia de DNA é formada por nucleotideos unidos covalentemente por
ligações fosfodiésler entre o grupo T-hidroxila de um nudeotideo e o grupo 5 -fosfato de
outro. A adição de cada nucleotideo à cadeia requer a energia liberada pela quebra de duas
ligações fosfoanidrido. liberadas na forma de piroíosfato.

na/timina e citosina/guanina denominadas interaçòes los em células vivas, onde tais moléculas possam ser
Watson-Crick. Essas mesmas interaçòes permitem que a replicadas, gerando indivíduos que contêm milhares de
síntese de uma molécula de RNA a partir da molécula de cópias idênticas ao fragmento original, sendo denomi¬
DNA seja uma cópia fiel da mesma, pois para a síntese nados clones recombinantes." A tecnologia, que vem
de RNA, o DNA é aberto por um complexo enzimático sendo empregada nos mais diferentes sistemas, tanto
específico e uma das fitas serve como molde para a animais como vegetais, se baseia em algumas descober¬
maquinaria que sintetiza o RNA. O isolamento dos pri¬ tas independentes. Entre elas, destacam-se:
meiros genes permitiu verificar que, anatomicamente, as 1. identificação, em bactérias, de endonucleases
sequências estruturais nào sào continuas, isto é, co-line- que cortam o DNA em locais específicos, chamadas
arescom o RNA delas transcrito, mas interrompidas por enzimas de restrição;
sequências de DNA que não têm correspondência com a 2. desenvolvimento de vetores moleculares para a
proteína codificada. Estas últimas sequências sào clonagem,a partir de um conhecimento mais aprofunda¬
chamadas introns, enquanto as sequências expressas são do dos plasmideos bacterianos e virus animais e vegetais;
chamadas exons. Sabe-se hoje que o processo de trans¬ 3. descrição de métodos para a introdução de
crição inclui simultaneamente a síntese do RNA e a DNA em bactérias e células superiores;
exclusão das sequências correspondentes a introns e 4. descoberta de uma enzima capaz de sintetizar
fusão das sequências correspondentes a exons. uma fita de DNA complementar a partir de um molde
Como o genoma de organismos superiores contém de RNA, a transcriptase reversa;
DNA correspondente a algo em torno de 10s genes, até 5. desenvolvimento da técnica de reação em
recentemente parecia impossível conseguir isolar um gene cadeia da polimerase - PCR;
a partir de tal diluição. Atualmente, é possível construir 6. técnicas de sequenciamento de DNA, per¬
genes sintéticos a partir do RNA mensageiro encontrado mitindo a caracterização de qualquer gene clonado.
nas células, introduzir tais genes em células mediante o
uso de vetores adequados e determinar a sequência destes
genes após sua amplificação. Além disso, a "varredura" de
bibliotecas génicas, contendo o repertório genòmico com¬ Preparo das moléculas
pleto de um organismo, permite o isolamento de genes de DNA recombinante
para as mais diferentes análises. O conjunto dessas técni¬
cas é conhecido como tecnologia do DNA recombinante. A descoberta da primeira enzima de restrição na década
De uma forma geral, a clonagem molecular con¬ de 1970 foi um evento que revolucionou a biologia. As
siste em ligar fragmentos de DNA in vitro e introduzi- enzimas tie restrição são endonucleases capazes de

58 A Célula
reconhecer sequencias específicas na molécula de DNA são moléculas de DNA circulares, dupla fita, capazes de
e causar a quebra da dupla fita. Normalmente, as enzi¬ auto-replicação e de se manter eventualmente em célu¬
mas de restrição clivam o DNA entre os terminais 5'-fos- las bacterianas ou eucarióticas como leveduras. Além
fato e 3'-hidroxila e, por causa da simetria da sequência dos genes necessários à replicação dessas moléculas
de reconhecimento, geram moléculas contendo extremi¬ para as células-filhas, a grande maioria dos plasmídeos
dades de 5 - fosfato proeminentes ou 3'hidroxila com¬ contém genes que codificam para resistência a antibió¬
plementares. Nesse caso, diz-se que as enzimas geram ticos, toxinas, metais pesados etc. A manipulação gené¬
extremidades coesivas nas moléculas de DNA. Outras tica dessas moléculas de ocorrência natural levou ao
enzimas, contudo, clivam a dupla fita 110 mesmo ponto, desenvolvimento de inúmeros vetores para a clonagem
gerando extremidades perfeitamente pareadas (Flush ou molecular. Os aspectos gerais a serem considerados em
Blunt ends). O uso apropriado dessas enzimas permite o relação a esses vetores dependem muito do tipo de uti¬
isolamento de fragmentos discretos de DNA, uniformes lização a que se prestará o vetor e serão discutidos a
em tamanho e capacidade de codificação, uma vez que seguir:
os cortes são realizados em regiões definidas e especifi¬ I. tipo de controle de replicação ao qual está
cas da molécula. Além disso, as referidas endonucleases sujeito o vetor - deve-se considerar a célula onde será
são um importante instrumento para a análise dos genes introduzido o vetor e utilizar uma origem de replicação
clonados, pois, por meio delas, pode-se estabelecer o que seja reconhecida pela maquinaria enzimática da
mapa físico da sequencia génica em questão. Hoje estão célula cm que o vetor será replicado, seja em procari-
disponíveis centenas de enzimas de restrição, acrescen¬ otos, bactérias ou células eucarióticas, como leveduras.
tando grande versatilidade a estratégias de clonagem e 2. existência de sítios únicos de enzimas de
caracterização primária de sequências génicas. restrição em locais estratégicos, que não interfiram com
A obtenção de fragmentos de I>NA contendo se¬ sequências necessárias para replicação ou resistência e
quências complementares em suas extremidades, como que permitam a clonagem do gene de interesse.
descrito, é a primeira etapa a ser vencida no processo de 3. presença de marcadores selctivos, que pode
clonagem de um gene. A clonagem de fragmentos com ser mais de um por vetor, principalmente se o vetor for
extremidades blunt também é possível, porém com baixa utilizado em organismos diferentes. Ror exemplo, um
eficiência. Segue-se a ligação desses fragmentos, in vitro, a vetor pode ser replicado em bactéria para obtenção de
vetores moleculares, que se encarregarão de transportá- grandes quantidades de DNA, que posteriormente é
los para dentro das células e, assim, gerar clones. Tal rea- purificado e inserido por transfecção em células de
ção de ligação é efetuada pela DNA ligase, enzima capaz mamíferos, onde será expressa a proteína recombinan-
de formar uma ligação covalente entre a extremidade 5'- te codificada pelo DNA plasmidial (Figura 4.34).
fosfato e 3*-hidroxila de dois fragmentos de DNA na pre¬ Neste caso, necessita-se de um marcador para seleçào
sença de ATP (adenosina trifosfato). em bactéria e outro em células de mamíferos.
Dentre as enzimas envolvidas 11a clonagem dos Marcadores seletivos são genes presentes 110 vetor que
genes, merece destaque uma enzima descoberta na codificam proteínas que conferem resistência a antibi¬
década de 1970, naturalmente envolvida 11a replicação ótico, ou a metais pesados, ou que levam à síntese de
de alguns vírus de RNA, capaz de sintetizar DNA nutrientes essenciais para a célula e que não são adi¬
usando como molde uma fita de RNA. Essa enzima, a cionados ao meio de cultura.
transcriptase reversa, pode ser utilizada para obtenção 4. tamanho do inserto a ser clonado 110 vetor -
de moléculas de DNA dupla fita, a partir de um RNA piasmídios comportam insertos gênicos de até 10.000
mensageiro (RNAm) isolado de células ou tecidos pares de bases. Se o fragmento de DNA a ser clonado for
diferentes. O produto da reaçào de transcriptase rever¬ maior que 10.000 pares de bases, vetores derivados de
sa é conhecido como DNAc, ou DNA complementar. bacteriófagos, por exemplo do fago lambda, têm sido
Pode-se obter DNAc de células únicas, e este pode ser amplamente utilizados na construção de bancos de genes
amplificado milhares de vezes pela técnica de PGR e bibliotecas genômicas. Fragmentos de DNA ainda mai¬
(discutida posteriormente neste capítulo), resultando ores podem ser inseridos e replicados eficientemente em
em fragmentos discretos de moléculas de DNA dupla vetores denominados cosmideos, que nada mais são que
fita. Desta forma, a partir de pequenas amostras de as sequências cos de fagos lambda, responsáveis pelo
tecido ou células obtêm-se fragmentos de DNA espe¬ empacotamento do DNA 110 fago, clonadas a uma dis¬
cíficos que podem ser clonados e assim localizados e tância de 36.000 a 51.000 pares de bases em cada "extre¬
analisados em detalhe. midade" do vetor a ser clonado. Pode-se ainda utilizar
Os vetores de clonagem molecular comumente vetores conhecidos como YAC (do inglês, Yeast Artificial
empregados são derivados de plasmídeos bacterianos, Chromosomes). Esses vetores são segmentos de DNA
bacteriófagos ou vírus animais e vegetais. Plasmídeos linear que contém todas as sequências necessárias para a

A Célula 59
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

replicação em leveduras. Fragmentos de centenas de interesse, mas envolve estudos de seus transcritos, ou
milharesde pares de bases podem ser clonados neste tipo mesmo da proteína codificada por aquele gene, uma
de vetor, que necessariamente terão de ser introduzidos e análise cuidadosa dos vetores e células hospedeiras
replicados em leveduras. faz-se necessária, uma vez que os mecanismos de ex¬
5. tipo de promotor que dirige, se for requerido. pressão génica nos organismos procarióticos diferem
a expressão tio gene inserido no vetor. Muitas vezes o sobremaneira daqueles que ocorrem nos eucariotos.
objetivo da clonagem de um gene é o estudo do papel Contudo, há vários exemplos que demonstram ser
da proteína codificada em um processo biológico ou a possível expressar genes de outros organismos em
produção da proteína para fins farmacêuticos, ou ainda células bacterianas. Para tanto, é preciso que as
para expressão da proteína em uma célula específica ou sequências estranhas estejam sob o controle dos meca¬
tecido específico de um animal ou planta. Promotor é nismos de transcrição e tradução da célula hospedeira.
uma sequência de DNA que dirige a ligação da RNA Esses vetores são chamados de vetores de expressão.
polimerase ao DNA para que seja sintetizado o RNA Muitas vezes, para facilitar o processo de purificação
mensageiro correspondente. Se o promotor for "forte". da proteína recombinante, pode-se clonar uma
via de regra, mais moléculas de RNAm serão sintetiza¬ sequência de sinalização justaposta ao fragmento de
das. Os promotores mais utilizados para a expressão de DNA que codifica a proteína, formando-se uma prote¬
sequências exógenas em li. coli são aqueles que, além de ína híbrida que será secrctada pela célula para o meio.
fortes, são reguláveis. Entre os promotores utilizados Outro fator importante a ser considerado é que mui¬
em vetores eucarióticos, um bastante estudado e tas proteínas precisam ser modificadas após a tradu¬
empregado é o do pequeno vírus SV40 de macaco, ção para serem funcionais. Neste caso, há a necessida¬
assim como vetores derivados de vírus herpes e baculo- de da utilização de uma célula hospedeira eucariótica
vírus, além desses promotores reguláveis também esta¬ para a expressão dessa proteína. Por exemplo, a produ¬
rem disponíveis em células eucarióticas. O promotor ção de um antigeno requer que este seja secretado pe¬
utilizado em vetores de expressão de organismos multi- las células cm cultura e se apresente corretamente gli-
celulares também pode ser especifico para um determi¬ cosilado com a conformação nativa esperada. Tudo
nado tecido, por exemplo, diversos tipos de queratinas isso pode ser obtido com um vetor que contenha uma
são expressos específica e unicamente em epitélio. se o sequência de sinalização justaposta ao gene clonado
DNA recombinante for donado sob o controle do pro¬ para secreção da proteína recombinante e que esse ve¬
motor de uma das queratinas. o produto desse plasmí- tor seja inserido em células eucariontes. O sistema
dio só será expresso em células epiteliais. aqui exemplificado é um sistema que passou a ser ade¬
quado à produção de vacinas a serem administradas
em animais, incluindo o homem.

Introdução e ampliação do DNA


recombinante na célula hospedeira
Caracterização de genes
A próxima etapa consiste em introduzir o DNA recom¬ e seus transcritos
binante numa célula hospedeira com capacidade de
manté-lo e replicá-lo indefinidamente. Há várias meto¬ Existem, basicamente, dois métodos para caracteriza¬
dologias para fazé-lo, mas, em geral, emprega-se algu¬ ção de vetores recombinantes que contém a sequência
ma forma de permeabilizaçâo pelo emprego de solu¬ de DNA clonada. O primeiro, e mais comum deles,
ções contendo cátions divalentes (Ca, Rb, Mn), liposso- consiste na caracterização física desses DNA,envolven¬
mos, ou mesmo eletrotransferéneia. Se o vetor é plasmi- do mapas de restrição, testes de hibridação e determi¬
dial ou derivado de bacteriófagos, empregam-se bacté¬ nação da sequência de nucleotídeos. No segundo mé¬
rias; cosmídeos ou vetores derivados de vírus de plan¬ todo, o gene é caracterizado pelo produto expresso na
tas, insetos ou animais podem ser introduzidos em célula hospedeira. Nos últimos anos, os maiores avan¬
células eucarióticas capazes de replicá-los e aumentar, ços em relação a algumas dessas técnicas se concentra¬
sobremaneira, a quantidade do DNA recombinante. A ram mais nos métodos de detecção, do que nos ensaios
partir dai, grandes massas do fragmento génico de inte¬ de hibridação propriamente ditos. Um dos motivos
resse podem ser purificadas e analisadas. desse avanço está relacionado ao desenvolvimento de
Novamente, a célula hospedeira para a introdu¬ métodos cada vez mais sensíveis e, eventualmente, de
ção do vetor de DNA recombinante depende do obje¬ realização mais rápida: comparemos, por exemplo, a
tivo do processo. Quando o objetivo não se restringe a exposição de um blot (hibridação em filtro) hibridado
ampliar DNA para facilitar a localização do gene de com sondas radioativas por 5 a 7 dias, verso a exposi-

60 A Célula
ção por alguns minutos, 110 caso de detecção por quimio- Hibridação em filtros
luminescéncia. Uma outra razão importante reside 110 (Southern e Northern "blots")
feto de que muitos desses métodos deixaram de ser fer¬
ramentas de trabalho exclusivas de pesquisa científica Este é um método muito empregado para a análise de
básica, para se tornarem instrumentos importantes em sequências de DNA (Southern) ou RNA (Northern)
diagnóstico. Assim, o emprego de sondas não-radioati- aderidos a filtros ou membranas de nitrocelulose e deri¬
vas, associadas a métodos de detecção colorimétricos, vados. O princípio da transferência de DNA para filtros
tem permitido a aplicação da metodologia de hibridação de nitrocelulose foi concebido por E. Southern,' tendo
molecular em diferentes áreas. sido, a seguir, aplicado para a análise de RNA. O DNA
Um avanço metodológico muito importante foi a extraído de células ou tecidos, após digestão com enzi¬
automatização do seqiienciamento de DNA, o que im¬ mas de restrição, é submetido á eletroforese em gel para
pulsionou, de forma impressionante, a descrição de ge¬ separação dos fragmentos gerados. Segue-se a desnatu¬
nes dos mais diversos organismos. Além disso, estão em ração das moléculas de DNA na presença de soluções
desenvolvimento, na atualidade, sistemas de análise de alcalinas e transferência para filtros de nitrocelulose, em
genes e seus transcritos em lâminas de vidro. Esses chips condições que garantem a adesão das fitas simples de
podem conter, por exemplo, todo o genoma de um or¬ DNA em posições definidas pelas condições da eletro¬
ganismo distribuído em milhares de pontos numa su¬ forese. Essa etapa não se efetua no caso de RNA, uma
perfície de poucos centímetros quadrados, tornando a vez que essas moléculas estão predominantemente cm
tarefa de busca de genes ainda mais facilitada e de reali¬ fita simples. No entanto, sendo comum observar-se a
zação em curto espaço de tempo. Alguns desses chips já presença de estruturas secundárias nos diferentes RNA,
estão disponíveis como ferramentas para diagnóstico, pois pontes de hidrogénio formam-se intra ou intermo-
principalmente, na detecção de organismos infecciosos e lecularmente, desde que haja complementaridade entre
de alterações genéticas associadas a patologias humanas. porções das cadeias, é fundamental que a separação
dessas moléculas seja feita por eletroforese em géis des-
naturantes (formaldeído, glioxal,entre outros). A trans¬
Técnicas de hibridação molecular ferência, seguem-se as etapas de hibridação, envolvendo
a imersão da membrana em uma solução que contém,
A maioria dos métodos de análise de genes e seus além de uma mistura definida de sais, a sonda molecu¬
transcritos se baseia no princípio da hibridação mole¬ lar. Esta poderá ser um fragmento de DNA, RNA ou oli-
cular,' que consiste na formação de fitas duplas (híbri¬ gonudeotideos convenientemente marcados para per¬
fitas simples de ácidos nucléicos (DNA ou
dos) entre mitir a identificação dos híbridos que se formarão. A
RNA). A formação de moléculas híbridas é dirigida marcação pode ser feita com o emprego de radioisóto¬
pela complementaridade das sequências de nucleotí- pos ou pela adição química de grupos reativos ou enzi¬
deos das fitas de DNA ou RNA, sendo estabilizada mas; nesse caso, a detecção é, via de regra, colorimétri-
pelas ligações, como pontes de hidrogénio, que se for¬ ca, ou por emissão de luz; no caso dos produtos serem
mam entre as bases nitrogenadas. A estabilidade do quimioluminescentes, enquanto híbridos isotopica-
híbrido pode ser modulada pela natureza, conteúdo mente marcados podem ser detectados por cintilação
G-C, homologia e comprimento das sequências de nu- líquida ou auto-radiografia. A especificidade da hibri¬
cleotídeos, lembrando que a interaçào entre as bases é dação é fortemente determinada pelas condições de
cooperativa, quanto maior o número de bases intera¬ remoção da sonda molecular após o período de hibri¬
gindo, maior a estabilidade do híbrido. Quanto maior dação (lavagem das membranas). Além disso, a intensi¬
o conteúdo de bases G ou C, maior a estabilidade do dade do sinal pode ser modulada â dependência do
híbrido, isto devido ao fato dessas bases formarem 3 método de detecção empregado.
pontes de hidrogénio entre si enquanto que as bases A A grande vantagem das hibridações em filtro é
e T formam apenas 2 pontes de hidrogénio entre si. permitir a caracterização de fragmentos específicos de
Qualquer outro fator que interfira, favorecendo ou DNA ou RNA, aplicando-se sobremaneira à averigua¬
dificultando a formação de pontes de hidrogénio entre ção da transcrição tissular de determinados genes dos
as cadeias do híbrido irá alterar a estabilidade deste. mais variados organismos. As principais desvantagens
Temperatura da reação, concentração de sais, pi I da consistem na necessidade de obtenção de uma quan¬
solução e tipo de solvente são parâmetros que definem tidade razoável de material genético integro e relati¬
as condições de maior ou menor rigor ( estringéneia) vamente puro 110 tempo de execução (que pode levar
da reação, os quais finalmente determinarão a especi¬ de dias a semanas). Algumas variações dessa metodo¬
ficidade e a sensibilidade do ensaio. Baseado nesses logia incluem a hibridação em pontos ou linhas ( dot
princípios, uma série de métodos estão disponíveis e ou slot blots), nos quais o material genético é aplicado
serão discutidos a seguir. diretamente às membranas, após desnaturação, omi-

A Célula 61
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

geneX

DNA
recomb«nante
transformação
Amp ÿ
de bactérias
ori purificação de
DNA recombinante Figura 4.34 Exemplo
I plasmxjial de utilização de um
expressão da proteína plasmidio como vetor
recombinante X íl de expressão 0 pías-
transfecçào em mdo tem duas marcas
células eucanóticas, de seíeçâo. Uma para
bactérias, na qual o
plasmidio éampkficado.
e outra, para seleçáo
em células de mamífe¬
ros. na qual o plasmidio
é transfectado para es¬
cultura de células tudo da expressão da
eucanóticas proteína recombinante.

tindo-se as etapas de digestão por enzimas de restrição reagentes conjugados com fluoróforos ou enzimas capa¬
e eletroforese. zes de catalisar reações colorimétricas. Neste caso, mais
de uma sonda pode ser utilizada por tecido, desde que
cada uma seja modificada por um grupamento diferen¬
te, por exemplo, uma biotinilada e outra modificada por
Hibridação in situ (HIS) digoxigenina: a biotinilada pode ser revelada com estrep-
Como o nome indica, esta metodologia permite a iden¬ tavidina marcada com um tipo de fiuoróforo e a digoxi¬
tificação de genes ou de seus transcritos simultanea¬ genina é reconhecida por anticorpo especifico que pode
mente à localização celular, sendo também efetuada em ser marcado com outro tipo de fiuoróforo, ambos podem
preparações cromossómicas.* Uma vez que pode ser ser analisados por microscopia fluorescente na mesma
realizada em tecidos fixados, embebidos em parafina, a lâmina apenas utilizando-se diferentes filtros. Quando se
hibridação m siím é principalmente empregada em estu¬ empregam sondas isotópicas, os tecidos devem ser reves¬
dos retrospectivos. Comparado às hibridações em filtro tidos com uma emulsão fotográfica e expostos por dias
ou PCR, como veremos adiante, este método tem (sondas marcadas com enxofre 35J, ou até semanas
menor sensibilidade, mas permite a análise 110 contexto (sondas marcadas com trítio 3„). Seguidamente, deve-se
da morfologia e distribuição tissular (Figura 4.35). corar as células ou núcleos celulares para observação do
Cortes de tecido fresco ou fixado, ou mesmo tecido total. Na Figura 4.35, por exemplo, o tecido foi
esfregaços celulares, são submetidos à MIS aderidos a corado com eosina e hematoxilina, revelando núcleos
lâminas de vidro. O principal problema de perda de celulares arroxeados e citoplasma rosado, enquanto que
tecido durante o processamento pode ser evitado, as áreas em que a sonda formou híbridos estáveis são
empregando-se substâncias que aumentam a adesivi- visíveis pela cor preta gerada pela precipitação da prata
dacle do tecido à lâmina, como poliiisina ou organosi- contida na emulsão fotográfica.
lano. Os tecidos são previamente tratados com protea¬
ses para facilitar o acesso da sonda; segue-se a adição
da mistura de hibridação, contendo a sonda molecular,
sobre o fragmento de tecido aderido à lâmina. As son¬ Reaçào em cadeia da polimerase (PCR)
das podem ser isotópicas ou não, conforme descrito A técnica da reação em cadeia da polimerase foi ideali¬
antes. Após algumas horas de hibridação em condições zada por G. Mullis e H. A. Erlich nos meados dos anos
rigorosas, as lâminas são lavadas, para remover os si¬ 1980" e, desde então, tem revolucionado a genética
nais inespecíficos, e reveladas. No caso de sondas qui¬ molecular por ter possibilitado uma abordagem com¬
micamente modificadas, a rcaçâo colorimétrica é de¬ pletamente nova para o estudo dos genes. Durante anos,
senvolvida em minutos, podendo todo o processo de a análise dos genes foi um grande problema, devido ba¬
HIS ser executado no mesmo dia. Sondas quimicamen¬ sicamente à complexidade genòmica, especialmente no
te modificadas podem ser reveladas por interação com caso de eucariotos superiores que possuem cerca de mi-

62 A Célula
zima responsável pela replicação, utiliza uma molécula

r. x de DNA fita simples como molde para sintetizar uma


nova fita complementar. Essa enzima também tem
: ,|k requerimento de um pequeno segmento de DNA dupla
'

fita para que, a partir deste ponto, ela possa iniciar a


síntese. Durante o processo de síntese faz-sc necessária
a presença de desoxirribonucleotideos trifosfatados
ÿ
'
ÿ& : ÿ

h
.ifÿM-o$
v
•> wTtÿífjB
(dN IP), como precursores, e sal de magnésio em con¬
centração específica com o co-fator para a DNA poli¬
merase. A primeira etapa da replicação do DNA in vitro
é a desnaturação do molde de DNA, ou seja, a separa¬
ção da dupla fita, que pode ser obtida por aquecimento.
Em seguida, é preciso que ocorra o anelamento dos ini¬
Figura 4.35 A hibridação in situ permite a identificação de sequências ciadores ( primers) em pontos específicos da cadeia de
nucleotidicas em nível celular utilizando cortes histológicos. fita simples do DNA molde, formando um pequeno
segmento dupla fita que fornece para a DNA polimera¬
lharcs dc genes diferentes. Todas as técnicas existentes na se uma extremidade 3'OH livre na ribosc para a adição
época utilizavam métodos de clonagem e hibridação de um novo nucleotideo. Desse modo, em uma reaçào
molecular para analisar regiões especificas de um deter¬ de PCR, pode-se direcionar a DNA polimerase para que
minado gene, processos estes geralmente demorados e ela sintetize uma região especifica do DNA molde de
muito trabalhosos. O surgimento da técnica da reaçào interesse. Durante esse processo, as duas fitas do DNA
da polimerase em cadeia (PGR, do ingles, Polymerase servem como molde para a síntese, catalisadas pela
Chain Reaction) mudou completamente esse cenário, DNA polimerase. Para que isso ocorra, faz-se necessária a
pois com ela tornou-se possível produzir um número presença de oligonucleotideos iniciadores para cada fita do
enorme de cópias de uma sequência específica de DNA DNA molde. Os iniciadores são escolhidos para flanquea¬
sem necessidade de clonagem. rem a região do DNA que vai ser amplificado, de maneira
A reaçào de PCR utiliza certas características do que as novas fitas de DNA sintetizadas, iniciando-se sem¬
processo de replicação do DNA. A DNA polimerase, en¬ pre a partir de um iniciador, sejam estendidas até a posi-

Desnaturação
Ligação dos
-
pnmers exten¬
são com DNA
polimerase
Repetição dos actos

Ampliação exponenaal
Figura 4.36
A técnica do PCR

A Célula 63
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

çáo do outro iniciador na fita oposta. Desse modo, novos tornou o processo de PCR mais barato e possibilitou a
sítios para a ligação dos iniciadores são gerados em cada utilização de cicladores térmicos automáticos, além de
nova molécula de DNA sintetizada (Figura 4.36). Se essa conferir maior especificidade à reação. Essas bactérias
misturade reação for novamente aquecida para separar as possuem uma DNA polimerase que funciona bem a
fitas moldes, tanto as fitas originais quanto as recém-sinte¬ 72 C e apresentam uma estabilidade razoável em tem¬
tizadas estão agora disponíveis para o andamento com os peraturas desnaturantes. Anteriormente, utilizava-se a
iniciadores e a síntese de novas fitas complementares. Esse DNA polimerase de E. coli. O processo era então ma¬
comportamento cíclico pode ser repetido n vezes sempre nual, bastante caro e tedioso, a cada ciclo era necessária
seguindo esse padrão de desnaturação, pareamento e a adição de mais enzima, pois a polimerase de /:. coli é
extensão. Assim, ao final de n ciclos, a reação terá um termossensível e funcional a 37 C, favorecendo ainda o
número teórico máximo de 2 moléculas de DNA dupla anelamento dois iniciadores em sítios inespecíficos.
fita, que serão cópias exalas da região específica do DNA A replicação do DNA in vitro não é um processo
molde que foi flanqueado pelos iniciadores. Portanto, a perfeito e, ocasionalmente, a DNA polimerase adiciona
reação tie PCR resulta em uma amplificação de regióes nucleotideos incorretos à cadeia crescente do DNA. A
específicas de um DNA. taxa de incorporação de um nucleotideo incorreto pela
A PCR é uma técnica relativamente fácil de ser Uni polimerase, em condições de temperatura e con¬
realizada em laboratório. O material inicial é o DNA centração salina ideais, é de cerca de um nucleotideo em
molde, que contém a sequência que será amplificada. cada 20.000 incorporações. Isso pode não ser um pro¬
Não é necessário clonagem da sequência que será am¬ blema quando se quer analisar o produto de PCR como
plificada, porque esta é definida pelos iniciadores utili¬ um todo, mas pode ser um problema grave quando se
zados na reação. A quantidade de DNA utilizada em quer obter um produto para se identificar a presença de
cada reação é muito pequena. Hm uma reação típica de uma mutação. Se a mutação ocorreu pela síntese do
PCR, utiliza-se cerca de 100 a 200 nanogramas (1 ng = DNA in vitro, a mutação identificada não representaria
10 vg) de DNA genômico total. Além desse, utiliza-se os a realidade do DNA analisado. Esse problema pode ser
iniciadores para definir a região que será amplificada, a vencido utilizando uma maior quantidade de DNA
DNA polimerase, e a mistura dos quatro desoxirribo- molde e, portanto, não necessitando de um grande
nucleotídeos precursores. Todos esses reagentes são número de ciclos; analisando a sequência das duas fitas
misturados em um tubo de reação que, ainda, contém do DNA amplificado; ou ainda repetindo a reação, pois,
uma quantidade de sal ideal para o funcionamento como a incorporação errada é aleatória, a probabilida¬
enzimático. O próximo passo é o processamento desses de da mesma incorporação ocorrer no mesmo ponto
reagentes em um ciclador térmico. O processo típico é em experimentos independentes é extremamente baixa.
iniciado por um aquecimento de 95°C por 5 minutos. O DNA para uma reação de PCR é frequente¬
Nessa temperatura, o DNA dupla fita é completamen¬ mente o DNA genômico total extraído de células, sendo
te separado, formando as fitas simples que servirão de que este não precisa estar altamente puro. A PCR pode
molde para os iniciadores e a DNA polimerase. Hm se¬ também ser utilizada para se estudar o padrão de
guida, a temperatura é diminuída para uma tempera¬ expressão génica: o RNAm (RNA mensageiro) é conver¬
tura de anelamento, que permite a ligação dos inicia¬ tido em DNAc (DNA complementar), utilizando-se a
dores à sequência por eles reconhecida. Hssa região de¬ enzima transcriptase reversa (enzima que sintetiza
limitada será a região amplificada ao final do processo. DNA a partir de RNA),eo DNAc recém-sintetizado po¬
A temperatura de anelamento é um ponto variável pa¬ de servir como DNA molde em uma reação de PCR.
ra determinar a especificidade de uma reação de PCR. Como o DNA é uma molécula bastante estável,
Temperatura e tempo utilizados variam dependendo diversas fontes podem servir como DNA molde para as
da sequência a ser amplificada. Nessa fase, gera-se o hí¬ mais diversas reaçòes de PCR. Assim, séries históricas
brido molde-iniciador necessário para a reação catali¬ de serviços de Patologia, ou o DNA extraído de tecidos
sada pela DNA polimerase. O próximo passo é aumen¬ guardados a centenas e milhares de anos, como o de
tar a temperatura para 72°C por um tempo médio de 2 fósseis ou múmias egipeias, podem ser amplificados
minutos.Esse ciclo básico de três temperaturas, a saber, por PCR. Essas vantagens têm dado destaque à utiliza¬
de desnaturação, anelamento e extensão, pode ser repe¬ ção dessa metodologia em Medicina Legal e Evolução.
tido várias vezes, em geral cerca de 30 a 40 ciclos. Ao fi¬ A PCR pode ser utilizada na identificação de
nal, teremos a amplificação da região especifica do sequências humanas repetidas e específicas, como as
DNA molde em estudo. sequências da família Àlu, que podem ser úteis para se
A DNA polimerase utilizada nesse tipo de reação caracterizara presença de DNA humano em misturas, das
é a da bactéria Thermus aquaticus ( Iiiif polimerase). A quais não se sabe a origem do material genético; na iden¬
descoberta de bactérias que vivem em águas térmicas tificação de mutações em genes relacionados ao câncer,

64 A Célula
como o protooncogcne Rase genes supressores de tumor, vagem química, desenvolvido por A. Maxam e W.
como o p53; na detecção do DNA bacteriano e/ou virai Gilbert, e replicação enzimática da interrupção contro¬
1

nas mais diversas doenças infecciosas humanas; para a lada, descrito por Frederick Sanger et ai*
determinação do sexo em células pré-natais de embriões. O método de Maxam e Gilbert inicia-se com a
fc ainda possível realizar PCR quantitativa, o que fornece marcação do DNA a ser sequenciado no final de uma
informações relevantes em relação a certos genes e seus das fitas com fósforo ("P) (Figura 4.37). A enzima
transcritos na célula. Deste modo, a aplicabilidade e ver¬ polinucleotídeo cinase é usualmente utilizada para adi¬
satilidade desta técnica são enormes e a combinação de cionar P na extremidade hidroxil 5' da fita do DNA. O
PCR com o sequenciamento é uma ferramenta de extra¬ DNA marcado é então quebrado, preferencialmente em
ordinário poder para os mais diversos estudos dos genes. um dos quatro nudeotídeos, pelo emprego tie reagentes
químicos que especificamente modificam e removem as
bases a partir de seus açúcares. As condições de quebra
são controladas de tal maneira que, em média, se obte¬
PCR in situ nha uma quebra por cadeia. Na mistura de reação para
A técnica de PCR in situ tem o mesmo objetivo de uma
hibridação in situ, porém utilizada quando o DNA alvo
é muito raro, ou seja. poucas cópias estão presentes no 0 0 0
tecido ou na célula, tornando sua detecção por hibrida¬ 1111 11
0— P—0—P—o— P—o— CH2-ÿ
A BASE
ção in situ muito difícil. Nesse caso, aplica-se uma com¬ J-
binação do método de I'CR e de hibridação in situ. A & 0 (!)
manutenção da estrutura morfológica é importante pa¬
5' 3"
ra esse método, cujo primeiro passo é a fixação do teci¬
do, seguida da preparação de cortes histológicos, que
- TT I I I I I I I I I T
C A TGCATGCAT G
são aderidos em lâminas de vidro. O tecido ou células
G T A C
são permeabilizados, em geral em solução contendo DNA polimerase
ÿ 4dNTP I I J—L
detergente, ou por meio de digestão parcial com prote¬ * ddTTP 3'
ase. e depois incubados com reagentes para reação de
transcriptase reversa seguida de PCR, se for o caso de 5' 3'
detecção de RNAm 011 apenas reagentes para PCR, no
caso de detecção de DNA. As condições para PCR serão
I I I I
C A T G C A T G C
I I I
XT TG
semelhantes às descritas anteriormente e a reação é H T A C
I I I
incubada em um ciclador térmico. A reação de RT-PCR
(reverse transcriptase PCR) ou PCR irá gerar em cada H>
célula que possui a sequencia alvo uma grande quanti¬
dade de fragmentos de DNA iguais à sequência original
H A
_C G T
J L -L I
A C
I I
correspondente. Segue-se então uma reação de hibrida¬ H>
ção in situ,na qual uma sonda complementar à sequên¬ ACGTACGT A C
H
cia amplificada, marcada por um dos métodos descritos I I I I I I I I -L-L
anteriormente, é incubada sobre a amostra sob condi¬ H
ções ideais de sal e temperatura. Após lavagem da G A T C
sonda, segue-se o procedimento de detecção da mesma ddGTP ddATP ddTTP ddCTP
e contra-coloraçào do tecido ou células para identifica¬
ção da morfologia. I I I t
c—
A
T


Seqiienciamento de DNA G-
c—
As análises da estrutura do DNA e da sua relação com a A—
T-
expressão génica foram bastante facilitadas pelo desen¬ G-
volvimento de técnicas de sequenciamento do DNA. c—

Atualmente, na literatura mundial, existe ampla varie¬
dade de métodos de sequenciamento, mas todos eles
foram derivados ou se baseiam nos princípios gerais
A
T
G- —
dos dois primeiros métodos desenvolvidos para deter¬
minação de sequência do DNA. Hsses métodos são cli¬ Figura 4.37 Procedmento para o sequenciamento de DNA.

A Célula 65
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

uma determinada base, cada cadeia quebrada produz Referências bibliográficas


unifragmento radioativo, cuja extensão vai da marca
do P para a base especifica da quebra e, assim, são pro¬
duzidos tantos fragmentos quantas bases existam den¬ I. Alberts B, Bray 1), Lewis 1, Raff M, Roberts K. Watson Jl>.
tro da sequência de DNA a ser analisada. Os fragmen¬ Molecular biology of the cell. 3* etl. New York: Garland
tos de cada mistura são separados por eletroforese em Publish Inc.. 1995. I294p.
gel de poliacrilamida desnaturante; o gel seco ê então 2. Alwine IC, Kemp DJ, Stark GR. A method for detection of
exposto a filme de raio X e o auto-radiograma, analisa¬ specifics RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzy-
do. Essa análise é baseada no fato de que os fragmentos loxymethvl-papcr and hybridization with DNA probes. Proc
de menor tamanho correspondem ao nucleotídeo mais Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5350-4.
próximo da marcação radioativa e, consequentemente, 3. Erlich HA, Gelfand D. Sninsky II. Recent advances in the
seria a extremidade 5' da fita de DNA que está sendo polymerase chain reaction. Science 1991; 152: 1643-51.
sequenciada. 4. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky II. White TJ. PGR proto¬
O método desenvolvido por Sanger utiliza a cols. A guide to methods and applications. San Diego:
DNA polimerase I para copiar uma sequência particu¬ Academic Press, 1990.
lar de um DNA fita simples. A síntese é iniciada a partir 5. Maxam AM, Gilbert W. A new method of sequencing DNA.
de um oligonucleotideo complementar a uma das ex¬ Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 560-4.
tremidades da fita simples do DNA a ser sequenciado. 6. Pardue ML. In situ hybridization. In: Hamcs BD. Higgins
Lm adição aos quatro desoxirribonucleotideos trifosfa- SJ, editors. Nucleic acid hybridization: a practical
tados (dNTP) utilizados como precursores (um deles approach. Oxford: IRI. Press, 1985.
sendo radioativo), a mistura contém análogos 2'-3'- 7. Saiki RK. Scharf S|, Faloona l:, Mullis KB. Horn GT, Erlich
dideoxinudeotídeos (ddNTP) de cada um deles. A HA, ct al. Enzymatic amplification of beta-globin
incorporação de um desses análogos bloqueia o cresci¬ sequences and restriction site analysis for diagnosis of
mento da cadeia que está sendo sintetizada, pelo fato da sickle cell anemia. Science 1985; 230: 1350-4.
ausência da hidroxila da posição 3' do açúcar. Portanto, 8. Sambrook I, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a
fragmentos de vários tamanhos são produzidos, nos laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Lab.,
quais encontramos o análogo dideoxi na extremidade 3' 1989.
da cadeia. Para cada nucleotídeo, faz-se uma mistura de 9. Sanger F, Nicklen S.
Coulson AL. DNA sequencing with
reação (contendo o análogo correspondente), sendo os chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA
fragmentos resultantes submetidos a uma corrida ele- 1977; 74: 5463-7.
troforética de alta resolução e a sequência de bases da 10. Southern E. Detection of specific sequences among DNA
cadeia do DNA recém-sintetizada é lida a partir do fragments separated by electrophoresis. IMol Biol 1975;
auto-radiograma das quatro bases diferentes. 98: 503-7.
Atualmente, pode-se empregar a enzima 1'aq DNA
polimerase,empregada na PGR, para o seqúenciamento de
DNA. Brevemente, o fragmento a ser sequenciado é pa-
reado a um oligonucleotideo iniciador especifico,que é mar¬
cado na presença de um nucleotideo trifosfato radioativo,
seguindo-se a extensão do iniciador marcado em quatro
reaçòes separadas,correspondendo a cada uma das bases
G, A. T e C, contendo os quatro dNTP e um ddNTP por
tubo, conforme descrito na reação de Sanger. Os produtos
tias reaçòes são, então, separados por eletroforese em gel tie
poliacrilamida/uréia de alta resolução e analisados por au¬
to- radiografia. Alternativamente, empregam-se oligonu-
cleotídeos iniciadores fluoresceinados, à semelhança do
que ocorre no seqúenciamento automático de DNA, reali¬
zado com muita velocidade e eficiência por máquinas que se
tornaram comercialmente disponíveis nos últimos anos.
Outra opção que tem sido muito utilizada é a utilização
de dideoxinucleotideos terminadores fiuorescentementc
marcados. Nesse caso, como cada dideoxinudeotídeo é
marcado com um fluoróforo diferente, a reação para a
leitura de uma sequência é feita em um só tubo.

66 A Célula
7 - CULTURA DE CÉLULAS ANIMAIS tipo de célula se desenvolver e efetuar suas atividades
metabólicas normalmente. Atualmente, a cultura celu¬
lar encontra-se em uma fase de especialização, no que
diz respeito aos estudos de mecanismos de controle de
funções diferenciadas. Nas últimas décadas, a cultura de
Selma Candelária Genari células tem se desenvolvido imensamente, deixando de
ser utilizada apenas em certas áreas especializadas, tor-
A compreensão da moderna Biologia Celular e Mole¬ nando-se uma ferramenta de trabalho fundamental em
cular, assim como de outros campos da Biologia e da diferentes novos campos de aplicação, tanto em pesqui¬
Medicina, depende não só dos materiais biológicos es¬ sa, como também na indústria biotecnológica e no
tudados, mas também do conhecimento das mais re¬ diagnóstico.
centes técnicas experimentais, que possibilitam a utili¬ Novas aplicações para a cultura de células têm
zação de modelos de estudo. Entre essas técnicas, a cul¬ continuamente se desenvolvido, possibilitando a investi¬
ture celular, ou seja, a manutenção de células vivas, pro- gação e criação de modelos para estudos da atividade,
liferando-se e até mesmo expressando propriedades di¬ metabolismo e fluxo intracelular como replicação, trans¬
ferenciadas fora do organismo animal, em condições crição e síntese de proteínas; interaçòes entre complexos
laboratoriais definidas (in vitro), vem sendo uma im¬ receptor- hormônios; nutrição; secreção de produtos
portante ferramenta metodológica nas mais variadas li¬ especializados; respostas â estímulos externos durante a
nhas de pesquisa. infecção ou transformação por agentes virais, assim co¬
A cultura tie células iniciou-se nos primeiros anos mo por agentes mutagênicos e açào de drogas; interaçào
do século XX, pelos trabalhos de Ross Harrison ( 1907), célula-célula na diferenciação e indução embriogénica;
que tinham como objetivo estudar o comportamento cinética de populações celulares, adesão celular, carcino-
das células animais em sistemas livres de variações para génese etc.
resolver um tema controverso na Neurobiologia. A O desenvolvimento das técnicas de cultura celular
hipótese examinada era conhecida como doutrina do tem possibilitado avanços nas pesquisas e na profilaxia
neurônio, que estabelece que cada fibra nervosa é o pro¬ de várias doenças infecciosas, por meio do entendimen¬
duto de uma única célula nervosa, e não o produto da to dos processos patológicos, assim como dos mecanis¬
fusão de muitas células. Para testar essa controvérsia, mos de defesa do organismo, dos sistemas de liberação e
pequenos pedaços da medula espinhal foram colocados ação de anticorpos, e pela produção de vacinas antivi-
sobre fluidos de tecido coagulado em uma câmara tími¬ rais, assim como testes de novas drogas ou fármacos. A
da e aquecida, e observados ao microscópio a intervalos cultura de células vem apresentando nas últimas déca¬
regulares de tempo. Após um ou mais dias, células ner¬ das grande aplicação no estudo de doenças como o cân¬
vosas individuais puderam ser vistas alongando-se para cer, contribuindo para o entendimento dos processos
dentro do coágulo. Assim, a doutrina do neurônio foi que causam perturbações nas interaçòes celulares, le¬
confirmada, e as bases para a evolução da cultura de vando ao crescimento neoplásico, assim como da iden¬
células foram assentadas. Em 1913, Alexis Carrel, cirur¬ tificação de agentes carcinogénicos.' A introdução de
gião francês, introduziu em suas culturas a utilização de técnicas, como a manipulação genética associada â cul¬
condições assépticas, o que permitiu a manutenção das tura celular, possibilitou o estudo genético das células
culturas por longos períodos. somáticas, o que tem permitido a análise cromossòmica
Neste período inicial, a cultura de células passou e génica no homem e demais animais, contribuindo
por uma fase de exploração, seguida de uma fase de ex¬ para o entendimento e o diagnóstico de doenças heredi¬
pansão na década de 1950, sendo que ainda no início tárias causadas por alterações genéticas e também estu¬
dos anos 1970, a cultura de tecidos era alguma coisa dos filogenéticos. Com o desenvolvimento das técnicas
entre uma mistura de ciência e bruxaria. Apesar de flui¬ de fusão celular, foi possível a utilização de linhagens
dos teciduais terem sido substituídos por meios líquidos celulares capazes de se dividir indefinidamente in vitro,
contendo quantidades específicas de diferentes substân¬ como plasmócitos produtores de anticorpos, obtendo-se
cias, como sais, glicose, aminoácidos e vitaminas, a mai¬ os chamados hibridomas e, por meio destes, a produção
oria dos meios também incluía uma mistura pobremen¬ dos anticorpos tnonoclonais. Outra área de atuaçáo cres¬
te definida de macromoléculas, na forma de soro de cente da cultura de células é a sua aplicação no desen¬
cavalo, soro fetal, de bezerro, ou ext ratos preparados de volvimento de biomateriais a serem utilizados como
embriões de galinha. Alguns desses meios são ainda hoje materiais de implante, para substituição de tecidos lesa¬
utilizados para o cultivo rotineiro de muitos tipos celu¬ dos, e também a serem usados para construção de ór¬
lares, mas eles dificultam o conhecimento de quais gãos artificiais, a bioengenharia de tecidos, permitindo
macromoléculas especificas são necessárias para cada avaliar o comportamento celular e a citotoxicidade dos

A Célula 67
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

materiais in vitro, restringindo os testes pré-clínicos que siste na remoção das células, transferindo-as para novos
utilizam animais. frascos de cultura com maior área de substrato de adesão
A fertilização assistida em reprodução humana em novo meio de cultura e em quantidades adequadas.
ou animal desenvolveu -se significativamente nesses úl¬ Após o primeiro repique, a cultura primária passa a ser
timos anos, tendo aplicações tanto para auxiliar casais considerada uma linhagem celular, sendo cada repique
com problemas de fertilidade, como para produção de considerado uma passagem, por exemplo, após três repi¬
animais em grande escala e reprodução de espécies ques a linhagem celular encontra-se na passagem 3. As cé¬
ameaçadas de extinção; essa área também tem se bene¬ lulas em cultura poderão apresentar diferentes proprie¬
ficiado da cultura celular, para obtenção e manutenção dades de crescimento, dependendo do tecido de origem.
de embriões durante as fases iniciais de desenvolvi¬ Os tipos celulares que necessitam estar aderidos a um
mento. substrato para crescerem são chamados de células depen¬
Com o desenvolvimento de novas metodologias dentes de ancoragem. As células que apresentam depen¬
e áreas de aplicação da cultura celular, uma série de ter¬ dência de ancoragem podem formar uma única camada
mos passou a ser rotineiramente utilizada, criando uma celular sobre o substrato, ou seja, crescem em monoca-
terminologia específica. Esses termos são continuamen¬ madas (Figuras 4.39a e 4.39c). O crescimento celular em
te revisados, ampliados e publicados em revistas cienti¬ monocamadas é observado na maioria das culturas pro¬
ficas especializadas (lerminoly associated with cell, tissue venientes de tecidos normais, com exceção do tecido
and organ culture, molecular biology and molecular hematopoético, cujas células crescem em suspensão, sem
genetics).1 necessitar estar aderidas a um substrato, sendo, portanto,
células com independência de ancoragem. A capacidade
de crescimento com independência de ancoragem é
observada não somente em células do tecido hematopo¬
Tipos dc cultura celular ético. como em cultura de linfócitos, por exemplo, mas
Como os estudos que deram origem a cultura celular também em algumas linhagens que sofreram modifica¬
utilizavam em sua maioria fragmentos de tecidos, o ções no seu padrão de crescimento, sendo chamadas
termo cultura de tecidos vem sendo empregado de for¬ transformadas (como será discutido adiante), ou obtidas
ma genérica, sendo utilizado para se referir aos estudos a partir de um tecido tumoral, que podem crescer em
utilizando células ou órgãos mantidos in vitro por mais meios líquidos ou semi-sólidos, formando agregados
de 24 horas. De forma mais específica, o termo cultura celulares, nos quais ocorre o crescimento cm múltiplas
de órgãos refere-se ao cultivo de fragmentos ou de um camadas.
órgão completo, com a manutenção da sua estrutura
tecidual tridimensional e das funções integrais ou par¬
ciais que eram exercidas in vivo, enquanto a cultura de
células sc refere a células mantidas in vitro, provenientes Biologia das células in vitro e sua
da desagregação mecânica, química ou enzimática de adaptação às condições de cultura
um tecido ou órgão.
Quando se estabelece uma cultura primária ou quando se
subcultiva uma linhagem celular, as células são submeti¬
das a um estresse considerável, pois o processo de disso¬
Cultura primária - células dependentes ciação enzimática pode causar ruptura das ligações entre
e independentes de ancoragem as células e entre a célula e o substrato em que ela estava
aderida. As células dissociadas geralmente mudamde for¬
Assim, por meio de um órgão fetal ou adulto,podem ser ma. perdem a polaridade funcional e apresentam altera¬
obtidas as chamadas culturas primárias, que implicam na ções na distribuição das proteínas na membrana plasmá¬
desagregação tecidual mecânica ou enzimática e obten¬ tica. Algumas células não sobrevivem ao tratamento de
ção de suspensões celulares que então são cultivadas em dissociação, enquanto outras, reparam os danos sofridos
camadas aderidas a um substrato ou suspensas em meio e conseguem se adaptar ao novo ambiente, voltando a
de cultivo; ou culturas primárias de explante, nas quais crescer e se dividir in vitro. As células em cultura "condi¬
pequenos fragmentos (< 1 mm ) de tecidos são utilizados cionam" seu ambiente, isto é, liberam para o meio subs¬
( figura 4.38). Com o crescimento e aumento da densida¬ tâncias como fatores de crescimento e elementos de ma¬
de celular, as culturas primárias necessitam ser subculti- triz cxtracelular, que promovem o estimulo para o cresci¬
vadas ou repicadas, pois o substrato disponível para adesão mento e/ou proliferação celular e a adesão.
ou o volume do meio de cultura não são mais suficientes
para a concentração celular. O repique ou subadtivo con¬

68 A Célula
i ammal adulto
embnáo

biópsia ou necrópsia (fragmento de órgào/tecido normal ou tumoral)


ÿ
i i
dissecção
adicional

\
mecânica

suspensão explante
celular
Cultura primária

Figura 4.38 Representação esquemática de diferentes formas de obtenção de culturas celulares pnmánas: a parir
de suspensão celular e por explante. Após o primeiro repique ou subcultrvo obtém-se as chamadas Linhagens
Celulares.

m --W'

Figura 4.39 Célutas de linhagens estabelecidas em cultura, a. Micrografia em microscopia de fase de células da linhagem Vero. que foram obtidas a partir
de rim de macaco verde africano, crescendo em monocamada. b. Micrografia de contraste de fase de células Vero crescendo em múltiplas camadas após
processo de transformação celular, c. Microscopia eletrònica de varredura de células V79. semelhantes a fibrobastos. obtidas a partir de pulmão de hams¬
ter, crescendo em mooocamadas aderidas à superfície da placa de cultura. As células arrendondadas encontram-se em drvisào. d. Células V79 após trans¬
formação celular, como crescimento em múltiplas camadas e formação de agregados celulares. Figuras c e d. cortesiade Leandro Pelinari.

A Célula 69
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Fases do crescimento celular células encontram-se em proliferação ativa. Quando a


população celular atinge a confluência, ou seja, forma
Quando se observa o crescimento de uma população um tapete celular contínuo sobre o substrato, a taxa de
celular em função do tempo de cultivo, pode-se anali¬ proliferação geralmente diminui, considerando-se
sar a chamada curva de crescimento,que é tipicamente células normais, pois não existe mais substrato dispo¬
uma curva sigmóide, na qual podemos identificar várias nível para a adesão. Lssa é a fase denominada de fase
fases do crescimento celular (Figura 4.40). A primeira estacionária ou plató. Na fase estacionária, as taxas de
etapa do cultivo celular, que ocorre logo após a inocula¬ divisão c morte celular estão equilibradas de tal modo
ção das células em cultura, é chamada de fase de adapta¬ que não ocorre aumento da população celular, sendo a
ção ou fase lag. Nesta fase, as células não se dividem, pois concentração de células denominada densidade de
se encontram em processo de adaptação ao novo ambi¬ saturação. Algumas variações podem ser observadas
ente. A duração da fase lag irá depender das condições nesta fase, dependendo do tipo celular cultivado.
de cultivo, como temperatura, meio nutriente e concen¬ Muitos tipos celulares que são dependentes de ancora¬
tração de soro utilizada, tipo celular etc., c da fase em gem mostram diminuição da atividade mitótica ao
que se encontrava a população quando o repique foi efe» atingir a confluência da monocamada, pois apresen¬
tuado. A densidade ou inoculo celular também irá influ¬ tam inibição por contato, e não mais se dividem na
enciar esta fase inicial, ou seja, quanto menor for o ino¬ ausência de substrato disponível. Outros podem conti¬
culo, maior a duração da fase de adaptação. Quando as nuar a se dividir, liberando as células-fllhas para o
células começam a se dividir, inicia-se a fase de cresci¬ meio de cultura. Alguns tipos celulares podem ainda
mento logarítmico ou fase log,na qual o número de passar a crescer empilhados, formando múltiplas
células presentes na população aumenta exponencial¬ camadas, por não apresentarem mecanismo de inibição
mente. Os estudos que envolvem a análise das funções por contato (Figuras 4.39b e 4.39d). A fase estacionária
celulares geralmente são realizados nesta fase, na qual as é seguida por um período em que ocorre diminuição do

LINHAGEM LINHAGEM CELULAR


CELULAR ESTABELECIDA

-
K
14 -

Figura 4.40 Curva de crescimento


representando diferentes fases da cultu¬
ra celular. No eixo das abscissas está
representado o tempo em cultura (em
semanas) e no eixo das ordenadas está
representado o número de células pre¬
sentes em crescimento logarítmico.
considerando valores numéricos hipoté¬
ticos. Modificado de Freshney (2005).

70 A Célula
número de células da população. Essa fase é denomina¬ controle de crescimento e imortalização das células em
da de fase de declínio e ocorre devido ao aumento da cultura. A sequência desses eventos é variável e influen¬
morte celular em função da liberação de produtos tóxi¬ ciada pelas condições de cultura, levando a uma pressão
cos e da fiilta de nutrientes. seletiva, de forma que somente as células mais adaptadas
a determinadas condições irão sobreviver e se proliferar.
Consequentemente, a transformação celular em cultura
não é facilmente definida, sendo frequentemente utiliza¬
Transformação celular do um critério de classificação em três grupos,de acordo
A maioria dos tipos celulares normais pode ser propa¬ com as propriedades observadas: (1) imortalização
gada em cultura apenas por um número limitado de (quando a transformação origina uma linhagem celular
vezes. Fibroblastos diplóides humanos, por exemplo, estabelecida); (2) transformação (quando envolve altera¬
duplicam-se de 50 a 70 vezes in vitro. Depois desse ções e perda do controle de crescimento) e (3) transfor¬
número de gerações, entram em seitescência ou envelhe¬ mação maligna ou neoplásica (quando as células, uma vez
cimento celular e morrem. Portanto, as linhagens celu¬ inoculadas em animais susceptíveis, apresentam a capa¬
lares obtidas a partir de culturas primárias têm vida cidade de crescer formando tumores invasivos).
finita. Todavia, algumas dessas linhagens celulares so¬
frem alterações genéticas e adquirem a capacidade de
crescer indefinidamente in vitro, tornando-se linhagens
celulares estabelecidas. Quando essas alterações que le¬ O ambiente das células em cultura:
vam à formação de linhagens estabelecidas, não impli¬ substrato, atmosfera, meio e
cam na ocorrência de modificações fenotípicas e no pa¬
drão de crescimento, geralmente este processo é deno¬ temperatura
minado apenas de imortalização. Quando ocorrem mo¬ Para poder crescer in vitro, as células devem ter condi¬
dificações 110 padrão morfológico e de crescimento,diz- ções adequadas de temperatura, concentração de O. e
se que as células passaram por um processo de transfor¬ de CO., nutrientes, pH e osmolaridade que se asseme¬
mação celular. Essa transformação pode ocorrer espon¬ lhem às encontradas in vivo, além de condições de este¬
taneamente 011 ser induzida por agentes químicos rilidade com ausência total de microrganismos e agen¬
(como carcinógenos), físicos (como as radiações ioni¬ tes tóxicos. Para tal, as células devem ser mantidas em
zantes - raio X) e biológicos (vírus) entre outros. A estufas apropriadas, que irão controlar a temperatura
transformação celular pode muitas vezes estar acompa¬ geralmente cm torno de 36,5°C (o que pode variar
nhada de modificações nas características de cresci¬ dependendo do tipo celular ou da espécie animal), con¬
mento, como aquisição de independência de ancora¬ centração de gases e umidade do ar. Para manipulação
gem, perda da inibição por contato com crescimento das culturas em procedimentos rotineiros, como troca
em múltiplas camadas (Figuras 4.39b e 4.39d) e dimi¬ de meio, repique e outros, deve-sc trabalhar utilizando-
nuição da necessidade nutricional. Apenas quando se câmaras de fluxo laminar, que são equipamentos que
essas células são capazes de formar tumores, uma vez possibilitam a filtração do ar por um sistema de mem¬
injetadas em animais (tumorigènese), diz-se que passa¬ branas seriadas com poros de diâmetro que decrescem
ram por um processo de transformação tumoral. gradativamente até 0,3 pm, criando-se assim um local
As linhagens celulares estabelecidas geralmente de trabalho, no qual o ar que irá entrar em contato com
apresentam aneuploidias e, frequentemente, possuem as células estará sob condições de esterilidade, evitan-
número de cromossomos entre o número diplóide e tetra- do-se a contaminação da cultura.
plóide da espécie de origem. Existe também uma variação Além dessas condições, é necessário o forneci¬
do número de cromossomos entre as células de uma mento dos nutrientes específicos e em concentrações
mesma população (heteroploidia), sendo o número de ideais, que estão presentes nos meios de cultura. Muitos
cromossomos presente 11a maioria das células de uma meios de cultivo disponíveis comercialmente foram
população referido como número modal de cromossomos. desenvolvidos tendo como base a análise do conteúdo
Existem diferentes propriedades celulares asso¬ dos fluidos biológicos, como plasma, linfa, soro e extra-
ciadas com a transformação in vitro (Tabela 4.5). Uma tos de tecidos, porém cada tipo celular apresenta seus
linhagem celular estabelecida ou transformada pode requerimentos específicos em termos nutricionais." O
apresentar uma ou algumas destas propriedades, mas meio de cultura básico deve conter:
não necessariamente todas." • Sais inorgânicos: são importantes para a manutenção
De forma semelhante à carcinogénese in vivo, a do pi I fisiológico e da pressão osmótica, e do poten¬
transformação in vitro é um mecanismo complexo e pro¬ cial de membrana, por serem co-fatores de muitas
gressivo, no qual uma série de eventos leva à perda do enzimas e por participarem dos mecanismos de ade-

A Célula 71
Capitulo 4 MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

Tabela 4 .5 Características e propriedades celulares que podem ser observadas em linhagens estabelecidas após o
processo de transformação celular.

Crescimento em cultura Imortal


Independentes de ancoragem, podendo crescer em
meios semi-sólidos com ágar ou em suspensão
Perda de inibição por contato, apresentando crescimen¬
to em múltiplas camadas ou regiões com focos ou agre¬
gados celulares
Alta densidade de saturação
Baixo requerimento de soro e fatores nutricionais
Presença de fatores de crescimento próprios
Alta eficiência de plaqueamento
Redução do tempo de duplicação da população

Propriedades genét icas Alta taxa de mutação espontânea


Aneuploidias
Ileteroploidia
Expressão aumentada de oncogenes
Deleçào de genes de supressão tumoral

Alterações estruturais Modificações 110 padrão de distribuição de actina no


citoesqueleto
Perda da fibronectina associada â superfície celular
Aumento da aglutinação por lectinas
Modificações na matriz extracclular
Alterações nas moléculas de adesão
Perda da polaridade

Propriedades neoplásicas Tumorigônese


Indução de angiogénese
Aumento da secreção de proteases (como 0 ativador de
plasminogénio)
Invasividade

são celular. Os ions inorgânicos geralmente utiliza¬ • Hormònios ou fatores de crescimento: são adiciona¬
dos são Na+, K+, Mg+2, Ca+2. Cl", SO.,"2, PO.,"3 e dos no meio de cultura em concentrações baixas e
HCO3-. conhecidas, ou pela adição de soro fetal bovino ao
• Fonte de energia: a glicose é o açúcar mais frequen¬ meio de cultivo.
temente utilizado na composição dos meios de cul¬ • Antibióticos: podem ser usados para prevenir conta¬
tura. A glutamina também pode ser utilizada para minação. Os antibióticos mais utilizados nos meios
certos tipos celulares. de cultivo são uma mistura de penicilina e estrepto-
• Aminoácidos: principalmente os aminoácidos essen¬ niicina ou gentamicina.
ciais, isto é, aqueles que não são sintetizados pelo • Soro fetal é utilizado para suplementar o meio de cul¬
organismo (arginina, cistina, histidina, isoleucina, tivo básico em concentrações que podem variar de 2
leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, a 30%, dependendo do tipo celular a ser cultivado.
triptofano e valina). Geralmente, maiores concentrações são utilizadas pa¬
• Vitaminas: muitas vitaminas do grupo B são precur¬ ra a obtenção de cultura primária, enquanto concen¬
soras dos co-fatores enzimáticos. As vitaminas mais trações menores, para a manutenção de linhagens
utilizadas são: ácido para-amino benzóico, biotina, estabelecidas.
ácido fólico, ácido nicotinico, ácido pantotênico, pi- Muitos meios de cultivo disponíveis comercial¬
ridoxal, ribollavina, tiamina e inositol. mente não permitem o crescimento celular por si só e

72 A Célula
devem ser complementados com soro animal. O soro minação por estes agentes existem testes que utilizam a
fetal bovino é o mais amplamente utilizado e contém imunofluorescéncia ou marcação de proteínas especificas.
vários fatores de crescimento, hormònios e substâncias
que participam da adesão celular, que são importantes
para a manutenção e o crescimento de células em cul¬
tura. O soro é um suplemento nutritivo efetivo para a Criopreservação e banco de células
maioria das células em cultura, além de conter fatores As linhagens celulares primárias ou estabelecidas podem
protetores (inibidores de proteases). ser congeladas e mantidas por tempo indeterminado.
Alguns meios de cultivo, denominados meios Pela utilização de meios de congelamento, que geralmen¬
quimicamente definidos, não necessitam da suplementa- te apresentam alta osmolaridade e presença de substân¬
ção com o soro, por apresentar na sua formulação os cias chamadas crioprotetores, como o glicerol e dimetil
fatores de crescimento em concentrações necessárias já sulfóxido, grande parte da água presente no interior da
estabelecidas para tipos celulares específicos. Esses célula é perdida para o meio e substituída gradativamen¬
meios podem ser reproduzíveis, não dependem de dis¬ te pelos crioprotetores,que impedem a formação de cris¬
ponibilidade de animal para fornecer o soro, simplifi¬ tais de gelo em seu interior. As células são geralmente
cam o processo de purificação de proteínas celulares e congeladas lentamente, em ampolas ou pequenos frascos
não têm fatores desconhecidos, como vírus, toxinas, resistentes, que posteriormente são armazenados em
inibidores de crescimento etc. No caso de uso de meios botijòes de nitrogénio líquido a -1%°C, podendo ficar
sem soro estes são especificamente desenvolvidos para estocadas por grandes períodos de tempo, até serem des¬
um determinado tipo celular. A insulina e transferrina congeladas e colocadas nas condições normais de cultu¬
são os suplementos mais utilizados nesses meios. Além ra, quando voltam a se dividir in vitro.
destes, outros hormònios polipeptídicos ou esteróides, Os bancos de células são organizações responsá¬
fatores de crescimento, agentes redutores, albumina e veis pela caracterização das linhagens celulares, assim
vitaminas podem ser adicionados.* como pela sua distribuição e comercialização, manten¬
do estoques delas sob condições padrões e sob normas
de segurança. Atualmente, existem bancosde células em
todo o mundo que fornecem catálogos de informações
Contaminação destas linhagens ou apresentam a disponibilização
Embora a contaminação microbiana seja a mais comum, dessas informações via rede internacional de computa¬
quando as condições de cultura já estão estabelecidas, dores, como o banco de células americano, American
pode ocorrer também a contaminação química, princi¬ Type Culture Collection (ATCC). *
palmente quando se utiliza lavagem de vidrarias e ma¬
teriais com água de qualidade não apropriada, e a cha¬
mada contaminação cruzada, que é a contaminação en¬ Referências bibliográficas
tre células de linhagens diferentes.
A contaminação microbiana leva à perda das cultu¬ 1. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff D, Roberts K. Watson JD.
ras celulares em andamento e geralmente ocorre em fun¬ Molecular biology of the cell. 4*-ed. New York: Garland,
ção de erros de manipulação durante a interaçào do ope¬ 2002.
rador com as técnicas e condições de cultura. Diferentes 2. Freshney Rl. Culture of animal cells. A manual of basic
tipos de agentes podem causar contaminação microbiana: technique. 5" ed. New York: Wiley I.iss. 2005.
bactérias, vírus, fungos, leveduras, protozoários e mico- 3. Pontén J. The relationship between in vitro transformation
plasmas. As contaminações por bactérias e fungos são and tumor formation in vivo. Biochim Bioph Acta 1976:
geralmente fáceis e rapidamente detectadas devido à tur- 458: 397-422.
vaçào do meio de cultura, alteração no pH, rápida morte 4. Schaeffer WI. Terminology associated with cell tissue and
celular e presença de partículas em suspensão. A presença organ culture, molecular biology and molecular genetics.
de micélios filamentosos de fungos é facilmente observada In Vitro Cell Dev Biol 1990: 26: 97-101.
em um frasco de cultura. As contaminações por vírus e 5. Genari SC. Wada MLF. Alterations in the growth and adhe¬
micoplasmas geralmente ocorrem de forma mais lenta, sion pattern of Vero cells induced by nutritional stress con¬
podendo apresentar período variável de latência, com ditions. Int Cell Biol 1998; 22: 285-94.
diminuição gradativa do crescimento celular até a perda 6. Davis JM. Basic cell culture. A practical approach. New-
das culturas. No caso dos vírus, âs vezes é possível a obser¬ York: IRL Press, 1996.
vação de regiões de morte celular nas culturas (efeito cito- 7. http://www. atcc.org/
pático), enquanto nos micoplasmas a detecção visual da 8. Peres CM, Curi R. Como cultivar células. Rio de lanciro:
contaminação não é possível. Para diagnóstico de conta¬ Guanabara Koogan. 2005.

A Cé u a 73
5 BIOMEMBRANAS
Arnaldo R. Santos Jr. e Hernandes F. Carvalho

As biomembranas são estruturas laminares» compostas principalmente de lipídios e proteínas, que defi¬
nem os limites entre as células e o ambiente extracelular. Elas formam barreiras de permeabilidade sele-
tiva, que regulam a composição molecular e iònica do meio intracelular. Também tornam possível a
compartimentalização das atividades metabólicas, por meio da segregação de enzimas e outros
componentes nas diferentes organelas membranosas presentes na célula.
As biomembranas possuem muitasenzimas e sistemas de transportes importantes. Alguns tipos espe¬
cializados de membranas geram gradientes iónicos que podem ser utilizados para sintetizar ATP ou para
produzir e transmitir sinais elétricos. Além disso, na superfície externa das células, estão localizados muitos
sítios receptores ou de reconhecimento, que podem interagir com outras moléculas ou mesmo com outras
células. Apesar dessas diferentes funções, as membranas têm em comum a sua estrutura geral: uma Incarna¬
da composta de lipídios e proteínas, mantidos juntos principalmente por interaçôes hidrofóbicas.

Estrutura das membranas biológicas bulares encontravam-se na periferia das membranas,


interagindo com as cabeças polares dos fosfolipídios'
No século passado, Kõlliker observou que células ani¬ (Figura 5.1). Hm 1961, por meio de estudos em micros¬
mais e vegetais, quando colocadas em soluções iónicas copia eletrónica, Robertson propôs o modelo de unida¬
concentradas, permitiam a passagem de água, mas não de de membrana, no qual todas as membranas celulares,
de moléculas solúveis. Isso sugeria a existência de uma observadas ao microscópio eietrônico, apresentavam
barreira semipcrmeável envolvendo as células.' As pri¬ uma estrutura trilaminar, com duas bandas eletrodensas
meiras informações sobre a composição química dessas separadas por uma banda eletrolúcida. Hsse aspecto foi
barreiras foram levantadas por Overton, ainda no sécu¬ relacionado a uma bicamada lipídica no interior de ca¬
lo XIX. Por meio de experimentos com vários solventes, madas fibrosas de proteínas" (Figura 5.1). Posterior¬
ele determinou que o transporte através das membra¬ mente, com a descoberta de que as proteínas participa¬
nas estava relacionado à solubilidade de lipídios.1 vam do transporte de moléculas polares através das
Portanto, as membranas biológicas deveriam ser com¬ membranas, os modelos destas foram revistos, de modo
postas, ao menos em parte, por esse tipo de substância. a incorporar poros protéicos na bicamada lipídica.'
Hm 1925, Gorter e Grendel extraíram fosfolipí- O modelo de Danielli-Davson-Robertson, apesar
dios de eritrócitos humanos e os colocaram em um re¬ de apresentar os seus méritos, era sujeito a críticas,
cipiente com água. Foi observado que esses lipídios for¬ como a limitação da permeabilidade que as camadas
mavam uma camada na interface entre a água e o ar. compactas de proteínas representavam. Por volta da
Quando os fosfolipídios foram comprimidos por meio década de 1970, observou-se que muitas proteínas de
de barreiras móveis, a superfície de área recoberta foi membrana apresentavam domínios estruturais com¬
estimada sendo de 1,8 a 2,2 vezes maior que a superfí¬ postos por a-hélices hidrofóbicas. Isso levou à sugestão
cie presente nas membranas dos eritrócitos. Por meio de que algumas proteínas de membrana apresentavam-se
desse experimento bastante simples, os autores sugeri¬ inseridas na bicamada lipídica. Além disso, foi mostra¬
ram que os lipídios dispunham-se em bicamadas na do que antigenos de superfície eram capazes de se
formação das membranas, com suas cabeças polares deslocar na superfície celular.- Com esses conhecimen¬
voltadas para a água e as caudas de hidrocarbonetos tos em mãos, cm 1972, Singer e Nicolson propuseram o
voltadas para um centro hidrofóbico (Figura 5.1). modelo do mosaico fluido para as membranas biológi¬
Em 1935, com a descoberta de que as membranas cas." Hsse modelo pressupunha que as proteínas esta¬
também eram compostas por proteínas, foi proposto, riam embebidas na bicamada lipídica, de forma que as
por Danielli e Davson, um modelo no qual proteínas glo- porções hidrofóbicas das proteínas encontrar-se-iam

74 A Célula
ca, que forma uma barreira de permeabilidade seletiva,
incrustada por proteinas, que são as principais, mas não
únicas, responsáveis pelas diversas funções apresentadas
Modelo de membrana de
Lipídios Gorier e Grendel (1925) pelas diferentes biomembranas. Quanto mais diversas as
funções desempenhadas por uma determinada mem¬
brana. maior a variedade de proteinas nela presentes. Há
também carboidratos, ligados às proteínas e aos lipídios,
Proteínas formando glicoproteínas e glicolipidios, que exercem

Lipídios
-c Modelo de membrana de
Danielà e Davson (1935)
diferentes funções, a principal delas correspondendo à
comunicação intercelular.

Composição química
Proteinas
Modelo de membrana de As biomembranas são compostas basicamente por
id,os
Lipídios
-C I Robertson (1961) lipídios e proteínas, sendo que alguns desses compo¬
nentes estão covalen temente ligados a carboidratos. A
seguir, cada um desses componentes e suas respectivas
importâncias para a estrutura e fisiologia celular serão
analisados.
Lipídios Modelo de membrana de
Singer e Nicoison (1972)
Lipídios
Pro emas São substâncias orgânicas insolúveis em água e solúveis
em solventes orgânicos. Os lipídios são moléculas peque¬
Figura 5.1 Principais modelos apresentados para as membranas biotógi- nas, sendo que há cerca de 50 moléculas de lipídio para
cas. O pnmetro deles, de Gorier e Grendel (1925), apresentava as bo- cada molécula de proteína nas biomembranas." Dentre
membranas com bicamadas lipídicas O modelo de Damelli e Davson
(1935) acrescentava sobre a bicamada iipidca de algumas membranas. os vários tipos existentes, os mais abundantes nas mem¬
porém não de todas, proteinas globulares. Robertson (1961), baseado em branas biológicas são os fosfolipídios, que pertencem à
observações feitas ao microscópio eíetrónico. apresentou o conceito da classe dos fosfoglicerídeos. Hm menor quantidade, são
unidade de membrana, no qual a bicamada hpidíca encontra-se entre
camadas compactas de proteinas. Finalmente. Singer e Nicoison (1972) encontrados os esfingolipídios e o colesterol.
propuseram o modelo do mosaico Ruido, no qual as proteínas encontram- Os fosfolipídios (Figura 5.2) apresentam uma cabe¬
se inseridas na bicamada fapidca. ço polar, ou hidrofilica, e duas caudas apoiares, ou hidrofó¬
bicas. Dessa forma, pelo fato de apresentarem regiões iú-
no interior também hidrofóbico da bicamada, ambos drofilicas e hidrofóbicas, os lipídios de membrana são
protegidos do contato com a água (Figura 5.1). Isso in¬ moléculas anfipáticas.' ' ' A cabeça polar é composta pelo
dicava que essas proteinas apresentariam, portanto, três glicerol (um triálcool), um fosfato e um álcool, como a
domínios distintos: dois hidroíilicos, nas faces externas colina, a etanolamina, o inositol ou a serina. As caudas
da membrana, e um hidrofóbico, no interior dela. O apoiares são compostas pelas cadeias carbónicas dos áci¬
modelo propunha também que as proteinas, dada a flu¬ dos graxos. Ácidos graxos são ácidos carboxílicos de ca¬
idez dos lipídios, estivessem em movimento constante deia longa que possuem de 12 a 24 átomos de carbono,
pela bicamada lipídica* embora os mais abundantes nas biomembranas tenham
A maior parte do modelo proposto por Singer e entre 16 e 18 carbonos (os principais ácidos graxos são
Nicoison é válida até o presente momento. Iloje, sabe¬ listados na Tabela 5. 1). Esses ácidos graxos podem ser sa¬
mos que nem todas as proteínas se movem livremente turados ou insaturados. Normalmente, os fosfolipídios
pela bicamada lipídica.como sugeria o modelo original. apresentam, pelo menos, uma cadeia insaturada em sua
Quanto à imagem das membranas observadas à micros¬ composição. Diferenças na quantidade de insaturações
copia eletrôn ica.com uma região eletrolúcida entre duas dos ácidos graxos são importantes, pois influenciam a
regiões eletrodensas, atualmente é considerada um arte- aproximação e movimentação dos fosfolipídios e, conse¬
fato de técnica, causado pela utilização de tetróxido de quentemente, a fluidez das membranas." A nomencla¬
ósmio durante a fixação e processamento do material tura dos fosfolipídios é dada de acordo com o tipo de ál¬
para ser observado ao microscópio eíetrónico. cool presente na cabeça polar. Quando o álcool da cabeça
As biomembranas apresentam espessura que varia polar corresponde à etanolamina, temos o fosfatidiletano-
de 7,5 a 10 nm. Consequentemente, só podem ser visua¬ lamina,a uma colina, temos o fosfatidilcolina (ou leciti¬
lizadas à microscopia eletrônica. As membranas possuem na), a uma serina, temos o fosfatidilserina, a um inositol,
sempre a mesma estrutura básica: uma bicamada lipidi- temos o fosfatidilinositol. Além desses, existe também um
1

A Célula 75
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

FOSFOLIPÍDIOS
R
nh3* N(CH3)3*
? - ch2 çh2
0 H
0-

?
P—O"
çh2 çh2
Fosfato H-C- -CH? ? ?
C-0 0=P—0" 0=P—0"
Glicerol o o
ÇH3 Fosfatiddetanoíarrvna
I
FosfaWilcolina
CH2
çh2 C00" H H
o
s ch2
X
2 S5
*H3N-CH
çh2 8 CH2
2
I
45 ?
çh2 </>
£ 0-P-0" 0=P-0"
fH2
<fH2
o
"O
i
Fosfatidilserina FosfaMilmositol

fH2
çh2 OH

?h2 h2ç -i
I
- -çh2
çh2 ? H
?
f2 O— P—0" O— P—O"

çh2 ?
|H2 Dfosfati<Ji5gl«cerol (cardobpina)
ch3
Cabeça polar

Figura 5 2 Principais fosfotipídios das toomembranas. Os fosfolipídios sào formados por uma cauda apolar, composta pelas cadeias de ácidos graxos. e
uma cabeça polar, constituída peto glicerol. um fosfato e um álcool. Normalmente, nesse radical, encontramos etanoamina. colma ou serina. No caso da
cardiolipma. um hpídto encontrado na membrana interna das mitocóndrias. o grupo R é formado por uma molécula de glicerol. constituindo assim um fos-
fobpídto "duplo". A molécula formada pela umâo dos ácidos graxos, do glicerol e do fosfato recebe o nome de áodo fosfatidico. No entanto, o que dá nome
ao fosfo&pidio é o radical que ele apresenta no grupo R.

tipo especial de fosfolipídio denominado difosfatidilglicc- apoiares sejam confinadas em regiões hidrofóbicas e
rol ou airdiolipina. A cardiolipina é um fosfoglicerídeo as cabeças hidrofilicas fiquem em contato com a
duplo, com dois ácidos fosfatídicos unidos por uma água.'*1 Essa propriedade intrínseca dos fosfolipídios
molécula de glicerol (Figura 5.2). Bse tipo de lipídio é faz com que se possa produzir in vitro, até com rela¬
encontrado exclusivamente na membrana interna das tiva facilidade, membranas artificiais.
mitocóndrias, fazendo com que a sua permeabilidade seja Um tipo de bicainada sintética, utilizada para se
bastante baixa.*""1 estudar as propriedades das membranas lipidicas, sào
Os fosfolipídios em solução aquosa, devido ao .
os lipossomos Os lipossomos sào como vesículas rela¬
seu caráter antipático, têm tendência natural â forma¬ tivamente esféricas cujos fosfolipídios, dispostos em
ção de bicamadas. Quando esses lipídios sào expostos bicamadas, separam uma região central do meio exter¬
à água, tendem a se agregar de modo que suas caudas no.' O seu diâmetro pode variar de 25 nm a I um,

76 A Célula
Tabela 5.1 Principais ácidos graxos encontrados nas membranas celulares.

Ácidos graxos

Nome Esqueleto Estrutura* Nome sistemático Ponto de


comum carbónico (IUPAC) fusão (°C)
S Ác.
láurico 12:0 CH3(CH2)10COOH Ác n - dodecanaco 44.2
a
t Ác. miristico 14:0
ÿ1 i t 11 V
CH3(CH2)í2COOH t r? ---
Ac n -tetradecanótco
l
53.9
u Ác. palmítico 16:0 CHÿShSmCOOH ~
1
ÿ

Ac.
..
---..... --
I » -- *

esteárico
..... . ...
- »iÿ i
4

13:0 CH3(CH2)16COOH
~>
Ác. n -hexadecanótco
,»ÿ

Ác. n -octadecanoco
— «BMmJ
63.1
69.6
d |
- .
d Ac. araquidico
i. i
iÿ—

CHa(ClÓiãC00H
~

mc. oenenico
Aa
20:0
A II 1 V AAA II
Ác. n -eicosanóko J 76.5
0 l\Af\ AAiAA
22:0 CH3(CH2)2oCOOH |Ác. n • docosanóico 81.0
s Ac. I grocenco 24:0 CH3(CH2)22COOH Ác. n -tetracosanóco 86.0
Ác. palmitoteico 16:1 (íjT CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH Ác. os9 •
-0.5
1• 1 1
n-7 ou o>-7 hexadecenóco
n Ác. oleico 18.1 (tf) Ác. os 9 •
s n-9ouo>-9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH octadecenóico 13.4
. , ...
| I 1
o
o
Ác. linoleico 18:2 (A j. 4 A A 4
Ac. as, as 9. 12-
t n-6 ouo>6 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH octadecadienófco -5.0
u 1 i » ÿ ÿÿ ÿ

r 18:3 (D'-'1). Ac. ás, ás. as 9. 12. 15-


Ác. linolènico n-3 ou o>3 CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH 11,0
._
octadecatrienóico •
a .... [
kA AmaÉÿ

- ..... ÿ ÿ

d 20:4 (tf "*M), Ác. ás,as,os 5. 8.11. 14-


o Ác. araquidônico n-6.ou o>6 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH (cosatetraenóco
. -49,5
I 1 > ÿ ÿ
\ 11 'ÿ

s

24:1 (A"). Ác. os 15-


Ác. nervònico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)13COOH tetracosenóx» 39
n-9 ou (t>9
' Os ácidos graxos aqui mostrados estão em sua forma não-ionizada Entretanto, em pH 7. todos os ácidos graxos encontram-se ionizados nos grupos car-
boxita (COO-). Extraído e modificado de Lehninger et al. Principles of biochemistry. 2' ed. 1993. p.241.

dependendo de como cies são produzidos. Estudos rea¬ Na verdade, ela assemelha-se muito aos fosfoglicerídeos
lizados com lipossomos mostraram que membranas em suas propriedades gerais."11 A esfingomielina forma
exclusivamente lipídicas são impermeáveis ã maioria a bainha de mielina das células nervosas.
das moléculas polares. Elas bloqueiam também a passa¬ Os cerebrosideos não contêm fosfato nem pos¬
gem de moléculas apoiares grandes, ou seja, com alta suem carga elétrica, mas possuem em sua constituição
massa molecular (como carboidratos, aminoácidos e uma ou mais moléculas de carboidratos (são glicolipí-
nucleotideos) e moléculas com cargas elétricas (como dios). Os carboidratos substituintes podem ser a galac¬
íons).* Uma vez que as biomembranas são seletiva- tose (galactocerebrosídeos) ou glicose ( glicocerebrosí-
mentc permeáveis a esses diferentes tipos de moléculas, dco$). Eles ocorrem nas camadas nào-citosólicas de
fica evidente que outros de seus componentes, no caso algumas biomembranas.
as proteínas, promovem o transporte de substâncias Os gangliosideos são molélulas mais complexas.
que não as atravessam espontaneamente. Apresentam uma cabeça polar muito grande e com
Os esfmgolipidios também são componentes muitas moléculas de carboidrato em sua composi¬
das membranas, embora em menor quantidade. Esses ção." " Ocorrem em quantidades relevantes nas célu¬
compostos também são formados por uma cabeça po¬ las nervosas, onde atingem cerca de 6% do total de lipí¬
lar e duas caudas apoiares. A cabeça polar é constituída dios, e em quantidades menores nas membranas dos
pela esfingosina e por um álcool aminado. As caudas demais tipos celulares (Figura 5.3).
apoiares são constituídas por um ácido graxo e pela O colesterol é outra molécula que ocorre nas
porção hidrofóbica da própria esfingosina. Diferente¬ membranas biológicas de eucariontes. £ um esteróide
mente dos fosfoglicerídeos, os esfingolipídios não composto por quatro anéis fundidos derivado do ci¬
apresentam o glicerol. Há três subclasses de esfin¬ clo pentanoperidrofenantreno"*"" (Figura 5.3). O co¬
golipídios: as esfingoinielinas, os cerebrosideos e os lesterol está intimamente relacionado à fluidez das
gangliosfdeos (Figura 5.3). biomembranas, como será visto adiante." "
A esfingomielina contém um grupo fosfato e Fato interessante é que a composição lipídica das
também pode ser classificada como um fosfoglicerídeo. duas laces das membranas biológicas é bastante dife-
'

A Célula 77
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

h3c_ N'_
CH3

HC-OH

cfc3
Esfingosina Ceramida Esfíngomielina Glicocerebrosideo Gaiadocerebrosideo

COIESTEROL CICLOPENTANO PERIDROFENANTRENO

H3OCHrCHrCHrCHrCH2

Figura 5.3 Outros tipos de lipídios encontrados nas membranas biológicas. Os esfingolipidios sào compostos por uma cadeia de ácido graxo e uma ca¬
beça polar, que pode ou não apresentar um radical fosfato. A esfmgosina participa da composição tanto da cabeça polar como das caudas apoiares.
Os cerebrosideos apresentam um cartxxdrato. glicose ou galactose, na cabeça polar. Os gangtosideos possuem estrutura semelhante à dos cerebro-
sideos. ocorrendo porém um padrão de glxosilaçào mais complexo, com vários oligossacarideos. É mostrado também o colesterol, destacada a regi¬
ão da molécula que corresponde ao citíopentano peridrofenantreno.

78 A Célula
rendada. Diz-se então que as membranas são assimé¬ das membranas. Assim, a possibilidade de existirem
tricas. Normalmente, os lipídios fosfatidilcolina e esfin- proteínas semi-inseridas nas membranas biológicas é
gomielina estão localizados apenas na face externa das pequena.
membranas, enquanto a fosfatidilserina e a fosfatidile- Algumas proteínas intrínsecas apresentam uma
tanolamina estão situadas na face interna ou citoplas- única região que atravessa a bicamada. Essas proteínas
mática.M> Uma vez que a fosfatidilserina tem carga elé- são conhecidas como unipasso (Figura 5.4a). Outros
trica negativa, existe, portanto, uma significativa varia¬ tipos de proteínas possuem mais de um domínio trans¬
ção na distribuição de cargas elétricas entre as duas fa¬ membrana, sendo denominadas tnultipass<f':' (Figura
ces das membranas. 5.4b). Todas as proteínas transportadoras de membra¬
na, assim como os canais iónicos, são multipasso. No
Proteínas caso das proteínas que compõem os canais, várias das
Embora a estrutura básica de uma biomembrana seja porções que cruzam a fase lipidica apresentam aminoá¬
dada pela bicamada lipidica, a maioria de suas funções cidos hidrofilicos, que contribuem para a formação dos
especificas é realizada por proteínas.' Entre essas fun¬ canais iónicos.
ções, pode-se citar o transporte de Sons e moléculas Outros tipos de proteínas ligam-se à membrana
polares, interação com hormònios, transdução de sinais por interações fracas. Neste caso, as proteínas podem ser
por meio de membranas e até a estabilização estrutural. solubilizadas por procedimentos suaves, como exposi¬
Não é de se espantar, portanto, que a razão entre proteí¬ ção a soluções de força iônica elevada ou a variações de
nas e lipídios nas biomembranas varie de acordo com a pi I. Essas proteínas são conhecidas como proteínas peri¬
atividade funcional da mesma. Por exemplo, o teor de féricas ou extrínsecas.' Dessa forma, esse tipo de pro¬
1

proteínas presentes na bainha de mielina é cerca de 25% teína não interage diretamente com o interior hidrofó¬
do peso total, lá na membrana interna de mitocòndrias bico das biomembranas, ligando-se a elas por meio de
e de cloroplastos, elas correspondem a 75%. Na mem¬ ligações eletrostáticas ou de hidrogénio com outras pro¬
brana plasmática, a quantidade gira em torno de 50%."-' : teínas periféricas, com proteínas intrínsecas ou mesmo
As proteínas de membrana podem se associar a com os fosfolipídios (Figura 5.4c).
lipídios de diversas formas. Algumas proteínas intera¬ A hidrofobicidade de algumas proteínas nas
gem muito fortemente com as porções hidrofóbicas dos membranas e, portanto, sua capacidade de se associar a
lipídios de membrana. Essas proteínas só podem ser elas, pode ser aumentada pela ligação covalente de gru¬
extraídas com o uso de agentes que quebrem essas pamentos lipídicos. Esses grupamentos se inserem na
interações, solubilizando as membranas, como os deter¬ fase lipidica das membranas, estabilizando a associação
gentes. Essas proteínas são conhecidas como proteínas proteína-membrana." Outras proteínas localizadas no
intrínsecas: As proteínas intrínsecas estão inseridas na
1
citoplasma associam-se às membranas apenas por
bicamada lipidica c apresentam domínios citoplasmáti- meio de uma ou mais cadeias de ácidos graxos ou por
co, transmembrana e nào-citoplasmático. Os domínios outros tipos de lipídios covalcntemcnte ligados, deno¬
que passam pelo interior das membranas e que fazem minados genericamente grupos prenil (Figura 5.4d).
parte de um ambiente hidrofóbico possuem, em sua Existem ainda proteínas que se associam às membra¬
maioria, resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Uma nas na face extracelular por meio de âncoras, ligadas
vez que o ambiente ao redor da ligação peptidica é covalentemente a oligossacarideos e estes, por sua vez,
hidrofílico e que o interior da membrana é hidrofóbico, aos lipídios da bicamada. Essas proteínas interagem
há uma tendência geral de que os segmentos trans¬ com as membranas apenas por meio de âncoras degli-
membrana adotem uma estrutura em a-hélice, que cos ilfosfat idiilinositol (GPI)""6 (Figura 5.4e). Tais pro¬
comprometem estes mesmos grupos em ligações de teínas podem ser liberadas da membrana facilmente
hidrogénio."" Essa formação de ligações de hidrogénio por meio de fosfolipases, que clivam o fosfatidilinosi-
é maximizada quando a proteína forma uma a-hélice tol, liberando a proteína da membrana para o meio.
ao atravessar a membrana, o que de íãto ocorre na A forma como as proteínas se associam às mem¬
grande maioria das proteínas intrínsecas.M* A forte ten¬ branas normalmente reflete sua função. Por exemplo,
dência à formação de ligações de hidrogénio na ausên¬ somente proteínas intrínsecas podem exercer sua fun¬
cia de água também faz com que a cadeia polipeptídica ção cm ambos os lados da membrana. Exemplos de
que passa pelo interior da bicamada lipidica a atravesse proteínas com esse tipo de atividade sào os canais ióni¬
completamente antes que ocorra qualquer alteração no cos, proteínas transportadoras e receptores. Por outro
seu direcionamento, tais como dobras na cadeia protéi- lado, proteínas que sào funcionais apenas em uma das
ca. A existência de tais dobras requer a perda da regu¬ faces da membrana encontram-se associadas apenas
laridade das interações obtidas pelas ligações de nas regiões em que elas sào funcionais.
hidrogénio, o que, por sua vez, levaria à exposição de
radicais polares no ambiente hidrofóbico no interior

A Célula 79
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

Figura 5.4 Modelo da membrana plasmática


no qual podem ser vistas (em azul) as proteí¬
nas intrínsecas, que interagem com a bica-
mada lipidica. e (em laranja) as proteínas
periféricas. A face voltada para o meio extra¬
celular é ricamente glicosilada. formando
uma camada denominada revestimento
celular ou gbcocalíx. Pode-se observar tam¬
bém que as membranas biológicas apresen¬
tam uma distribuição diferencial de seus
componentes, sejam proteínas, lipídios ou
carboidratos Essa diferenciação estrutural
também se reflete em uma assimetria fun¬
cional desempenhada pelas diferentes
faces da membrana, a = proteínas unipas-
so: b = proteínas mulbpasso; c = proteínas
periféricas ou extrínsecas: d = proteínas
associadas por grupos premi; e = proteína
associada por meio de âncora de glicosíl-
fosfatHdilmositol (GPI).

No entanto, para que os carboidratos possam par¬


Girboidratos ticipar do reconhecimento molecular, é necessário que
Os carboidratos presentes nas biomembranas corres¬ existam componentes celulares capazes de reconhecê-los.
pondem às porções glicídicas de suas glicoproteínas, Isso é feito por meio de proteínas denominadas lectinas.
proteoglicanos e glicolipidios. Esses carboidratos são Essas proteínas são capazes de reconhecer e se ligar de
encontrados principalmente na face nâo-citoplasmática forma rápida, específica e reversível a carboidratos, não
das membranas. Assim, na membrana plasmática, os sendo nem enzimas, nem anticorpos. M* Existem lecti¬
carboidratos estão voltados para o meio extracelular, nas específicas para diferentes tipos de carboidratos. O
enquanto nas membranas das organelas citoplasmáti- grande número de lectinas identificadas (Tabela 5.2) e a
cas, eles estão voltados para o lúmen. Dentre os car¬ grande variabilidade em sua estrutura, propriedades e
boidratos presentes nas biomembranas, são encontra¬ distribuição refletem uma ampla gama de adaptações das
dos glicose, galactose, manose, fucose, N-acetilgalacto- lectinas aos mais diferentes fenómenos biológicos. "*
samina e ácido N-acetilneuramínico (ou ácido siálico). Alguns tipos de lectinas interagem preferencialmente
Os carboidratos são de grande importância para a com células tumorais, o que indica que essas células dife¬
fisiologia das biomembranas. Eles ocupam espaço rele¬ rem das células normais correspondentes quanto ao pa¬
vante da superfície das membranas. No caso da membra¬ drão de glicosilaçào específico da superfície celular. Além
na plasmática, os carboidratos presentes na superfície disso, a glicosilaçào das células tumorais é geralmente
celular compõem um tipo especial de camada, com cerca aumentada. Sabe-se que há um grande acúmulo de glico-
de 10 a 20 nm, conhecida como cobertura celular ou glico- esfingolipidios na membrana plasmática em vários tipos
cálix.™ Uma vez que os carboidratos carregados negativa¬ de tumores. Entretanto, não existe um padrão de glicosi¬
mente, em especial o ácido siálico, apresentam-se em laçào que seja específico das células transformadas. "
quantidades significativas, o glicocálix é,em grande parte, As lectinas estão relacionadas à i«iteração de
responsável pela carga clétrica negativa encontrada na vários tipos celulares em diferentes processos fisiológi¬
superfície da célula. cos que envolvem adesão célula-célula, como, por
A função mais importante dos carboidratos nas exemplo, na interaçáo do espermatozóide com o óvulo,
membranas é o reconhecimento molecular, o que permite na germinação do grão de pólen e sua interaçáo com o
também a comunicação intercelular. Enquanto os ami¬ estigma, na adesão de bactérias Rltizobium à superfície
noácidos nas proteínas ou os nucleotideos nos ácidos nu- radicular de leguminosas, na remoção de glicoproteí¬
cléicos formam um tipo de ligação,duas hexoses idênticas nas do plasma sanguíneo pelas células hepáticas, e
(como a glicose, por exemplo) podem interagir umas mesmo na resposta inflamatória." Nesta última, exis¬
com as outras em diversas posições." Dois monossaca- te a interaçáo entre as células do sistema imune e as cé¬
rideos podem se ligar e formar 11 dissacarídeos idênticos, lulas que compõem a parede dos vasos sanguíneos, as
enquanto 2 aminoácidos diferentes podem formar apenas células endoteliais. Isso é feito por um tipo especial de
um dipeptídeo. Esse grande potencial de diversidade proteínas denominadas sclectinas. Elas são proteínas de
estrutural faz com que os carboidratos tenham uma ele¬ adesão celular que promovem, em sua grande maioria,
vada capacidade informacional. interações do tipo célula-célula. Na extremidade ex-

80 A Célula
Tabela 5.2 Algumas leclinas. suas fontes e os açúcares com os quais elas estabelecem interaçòes especificas.

Lectinas Organismo de origem Açúcar especifico

Con A Canavalia
..... ensiformis u-D-manose e a-D-gl.cose
[ÿ " ——
ÿÿÿ 1

Lensculmans
A í*
a-D-manose
*

LCA |
PSA p ÿ
Pisum sativum a-D-manose e a-D-gficose
UEA-I Ulex europaeus a-L-fucose
f

LTA Lotus tetragonolobus 1


a-L-fucose
OFA Aleuria aurantia a-L-fucose
1
LPA Limulus potypbemus
.......
ácido siálico
| 1. 1. ÿ ÿ ÿ

LFA [
Umax flavus ácido siálico
WGA >
Tritucum vulgare N-acetilglicosamina e ácido siálico
DBA Dolichos biflorus a-D-galactose e N-acetitglicosamina
RCA Ricinus communis a-D-galactose
SBA Glycine max a-D-galactose e N-acetilglicosamina
HPA Helix pomatia N-acetilgalactosamina
BPA Bauhinia purpurea N-acetilgaiactosamina_
N-acetilgalactosamina_
[ ÿ ÿ 1 i
ÿ
i 1

PHA Phaseolus vulgaris


SJA Sophora japontca N-acetilgalactosamina
) ÿ
~ *ÿ" * ÿ
• *

MPA Madura pomifera a-D-galactose


Li.
|
- --— -- --— -------
ÿ ÿ

-— -- — — .ih
ÿ ÿ

-
GSA-I Gliffonia simphcifolia a-D-galactose
I
G9A-II
UOA*ll ftdffnniâ çi(ní\lic(f(\liA
\jlillK/n(a O"
Hf/»W/v/i'Cf
N.arpJilnltfwcanvna
iN*occuiyitCvoouiiuo

PNA
f
Arachis
. hypogaea
..... ÿ ÿ 11
Galactosil. Galbl — 3NAcGal D-galactose
JCA Arihocarpus integrifolia a-D-galactose e N-acetilgalactosamina
[
Trifoliina Trifolium repens 2-desoxiglicose
Fimbrilina E. coli (fímbrias) j
Tipo 1 Ligomanose
TipoP Galai Gal
TipoS
Tipo 2
AcNeu «2
Galpl -»ÿ 3N-AcGal
3 Gal
_
Entamoeba histolytica Gaipi 4N-AcGlic
Disooidnas 1 e II Dictyostetium discoideum Galactose. N-acetilgalactosamina
Virus da influenza AcNeu a2 — 6 Gal e AcNeu a2 — 3 Gal
r
--------
RL-14. 5; Rl-18ÿRl-29 Rato (pulmão)
ÿ ÿ «

frflalactosMeos _
HL-14; HL-22; HL29 Homem (pulmão) (i-galactosídeos

Modificada de Carvalho (Cȏncia e Cultura 1990; 41: 885).

A Célula 81
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

tracclular dessas proteínas, existe um domínio estrutu¬ hemácias do tipo B, nas quais o açúcar terminal que lhe
ral semelhante ao encontrado nas lectinas, que reconhe¬ confere antigenicidade c1 uma galactose. Os indivíduos
ce os carboidratos presentes na superfície de outros ti¬ que apresentam o sangue tipo AB possuem ambas essas
pos celulares. sequências antigénicas. Esses antígenos, por tornarem os
Outra atividade biológica importante desempe¬ eritrócitos susceptíveis à aglutinação, são conhecidos
nhada pelos açúcares de superfície celular c a especifica¬ como aglulinogênios. Quando o aglutinogênio A não
ção dos grupos sanguíneos do sistema ABO. Os grupos está presente nos eritrócitos do indivíduo, desenvolvem -se
sanguíneos humanos são determinados em parte por no seu plasma anticorpos específicos contra eles, as
uma sequência de oligossacarideos presentes nos esfin- aglutininas anti-A. Do mesmo modo, quando o agluti¬
golipídios da membrana plasmática dos eritrócitos. To¬ nogênio B não está presente, desenvolvem-se aglutininas
dos os tipos sanguíneos do sistema ABO apresentam anti-Ii.:'Q indivíduo tipo O, por não apresentar antíge¬
uma sequência básica composta por glicose, galactose, nos de nenhum tipo, desenvolve ambas as aglutininas,
N-acetilgalactosamina, galactose e fucose* (Figura 5.5). enquanto as pessoas com o tipo AB não desenvolvem
No caso das hemácias do tipo A, existe ainda uma N- aglutinina alguma. Sendo assim, os indivíduos do tipo
acetilgalactosamina terminal, que confere antigcnicida- O, por não apresentarem antígenos, são doadores uni¬
de á sequência glicosídica. O mesmo ocorre com as versais. No entanto, podem receber sangue apenas de

Tipo sanguíneo Sequência Antigeno Aglutinina


(eritrócito) otígossacahdea (aglutinógeno) (plasma)

Anti-A e
Anti-B

GaINac

Figura 5.5 Especificação dos grupos sanguineos do sstema ABO por açúcares de superfioe celular. Neste sistema, os entróotos apresentam uma sequên¬
cia oligossacaridica composta por Gic. Gal. GaINac. Gal e Fuc. No caso do tipo A. existe uma GaINac terminal, que confere antigenicidade à seqúénoa. 0
mesmo ocorre com as hemácias do tipo B. só que nesse caso o açúcar terminal é uma Gal. Os indivíduos que apresentam o sangue tipo AB possuem
ambos os antígenos. No caso de uma transfusão, esses antígenos tornam as hemáoas susceptíveis à aglutinação, sendo, por isso. conhecidos como
aglutmogênios. As aglutininas. anticorpos específicos contra eles. podem estar presentes no plasma do indivíduo receptor.

82 A Célula
indivíduos com o mesmo tipo sanguíneo, pois apresen¬ dos ácidos graxos é a temperatura em que a molécula
tam aglutininas anti-A e anti-B. O oposto ocorre com os passa do estado gel para um estado líquido-cristalino
indivíduos com o tipo AB. Kssas pessoas podem ser (ver ponto de fusão dos ácidos graxos na Tabela 5. 1). Em
receptoras de qualquer tipo de sangue, são os receptores uma biomembrana no estado gel, os fosfolipídios estão
universais; no entanto, podem doar sangue somente completamente estendidos e alinhados, agrupando-se
para pessoas do tipo AB. de forma bastante fechada e perpendicular ao plano da
bicamada. A movimentação dos lipídios, nesse caso, fica
bastante restrita, o que torna a membrana bastante rígi¬
da, compacta e impermeável. For outro lado, o estado
Aspectos funcionais líquido-cristalino é caracterizado por uma intensa
Fluidez das membranas movimentação dos ácidos graxos, o que representa uma
Dada a ausência de ligações químicas entre os diferentes maior fluidez e maior permeabilidade.* ' '
componentes das biomembranas, eles possuem relativa • Presença de moléculas interpostas: a presença
liberdade com respeito aos adjacentes e são livres para se de moléculas entre os fosfolipídios, como o colesterol, é
mover no plano da bicamada. A fluidez é a capacidade capaz de interferir na fluidez, pois altera o grau de com¬
de movimentação dos diferentes componentes na bica¬ pactação normal dos ácidos graxos e dificulta a movi¬
mada lipídica. Essa movimentação é intensa. Estima-se mentação destes no plano da bicamada. O colesterol
que os lipídios se movimentem cerca de 10 vezes por quebra a estrutura altamente ordenada das cadeias dos
segundo, ou seja, aproximadamente 10 cm/segundo. ácidos graxos. Assim, em uma dada temperatura, por
Isso quer dizer que uma molécula de lipídio se difunde impedir a aproximação e a associação lateral, o coleste¬
por cerca de 2 pm em aproximadamente Isegundo, per¬ rol mantém as cadeias de hidrocarbonetos dos fosfoli¬
correndo o comprimento médio de uma bactéria." A pídios em um estado fluido intermediário entre o gel e
movimentação dos lipídios pode ser difusão lateral, em o liquido-cristalino.*,0,,>
rotação ou constituir-se em uma flexão com respeito ao • Dieta alimentar: outro fator que pode interfe¬
seu próprio eixo.Pode existir também a movimentação de rir na composição lipídica das membranas celulares e,
lipídios de uma camada da membrana para a outra. Esse como consequência, na sua fluidez, é a dieta. Os lipídios
movimento é denominado difusão transversal ou flip- obtidos via cadeia alimentar, entre eles ácidos graxos
flop. Embora esse tipo de movimentação possa ocorrer,ele saturados, insaturados, poliinsaturados e o próprio co¬
é bastante raro.*'' Entretanto, o flip-flop pode ser facilita¬ lesterol, são incorporados às membranas. Desta forma, a
do por enzimas translocadorasde fosfolipídios denomina¬ dieta observada em uma dada população, seja animal ou
das )lipases.A açào dessasenzimas é importante no retícu¬ humana, é capaz de interferir de forma bastante acentu¬
lo endoplasmático, onde os fosfolipídios são sintetizados e ada na fisiologia das membranas biológicas.
adicionados à membrana (ver Capitulo 12).
A movimentação dos lipídios é de extrema impor¬
tância. Além de diminuir a rigidez das membranas bioló¬
gicas, ela permite a difusão dos seus diferentes constituin¬ Modulando a composição
tes. Na verdade, a maior parte dos fenómenos associados
e fluidez das membranas
à fisiologia das membranas,entre eles a atividade enzimᬠApesar de todos esses fatores, existe uma certa capacidade
tica e o transporte de solutos, é profundamente afetada dos seres vivos em alterar suas membranas, de modo a se
pela fluidez."-*'5 A fluidez é uma característica dada pela adaptarem a variações ambientais. Normalmente os
composição lipídica. Dentre os fatores que podem inter¬ níveis de ácidos graxos com ponto de fusão menor estão
ferir na fluidez estão ( 1) a presença ou não de ins,itura¬ aumentados nas membranas de animais que vivem em
ções nas cadeias dos ácidos graxos, (2) a temperatura regiões em que a temperatura é mais baixa,enquanto nas
ambiental, (3) a presença de moléculas interpostas na membranas de animais que habitam em temperaturas
bicamada lipídica, e (4) a própria dieta alimentar. mais elevadas são encontrados ácidos graxos com ponto
• Presença de insaturações: as cadeias carbónicas de fusão mais alto. Por outro lado, seres que vivem em
dos ácidos graxos podem ser saturadas ou insaturadas. regiões em que existe uma acentuada variação térmica,
As insaturações fazem com que os ácidos graxos ocupem principalmente microrganismos ciliados, algas e mesmo
um maior espaço no plano da membrana,possibilitando peixes e mamíferos, são capazes de alterar a composição
assim uma maior movimentação dos lipídios e conse¬ de ácidos graxos nas membranas de suas células, de forma
quentemente das proteínas.' "" a manté-las dentro de certos limites funcionais. Assim,
• Temperatura: a temperatura interfere na fluidez quando a temperatura ambiental diminui, são incorpora¬
ilas membranas porque os ácidos graxos que as compõ¬ dos ácidos graxos com ponto de fusão menor e quando a
em apresentam um determinado ponto de fusão e, con¬ temperatura se eleva, ácidos graxos com ponto de fusão
sequentemente, uma transição de fase. O ponto de fusão maior são introduzidos. No entanto, essa capacidade de

A Célula 83
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

modular a composição das biomcnibranas é, normal¬ Assim, em uma dada temperatura, os estágios li-
mente, limitada. quido-cristalino e líquido-ordenado podem coexistir, su¬
Embora a fluidez das membranas seja uma pro¬ gerindo que a separação física de domínios com fosfo¬
priedade determinada pelos lipídios,as proteínas presentes lipídios e esfingolipídos/colesterol possa ocorrer se estes
na membrana também estão sujeitas a ela. A fluidez da últimos estiverem em quantidades relevantes nas mem¬
camada lipídica permite o deslocamento lateral de, virtual¬ branas.' Essa teoria é apoiada pelo fato de que mem¬
mente, todas as proteínas inseridas nas membranas, exceto branas sintéticas também são capazes de gerar domínios
aquelas que apresentam algum tipo de interaçáo estável e diferenciados de lipídios em sua estrutura." A segregação
consequentemente as mantenham fixas em um determina¬ tie proteínas nesses domínios nas biomembranas poderia
do ponto nas membranas. Essas interações podem ser esta¬ se dar por meio de afinidade molecular. Por exemplo,
belecidas com componentes do ambiente extracelular, proteínas inseridas nas membranas por meio de âncoras
como, por exemplo, a matriz extracelular, ou do meio cito- de GPI, por possuírem cadeias acil saturadas, portanto
plasmático, com os componentes do citoesqueleto.' com um ponto de fusão mais elevado, podem ter prefe¬
rência por um ambiente líquido-ordenado. Desta forma,
poderiam ser estabelecidos domínios nas membranas
Domínios de membranas compostos não apenas de lipídios, mas também por
determinadas proteínas.
Apesar da fluidez das membranas, muitos tipos celulares
são capazes de segregar determinados tipos de lipídios e
proteínas em regiões específicas nas bicamadas. Essas Receptores
regiões são denominadas domínios de membranas. A
separação tanto de lipídios como de proteínas pode ser A habilidade da célula de responder a sinais ambientais
feita por meio de barreiras fisicas, como alguns tipos de é de crucial importância para seu destino. A sinalização
junções celulares denominadas junções de oclusão, as celular é feita por grande variedade de moléculas, que
quais não permitem a difusão lateral dos lipídios ou pro¬ são denominadas genericamente como ligantes. Alguns
teínas pelo plano da membrana*1' (ver Capítulo 6). desses ligantes são moléculas lipossolúveis e, portanto,
Contudo, existem células que podem criar domínios de atravessam as membranas e se ligam a receptores cito-
membrana sem o uso de junções celulares ou quaisquer plasmáticos ou nucleares, como por exemplo os hor-
outros tipos de barreiras fisicas conhecidas. Os esperma¬ mônios esteróides. Outros tipos de ligantes, como poli-
tozóides de mamíferos, por exemplo, conseguem segre¬ peptídeos e pequenas moléculas polares, não são capa¬
gar antígenos de superfície celular diferentes ao longo da zes de atravessar diretamente a bicamada lipídica. Essas
membrana que delimita a cabeça e a cauda.* moléculas necessitam então interagir com proteínas
A forma como a célula consegue segregar os lipí¬ presentes nas biomembranas. Essas proteínas especiali¬
dios cm porções específicas das membranas ainda pre¬ zadas, que reconhecem ligantes de forma específica, são
cisa ser esclarecida. Uma teoria seria a distribuição não denominadas receptores. Uma vez que os receptores de
aleatória destes lipídios nas bicamadas. Como foi dito, membrana são proteínas intrínsecas, eles apresentam
as membranas são compostas por fosfolipídios.esfingo- três domínios estruturais distintos: um domínio extra¬
lipídios e colesterol.Todos esses componentes apresen¬ celular, capaz de reconhecer os diferentes ligantes, um
tam um determinado ponto de fusão. Acima desse domínio transmembranário, composto por aminoáci¬
ponto, os lipídios encontram-se em um estado líquido- dos hidrofóbicos, e um domínio citoplasmático, que
cristalino, ou seja, um estado fluido. Abaixo dele, os lipí¬ executa uma função sinalizadora para o interior celular,
dios estão no estado gel, ou seja, um estado rígido que liberando segundo-mensageiros. Por outro lado, os
não permite a sua movimentação/0 Os fosfolipídios, em receptores presentes nas membranas das organelas
decorrência de suas cadeias insaturadas de ácidos gra- celulares possuem um domínio citoplasmático, um
xos, geralmente apresentam um ponto de fusão mais domínio que atravessa a membrana e um domínio vol¬
baixo, enquanto os esfingolipidios e o colesterol possu¬ tado para a luz da organela.*-1,
em um ponto de fusão mais alto. Essa disparidade suge¬ Basicamente, os receptores presentes na superfície
re que possa haver a separação de fases desses lipídios celular possibilitam que as células respondam aos estímu¬
em dois fluidos distintos. Nesse caso, em consequência los externos de quatro formas básicas (Figura 5.6):
da temperatura e do ponto de fusão, pode ser gerado cm 1. O sinal é transmitido por meio de alterações na
alguns lipídios um estado com propriedades intermediárias atividade funcional do domínio citoplasmático dos recep¬
entre as fases líquida-cristalina e a gel, denominado estado tores, de modo a gerar reaçóes intracelulares em cascata
liquido-ordenado. Neste estado, os lipídios se disporiam de que culminam por alterar o comportamento celular. Isso
uma forma ordenada, semelhante à fase gel, mas com ocorre, por exemplo,quando a célula interage com hor-
mobilidade menor que na fase líquida-cristalina. niònios ou fatores de crescimento" :u (Figura 5.6a).

84 A Célula
2. 0 receptor interage com o ligante de modo a ini¬ rem dos demais por se ligarem a seus respectivos ligantes
ciar um processo de internalização do mesmo por meio por interações de afinidade relativamente baixa. Além
do estrangulamento da membrana e formação de uma disso, estão presentes em quantidades bem maiores que
vesícula.* ' Isso ocorre, por exemplo, durante a endocito- os demais tipos de receptores da superfície celular (cerca
se mediada por sinal (ver Capitulo 14) (Figura 5.6b). de 10 a KM) vezes mais).*" '
3. Ao interagir com seu receptor, o ligante é trans¬ grande variabilidade funcional desempenhada
A
ferido para o interior da célula. Isso ocorre no transpor¬ pelas diferentes membranas biológicas é reflexo da gran¬
te de vários tipos de moléculas, pelas membranas, prin¬ de diferenciação estrutural e funcional de proteínas
cipalmente ions'-" (Figura 5.6c). receptoras nelas presentes. São essas proteínas que possi¬
4. O receptor interage de forma estável com o li¬ bilitam à célula interagir com o meio extracelular, parti¬
gante. o que normalmente induz alterações no arranjo cipar de processos de migração celular, interpretar sinais
do citoesqueleto. Esse tipo de interação ocorre nos pro¬ vindos do ambiente, que induzem alterações fisiológicas
cessos de adesão célula-célula ou célula-matriz extra¬ ou no padrão de diferenciação das próprias células, e até
ocular"*» (Figura 5.6d). fazem com que moléculas sejam englobadas pelas mem¬
A afinidade entre os diferentes receptores e seus branas, influenciando de forma significativa no balanço
ligantes varia enormemente. A maioria das moléculas iònico de algumas células.
sinalizadoras, como os hormônios e fatores de cresci¬
mento, apresenta-se em concentrações muito baixas.
Dessa forma, os receptores presentes nas membranas Permeabilidade
apresentam uma afinidade alta em relação a eles.' For
outro lado, os componentes da matriz extracelular, uma Se analisarmos a permeabilidade de membranas lipídicas
rede composta por macromoléculas, são extremamente sintéticas, veremos que elas bloqueiam a passagem da
abundantes. Assim, seus receptores, as integrinas,dife¬ maioria das moléculas polares, de moléculas apoiares

Meio extracelular
Ligantes

Meio intracelular

\ I I I Matriz
extraocular
Meio extracelular
b) c)

Vinculma

actinma

Figura 5.6 Diversidade funcional dos receptores pre¬


sentes nas membranas, a. A interação ligante-receptor
desencadeia um sinal, que é transmitido por meio de
uma cascata de reações intracelulares, b. 0 receptor
interage com o ligante de modo a interiorizá-lo. por
meio de uma invaginação de membrana e formação de
uma vesícula, c. 0 ligante interage com o receptor e é
fisicamente transportado através dele. d 0 receptor
interage de forma estável com o ligante. o que leva a
alterações no arranjo do citoesqueleto.

A Célula 85
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

grandes (de alta massa molecular) ou moléculas car¬ O transporte mediado por proteínas nas mem¬
regadas eletricamente. l-ssa barreira é de crucial impor¬ branas pode ser feito de trés formas diferentes:
tância, pois permite à célula manter diferentes concen¬ • Uniportc: quando uma única molécula é trans¬
trações de solutos no citoplasma em relação ao fluido portada unidirecionalmente através da membrana;
extracelular. • Simporte: quando duas moléculas são trans¬
As biomembranas permitem a passagem não portadas simultaneamente em uma mesma direção;
apenas de pequenas moléculas, mas também de molé¬ • Antiporte: quando duas moléculas são trans¬
culas polares, como açúcares, aminoácidos, nucleoti- portadas, simultaneamente, cm direçòes opostas* '
deos e metabólitos. Esse transporte pelas suas membra¬ (Figura 5.8).
nas é feito por proteínas transportadoras de membrana, O transporte através das biomembranas ocorre
que atravessam a bicamada lipídica, formando uma via por dois mecanismos básicos. For difusão (transporte
para a passagem de diferentes moléculas. A importância passivo) ou por transporte ativo. A difusão é caracteri¬
do transporte mediado por proteínas é demonstrada zada por não existir gasto energético durante o trans¬
pelo fato de que cerca de 20% dos genes conhecidos de porte. Ela pode se dar por difusão simples ou por difu¬
/:. colisão associados a processos de transporte.* Surpre¬ são facilitada. O transporte ativo é caracterizado basica¬
endentemente, a água, embora seja uma molécula mente por envolver gasto energético (Figura 5.8). Veja¬
polar, é pequena o bastante para conseguir passar entre mos agora as principais formas de transporte através
os fosfolipidios, garantindo livre passagem. M
das biomembranas.
As proteínas são capazes de exercer suas atividades • Difusão simples: ocorre a favor de um gradiente
de diferentes maneiras. Algumas delas apresentam espa¬ de concentração de soluto, até que seja atingido o equilí¬
ços hidrofilicos, criando canais para o deslocamento de brio entre os dois compartimentos. A velocidade da di¬
certos ions ou moléculas. Essas estruturas são denomina¬ fusão depende da solubilidade dos solutos em relação aos
das proteínas canais. Nesses canais protéicos, não ocorre lipídios e do tamanho das moléculas. Quanto maior a so¬
ligação do soluto com as proteínas que os compõem." O lubilidade das moléculas nas membranas, maior será a
transporte, neste caso, tende a ser relativamente rápido, permeabilidade e mais rápido o transporte dessas molé¬
sendo dirctamentc proporcional â concentração do solu¬ culas (Figura 5.7). For exemplo, as solubilidades do oxi¬
to (Figura 5.7). Outros tipos protéicos presentes na mem¬ génio e do nitrogénio são extremamente altas. Desse mo¬
brana interagem com as moléculas solúveis, de modo a do, esses compostos se deslocam pelas membranas como
ocorrer alterações estruturais na proteína. Essas alterações se elas não representassem qualquer barreira. Moléculas
permitem o deslocamento dos solutos através da bio- com a mesma solubilidade terão como fator limitante ao
membrana. As proteínas que funcionam dessa maneira transporte o seu tamanho. As que forem menores per¬
sào denominadas proteínas carrcadoras ou permeases." t meiam mais facilmente pelas membranas.* '
importante ressaltar que, embora a velocidade de trans¬ • Difusão por canais protéicos: os canais protéicos
porte aumente â medida que aumenta a concentração do constituem vias aquosas para a passagem de solutos.
soluto, a translocaçáo de moléculas por meio de carreado- Esses canais são altamente seletivos à passagem de ions
res tende a ser mais rápida que nos canais protéicos. O ou moléculas. Essa seletividade é consequência das pró¬
transporte mediado por carreadores apresenta, contudo, prias características dos canais, como o seu diâmetro e
uma velocidade máxima de transporte (Figura 5.7). Esse a disposição de cargas elétricas ao longo deste. Os canais
ponto de saturação é atingido quando todos os carreado¬ de sódio, por exemplo, apresentam diâmetro entre 0,3 e
res presentes na membrana estão trabalhando em veloci¬ 0,5 nm e são ricos em cargas negativas. Essas cargas
dade máxima."""* atraem os ions Na' em maior quantidade que outros

o. Vmáx. Figura 5.7 Comparação entre o transporte por difusão simples


</> Transporte medado por
c
CO z' / carreadores e o dependente de carreadores. No mecanismo de difusão sim¬
ples ou med-ado por canais lòrucos, pode ser observado que. á
1/2 Vmáx.
/ /
/ /
Difusão Facatada ou
Transporte Ativo medida que a concentração de solutos aumenta, a velocidade
o
"O Difusão simples de transporte aumenta proporcionalmente. Já nas formas de
// / ou mediada por transporte que envolvem a atrvdade de proteínas carreadoras,
•§ // canau protéicos como na difusão facetada ou no transporte ativo. observa-se
• que. com o aumento da concentração de solutos, a velocidade
de transporte aumenta somente até o ponto de saturação
(Vmáx.). Neste ponto, todos os carreadores presentes na mem¬
Km brana estão participando no transporte da substância em ques¬
tão. A concentração do soluto, na qual o transporte atinge meta¬
Concentração de moléculas transportadas de de seu valor máximo, aproxima-se à constante de hgação
(Km) do carreador pelo soluto.

86 A Célula
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D)-* < i-
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H|ADP ÿ P |
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(Canal aberto) (Canal fechado)

[Transporte por canais protétcos Transporte por carreadores |[ÿ


TRANSPORTE PASSIVO TRANSPORTE ATIVO

Figura 5.8 Mecanismos de transporte através da txomembranas. Em a ó mostrado um tipo de difusão simples no qual ocorre o
deslocamento de uma molécula (UNIPORTE) por meiode um canal proteico. Os canais protércos nas membranas biológicas podem
ser encontrados abertos ou fechados. Em b é mostrado um carreador de membrana, promovendo o transporte unidireconal de
moléculas diferentes através da membrana (SIMPORTE). Em c observa-se uma forma de transporte ativo através da membrana.
Nesse caso existe o transporte bidirecional de moléculas (ANTIPORTE). envolvendo o gasto de energia quimica na forma de ATP.
compostos, pois a relação entre a força de atraçào e o vado, embora a concentração do soluto possa aumentar
diâmetro iònico é maior para o sódio que para outros (Figura 5.8). Apesar da difusão facilitada proporcionar
íons/' Já os canais de potássio nào apresentam cargas um descolamento mais rápido que as outras formas
elétricas, de modo que não exercem atraçào molecular. passivas de transporte, ela é incapaz de carrear molécu¬
Uma vez que o íon Na' é menor que o K , sua densida¬ las pelas membranas contra um gradiente de concen¬
de de carga e seu campo elétrico são mais fortes. Assim, tração. "" A distribuição de Na* e K', por exemplo,
a forma hidratada do Na é maior em diâmetro que o depende de transporte ativo, que consome 25% da
K .Como consequência, os ions potássio hidratados são energia da maioria das células e até 60% da energia de
menores e arrastam uma menor quantidade de água. células excitáveis,como neurónios.
Desta forma, eles passam por seus canais, enquanto os • Transporte ativo: esse transporte é feito às custas
ions sódio hidratados sào retidos cm decorrência de de gasto energético. Ele é mediado por proteínas carrea-
suas dimensões." ' Os canais proteicos nem sempre doras, da mesma forma que na difusão facilitada. No
estão abertos. Existe um sistema de fechamento, seme¬ entanto, no transporte ativo o carreador consome energia
lhante a comportas, que os obstruem. Esse sistema de química (ATP) para promover o transporte de moléculas
fechamento representa um mecanismo fisiológico que contra gradientes de concentração ou eletroquímico. O
permite o controle da permeabilidade das biomembra- exemplo mais comum de transporte ativo é a bomba de
nas. Esses canais podem ser abertos por ( 1 ) potenciais sódio e potássio, mediada pelo carreador Na'/K'-
elêt ricos gerados nas membranas ou (2) por interações ATPase." Esse mecanismo transporta ions Na' do interior
com outros tipos moleculares, como hormônios ou da célula para fora e ions K doambiente extracelular para
neurotransmissores." o citoplasma. Embora o Na'/K -ATPase seja o exemplo
• Difusãofacilitado: um grande número de com¬ mais conhecido de transporte ativo, ele nào é o único que
ponentes, como açúcares e aminoácidos, atravessam as ocorre na célula. A bomba de Ca é um carreador encon¬
biomembranas com uma taxa maior do que a esperada trado na membrana plasmática e em endomembranas,
em relação ao seu tamanho, carga elétrica ou concen¬ como as mitocondriais e do retículo sarcoplasmático (o
tração. Esses compostos são translocados para o inte¬ retículo endoplasmático das células musculares)." Esse car¬
rior da célula por meio da difusão facilitada. Esta últi¬ reador, como o próprio nome sugere, promove o transpor¬
ma é uma forma passiva de transporte mediada por car¬ te de Ca*\ Outro carreador que trabalha mediante gasto
readores que apresentam especificidade para os solutos energético é a bomba de II,presente nas membranas lisos-
presentes no meio extracelular; entretanto, por se tratar somais.'s Assim como no caso da difusão facilitada, o
de um transporte mediado por proteínas de membrana, transporte ativo também apresenta um ponto de satura¬
ela apresenta um limite de saturação. Acima desse pon¬ ção, que é atingido quando todos os carreadores de mem¬
to, o aumento na taxa de transporte nào é mais obser¬ brana estão trabalhando em atividade máxima (Figura

A Célula 87
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

5.7). O transporte ativo é de extrema importância para a teína intrínseca de membrana denominada CFTR (cystic
fisiologia da célula, embora seja bastante dispendioso em fibrosis transmembrane conductance regulator). ' O defei¬
termos energéticos. Uma boa parte da energia celular é tomais comum nessa doença, e que ocorre em cerca de
gasta em processos dessa natureza.* 70% dos casos, é a deleção da fenilalanina da posição 508
O transporte através de membranas é bastante Tabela 5.3 Algumas doenças resultantes de alterações nas funções das
complexo. Uma mesma molécula pode ser carreada biomembranas.
por diferentes maneiras para o meio intracelular. Por
exemplo, a maior parte das células animais absorve gli¬ Alteração existente Doença
cose do meio extracelular, na qual sua concentração é Canais proteicos
mais elevada em relação ao citoplasma, por meio de Canais de cloreto Fibrose cística
difusão facilitada mediada por carreadores que operam
Miotonia conqènita
em sistema uniporte. Por outro lado, células presentes
no intestino e nos rins são capazes de captar glicose da Desordens tubulares renais
ÿ ÿ!ÿ»ÿ«»ÿ '
ÿ 1 1
I.1 ÿ

luz intestinal ou dos lóbulos renais, respectivamente, Síndrome de Bartter


|
onde a concentração deste açúcar é muito baixa. Essas Nefrolitiase hipercalciúrica
células são capazes de transportar ativamente a glicose
através da membrana plasmática por um processo sim- Canais de sódio
porte em conjunto com os tons sódio.'
1
Paralisia periódica hipoquatêmica
Paramiotoma congénita
Hipertermia maligna
Aspectos patológicos Canais de cálcio
Uma vez que a estrutura das biomembranas está inti¬ Paralisia periódica hipoquatêmica
mamente ligada com a fisiologia celular, fica evidente Hipertermia maligna
que alterações em sua composição e estrutura levam a
diferentes tipos de patologias." As células tumorals, por Síndrome miastèmica de Lambert-Eaton
exemplo, apresentam alterações na composição lipidica Canais de potássio
e nos tipos de carboidratos presentes na superfície celu¬ Neuromiotomia
lar, além de possuírem proteínas de membranas com | ......
* ..
Síndrome de Bartter
atividade alterada.' " No entanto, abordaremos a seguir 1

algumas alterações que levam a situações patológicas Epilepsia neonatal benigna


cuja causa básica reside em alterações acentuadas ou Proteínas estrutu¬
mesmo na perda da funcionalidade das membranas rais de membrana
biológicas. Distrofina Distrofia muscular de Duchenne
A fibrose eístiai é uma doença autossômica recessi¬
|

PMP22 Neuropatia tomaculosa*


va que afeta uma em cada 2.000 crianças, ocorrendo pre¬
dominantemente em populações caucasianas.' A pato- PLP Doença de Pilizaeus Merzbercher"
génese tia doença é causada por duas anormalidades bas¬
tante características: ( I) composição iónica anormal no Citocromos
produto secretado por glândulas exócrinas e (2) compor¬ Citocromo oxidase Miopatia infantil fatal
tamento fisico-químico alterado do muco nos duetos (Síndrome de Toni-Fanconi-Debre)
exócrinos e/ou cavidades corporais. Isso leva à desidrata¬
Miopatia mitocondrial infantil benigna
ção e morte das células epiteliais. As alterações encontra¬
das no muco fazem com que este se apresente muito vis¬ Esclerose polidistrófica
coso, túrbido e se precipite, obstruindo os duetos ou progressiva da infância
cavidades corporais, o que leva â doença pulmonar obs¬ Síndrome de Leigh
trutiva crónica, â insuficiência pancreática, à obstrução
intestinal, â cirrose hepática e a outras complicações. Receptores de
membrana
Alterações patológicas incluem atrofia, dilatação, obstru¬
ção, inflamação e destruição tecidual, além da formação Receptor para Não-tolerància alcoólica (em ratos)
de tecido cicatricial fibroso." Na maior parte dos casos, i
Epilepsia
...
noturna do lobo frontal
w

cerca de 90%, a fibrose cística está associada à infecção Receptores neurais Esquizofrenia
por Pseudonionas aeruginosa, que é a causa mais comum nicotínicos
de morte associada â doença. O gene responsável por essa
ÿ

• Neuropatias desmielimzantes hereditárias.


doença, localizado no cromossomo 7, codifica uma pro¬

88 A Célula
Especializações de membrana
Microvilosidades
As microvilosidades são especializações digiliformes da membrana plasmá¬
tica responsáveis pela ampliação da superfície celular visando trocas entre a
célula e O meio. Essas estruturas estão especialmente presentes nas células
absortivas, como as células epiteliais intestinais (Figura I) ou dos túbulos proxi-
mais dos rins. Estruturalmente, as microvilosidades assemelham-se a um cilin¬
dro recoberto pela membrana plasmática. Um feixe de filamentos tie act ina
(Figura 2 - seta) constitui o cerne da microvilosidade, dando-lhe o formato
característico. Os fílamentos de actina extendem-se em direção ao citoplas¬
ma e conectam-se a uma rede de filamentos de actina que constituem a
trama terminal (Figura 1 - seta). Recobrindo externamente a vilosidade,
existe um glicocálix desenvolvido, principalmente no intestino. O tamanho
c a densidade das microvilosidades varia conforme o tipo celular. (Figura 2 -
cortesia de Paulo 1*. Joazeiro)

Estereocílios
A semelhança das microvilosidades, os estereocílios também têm importân¬
cia no aumento da superfície de trocas entre a célula e o meio que a circun¬
da. Os estereocílios são mais longos e mais finos que as microvilosidades e
não apresentam o feixe de actina característico destas últimas. No epidídimo
(Figura 3), os estereocílios (pontas de seta) estão envolvidos com a modifi¬
cação da composição do liquido em que ficam imersos os espermatozóides
(seta) durante a sua capacitação.

Bainha de mielina
-
A bainha de mielina corresponde a expansões da membrana plasmática das células de Schwann (Figura 4 Sch),
que se enrolam ao redor de alguns tipos de axônios (Ax). A função principal da bainha de mielina é garantir um
isolamento elétrico do axÔnio. que contribui para aumentar a velocidade de propagação do impulso nervoso.
Entre uma célula de Schwann e outra há uma descontinuidade da bainha de mielina (conhecida como nódulo de
Ranvier). O empacotamento das membranas é bemestreito e a extensão bastante longa, de forma que a passagem
de nutrientes ocorre através de junções comunicantes que aparecem nos níveis das incisuras de Schmidt-
Lantermann. (Figura 4 - cortesia de Luciano Queiroz)
N » vyi ÿ > m:

A Célula 89
Capitulo 5 BIOMEMBRANAS

da proteína. Além dessa mutação, mais de outros 500 11. Thompson TE, Huang C. Composition and dynamics of
tipos diferentes têm sido identificados. A função normal lipids in biomcmbrancs. In: Andreoli TE, Hoffman JF,
do Cl-TR é a de canal para ions cloreto, regulado por Fanestil 1)1), Schultz SCI. Physiology of membrane disor¬
AMP cíclico (AMPc), na membrana apical das células ders. 2 ed. New York: Plenum Medical, 1986. p. 25-44.
epiteliais.'* Com sua alteração, tem-se a diminuição na 12. Goodman SR. Medical cell biology. 2"' ed. Philadelphia:
exportação c o aumento da absorção de elctrólitos por Lippincott-Ravcn, 1998. 320p.
meio dos canais de cloreto. Isso ocorre principalmente 13. Spector AA, Yorek MA. Membrane lipid composition
nos epitélios respiratório, biliar, intestinal e pancreático, and cellular function. ILipid Res 1985; 26: 1015-35.
coincidentes com os órgãos afetados. 14. Yeagle PL. Cholesterol and the cell membrane. Biochcm
A distrofia muscular de Duchenneé outra patolo¬ Biophys Acta 1985; 822: 267-87.
gia associada a alterações nas membranas. Ela corres¬ 15. Rothman I, Lenard J. Membrane asymmetry. Science
ponde a um quadro degenerativo progressivo e letal, 1977; 195: 743-53.
caracterizado por um enfraquecimento lento e gradual 16. Singer SI. The structure and insertion of integral pro¬
da musculatura esquelética. Essa síndrome torna-se per¬ teins in membranes. Annu Rev Cell Biol 1990; 6: 247.
ceptível com o inicio do desenvolvimento motor da cri¬ 17. Sharon N, Lis H. Carbohydrates in cell recognition. Sci
ança, geralmente entre 3 e 6 anos de idade. Os primeiros Am 1993; 268: 82-9.
sintomas correspondem a dificuldades para correr e 18. Carvalho HF. Aspectos biológicos e moleculares das
subir escadas e quedas frequentes." Com o agravamen¬ lectinas. Cien Cult 1990; 42: 884-93.
to dos sintomas, por volta dos 10anos, os indivíduos são 19. Drickamcr K, Taylor ME. Biology of animal lectins.
incapazes de andar e, por volta dos 20 anos de idade, fre¬ Annu Rev Cell Biol 1993; 9: 237-64.
quentemente morrem. A distrofia muscular é causada 20. Hakomori S. Cancer-associated glycosphingolipid anti¬
por uma mutação que leva ã ausência ou deficiência gens: their structure, organization, and function. Acta
marcante da proteína distrofitu?.•" A distrofina é uma Anat 1998; 161: 79-90.
proteína estrutural da membrana plasmática, cuja fun¬ 21. Bevilacqua MP, Nelson RM. Select ins. I Clin Invest
ção, nos indivíduos normais, é ancorar as miofibrilas 1993;91:337-87.
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A Célula 91
6 JUNÇÕES CELULARES
Carla B. Collares-Buzato

As células dentro de um tecido, ou órgão, estão interconectadas com outras células e com a matriz extraocu¬
lar por meio de estruturas especializadas da membrana plasmática, denominadas junções intercelulares e
junções célula-matriz, respectivamente. Estruturalmente, as junções intercelulares são classificadas em qua¬
tro diferentes componentes: junção de oclusão (zonula occludensou tight junction), junção aderente (ou zo¬
nula adherens), desmossomo (ou maculae adherens) c junção comunicante (nexus ou gap junction) (Figura
6.1 ). Quanto ás junções célula-matriz, estas podem ser divididas em dois tipos: a junção de adesão focal e o
hemidesmossomo ( Figura 6. 1 ). Todas essas junções celulares não são necessariamente encontradas em todos
os tipos celulares do organismo; as células do sangue, por exemplo, são desprovidas dessas estruturas. Em
outros casos, como no dos epitélios de revestimento, as junções aparecem bem desenvolvidas.
Tem sido demonstrado que essas especializações da membrana constituem-se em elementos alta¬
mente dinâmicos e reguláveis da membrana celular, sendo modulados por substâncias e tratamentos
diversos. Várias proteínas integrantes das junções já foram identificadas, isoladas e bioquimicamente ca¬
racterizadas, tendo sido evidenciado o envolvimento dessas estruturas em vários processos fisiopatológi-
cos. A disfunção de algumas junções pode contribuir na etiologia do processo de infecção bacteriana in¬
testinal, câncer e metástase, doenças dermatológicas de origem auto-imune, neuropatias etc. Este capítu¬
lo descreve a estrutura, a função c a regulação das junções celulares.

Junções intercelulares
Junções intercelulares são definidas como especializações Microvfosidade
da membrana plasmática que intcrconcctam células vizi¬
nhas dentro de um tecido. As junções foram originalmen¬
te denominadas harru terminal, pois apareciam como uma
série de pontos mais corados das membranas laterais de
células adjacentes, imediatamente abaixo da superfície Junção de oclusão
apical do epitélio intestinal, observado por microscopia de Filamentos de acima
luz. Acreditava-se que, neste local, ocorria depósito de um
cimento intercelular que servia para selar o espaço interce- Junção aderente
lular. Com o adventoda microscopia eletrónica, entretan¬ Filamentos intermediários
to, a barra terminal (termo, agora, em desuso) foi identifi¬
cada como um complexo de estruturas morfologicamente
distintas, localizadas na membrana lateral da célula. No
tecido epitelial, a junção de oclusão (localizada na porção Junção comunicante
mais apical), seguida pela junção aderente e pelo desmos¬
somo, formam uma tríade na membrana lateral das célu¬
las, conhecida como Complexo Unitivo. Funções especifi¬ Núcleo
cas foram atribuídas a cada um dos componentes das jun¬
ções intercelulares, baseando-se na sua ultra-estrutura
visualizada por microscopia eletrónica. A junção de oclu¬ Matriz extracelular Hemidesmossomo Adesào focal
são, a junção aderente e os desmossomos representam dis¬
positivos de adesão intercelular. No epitélio de revestimen¬ Figura 6.1 Diagrama mostrando as junções celulares em uma célula
to, a junção de oclusão age como uma barreirade difusão, epitelial hipotética.

92 A Célula
limitando a permeaçào dc H2O, ions e pequenas molécu¬ occludens ou tight junction, forma um cinturão ao redor
las entre as células (ou via paracclular). A junção comuni¬ da célula epitelial, com o qual as membranas laterais de
cante desempenha uma função importante no processo de células vizinhas estão em íntimo contato. Em alguns tipos
comunicação intercelular. A estrutura bioquímica do celulares, entretanto, esse cinturão formado pela junção
Complexo Unitivo tem sido intensamente estudada nos de oclusão é descontínuo, recebendo a denominação de
últimos anos, tendo sido identificadas várias proteínas fasciae occludens {fasciae, do latim, faixa). Sob micros¬
integrantes a essas estruturas (Figura 6.2). copia eletrônica de transmissão (ME), a junção de oclu¬
são aparece como uma série de sitios de aparente fusão
parcial das membranas lateraisde células vizinhas (Figura
Junção de oclusão 6.3a). A espessura da membrana na região dessa junção é,
portanto, menor que a espessura total de duas unidades
Estrutura e bioquímica de membrana plasmática. Imagens de ME de células in¬
A junção de oclusão, também conhecida como zonula testinais, após extração com detergente que destaca o ci-

Odudina
Claudmas

Cingulma

J unção de Oclusão

Cateninas Vinculma

Junção Aderente |
a-Actinina
Desmcplaquma

Filamento Intermediário
Complexo Unitivo

Desmogleina Placoglobina
e'ou
Desmocolina
Membrana Plasmática

Figura 62 Diagrama mostrando um modelo da composição bioquímica e mterações entre as proteínas integrantes do Complexo Unitivo, formado pela junção
de oclusão (b). junçào aderente (c) e desmossomo (d). A esquerda, uma fotomicrografia ultra-estrutural do Complexo Unitivo (a).

A Célula 93
Capitulo 6 JUNÇÕES CELULARES

Figura 6.3 Aparénoa da junçáo de odusào observada por microscopia etetrónkca de transmissão (a), em chofratura (b) e por imunofluorescôncia (c). Em
c. células epitekais em cultura (linhagem MOCK) foram incubadas com anticorpo primário anti-ZO-1. c' corresponde a um corte transversal óptico de c.
mostrando a localização da proteína junto à borda apical da célula A seta indica a base das células, b reproduzida do artigo de Cohen et al. (J Cetl Sei
1999; 112: 2657). com autorização da Company of Biologist
toesqueleto, mostram uma débil associação entre micro- posto á face interna da membrana, o qual é formado por
filamentos de actina com o lado citoplasmático dos sítios três proteínas citoplasmáticas, a ZO-I, a ZO-2 e a ZO-3
de fusão da junção de oclusão. (Figura 6.2b).' A ZO-1 foi a primeira proteína integrante
Lm criofraturas, a junção de oclusão constitui uma da junção de oclusão a ser identificada, possui 225 kDa e
rede complexa de cordões anastomosantes e reentrâncias um formato globular alongado, que contém vários resí¬
complementares, que correspondem aos sítios de fusão duos de fosfoserinas em sua estrutura (Figura 6.3c).' Em¬
identificados em secções ultrafinas (Figura 6.3b). A inter¬ bora a ZO- 1 seja um componente constante em junções
pretação mais plausível, em nível molecular, para essa de oclusão em células epiteliais, essa proteína pode ser
imagem da criofratura da junção de oclusão, é que partí¬ também encontrada em outras células de origem nào-
culas proteicas integrais da membrana de células vizinhas epitelia! (como em miócitos cardíacos, fibroblastos, astró-
se dispõem lado a lado, formandocordões de vedação que citos, células de Schwann etc.), podendo estar associada a
se entrelaçam e aderem firmemente entre si. Uma analo¬ outra junção, como a do tipo aderente. '' Por essa razão, a
gia que auxilia na compreensão dessa estrutura é a repre¬ ZO- 1 não parece constituir-se em um marcador específi¬
sentação dessas partículas como os dentes de um zíper; co da junção de oclusão, como é o caso das outras proteí¬
quando as partículas de células vizinhas interagem e se nas, como ocludina, ZO-2 e cingulina (veja a seguir). As
unem (similar ao que acontece no fechamento de um proteínas ZO-2 e ZO-3 têm 160 kDa e 130 kDa, respecti¬
zíper) há a obliteração do espaço intercelular nessa região, vamente, e as suas estruturas primárias apresentam várias
ao longo dos cordões. regiões homólogas a ZO-1.' Esse complexo ZO-l/ZO-
Os possíveis candidatos paracomporem esses cor¬ 2/ZO-3 parece estar envolvido na regulação da interação
dões de vedação da junção de oclusão são as proteínas in¬ entre moléculas de ocludina, ou ainda, na localização da
tegrais, denominadas ocludina e claudinas. A ociudina, ocludina na região específica da junção de oclusão. Uma
com massa molecular de aproximadamente 63 kDa, pos¬ outra proteína citoplasmática integrante desse tipo de
sui quatro regiões hidrofóbicas inseridas na membrana junção é a cingulina. A cingulina é uma proteína de 140
plasmática, dois domínios extracelulares (responsáveis kDa, de formato alongado semelhante a um bastão, que
pela interação com outra molécula vizinha) e dois domí¬ apresenta homologia com proteínas associadas aos
nios intracelulares (responsáveis pela interação com ou¬ microfilamentos, como miosina, tropomiosina ou espec-
tras proteínas citoplasmáticas). As claudinas formam trina/fodrina." Uma provável função atribuída à cingulina
uma família com 20 membros de proteínas integrais é a de regular a ancoragem dos microfilamentos do cito-
identificadas (claudinas 1 a 20), com massa molecular esqueleto na região da junção de oclusão. O complexo
aproximada variando de 20 a 27 kDa, apresentando tam¬ ZO-1/ZO-2/ZO-3 parece não interagir diretamente com
bém 4 domínios moleculares, mas nenhuma similaridade cingulina, sendo possível que outras proteínas desempe¬
com a ocludina quanto à sequência de aminoácidos.' lán- nhem esse papel (como o antígeno 7116. a simplequina, a
to a ocludina como as claudinas são detectadas por imu- proteína AF-6).1* A Figura 6.2b mostra o arranjo desses
nocitoquímica ultra-estrutural, exclusivamente, nos cor¬ componentes protéicos da junção tie oclusão.
dões da junção de oclusão de vários epitélios, mas estão
ausentes em tipos celulares desprovidos desse tipo de jun¬ Funções
ção (como, por exemplo, libroblastos e células musculares Até a metade do século XX, acreditava-se que a junção de
cardíacas)/ Ainda não é conhecido como a ocludina e as oclusão fosse uma estrutura totalmente impermeável e
claudinas estão arranjadas dentro do cordão de vedação. não-regulável da membrana plasmática de células epiteli¬
A região C-terminal da ocludina voltada para o ais. Atualmente, sabe-se que essa junção apenas limita a
citoplasma interage diretamente com um complexo justa¬ difusão passiva de ions e pequenas moléculas através do

94 A Célula
espaço intercclular (também conhecido como transporte crucial para certos epitélios, como o intestinal e o renal,
paracelular), embora seja praticamente impermeável a que dependem da distribuição assimétrica de proteínas
moléculas com raio maior que 15 A. Essa impermeabili¬ transportadoras na membrana para desempenhar a fun¬
dadeda junção de oclusão a diferentes moléculas pode ser ção de absorção e transporte transepitelial. Por outro lado,
observada ao ME; substâncias eletrodensas, como por sabe-se que tanto a formação como a manutenção da
exemplo, sais de lantánio ou ferritina, quando adiciona¬ polaridade celular dependem não somente da junção de
das a um dos lados do epitélio, não atingem o lado con¬ oclusão, mas também da junção de adesão e do citoesque-
tralateral do mesmo, parando especificamente na região leto (veja adiante).
da junção de oclusão (Figura 6.'»).
A função tie barreira de difusão, desempenhada Função de barreira e sua regulação
pela junção de oclusão, é crucial no caso dos epitelios que A permeabilidade da junção de oclusão pode ser modu¬
revestem cavidades e superfícies livres do organismo. lada por inúmeras condições experimentais e fisiopato-
Esse tipo de tecido delimita compartimentos de composi¬ lógicas. A função de barreira da junção de oclusão pode
ção química distinta (como, por exemplo, o epitélio intes¬ ser determinada utilizando-se várias técnicas, como (1)
tinal, renal, da bexiga etc.); a perda da junção de oclusão análise da estrutura dessa junção por imunocitoquimica
significaria a dissipação do gradiente eletroquimico entre e microscopia cletrônica; (2) medição da resistência elé¬
os dois lados do epitélio e, consequentemente, o compro¬ trica transepitelial; e (3) medição do fluxo transepitelial
metimento da função desses órgãos. Diferentes epitelios de moléculas, conhecidas como marcadores extracelula-
podem apresentar diferenças no grau de permeabilidade a res, que atravessam o epitélio somente pela via paracelu¬
ions da junção de oclusão, como demonstrado pela medi¬ lar (cruzando a junção de oclusão). Quando ocorre uma
ção, com auxilio de eletrodos, da resistência transepitelial diminuição da R, acompanhada de um aumento do
(Ri) à passagem de corrente elétrica. As diferenças no grau fluxo de um marcador extracelular específico, de um lado
de vedação dessa junção estão diretamente relacionadas para o outro do epitélio, diz-se que a permeabilidade
através da junção de oclusão está aumentada e que,por¬
com sua ultra-estrutura. Portanto, o epitélio da bexiga,
que é relativamente impermeável e com elevada R, apre¬
senta maior número e complexidade dos cordões de veda¬
. tanto. a sua função de barreira está comprometida
(Figura 6.5). Em uma situação inversa, caracterizada por
ção, visualizados em criofraturas desse tecido; já em epite¬ aumento da Rr e redução do fluxo transepitelial de mar¬
lios mais permeáveis (com baixa R, ), como o endotélio cadores extracelulares, a barreira de difusão, constituída
que reveste capilares não-cerebrais, a junção de oclusão por essa junção, está reforçada.
apresenta apenas umou dois desses cordões de vedação. O Existem tratamentos e substâncias que aumentam a
número de cordões de vedação, por sua vez, correlaciona- permeabilidade da junção tie oclusão, como, por exemplo,
se, em vários tipos celulares, com o grau de expressão da aumento do cálcio intracelular,111 diminuição do pH cito-
odudina, enquanto que a permea¬ plasmâtico e do cálcio extracelular," exposição a certos
bilidade de cada cordão de veda¬ hormònios e citocinas (bradicinina,1- interferon-y. insu¬
ção depende da expressão e do ti¬ lina) etc. Outros,como, por exemplo, a exposição à vita¬
po tie claudina que o compõe. mina A," proteases1" e glicocorticóides, reduzem a passa¬
Além tia função de barreira, gem de ions e solutos através dessa junção. Entretanto, os
a junção de oclusão também de¬ mecanismos intracelulares envolvidos no controle da
sempenha um papel importante estrutura e função da junção de oclusão ainda permane¬
na manutenção da polaridade ce¬ cem desconhecidos. O»ntudo, sabe-se que o grau de fosfo-
lular.1" Esta é caracterizada pela rilaçào das proteínas integrantes dessa junção e sua asso¬
distribuição assimétrica de proteí¬ ciação com o citoesqueleto são fundamentais para a ma¬
nas e lipídios entre os domínios nutenção da função de barreira no epitélio. O tratamento
ÿ apical e basolateral da membrana com a droga citocalasina, que fragmenta os filamentos de
plasmática. A polaridade celular é actina, induz ruptura da barreira epitelial.1 O aumento
Figura 6.4 Função de barreira de difusão
experimental da atividade de certas cinases,como a prote¬
da junção de oclusão. Fotomicrograíia ele- ína cinase C (PKC) ou a proteína tirosina cinases (PTK),
trónica de transmissão de duas células resulta em fosforilaçào nos resíduos serina/treonina ou
epiteliais adjacentes. Uma solução de pe¬ tirosina da odudina, da ZO-l/ZO-2 e cingulina. A fos¬
roxidase. quando adicionada ao lado ba¬
solateral do epitélio. difunde-se pelo espa¬ forilaçào das proteínas associadas à junção de oclusão {Hi¬
ço intercelular, mas é impedida pela jun- de levar a uma dcsestruturaçâo na arquitetura dessa jun¬
çào de oclusão de alcançar o lado apical ção, em decorrência de um comprometimento das intera-
da célula (seta) Reproduzido do artigo de
Conyers et al.. publicado no American çòes moleculares entre essas proteínas da junção e/ou da
Journal of Physiology 1992: 259: C577. internalizaçào dessas moléculas em vesículas citoplasmá-
com autorização da editora. ticas (Figura 6.5).

A Célula 95
Capitulo 6 JUNÇÕES CELULARES

Figura 6.5 Modulação da função de barreira desempe¬


nhada pela junção de oclusão no epiiélio. 0 tratamento
com ortovanadato de sódio e H20? induz desarranjo da
arquitetura da junção de odusáo (JO), incluindo o desa¬
parecimento gradual da 20-1 da região da JO (b). As
imagens a e b mostram células marcadas por imunocito
química para Z0-1; em a. células nào-tratadas, e em b.
após tratamento com vanadataH202. Concomitante¬
mente. esse tratamento resulta em aumento da permea¬
bilidade da via paracelular. como comprovado pela redu¬
Controle Tratado Controle Tratado ção da resistência etétnea transeprtelial (c)e aumento no
fluxo de inulina. um componente que somente atravessa
o epilélio pela junção de odusào (d). * Estatisticamente
diferente do grupo controle

A modulação da estrutura e função da junção de to das junções de oclusão das células epiteliais para per¬
oclusão pode também ocorrer em certos processos fisio¬ mitir a sua passagem. Em adição, a função de barreira
lógicos. O controle da permeabilidade dessa junção pare¬ desempenhada pela junção de oclusão pode estar com¬
ce importante 110 processo de absorção de nutrientes pelo prometida em alguns estados patológicos. Certas bacté¬
intestino. Em células epiteliais da mucosa intestinal (ente- rias e toxinas de origem bacteriana podem induzir au¬
rócitos),a ativaçào de co-transportadores de Na*/nutrien- mento da permeabilidade dessa junção em células epiteli¬
tes pela glicose e por certos aminoácidos induz aumento ais em cultura. Esses patógenos e suas toxinas compro¬
da permeabilidade da junção de oclusão, resultando em metem a função de barreira epitelial intestinal promoven¬
absorção de nutrientes também pela via paracelular por do, em alguns casos, contraçáo do citoesqueleto perijun-
difusão passiva. A hipótese vigente para explicar esse cional, aquele associado à junção de oclusão, ou intera¬
mecanismo propõe que a ativaçào desse transportador gindo diretamente com os componentes dessa junção. - '
resulte 110 desencadeamento de uma cascata de sinais Um exemplo interessante é a enterotoxina da Clostridium
intracelulares, provavelmente liderada pela cinase da perfringens, um polipeptídeo de massa molecular de 35
cadeia leve da miosina (ou MLCK.do inglês, Miosin Light kDa,que é o principal agente causador dossintomas asso¬
Chain Kinase),acarretando na contraçáo do anel perijun- ciados à intoxicação alimentar por ess;» bactéria no ho¬
cional. Essa contraçáo, por sua vez, leva a uma t ração na mem. Esse polipeptídeo tem a capacidade de interagir
membrana da região da junção de oclusão e consequente com as moléculas de claudinas, a partir do exterior das cé¬
aumento da permeabilidade dessa estrutura. Outros lulas, e induzir a remoção dessas proteínas da junção de
exemplos de regulação fisiológica dessa junção são: a oclusão em células epiteliais, reduzindo a função de bar¬
transmigração de leucócitos polimorfonucleares através reira. ' O comprometimento da função de barreira por
de epitélios em estadosde inflamação aguda ' e a transmi¬ esses agentes patogênicos pode contribuir para intensifi¬
gração das células germinativas através da barreira do epi- car o estado de diarréia, frequentemente observado no ca¬
télio seminifero (formada pelas células de Sertoli) na es- so de infecção bacteriana do intestino, bem como oferecer
permatogénese. Em ambos os casos, as células migrató¬ um possível portal de entrada para reinfecção pela pró¬
rias induzem mudanças conformacionais ou rompimen- pria bactéria ou por outros microrganismos.

% A Célula
Junção aderente inserido na membrana, (2) uma região extracelular ami-
no-terminal, que apresenta 4 a 5 subdominios repetitivos,
Estrutura e bioquímica cada qual contendo 2 sitios de ligação ao Ca'', e (3) um
Assim como a junção de oclusão, a junção aderente (ou domínio intracelular carboxi-terminaL ' As caderinas
zonula adherens) também forma um cinturão que circun¬ ficam inseridas na membrana como dímeros unidos por
da a região subapical das células epiteliais. Entretanto,em .
pontes de Cr e a adesão intercelular se dá pela intera-
secções ultrafinas, a junção aderente aparece como uma çáo, também por pontes de Ca ,dos domínios extracelu-
região especializada da membrana, localizada logo abaixo lares de vários desses dímeros entre células vizinhas" (Fi¬
da junção de oclusão, onde as duas membranas adjacen¬ gura 6.2c). Essa interaçào ocorre somente entre subtipos
tes ficam paralelas e separadas por um espaço de 150-250 A idênticos de caderinas (interaçào homotípica); portanto,
de largura, preenchido com um material amorfo, apa¬ somente células semelhantes ou que expressam o mesmo
rentemente homogéneo, de densidade fina. No lado cito- subtipo ou um conjunto idêntico de subtipos de caderina
plasmático, há uma espessa malha de filamentos de 70 A irão se aderir.
constituídos essencialmente de F-actina. lasses microfila- A região citoplasmática das caderinas. por sua vez,
mentos de actina podem arranjar-sc em paralelo à mem¬ associa-se indiretamente ao citoesqueleto por meio de
brana celular apical, circundando toda a periferia da célu¬ um complexo de proteínas citoplasmáticas denominadas
la e formando o anel de actina pcrijuncional. A junção cateninas. Existem três cateninas já identificadas e co¬
aderente também aparece como faixas descontínuas ou nhecidas: a-catenina, [i-catenina e placoglobina (ou y-
pontos de adesão intercelular, denominados faseia catenina), as quais apresentam massas moleculares de
adherens ou punctum adherens, respectivamente, observa¬ 102, 88 e 80 kDa, respectivamente. A molécula de cade¬
dos em alguns tipos de epitélios glandulares e em tecidos rina interage diretamente com a (5-catenina ou com a
não epiteliais (como no músculo cardíaco). placoglobina, as quais se associam com a a-catenina.' A
Com base na sua aparência ao ME, a função pri¬ p-catenina e a placoglobina constitucm-se em proteínas
mária sugerida para a junção aderente é a de promover a homólogas, cuja possível função seria a de transdutor de
adesão entre células vizinhas. A evidência experimental, sinais, intra e extracelulares, que regulam a propriedade
para essa função adesiva, foi primeiramente obtida quan¬ adesiva da junção aderente. Ambas as proteínas, p-cate-
do se observou um comprometimento do processo de a- nina e placoglobina, podem ser alvos de cinases intraci-
desão intercelular após a exposição das células a anticor¬ toplasmáticas e, potencialmente, interagem com recepto¬
pos que reconheciam glicoproteínas da superfície celular, res de fatores de crescimento como, por exemplo, o fator
as quais se concentravam particularmente na junção ade¬ de crescimento epidermal (ou EGF, do inglês, epidermal
rente. Posteriormente, foram denominadas moléculas growth factor).' A a-catenina teria a função de ligar os
de adesão celular ou CAM (do inglês, Cell Adhesion Mole¬ complexos caderina/p-catenina e caderina/placoglobina
cules).' As CAM podem ser classificadas em dois grupos com os microfilamentos de F-actina e uma outra proteí¬
principais de acordo com a dependência ou não de Ca' na associada ao citoesqueleto, a a-actinina, que interco-
para sua propriedade adesiva: ( 1) as pertencentes à super- necta filamentos de actina vizinhos.' A a-actinina é uma
família das Caderinas que dependem de Ca' e (2) as per¬ proteína formada por dois polipeptídeos idênticos com
tencentes à superfamília das Imunoglobulinas (Igs) de formato de bastão, cada qual apresentando uma massa
receptores de adesão que não dependem desse cátion. molecular aproximada de 104 kDa.Ainda, a ligação da a-
Existe apenas um membro da superfamília das Igs que é catenina com a a-actinina pode ser direta ou via outra
encontrado especificamente nas junções aderentes: a N- proteína, frequentemente associada ao citoesqueleto, de¬
CAM, que é expressa somente em células do tecido neu¬ nominada vinculina (Figura 6.2c). A vinculina é um po-
ral; os outros membros são anticorpos e receptores da lipeptideo de 1 16 kDa, cuja molécula apresenta uma re¬
superfície de leucócitos e células T, envolvidos na respos¬ gião de aspecto globular, denominada "cabeça" e uma
ta imunológica. As caderinas são os principais compo¬ região com formato de bastão, denominada "cauda"." A
nentes da junção aderente e existem dezenas de subti¬ região da cabeça da vinculina é essencial para a ligação
pos/membros já identificados." Cada subtipo apresenta com a a-actinina, enquanto a actina e outras moléculas
uma distribuição tecidual característica, sendo encontra¬ de vinculina podem interagir com a região da "cauda". A
do somente em determinado grupo de tipos celulares. interaçào caderina com o citoesqueleto, via cateninas, é
Assim, o subtipo conhecido como E-caderina é encontra¬ fundamental para a função de adesão das caderinas. Des¬
do principalmente em epitélios, a N-caderina, em tecidos ta forma, o comprometimento da ligação entre caderinas
de origem nervosa, a E-caderina, na placenta e no endoté- e cateninas resulta em perda da adesão intercelular.
lio, a M-caderina, em músculo etc. Entretanto, todos os
membros da superfamília das caderinas exibem uma Funções
estrutura molecular semelhante, cuja molécula inclui os A principal atribuição funcional da junção aderente é
seguintes domínios: ( 1) um domínio hidrofóbico que fica promover uma firme adesão entre células vizinhas, o que

A Célula 97
Capítulo 6 JUNÇÕES CELULARES

é crucial para a formação c manutenção da arquitetura a formação da junção de oclusão, de desmossomos e de


tecidual. A manutenção dos contatos celularesé fisiologi¬ junções comunicantes, além da própria junção ade¬
camente significativa, dado o fato que o comprometi¬ rente. Adicionalmente, a redução da propriedade adesi¬
mento do mecanismo de adesão celular, mediado pelas va da E-caderina, pela retirada do Ca extracelular de
caderinas/cateninas, consiste em uma etapa importante células epiteliais in vitro, ou, ainda, pela exposição a
para o desencadeamento do processo tumoral." Células anticorpos contra E-caderina, resulta em desestrutu-
transformadas, como as que dão origem aos tumores de raçào da junção de oclusão e consequente comprometi¬
origem epitclial {por exemplo, carcinomas e adenocarci¬ mento da função de barreira epitelial."
nomas), apresentam frequentemente baixa adesividade A interação celular mediada pela junção aderente
com outras células e com a matriz extracelular, combina¬ parece também importante para manter a polaridade ce¬
da com uma alta motilidade celular. O processo de trans¬ lular. Acreditava-se que a junção de oclusão fosse o prin¬
formação inicia-se com a perda de adesão intercelular cipal componente celular responsável em manter a [Hila¬
quando,então, as células transformadas se tornam extre¬ ridade celular, restringindo a difusão lateral de diferentes
mamente móveis (Figura 6.6). Devido, em parte, a essa componentes da membrana entre os domínios apical e
baixa adesividade, cessa-se a inibição por contato do basolateralde células. A junção aderente juntamente com
crescimento celular, que ocorre quando uma célula nor¬ o citoesqueleto (o qual ancoraria proteínas especificas em
mal entra cm contato com outra idêntica; a célula trans¬ certas regiões da membrana) desempenha um papel im¬
formada começa, então, a se multiplicar desordenada¬ portante nesse processo de formação de domínios da
mente. Num grau mais intenso de transformação ou de membrana. A junção aderente promove a polarização da
dediferenciação, as células podem se tornar metastáticas membrana celular por dois mecanismos: < 1) induzindo a
e sair do seu localde origem, invadindo outros órgãos via formação da junção de oclusão na interlace entre as
circulação sanguínea e/ou linfática. Vários mecanismos membranas apical e basolateral e (2) organizando indire-
moleculares podem estar envolvidos na perda de adesivi¬ tamente um citoesqueleto basolateral (pela ancoragem
dade celular entre as células tumorais: (1) mutação nos dos microfilamentos na membrana basolateral). As evi¬
genes que codificam caderinas e cateninas, (2) repressão dências experimentais para essa idéia vieram de experi¬
do processo de transcrição dos genes das caderinas e mentos em cultura com fibroblastos transfectados com
cateninas ou (3) comprometimento da interação mole¬ UNAc codificando E-caderina. A expressão induzida de
cular entre caderinas e cateninas" (Figura 6.6). Este últi¬ E-caderina, nestas células, resultou em redistribuição de
mo,em particular, parece ser o principal mecanismo pelo Na*, K - AT Fase para a zona de contato, o que contrastou
qual certos oncovirus induzem transformação celular. com a distribuição não-polarizada desse transportador
Tem sido comprovado que certos vírus oncogénicos (que observada nos fibroblastos que não foram transfectados.
são vírus capazes de provocar câncer) induzem rompi¬ Neste sistema, a polarização celular da Na', K -AI Fase
mento da interação molecular entre caderina e cateninas, observada após expressão de E-caderina ocorreu na
modificando bioquimicamente essas proteínas via fosfo- ausência da junção de oclusão, mas coincidiu com a reor¬
rilaçâo nos seus resíduos de tirosina. ganização do citoesqueleto associado ã membrana celular.
A junção aderente desempenha um papel crucial A junção aderente está também envolvida no pro¬
na formação e manutenção da estrutura e da função das cesso de reconhecimento celular. Como mencionado
outras junções intercelulares. ' A exposição de células anteriormente, as caderinas interagem entre si homotipi-
em cultura a anticorpos contra E-caderina compromete camente, e, portanto, a adesão intercelular somente ocor-

Fosforilaçào das cateninas

Repressão da transenção gém¬


ea das caderinas/cateninas

Dediferenciação/lnvasão
Figura 6.6 Mecanismos mole¬
culares comprometendo a ade¬
são celular mediada pelas ca-
derinas'cateninas, levando à
dediferenoaçào e aumento de
motilidade e invasão vascular/
Mutação dos genes das cadennas/catenma tecidual por células de origem
epdeftal (veja o texto).

98 A Célula
Figura 6.7 Rearranjo celular em co-cultura de duas cepas da Snhagem de célula epitefial. WDCK. que diferem quanto ao grau de expressão de E-caderina
(a). A cepa MDCK-Í for pré-marcada com um corante fluorescente vital, CSFE, enquanto que a cepa MDCK-II. não. Logo após colocadas em cultura, as
células MDCK-I marcadas (seta) ficam espalhadas aleatoriamente entre as células MDCK-II não marcadas (em negro) (a). Após lOh de cultivo, as células
MDCK-I começam a se rearranjar (b) e. no terceiro dia de cultura, as células MDCK-I fluorescentes agrupam-se em (lhas (seta), rodeadas por MDCK-II não-
fluorescentes (c). Em d. mostra-se. em uma co-cultura de 3 dias. uma ilha de células MDCK-I. que expressa alto teor de E-caderina na junção (como deter¬
minado por imunocitoquímica), rodeada por células MDCK-II. que expressam relativamente baixa quantidade dessa molécula de adesão.
re entre células queexpressam subtipo idêntico decadcrina. com um formato de botào, que ficam localizadas frequen¬
1'or outro lado, células heterotípicas que expressam dife¬ temente abaixo da região da junção aderente no epitélio.
rentes caderinas ou quantidades diferentes do mesmo Os desmossomos são visualizados ao ME como duas pla¬
subtipo não têm a capacidade de se aderirem e tendem a cas lineares e paralelas, de 100 a 500 nm de comprimen¬
se desagregar, formando massas homotípicas separa¬ to, relativamente grossas e eletrodensas, que delimitam
das" (Figura 6.7). Esse reconhecimento celular mediado um espaço intercelular de aproximadamente 250 A (Fi¬
pelas caderinas, observado in vitro, c conhecido como cell gura 6.8). Esse espaço, preenchido com material filamen¬
sorting (do inglês,sorting,segregação) e é fundamental no toso de baixa densidade, por sua vez, delineia uma linha
processo de organogênese. Células do embrião formam mediana eletrodensa. Em adição, um material fibrilar e
uma massa celular indiferenciada e relativamente homo¬ também eletrodenso, com filamentos de 100 A, concen-
génea. Numa certa etapa do desenvolvimento embrionᬠtra-se na matriz citoplasmática adjacente à placa. Esses
rio, grupos diferentes de células entram num processo de filamentos citoplasmáticos, associados aos desmossomos,
diferenciação, começam a expressar caderinas diferentes e correspondem a filamentos intermediários do citoesque-
se segregam. Cada um desses grupos de células homotípi¬ leto.que se inserem na placa desmossomal e retornam ao
cas passa a ter um destino distinto, promovendo a for¬ citoplasma, formando alças. O filamentos intermediários
mação de órgãos diferentes. formam uma rede que interconecta todos os desmosso¬
mos espalhados pela membrana plasmática e que envolve
o núcleo da célula. A composição dos filamentos interme¬
diários associados aos desmossomos depende do tipo ce¬
Desmossomo lular: eles serão filamentos de queratina na maioria das
Estrutura e bioquímica células epiteiiais, filamentos de desmina em células mus¬
Os desmossomos são componentes comuns de vários culares ou, ainda, filamentos de vimentina em células de
tecidos, epitelial e náo-epitelial, e correspondem ao tercei¬ origem mesenquimal.
ro elemento do Complexo Unitivo de células epiteiiais. Essa junção possui uma estrutura básica similar à
Devido ao fato de essas junções serem facilmente discer- descrita para a junção de adesão, embora as proteínas
niveis ao ME, elas foram o primeiro tipo de junções inter- associadas sejam distintas (Figura 6.2d). O desmossomo
celulares a ser descoberto. Os desmossomos aparecem à também contém moléculas de adesão dependentes de
microscopia eletrónica como estruturas descontínuas, Ca'', responsáveis pelo contato intercelular, e moléculas

Figura 6.8 Aparência de um desmos¬


somo observada por microscopia
eletrónica detransmissão (a) esua loca¬
lização por imunofluorescéncia (b). Em
b. células eprteliais em cultura (linhagem
MDCK) foram incubadas com anteorpo
que reconhece uma proteína desmosso¬
mal. a reproduzida do artigo de Joaze*o
e Mentes (J Anat 1991; 175: 27). com
autorização da Cambridge University
Press

A Célula 99
Capitulo 6 JUNÇÕES CELULARES

citoplasmáticas que intcrconectam essas moléculas de ade¬ A importância dos desmossomos como estrutura
são ao citoesqueleto. Até o momento, as duas únicas molé¬ de adesão é melhor apreciada pelo seu envolvimento na
culas de adesão identificadas no desmossomo foram a des- doença dermatológica crónica, potencialmente fatal,
mogleína (Dsg) (de 135 a 165 kDa) e a desmocolina (Dsc) denominada pénfigo.'** Essa dermatose é caracterizada
(de 115 a 130 kDa).'"; Cada uma dessas proteínas possui pelo aparecimento de bolhas flácidas na epiderme e, his-
três subtipos (Dsgl, Dsg2, Dsg3 e Dscl, Dsc2 e Dsc3, res- tologicamente, por acantólise (perda de adesão celular
pectivamente), que se diferenciam pela sua reatividade dos queratinócitos). Existem dois tipos de pénfigo, o
imunológica e pela sua distribuição diferencial em tipos pénfigo vulgar e o pénfigo foliáceo, que se diferem pelo
celulares ou tecidos distintos. A desmogleína e a desmoco¬ tipo de lesão epidérmica e sua extensão. As lesões na pele
lina pertencem à superfamília das caderinas e apresentam dos pacientes com pénfigo vulgar são caracterizadas por
sequências de aminoácidos homólogas a outros membros erosões extensas e bolhas flácidas que facilmente se rom¬
dessa superfamília, principalmente nas regiões extracelu- pem. Já nos pacientes com pénfigo foliáceo, as lesões são
lar e transmembrana. A região citoplasmática dessas molé¬ caracterizadas por escamações, eritema e erosões mais
culas de adesão, por sua vez, interage com proteínas distin¬ superficiais. Em ambos os tipos, as lesões podem se tor¬
tas que fazem parte da placa interna do desmossomo." " nar generalizadas, acometendo também órgãos internos,
Umadessas proteínas é a placoglobina, que também ocor¬ como faringe, laringe, esófago, ânus etc. O pénfigo pode
re na junção de adesão, como foi mencionado anterior¬ ser látal se o paciente não for tratado adequadamente,
mente. Ensaios in vitro têm demonstrado que a placoglo¬ por causa da perda da função de barreira epidermal,
bina interage mais fortemente com as caderinas desmos- levando à perda tie grande quantidade de fluidos corpo¬
somais que com as caderinas clássicas." Outro componen¬ rais e à infecção bacteriana secundária. A etiologia dessa
te da placa é a desmoplaquina, que, ao contrário da placo¬ dermatose era desconhecida até meados da metade do
globina, está restrita aos desmossomos. Existem dois sub¬ século passado, quando anticorpos contra a pele foram
tipos de desmoplaquina: subtipo I (massa molecular de encontrados no soro de pacientes com pénfigo por imu-
332 kl)a) e II (massa molecular de 260 kDa), cujas molé¬ nofluorescéncia indireta, e essa dermatose foi, então,
culas apresentam três regiões: uma central, com estrutura caracterizada como uma doença auto-imune.* O soro de
a- helicoidal e formato de bastão, flanqueada por duas paciente com pénfigo vulgar tende a corar a superfície
regiões terminais globulares. Nos desmossomos, o com¬ dos queratinócitos da camada basal e porção inferior da
plexo placoglobina/desmoplaquina teria a função de inter¬ camada espinhosa, enquanto que o dos acometidos por
ligar e/ou estabilizar a ligação entre as caderinas desmos- pénfigo foliáceo cora mais intensamente as regiões supe¬
somais e os filamentos intermediários do citoesqueleto. riores da epiderme. A partir da década de 1980, com a
utilização de técnica imunoquimica e de seqúenciamen-
Desmossomos e doenças auto-imunes da pele to de DNAc, foi possível demonstrar que a molécula alvo
A função primária dos desmossomos é promover a adesão dos auto-anticorpos produzidos por esses pacientes era a
intercelular. Em contraste à junção aderente, não há evi¬ molécula de adesão desmossomal, a desmogleína (o sub¬
dências de que os desmossomos interfiram na formação tipo Dsg3, no caso do pénfigo vulgar, e o Dsgl, no pénfi¬
ou função das outras junções intercelulares. Assim, anti¬ go foliáceo).''" A Dsgl é expressa preferencialmente na
corpos contra desmocolina inibem a formação dos des¬ porção superior da camada espinhosa e na camada gra¬
mossomos sem afetar a morfologia celular ou a estrutura nulosa da epiderme; a Dsg3 é encontrada na porção infe¬
das junções de oclusão e aderente em uma linhagem de rior da camada espinhosa da epiderme. Tem sido propos¬
célula epitelial." Desmossomos são extremamente abun¬ ta a utilização de proteínas recombinantes com antigeni-
dantes em tecidos que estão sujeitos a severo e constante cidade idêntica aos antígenos autênticos do pénfigo
estresse mecânico,como,por exemplo, na epiderme. Nesse (Dsgl e 3) como uma estratégia terapêutica, em substi¬
tecido, os desmossomos são encontrados recobrindo toda tuição ao tratamento convencional com corticóides e
a superfície celular dos queratinócitos, cm contraste com outros imunossupressores, os quais apresentam severos
uma localização especificamente lateral cm outros tipos efeitos colaterais. Essa proposta terapêutica baseia-se no
celulares epiteliais. Essas junções correspondem às pontes pressuposto que as proteínas recombinantes ligam-se aos
intercelulares, observáveis ao microscópio de luz, e confe¬ auto-anticorpos do soro dos pacientes, interferindo na
rem o aspecto espinhoso às camadas suprabasais (princi¬ interação com os antígenos endógenos.
palmente a camada espinhosa) da epiderme. A ancoragem
da rede dos filamentos intermediários na membrana celu¬
lar e a interaçào das membranas celulares adjacentes pelos
desmossomos, efetivamente, ligam os citoesquelctos de cé¬
Junção comunicante
lulas vizinhas, o que permite que a camada celular distri¬ Estrutura, bioquímica e função
bua as forças mecânicas incidentes por toda a sua exten¬ A junção comunicante, também conhecida como nexus
são, mantendo a sua forma e funcionalidade. (do latim, nexus: ponte, ligação), é uma coleçào de canais

100 A Célula
localizados na membrana plasmática, que diretamente concxinas foram identificados, os quais diferem ligeira¬
interliga o citoplasma de duas células adjacentes." " Essa mente entre si pela massa molecular, variando de 21 a 70
junção está presente em praticamente todos os tipos celu¬ kDa (como, por exemplo, Cx26, Cx3 1 , Cx33,Cx40, 0x43,
lares de animais superiores, exceto em células sanguíneas Cx50etc.).' As conexinas são codificadas por vários genes
circulantes, em espermatozóides e em músculo esqueléti¬ e cada subtipo de conexina apresenta uma distribuição
co. Sob microscopia eietrònica de transmissão, a junção tecidual característica, embora diferentes conexinas pos¬
comunicante aparece como uma aproximação sem fusão sam ser também co-expressas em um dado tipo celular
das membranas adjacentes, delimitando uma fenda inter- (Figura 6.9c).'
celular com aproximadamente 30 A de largura (Figura Uma combinação das técnicas de difraçào de raios
6.9a). Devido à sua aparência ao ME, esse tipo de junção X e microscopia eietrònica foi usada para desenvolver o
foi também denominada gap junction (do inglês,gap: fen¬ modelo, atualmente aceito, da estrutura molecular da
da). Em réplicas de criofraturas, as membranas adjacentes junção comunicante (Figura 6.10a). De acordo com esse
contém inúmeras partículas proteicas integrais, num modelo, seis unidades de conexinas arranjam-se num
arranjo em forma de disco (Figura 6.9b). Em 1979, foi complexo hexagonal, denominado conéxon, que delimita
isolado, a partir de frações enriquecidas de membrana de centralmente um hemicanal. A junção comunicante re¬
hepatócitos de rato, o primeiro constituinte proteico da sulta da interação de dois conéxons,cada um inserido em
junção comunicante, apresentando uma massa molecular uma das membranas de células vizinhas, com a formação
de 32 kDa, sendo, então, denominado conexina 32 de um canal hidrofilico que conecta os seus citoplasmas.
(Cx32). Desde então, outros 19 membros da família das As moléculas de conexinas isoladas ficam inseridas na
bicamada lipídica de acordo com o modelo representado
na Figura 6.10c. O polipeptídeo possui quatro domínios
hidrofóbicos transmembranas, com as extremidades car-

célula A
membrana A
Espaço
intercelular

Conéxon
membrana B

célula B

Conexina

b) Espaço Conexina
ÿ extracelular
fechado aberto

Espaço
intracelular

Figura 6.10 a. Diagrama mostrando um modelo da estrutura da junção


comunicante que contém canais intercelulares imersos nas membranas
plasmáticas de duas células vizinhas (A e B) conectando os seus cito¬
plasmas. Cada canal é constituído por dois conéxons. b. Desenho
etetrônica de transmissão (a), em crioíratura (b) e por imunofluorescén- esquemático mostrando a alteração do estado funcional, aberto ou
da (c). Em c. células B do pâncreas endócrino em cultura (linhagem HIT) fechado, dos canais das junções comunicantes, c. Estrutura molecular
(oram incubadas com anticorpo primário anti-conexina 43. a e b. cortesia da conexina que é a proteína constituinte do conéxon; cada conéxon é
de Paolo Burighel s GJ = Gap Junction: EF = lace exoplasmática*; PF = formado por seis conexinas.
face protoplasmétca".

A Célula 101
Capitulo 6 JUNÇÕES CELULARES

boxi (C) e amino (N) terminais voltadas para o citoplas¬ a um aumento na comunicação intercelular, dependendo
ma.' Além disso, cada conexina apresenta um domínio do tipo de célula."* Essas formas múltiplas de controle
intracelular denominado E3 e dois domínios extracelula- enfatizam que as junções comunicantes não são meros
res denominados Hl e H2. Essas regiões da molécula das tubos intercelulares, mas sim, estruturas altamente dinâ¬
conexinas, El e E2, parecem estar envolvidas na interaçào micas e reguláveis, à semelhança de outros canaisda mem¬
entre conéxons de células adjacentes e contêm várias por¬ brana plasmática.
ções homólogas entre os vários subtipos de conexinas. A Tem sido proposto um modelo para explicar a
alça intracelular E3,bem como a extremidade C-terminal mudança 110 estado fechado/aberto desses canais. Como
dessas proteínas, são bastante variáveis entre as diferentes ilustrado na Figura 6.10b, a alteração do estado funcional
conexinas e parecem ser importantes na regulação das dos canais das junções comunicantes envolve, inicialmen¬
junções comunicantes,já que são locais de sítios de fosfo- te, uma mudança conformacional na estrutura das cone¬
rilação por cinases.' O canal intercelular da junção comu¬ xinas e, consequentemente, uma alteração na interação
nicante permite a passagem intercelular de ions (como intermolecular entre essas proteínas dentro do conéxon.
Ca*\ II.Na", K ,Cl") e moléculas com massa molecular Isso resulta em um "deslizamento" das conexinas e, con¬
até IkDa (monossacarideos, aminoácidos, nucleotídeose sequentemente, fechamento ou abertura do poro, à seme¬
mensageiros secundários como IP3 e AMPc). Entretanto, lhança de um diafragma.
ele exclui proteínas, DNA. RNA e organelas celulares.
Portanto, células conectadas pelas junções comunicantes Acoplamento intercelular
são acopladas elétrica e metabolicamente, mas mantém e sua importância fisiopatológica
sua individualidade genética e estrutural. Em tecidos excitáveis, como as células nervosas, os canais
Experimentalmente, o grau de acoplamento entre das junções comunicantes permitem que o potencial de
células vizinhas pode ser facilmente avaliado microinje- açáo se espalhe rapidamente de célula para célula, sem o
tando-se, dentro de uma dada célula, uma substância fluo¬ atraso que ocorre nas sinapses químicas. Essa caracte¬
rescente e impermeável à membrana celular (como. por rística da sinapse elétrica, mediada pela junção comuni¬
exemplo,o Lucifer Yellow) e observando-se, por microsco¬ cante. é vantajosa quando a rapidez da condução do im¬
pia de fluorescência, sua transferência para as células vizi¬ pulso nervoso é crucial, como, por exemplo, na resposta
nhas, o que ocorre por meio das junções comunicantes. A de fuga de certas espécies de peixes e insetos. As junções
permeabilidade dos canais intercelulares que compõem a comunicantes interligando neurónios permitem a passa¬
junção intercelular pode ser regulada reversivelmente por gem direta de íons de uma célula para outra, conduzin¬
uma enorme variedade de efetores, pelo menos sob condi¬ do,assim, a onda de despolarização de forma mais rápi¬
ções experimentais. Esses efetores podem induzir a aber¬ da e bidirecional. Similarmente, o acoplamento elétrico
tura do canal hidrofilico e, consequentemente, aumentar a das células musculares cardíacas permite a propagação
passagem de ions e pequenas moléculas através da junção rápida da onda de contraçào e a sincronização da respos¬
comunicante, ou podem promover o fechamento desse ta contráctil cardíaca. Portanto, devido à presença dos
canal, reduzindo a permeabilidade do mesmo. (Contudo, o canais intercelulares, o músculo cardíaco, que reveste as
efeito final desses agentes, bem como o grau de sensibili¬ diferentes câmaras do coração (átrios e ventrículos), fun¬
dade à açáo dos mesmos,variam conforme o tipo de cone¬ ciona como um sincício, possibilitando uma contraçào
xina e o tipo de tecido envolvidos. Entretanto, em termos coordenada dessas câmaras e, consequentemente, o
gerais, os exemplos de agentes que induzem diminuição da bombeamento do sangue. Em ambos os casos, os canais
condutividade através desses canais intercelulares, redu¬ da junção comunicante funcionam como canais de íons,
zindo, consequentemente, o acoplamento entre células, principalmente o K ;pelo lato desse íon ser o mais abun¬
são: elevação exacerbada do Ca intracelular, diminuição dante c mais móvel no citoplasma, ele é o responsável por
do pM citoplasmático, exposição a certos componentes transportar a corrente despolarizante de uma célula para
lipofilicos (por exemplo, n-heptanol, n-octanol, ácido ara- outra, propagando o potencial de açáo.
quidònico)' ,v etc. Por outro lado, os exemplos de condi¬ Alterações funcionais da junção comunicante no
ções experimentais que, geralmente, aumentam o acopla¬ músculo cardíaco podem estar envolvidas em algumas
mento celular são: exposição ao ácido retinóico" e a certos doenças cardiovasculares, como arritmias associadas à
hormônios (prolactina, glucagon etc.). A ativação de ci¬ isquemia e/ou infarto do miocárdio e à doença de Cha¬
nases citoplasmáticas (como, por exemplo, tirosina cinases gas.47 Por meio de experimentos in vitro, demonstrou-se
ou a proteína cinase C (PKC) e cinase A) também induz que a infecção de células cardíacas pelo protozoário
modulação do acoplamento intercelular mediado pelas Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de
junções comunicantes. A partir da indução de fosforilação Chagas, é acompanhada por marcante redução na
na molécula da conexina nos seus resíduos de tirosina ou comunicação intercelular e uma diminuição da expres¬
de serina/treonina, essas enzimas podem levar a uma são da proteína juncional presente nesses tipos de
diminuição (o que ocorre na maioria das vezes) ou, ainda, canais, a Cx43.

102 A Célula
Nas células do cristalino, as junções comunicantes plamento celular mediado pelas junções comunicantes
funcionam primariamente como canais em que metabó- tem sido particularmente bem demonstrada 110 pân¬
litos são livremente trocados entre células acopladas. creas endócrino. Células B isoladas em cultura secre-
Como a vascularização da lente é pobre, o acoplamento tam, após estímulo, uma quantidade menor de insulina
metabólico entre as suas células permite o fornecimento que células arranjadas em grupos. ' Ainda, o bloqueio
de nutrientes por toda a extensão do cristalino.' O com¬ farmacológico das junções comunicantes com heptanol
prometimento da comunicação intercelular nas células induz uma redução significativa da secreção desse hor-
do cristalino está associado a alterações nos níveis de cál¬ mónio. Em adição, estudos in vivo c in viíro têm de¬
cio intracelular e aumento da proteólise das cristalinas. monstrado que a estimulação da liberação de insulina
Cristalinas são proteínas expressas nas células diferencia¬ pela glicose e outros secretagogos está associada a um
das do cristalino e conferem a propriedade de transparên¬ aumento no acoplamento das células B. devido à ex¬
cia à lente. Alteração da estrutura molecular das cristali¬ pressão aumentada das conexinas integrantes da junção
nas, como a que ocorre durante o comprometimento da comunicante dessas células, as conexinas 36 e 43.*""
comunicação intercelular mediada pelas junções comuni¬
cantes 110 cristalino, tem sido associada à formação de
catarata, doença caracterizada pela perda da transparên¬
cia do cristalino ou da sua cápsula.' O acoplamento
Junções célula-matriz
metabólico mediado pelas junções comunicantes tam¬ Além de suas relações intercelulares, a célula também
bém pode ocorrer dentro de uma mesma célula, como, interage com a matriz extracelular, rica em proteínas e
por exemplo, na célula de Schwann. Essas células envol¬ proteoglicanos, por junções representadas pela junção
vem os axónios de fibras nervosas mielinicas do sistema de adesão focal e heniidesmossomos. Embora bioqui-
nervoso periférico, por prolongamentos citoplasmáticos micamente distintas, as junções célula-matriz mostram
arranjados como lamelas concêntricas ao redor desse uma estrutura básica semelhante àquela encontrada nas
axônio. Entre essas lamelas da célula de Schwann, exis¬ junções intercelulares; as células interagem com o am¬
tem junções comunicantes que teriam a importante fun¬ biente extracelular por meio de moléculas de adesão
ção de promover a troca necessária de nutrientes entre a inseridas na membrana plasmática, que, por sua vez,
região perinuclear da célula de Schwann e seus prolonga¬ interagem com o citoesqueleto por meio de moléculas
mentos citoplasmáticos (Figura 6. 1 1 ). A
Cx32 é a respon¬ de ligação. Na adesão focal, ocorre associação com mi-
sável por formar os canais das junções comunicantes na crofilamentos, à semelhança da junção aderente, en¬
bainha de mielina das células de Schwann, em regiões quanto que, no hemidesmossomo, ocorre associação
especificas destas: nas incisuras de Schmidt-Lantermann com filamentos intermediários do citoesqueleto, como
e nas porções paranodais do nodo de Ranvier (Figura visto nos desmossomos (Figura 6.1).
6.1 1 ).' Mutações múltiplas 110 gene codificador da Cx32 Tal como as junções intercelulares, as junções célu¬
têm sido associadas à doença humana de Charcot- Marie- la-matriz constituem-se em estruturas altamente dinâmi¬
Tooth, ligada ao cromossomo X.' ' Essa doença, uma cas e reguláveis, sofrendo alterações estruturais e funcio¬
neuropatia congénita, foi a primeira disfunção descrita nais sob condições experimentais e nào-experimentais,
como sendo diretamente resultante de um comprometi¬ como por exemplo, durante a motilidade e a divisão celu¬
mento das junções comunicantes em uma célula. Trata- lar. Além disso, tem se consolidado recentemente a idéia de
se de uma neuropatia resultante de desmielinização e que as moléculas de adesão associadas especificamente a
degeneração progressiva dos nervos periféricos associada essas junções, as integrinas, constituem-se em transdu¬
a defeitos nas células de Schwann. Ela é caracterizada por tores de sinais da matriz para dentro da célula, e vice- versa.
fraqueza e atrofia muscular, deformidades nos pés e, em Como veremos a seguir, essa sinalização entre célula e
alguns casos, por comprometimento da função sensorial matriz, parece ser fundamental em alguns processos celu¬
dos membros inferiores. Defeitos nessa junção, como os lares,como na migração, diferenciação celular, controle do
encontrados 11a doença de Charcot-Maric-Tooth, resul¬ ciclo de divisão e morte celular.
tam em comprometimento da estrutura das células de
Schwann e, consequentemente, desmielinização das
fibras nervosas.
Em glândulas endócrinas e exócrinas, a junção Junção dc adesão focal
comunicante pode funcionar primariamente como Estrutura c bioquímica
canais de Ca e de mensageiros secundários, como Junções de adesão focal foram primeiramente descritas
AMI'c e IP3. " A troca intercelular desses elementos per¬ em estudos de microscopia eletrônica de células em cul¬
mite a amplificação da resposta secretória, pois medeia tura." Nesses estudos, notou-se que, em algumas re¬
um recrutamento rápido de células secretoras situadas giões da superfície ventral da célula, a membrana plas¬
à distância do sítio do estímulo. A importância do aco¬ mática se aproximava do substrato e, neste local, havia

A Célula 103
Capitulo 6 JUNÇÕES CELULARES

ancoragem de feixes de microfilamentos do citoesquclc- formando mais de 24 heterodímeros de integrinas dis-


to, formando as fibras de estresse. A área da adesão focal tintas.,,A' As subunidades a possuem três a quatro sí¬
era confinada a uma região restrita da membrana, com tios de ligação para cátions divalentes, como Ca' ou
aproximadamente 2-10 pm de comprimento e 0,25-0,5 Mg ", e a interaçào das integrinas com componentes da
pm de largura. Nessa região, a distância entre a mem¬ matriz requer a presença desses cátions. O tipo de par
brana plasmática e o substrato era de apenas 10-15 nm. a/p formado determina a especificidade de ligação a
A adesão focal era frequentemente considerada um proteínas da matriz. Algumas integrinas, como a aÿPj,
artefato da cultura de tecido, por ser abundante em cul¬ o receptor clássico de fibronectina, ligam-se somente a
tura de células, mas de difícil identificação em células in um tipo de proteína da matriz extracelular." Entretan¬
vivo. Além disto, esse tipo de junção era mais facil¬ to, em geral, um subtipo de integrina tem a capacidade
mente identificável nas células em cultura, pelo seu de reconhecer e interagir com vários componentes da
aspecto plano e tamanho das fibras de estresse associ¬ matriz, como colágeno, fibronectina, laminina e vitro-
adas (Figuras 6. 12 e 6. 1 3a'). nectina." Ambas as regiões extracelulares das subuni¬
A célula interage com a matriz extracelular e se dades a e p contribuem para interaçào com a matriz.
adere a ela por meio de proteínas integrais denomina¬ Um grande número de integrinas reconhece o tripeptí-
das integrinas. Estas são uma família de glicoproteínas deo RGD (Arginina-Glicina-Asparagina),que íaz parte
que agem, quando localizadas na adesão focal, como da estrutura primária de várias proteínas da matriz.
receptores de proteínas da matriz extracelular." Entretanto, existem integrinas que reconhecem regiões
Existem também subtipos de integrinas que medeiam maiores dessas proteínas. No lado citoplasmático da
a interaçào célula-célula no sistema imune e a intera- adesão focal, a integrina se liga a um complexo de pro¬
çào das plaquetas com fatores de coagulação do san¬ teínas associadas ao citoesqueieto.' Uma dessas pro¬
gue. Cada integrina é um heterodimero que contém teínas é a talina, que interage com a subunidade P da
uma subunidade a e uma subunidade JJ, sendo que integrina. A talina é um homodimero, com subunida¬
cada subunidade apresenta um domínio extracelular des de 270 kl)a cada, arranjadas com direções antipa-
longo, uma única região hidrofóbica, que se insere na ralelas. A talina tem a função de conectar os microfila-
membrana, e uma região citoplasmática curta. A famí¬ mentos do citoesqueieto com a adesão focal; essa cone¬
lia das integrinas nos vertebrados inclui, pelo menos, xão pode ser direta, pois a talina tem a propriedade de
18 tipos diferentes de subunidades a e 8 subunidades se ligar aos filamentos de actina, ou indireta, por meio
(J, que podem se associar em diferentes combinações, da vinculina (Figuras 6.12 e 6.13a). Por sua vez, as mo¬
léculas de vinculina podem interagir com a talina ou
com a a-actinina, por uma de suas extremidades, e
Nódulo de Ranvier Célula de Schwann com outras moléculas de vinculina ou com a F-actina,
pela outra. O resultado final dessas intcraçòes molecu¬
lares é a ligação do complexo integrina/talina com os
microfilamentos do citoesqueieto. Outras duas proteí-
Membrana plasmática da
Paranodai célula de Schwann

Axónio

Incisuras de
Schmidt-lantermann
Canal de Cx32 '
Axòoio
Citoplasma

Figura 6.11 Esquema (supenor) mostrando uma fibra nervosa mtelini-


ca. na qual o axònk) é envolvido por sucessivas camadas concêntricas
de membrana (rica em mielina) e citoplasma da célula de Schwann. 0
local de interrupção desse envoltório na fibra mielinica é denominado
Nódulo de Ranvier. Esquema (inferior) mostrando a localização dos ca¬
nais da junção comunicante nas membranas da célula de Schwann que Figura 6.12 Imunolccalização das junções de adesão focal em fibrobtas-
conectam restos de citoplasma desta célula na bainha de mielina da re¬ to em cultura. Para lai, foi feita uma imunofluorescénoa empregando anti¬
gião paranodal (esquema à esquerda) e das incisuras de Schmidt-Lan- corpos anti-actina (em verde) e anti-talma (em vermelho) para localização
termann (esquema à direita, representação de um corte transversal). das fibras de estresse e da junção adesão focal, respectivamente.

104 A Célula
nas que fazem parte da estrutura bioquímica da adesão tretanto, os mecanismos reguladores desses eventos
focal são a paxilina e a cinase denominada FAK (do ainda são pouco conhecidos. Os sinais intracelulares
inglês, Focal Adhesion Kinase). A paxilina é uma prote¬ desencadeados pela interação da integrina com certos
ína de peso molecular de 68 kDa e que pode se associar componentes da matriz extracelular são: ( I) aumento da
a moléculas de vinculina ou se ligar à FAK. Essa enzi¬ concentração de Ca ' citoplasmático, pela ativaçào de
ma, por sua vez, pode também interagir com a subuni- canais de Ca* da membrana; (2) ativaçào do co-trans-
dade P da integrina. A FAK é uma proteína cinase de portador Na /H* da membrana plasmática, com conse¬
aproximadamente 125 kDa que tem a capacidade de quente alcali nizaçào de componentes do citoplasma e
fosforilar resíduos de tirosina de várias proteínas asso¬ (3) ativaçào de várias cinases, com consequente aumen¬
ciadas á adesão focal e/ou de enzimas envolvidas em to da fosforilação de proteínas associadas ou não à
vias de transdução de sinais intracelulares."'" Como junção de adesão focal. " f. por meiodessa maquinaria
veremos a seguir, a FAK é fundamental nos processos intracelular de enzimas e mensageiros secundários, con¬
de sinalização mediados pelas integrinas. A Figura trolada pelas integrinas. que a célula consegue regular
6.13a mostra as possíveis interações moleculares processos complexos, como a migração, diferenciação e
encontradas na junção de adesão focal. crescimento celular, em função do ambiente que a cir¬
cunda. As integrinas funcionam como receptores que
Regulação da adesão focal fornecem informações sobre a composição da matriz
A semelhança do que ocorre com as junções intercelu- extracelular, a disponibilidade de nutrientes e fatores de
lares, a estrutura e a função adesiva da adesão focal po¬ crescimento e de diferenciação.
dem ser reguladas durante processos celulares (como, Existem vários exemplos experimentais de con¬
por exemplo, durante a migração e a divisão celular), trole da diferenciação celular e da expressão génica pe¬
bem como sob condições experimentais. Vários agen¬ las integrinas. Células mamárias, quando cultivadas em
tes, como hormònios ou drogas que aumentam o AMP plástico, crescem como monocamadas e perdem a habi¬
cíclico intracelular, fatores de crescimento, substâncias lidade de sintetizar e secretar proteínas do leite, mesmo
tumorigcnicas e componentes (como as desintegrinas e na presença de prolactina (o principal hormònio esti¬
metaloproteinases) de venenos de animais peçonhen¬ mulador da produção de leite pelos alvéolos mamá¬
tos são capazes de desestruturar a adesão focal, o que é rios)." Entretanto, quando essas células são cultivadas
acompanhado de desagregação das Fibras de estresse e em um substrato recoberto com componentes da ma¬
comprometimento da adesão célula- matriz em células triz, elas formam estruturas semelhantes aos alvéolos
in vitro Fm condições in vivo, as junções de adesão mamários e passam a secretar quantidades significati¬
focal podem estar em constante estado de ruptura e vas de proteínas do leite, principalmente a (5-caseina."
formação, principalmente em situações que envolvem A adição de anticorpos contra a subunidade (51 da inte¬
movimentação da célula sobre o substrato, como ocor¬ grina, nessas culturas, bloqueia a produção de caseína,
re durante a migração e divisão celular. Durante a mo¬ sugerindo que o sinal da matriz é transmitido pelas
vimentação, a célula estende uma porção "proximal" integrinas.' Um outro exemplo interessante de expres¬
do seu corpo celular, a qual se adere Firmemente ao são génica regulada pelas integrinas, é o que ocorre nos
substrato por junções de adesão focal formadas "de monócitos. Estes precisam interagir com a matriz extra¬
novo", e, sequencialmente, retrai a sua porção "distai", celular durante a sua migração da circulação sanguínea
seguida de ruptura de junções de adesão focal antes ai para os sítios de inflamação. Experimentalmente, quan¬
localizadas. A repetição, em sequência, dessas etapas do os monócitos provenientes da circulação periférica
resulta em movimentação da célula em uma direção são cultivados em substrato contendo componentes da
determinada. Ainda não se pode explicar, em nível matriz extracelular, como flbronectina, colágenos ou
molecular, os mecanismos pelos quais a célula coorde¬ laminina, há uma rápida e significativa indução da sín¬
na, temporal e espacialmente, esses dois fenómenos tese de citocinas, como interleucinas e o fator de necro¬
antagónicos de formação e desagregação da adesão se tumoral a (TNF-a), que desempenham um papel
focal. Entretanto, como veremos a seguir, a ativaçào da importante no processo de defesa imunológica media¬
FAK, mediada pelas integrinas, parece ser uma etapa da pelos monócitos." Entretanto, os monócitos não sin¬
importante. tetizam tais fatores quando mantidos em cultura em
tubos de polipropileno sob constante agitação para evi¬
Integrinas como transdutores tar adesão."
de sinais intracelulares A interação com a matriz extracelular mediada
Em adição ao seu papel na adesão, as integrinas me¬ pelas integrinas é também importante nos processos de
deiam a transdução de sinais da matriz para o interior crescimento e de morte celular programada." A adesão
da célula. Algumas das moléculas e vias de sinalização da célula à matrizconstitui um fator "permissivo" para a
sob o controle das integrinas têm sido identificadas. En¬ divisão celular e, ao mesmo tempo, "inibidor" da morte

A Célula 105
Capitulo 6 JUNÇÕES CELULARES

Filamentos
intermediànos
F-actina
BP230
a-Actinina

Vinculina Paxilin

.
b
Matriz
extraocular
Figura 6.13 Diagrama mostrando um modelo da composi¬
ção boquimca e interaçóes entre as proteínas integrantes
das junções de adesão focal (a) e hemidesmossomo (b).
Acima dos esquemas, fotcxntaografias de uma junção de
adesão focal (a'Xseta) e de hemdesmossomos (b Kseta)
como são observados por mtaoscopia eletrónica. a' repro¬
duzida do artigo de Geiger et al. (J Cea So 1987: supl 8:
251). com autorização da Company of &ofog«st: b' reprodu¬
Matriz extracelular zida do artigo de Joazeiro e Montes (J Anat 1991: 175: 27).
com autorização da Cambridge University Press.

celular por apoptose. Vários tipos de células animais não morrem ao invés de sobreviverem para proliferar e
se dividem quando estão em suspensão numa solução invadir outros tecidos. Entretanto, os fenómenos de
fluida ou num gel de ágar. Se tais células forem postas crescimento e apoptose dependentes de ancoragem não
em contato com um substrato rígido, elas aderem-se, são observados em células derivadas de tumores ou
espalham-se e se multiplicam. Tal crescimento celular é transformadas com vírus oncogènicos, as quais não
denominado crescimento dependente de ancoragem. No entram em apoptose e, ainda, mantêm a propriedade de
caso particular das células epiteliais, quando são impe¬ se dividirem, mesmo na ausência de junções célula-
didas de se ancorarem ao substrato, além de não se matriz.
dividirem, entram em apoptose. O significado fisiológi¬ Quais são as vias de sinalização intracelular que
co da apoptose regulada por ancoragem é relativamente medeiam todas essas açòes celulares induzidas pela inte-
fácil de se entender: a apoptose evitaria que células, ração da integrina à matriz? Embora, ainda, não exista
quando desprendidas da matriz, colonizassem outros uma resposta completa para essa pergunta, sabe-se que a
órgãos e comprometessem a função destes. Um possível EAK desempenha um papel central. Imediatamente após
papel da apoptose regulada por ancoragem é a a adesão da célula com a matriz, a EAK, que se localiza nas
supressão da formação de tumores. Quando as células junções de adesão focal, autofosforila-se em resíduos de
perdem o contato com a sua matriz extracelular, elas tirosina; quando a célula perde sua adesão ao substrato,

106 A Célula
essa enzima é desfosforilada." A autofosforilação da FAK interação entre essas duas moléculas do citoesqueleto. A
resulta em ativaçào da região da sua molécula responsável Figura 6.14 mostra algumas possíveis vias de sinalização
pela ligação com outras proteínas c também do seu domí¬ controladas pela integrina.
nio catalítico; a FAK passa, então, a interagir com várias
proteínas e a fosforiiar algumas delas nos resíduos de tiro-
sinas.*' Várias proteínas estruturais e enzimas são alvos da
FAK. A interação da FAK com proteínas da adesão focal,
Hemidesmossomo
seguida de fosforilaçào (como ocorre com a paxilina), Estrutura, bioquímica e função
pode ser importante no processo de recrutamento de no¬ O nome de hemidesmossomo é derivado da sua seme¬
vas proteínas para a região da adesão focal e na reorgani¬ lhança ultra-estrutural com uma metade do desmosso-
zação do citoesqueleto a partir desse local. Sob a açào da 1110." O hemidesmossomo aparece ao MF. como uma
FAK, várias enzimas também podem ser ativadas. resul¬ placa eletrodensa que medeia a adesão de células epite-
tando no desencadeamento de cadeias enzimáticas de si¬ liais com a sua membrana basal, conectando os fila¬
nalização intracelular, como a via da proteína cinase ati- mentos intermediários do citoesqueleto com a matriz
vada por mitógeno (MAPK, do inglês. Mitogen-Activated extracelular" '(Figura 6.1 ). Os hemidesmossomos,jun¬
Protein Kinase) e da fosfatidilinositol-3-cinase (a PI-3K). tamente com os desmossomos, por ancorarem o citoes¬
A FAK pode se ligar diretamente à P1-3K, ativando-a. A queleto aos sítios de forte adesão, entre a célula e a ma¬
PI-3K, por sua vez, desempenha importante papel na triz, e entre células, respectivamente, formam uma rede
inibição do processo de apoptosev' Após ativação indire- intracelular de filamentos intermediários que confere,
ta pela FAK, a MAPK se move para o núcleo, onde pro¬ ao tecido, resistência frente a forças de estresse mecâni¬
move a regulação de vários fatores de transcrição e a ex¬ co. O hemidesmossomo ocorre em células epiteliais,
pressão de proteínas importantes no processo de diferen¬ como os desmossomos, mas apresenta uma distribui¬
ciação e crescimento celular.*-*-' A MAPK pode também ção mais limitada que estes últimos. Os heniidesmosso-
fosforiiar e ativar diretamente uma outra enzima, a cina¬ mos são particulamente abundantes nas células basais
se da cadeia leve da miosina (MLCK, do inglês. Myosin da epiderme, mas também podem ser encontrados nas
Light Chain Kinase) :A': Essa enzima tem importante fun¬ células da córnea, nas células do epitélio de transição da
ção na contratibilidade do citoesqueleto e, portanto, na bexiga e em certos epitélios glandulares, como nas glân¬
motilidade celular. A MLCK fosforila a miosina II, dulas mamárias.' Certos epitélios simples, como os
1

expondo o sítio de ligação com a F-actina e permitindo a que revestem o trato gastrointestinal e respiratório,

Interação
IntegnnaMatnz

FAK
Autofosfoniação/Ativação

inas da Fosforilaçào de outras


-Proteínas Citoplasmãtícas
Cascata de
sinalização da
_ Cascata de
MAPK sinalização d<
PI-3K
MLCK

Contrailtx!-dade
do citoesqueleto
\
Adesão Expressão gènica
Diferenciação
Crescimento Inibição da
Apoptose
Motilidade

Figura 6.14 Possíveis vias de sinalização intracelular mediadas pelas integnnas (vide o texto).

A Célula 107
Capítulo 6 JUNÇÕES CELULARES

apresentam hemidesmossomos pouco definidos ultra- Uma outra proteína, que tem sido identificada
estruturalmente, cuja estrutura bioquímica também nos hemidesmossomos, é a BI'180, também reconheci¬
parece menos organizada.' da por auto-anticorpos de pacientes com penfigóide
Apesar da semelhança ultra-estrutural com os bolhoso.' Diferentemente da BP230, a BP 180 é uma
desmossomos, os hemidesmossomos apresentam uma proteína integral, ficando inserida na membrana
composição bioquímica bem distinta. A Figura 6.13b plasmática. A BP 180 provavelmente interage com a
mostra a estrutura bioquímica, até o momento docu¬ subunidade ct6 da integrina, por uma região do
mentada, dos hemidesmossomos. Em vez de caderinas, domínio extracelular localizada próxima à mem¬
o hemidesmossomo contém integrinas, que fazem a brana."' Essa região é o epítopo, reconhecido pelos
adesão da célula com a matriz extracelular. Até o mo¬ auto-anticorpos produzidos na doença penfigóide
mento, o único subtipo de integrina encontrado especi¬ bolhoso. Tem sido sugerido que a BP 180 teria a função
ficamente nos hemidesmossomos é a integrina de estabilizar a interação da integrina com o
cujo principal ligante da matriz é a laminina tipo 5. ' ' A citoesqueleto.
subunidade p4 apresenta um domínio citoplasmático
longo, o que a distingue dos outros tipos de subunidade Hemidesmossomos e doenças
p.:s Acredita-se que essa estrutura distinta explique o auto-imunes da pele
fato de a integrina c<6p4 ser a única associada aos fila¬ Por causa de sua importância como dispositivos de ade¬
mentos intermediários do citoesqueleto. O domínio ex¬ são à lâmina basal da epiderme, o comprometimento
tracelular da 04 tem a função de se associar à subunida¬ estrutural e o funcional dos hemidesmossomos está sem¬
de a(>. Ambos os domínios da molécula da subunidade pre associado a doenças vesicantes da pele. Um exemplo
1ÿ4 são importantes na formação do hemidesmossomo. é o penfigóide bolhoso. Essa dermatose é caracterizada
Anticorpos direcionados contra o domínio extracelular pela presença de bolhas grandes, tensas e subepidér-
dessa subunidade inibem a formação de hemidesmosso¬ micas, que podem se localizar em qualquer parte do
mos e perturbam a integridade estrutural de hemides¬ corpo, principalmente na região inguinal, nas axilas e nas
mossomos já formados. ' Por outro lado, a expressão in¬ superfícies flexoras dos antebraços. A evolução da doen¬
duzida de subunidades p4, sem o seu domínio citoplas¬ ça, o prognóstico e o tratamento do penfigóide bolhoso
mático, não inibe a formação de heterodímeros a(>($4 in são muito semelhantes aos já descritos para o pênfigo
vitro, embora os complexos formados não fiquem con¬ vulgar ou foliáceo. Com relação a sua etiologia, tem sido
centrados nos hemidesmossomos, mas estão difusa¬ proposto que os auto-anticorpos produzidos pelos por¬
mente distribuídos pela membrana plasmática. Esse tadores dessa doença comprometem a função de adesão
subtipo de integrina também está associado a cinases. dos hemidesmossomos, que são responsáveis por
Quando a integrina a6p4 interage com seu ligante extra¬ aderirem as células basais da epiderme á lâmina basal.
celular, a subunidade |Í4 é fosforilada nos seus resíduos Esses auto-anticorpos induzem a ruptura dos hemides¬
de tirosina; se essa fosforilação é inibida com inibidores mossomos, interferindo na interação entre a BP 180 e a
específicos de tirosina cinase, ocorre inibição da forma¬ subunidade a() da integrina.
ção dos hemidesmossomos. " Os hemidesmossomos estão também associados
Além da integrina ct6p4, várias proteínas são a outras desordens da pele. Por exemplo, na forma seve¬
encontradas na região da placa dos hemidesmossomos de ra da doença epidermólise bolhosa, associada à atresia
certos epitélios.'1M ' ' Entretanto,somente uma parece ser pilórica, foram identificadas mutações dos genes que
a principal e consistente constituinte dos hemidesmosso¬ codificam as subunidades cç, e P4" Em uma forma
mos na maioria do tecidos. Trata-se da proteína de 230 kDa, menos severa e benigna de epidermólise bolhosa, por
que é reconhecida por auto-anticorpos frequentemente sua vez, há expressão deficiente de BI' 180 e mutações
encontrados em pacientes portadores da doença derma¬ nos genes da BI'180 ou da laminina tipo 5.M " Portanto,
tológica vesicante, conhecida como penfigóide bolhoso. um melhor entendimento da estrutura e função dos
Por causa disto, esse polipeptídeo é conhecido pela sigla hemidesmossomos, e de seu correspondente intercelu-
BP230, do inglês, Bullous Pemphigoid antigen 230 kDa. A lar, os desmossomos, poderá contribuir no desenvolvi¬
BP230 fica localizada na região da placa do hemidesmos¬ mento de novos tratamentos para um grupo de doenças
somo e é uma provável molécula de ligação entre a integri¬ mutilantes e, em alguns casos, mortais.
na e os filamentos intermediários. A BP230 é homóloga á
desmoplaquina (proteína da placa dos desmossomos),
apresentando, portanto, um domínio central em forma
de bastão, flanqueado por duas extremidades globulares.
Conclusões
Emboranão demonstrado experimentalmente, acredita- As junções celulares são estruturas especializadas da
se que a região citoplasmática da subunidade [54 da inte¬ membrana plasmática que promovem a adesão e a intera¬
grina é o ponto de ligação com a BP230. ção da célula com o ambiente que a circunda, formado

108 A Célula
por outras células c pela matriz cxtracelular. As junções 12. Peterson MW, Gruenhaupt D. A23187 increases perme¬
são estruturas extremamente dinâmicas, que estão em ability of MDCK monolayers independent of phospho-
constante processo de formação e desagregação. A célula lipase activation. Am J Physiol 1990; 259: C69-76.
pode se utilizar dos seguintes mecanismos para regular 13. Li C. Poznansky MJ. Effect of FCCP on tight junction
tanto a estrutura como a função das junções celulares: ( 1 ) permeability and cellular distribution of ZO-1 protein
síntese ou inativação de moléculas da matriz extracelular in epithelial (MDCK) cells. Biochim Biophys Acta 1990;
(no caso especifico das junções célula-matriz); (2) bios- 1030: 297-300.
síntesc ou proteólise da proteínas integrantes da estrutu¬ 14. Collarcs-Buzato CB, McEwan GTA, Jepson MA,
ra das junções; (3) controle da agregação/desagregação do Simmons NL, Hirst BH. Paracellular barrier and junc¬
sistema de filamentos do citoesqueleto; e (4) modificações tional protein distribution depend on basolateral extra¬
pós-transducionais das proteínas das junções (principal¬ cellular Ca in cultured epithelia. Biochim Biophys
mente por fosforilação dos resíduos de serina/treonina ou Acta 1994; 1222: 147-58.
de tirosina dessas moléculas). A regulação fisiológica das 15. Rangachari PK. McWadc D. Peptides increase anion con¬
junções celulares é um evento fundamental em alguns ductance of canine trachea: an effect on tight junctions.
processos celulares, como comunicação intercelular, ade¬ Biochim Biophys Acta 1986; 863: 305-8.
são, diferenciação, crescimento e migração celular. Por 16. Madara I, Stafford J. Interferon-'/ directly affects barri¬
outro lado, a disfunção dessas estruturas de membrana er function of cultured intestinal epithelial monolayers.
pode resultar em vários estados patológicos. J Clin Invest 1989; 83: 724-7.
17. McRoberts JA, Aranda R, Riley N, Kang H. Insulin reg¬
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Capítulo 6 JUNÇÕES CELULARES

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A Célula 111
Capítulo 6 JUNÇÕES CELULARES

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112 A Célula
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

rinuclear pode apresentar-se dilatado e irregular. Quan¬


do por algum motivo o RE apresenta-se dilatado, é co¬
mum que o espaço perinuclear apresente o mesmo com¬
portamento. Como resultado da conexão entre o espaço
perinuclear e o RE, acredita-se que os conteúdos dos
dois sejam semelhantes. Assim, espera-se encontrar um
ambiente altamente redutor, com grande concentração
de cálcio e com as enzimas e proteínas envolvidas no
processamento dos peptídeos nascentes, como a pepti¬
dase do sinal, a FD1 (isomerase de dissulfeto em proteí¬
nas), glicosilases etc.

Figura 71 Ultra-estrutura da periferia nuclear de uma célula epitetal da Os complexos de poros


glândula mamária de ratas. Nesta figura é observado o envoltório nuclear e a permeabilidade nuclear
associado com a cromatina condensada (Cc) no interior do núcleo e a n-
bossomos na face dlopiasmática. O espaço perinuclear é evidente, sen¬
do interrompdo nos complexos de poro. Estendendo-se dos complexos Como já mencionado, a superfície do envoltório nuclear
de poro na direção nuclear existem canas preenchidos por cromatina é marcada pela presença de poros que correspondem a
frouxa (setas). O asterisco indica uma dilatação do espaço perinuclear. pontos de fusão entre as membranas nucleares interna e

ainda a continuidade do espaço perinuclear com a


luz do RE.
For outro lado, a membrana nuclear interna apre¬
senta características únicas de associação com a lâmina
nuclear e com a cromatina ou cromossomos. Essa mem¬
brana apresenta componentes fundamentais à estrutu¬
ração nuclear, principalmente por apresentar receptores
para componentes da lâmina nuclear e por ancorar
componentes proteicos. Dentre as proteínas intrínsecas
da membrana nuclear interna, existe a p58 (ou LBR),
também conhecida como receptor para a lamina B (um
dos principais componentes da lâmina nuclear), várias
outras proteínas que conectam a membrana nuclear in¬
terna com a lâmina nuclear, conhecidas como LAPipro¬ Figura 7.2 Aspectos da penfena nuclear de uma cétuía espermática de
teínas associadas à lâmina nuclear) e a emerina. Das H/la ranki. Podem ser observados complexos de poro (pontas de seta).
alguns dos quais associados com matenal em trânsito (seta). Cortesia de
funções das proteínas associadas à membrana nuclear Sebastião R. Taboga
interna, destacam-se as que estão relacionadas à ligação
com a lâmina nuclear e as de interações com a cromati¬
na (em especial com a cromatina condensada), além do
envolvimento na própria formação do envoltório nu¬
clear (ver adiante). Estão presentes também enzimas di¬
versas, entre as quais encontram-se aquelas envolvidas
com o metabolismo nuclear do fosfatidilinositol e da
biossíntese do colesterol.
Um terceiro domínio das membranas nucleares
tem sido considerado e corresponde à extensão que
passa pelos complexos de poro (veja modelo mais adi¬
ante). Essa porção da membrana possui características
únicas. Felo menos duas das mais de 100 proteínas do
envoltório nuclear são restritas a essa região.
O espaço perinuclear geralmente é formado por
um distanciamento uniforme entre as duas membranas Figura 7.3 Superfície nuclear de uma célula trofoblâstica gigante. Sào
observados vários complexos de poros em corte tangencial do núdeo. Em
nucleares. Em alguns casos de estímulo hormonal ou de alguns dos complexos de poros pode-se observar uma partícula central
intoxicação por diferentes tipos de drogas, o espaço pe¬ (setas). Cortesia de Sima Katz.

114 A Célula
Figura 7.4 Distribuição de complexos de poro revelados pelo procedi¬
mento de criofratura. Superfície do núcleo de espermátides de Euctosto
heros (Hemíptero). com distribuição uniforme dos complexos de poro
Cortesia de Sônia Na* Bào.

externa (Figuras 7.1 a 7.6). Dada a complexidade dessas


estruturas, no que concerne aos seus aspectos composi¬
cionais, estruturais e funcionais, elas são denominadas
complexo dc poro.
O número e a densidade de complexos de poro são
bastante variáveis. Enquanto oócitos são extremamente
ricos em complexos de poro (c têm se prestado enorme¬
mente ao estudo dessas organelas), espermatozóides são
desprovidos deles. Durante a diferenciação destes últi¬
Figura 7.5 Distribuição dos complexos de poro em espermátides em afo¬
mos,existe um agrupamento dos complexos de poro em gamento de Dermatobia hxomnis. a. Corte taogeooal de uma espermátide.
uma região restrita do envoltório nuclear (Figura 7.5), evidenciando complexos de poro agrupados na região nuclear próxima à
antes que eles sejam eliminados por completo. cauda Conforme o plano do corte atinge o conjunto, diferentes aspectos
dos complexos de poro são observados. As pontas de seta indicam micro¬
Os complexos de poro, por onde é efetuado o tubules que se assooam à superfície nudear. AC: adjunto do centríoto, Ax:
transporte de proteínas, RNA e suas combinações atra¬ axonema. Cortesia de Irani Quagio-Grassiotto. b. Corte transversal em que
vés do envoltório nuclear, são estruturas macromolecu- são observados sete complexos de poro associados em região nudear
oposta ã de acúmulo de cromatma condensada Reproduzida do artigo de
lares que possuem massa molecular superior a 1 12.000 Iram Quagio-Grassiotto e Edi de Lello (Nfem. Insl. Oswaldo Cruz 1995; 90:
kDa (ou 112 megaDaltons). 537). com autorização das autoras e dos editores.
Vários modelos foram propostos para a organi¬
zação dos complexos de poro. Alguns deles foram apre¬
sentados por Franke et al. em revisão de 1981 e apare¬
cem com frequência em diversos livros de biologia celu¬
lar. Foi sempre aparente a distribuição circular em si¬
metria octagonal de partículas às vezes tidas como glo¬
bulares, às vezes tidas como bastonetes (Figuras 7.5 e
7.6). Essas partículas protrudem dos dois lados do enve¬
lope nuclear e os aspectos globulares aparentemente re¬
sultam de artefatos oriundos do processamento neces¬
sário a sua observação à microscopia elctrónica.
Com o uso de técnicas modernas de microscopia
elctrónica e reconstrução de imagem, foi proposto um
modelo para o complexo de poro. O modelo (Figura
7.7) apresenta uma estrutura formada por oito pares de
elementos verticais, denominados colunar e luminal, co¬
nectados em suas extremidades e na porção mediana de
maneira a formar anéis. Além disso, as subunidades co¬
lunares são também conectadas lateralmente na porção Figura 7.6 Características dos complexos de poro, exibindo a distribui¬
mediana interna do complexo, formando a porção mais ção de suas subunidades em simetna octagonal, assim como a presen¬
ça de um elemento central (seta). Reproduzido do artigo de K. Fujimoto
estreita do canal, constituindo uma unidade anular. A e P. Pinto da Silva (European Journal of Cell Biology 1989: 50: 390).
membrana do envoltório nuclear passa entre as subuni- com autorização dos autores e da editora.

A Célula 115
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

Figura 7.7 Estrutura básca dos complexos de poro. a. Os complexos de poro possuem oito unidades fundamentais dispostas em simetria octagonal. Cada
unidade fundamental é formada por duas subunidades, uma colunar, voltada para o centro do complexo de poro (laranja), e uma luminal, voltada para o espa¬
ço perinuclear (azul), b. As diferentes unidades são conectadas nas extremidades citoplasmática e nudear. formando dois anéts (amarelo), c. Além desses
anéis, as subunidades colunares são conectadas na sua porção mediana, formando um anel no centro do canal (verde). A membrana nudear passa peto
espaço entre as subunidades colunar e luminal (linha tracejada). O espaço residual deixado pela membrana entre as duas subunidades forma, pelo menos,
do«s canais com cerca de 10 nm cada (linha brancas contínuas). Pode-se notar que esse arranjo final é bastante simétrico, aparentemente fundonando como
uma estrutura básica para o complexo de poro. Reproduzido do artigo de Hmshaw et al. (Cea 1992: 69. 1133). com autorização dos autores e da editora.

dades luminal e colunar. Com esse arranjo, além do ca¬ )á as primeiras observações sobre o complexo de
nal central, existem ainda, pelo menos, dois canais for¬ poro demonstraram a existência de um grânulo inira-
mados por essas diferentes subunidades. O diâmetro onular (Figuras 7.3 e 7.6), cujas análises de susceptibili¬
calculado para esses canais (cerca de 10 nm) permitiria dade enzimática posteriores demonstraram ser princi¬
a passagem de inúmeros compostos que podem, em palmente de complexos RNA-proteínas. Células em alta
algumas circunstâncias, difundir-se passivamente atividade de síntese possuem número aumentado dessas
através do envoltório nuclear. estruturas. Imagens clássicas da passagem de partículas
A estrutura apresentada deve corresponder apenas muito maiores que o diâmetro do poro foram sempre
a um suporte estrutural do complexo de poro. A simetria notadas,de forma que a partícula em trânsito se contorce
apresentada pelas faces nuclear e citoplasmática desse para se adaptar ao diâmetro estreitado do complexo de
modelo não corresponde a aspectos diferenciados já poro. Neste processo, parece haver uma acomodação da
observados para cada uma das faces do complexo de poro, estrutura quaternária do componente em trânsito, sem
como descrito antes, nem explicaria a função especializa¬ haver desnaturação deste (Figura 7.9). íi evidente a par¬
da de cada uma delas. Além disso, parece existir uma espé¬ ticipação do cesto formado pelos filamentos que se pro¬
cie de afunilamento do canal central pela existência de gli- jetam para o interior do núcleo.
coproteínas que se estendem em direção ao centro. A Acredita-se que o complexo de poro possua cerca
estrutura apresentada também não considera os compo¬ de 100 proteínas diferentes associadas entre si na for¬
nentes filamentares que formam a estrutura em cesto na mação da sua estrutura e na execução de suas funções.
face nuclear (figura 7.8). Ilá filamentos que se projetam a Uma característica comum a algumas das proteínas do
partir das diferentes subunidades em direção ao citoplas¬ complexo de poro é a presença de resíduos de N-acetil-
ma, mas eles são individualizados e não arranjados em glicosamina ligados a resíduos de serina (O-ligados).
cesto, como acontece na face nuclear (Figura 7.8). Atualmente, já se conhece a localização de algumas pro-

116 A Célula
Figura 7.8 AJém da estrutura básica apresentada na figura
anterior para o complexo de poro. alguns outros aspectos
mcrfológcos garantem, ao meoos em parte, a assimetria
apresentada pelos complexos de poro. a. Na face nuclear
sáo encontrados filamentos fcngos. que se originam em
cada uma das oito unidades principais e que se igam a um
anel dtslal. formando uma espécie de cesto (setas), b. Na
face otoplasmática. também existem filamentos que se pro-
jetam na direção do citoplasma, a parttf de cada unidade.
Esses filamentos sáo livres e se colapsam (pontas de seta)
frente ao processamento para a microscopia Reproduzido
do artigo de Jamik e Aet> (Journal of Structural Biology

>%
teínas específicas dentro do complexo de poro (Figura
1991; 107: 291). com autorização dos autores e daeditora

Uma função importante dos complexos de poro,


7.10). Algumas dessas proteínas são descritas a seguir. geralmente pouco considerada, é a participação dessas
A proteína NUPI 53 localiza-se no anel existente estruturas na compartimentalizaçâo das proteínas
na extremidade dos filamentos que formam a estrutura intrínsecas da membrana nuclear, mantendo os ambien¬
em cesto da porção nuclear do complexo de poro c apre¬ tes tipicos das membranas interna e externa e da própria
senta motivos Zn-finger, característicos de proteínas que membrana associada ao complexo de poro. Em oposição
se ligam ao DNA ativo em transcrição. Alguns autores a essa ideia está o fato de que algumas proteínas virais
supõem que essa propriedadepoderia resultar na aproxi¬ difundem-se livremente da membrana do RE para as
mação da maquinaria de transcrição dos seus pontos de diferentes membranas nucleares. Alguns autores supõem
saída do núcleo ou, pelo menos, organizaria os canais que a passagem de, pelo menos, algumas das proteínas da
preenchidos por cromatina frouxa que se estendem dos membrana nuclear interna se faça através dos canais de
complexos de poro ao interior do núcleo. 10 nm existentes entre as subunidades do complexo de
A proteína p62 ocupa a região central do complexo poro. Foi demonstrado que o anel distai da estrutura em
de poro, estando exposta tanto na face citoplasmática cesto voltada para o interior do núcleo é modulado por
quanto na face nuclear. Essa proteína apresenta resíduos cálcio, abrindo e fechando à semelhança de um diafrag¬
de N-acetilglicosamina e parece ser fundamental ã trans- ma, na presença e ausência do ion, respectivamente
iocação de macromoléculas através do complexo de poro. (Figura 7.11).
A gp210 é uma proteína transmembrana de 210
kDa que se localiza no segmento de membrana que pas¬
sa pelo complexo de poro. No espaço perinuclear, essa
proteína possui uma extensa porção aminoterminal rica O transporte através dos
em resíduos de manose. A ligação de anticorpos específi¬ complexos de poro
cos a essa região inibe o transporte através do complexo Após a identificação dos complexos de poro, com o auxi¬
de poro, sem no entanto, desestruturá-lo. lio da microscopia eletrônica, passou-se a acreditar que
A NUP214 é outra proteina com resíduos de N-acetil¬ partículas de pequeno tamanho passam livremente
glicosamina que se localiza na face citoplasmática, aparen¬ através do envoltório nuclear. O limite desse tamanho
temente associada aos filamentos da porção externa. A pre¬ seria ditado não pelo diâmetro do poro propriamente
sença de segmentos capazes de formar estruturas coiled- dito, mas pelos componentes aparentemente fibrilares
coil sugere a possibilidade de formação de filamentos e de que se estendem em direção ao seu centro.
interaçào com o citoesqueleto. Essa proteína possui tam¬ Alguns experimentos, utilizando ions ou solutos
bém motivos Icuciite-zippcr,envolvidos em interaçòes pro- de baixa massa molecular, demonstraram que partícu¬
teina-proteína, talvez importantes nos processos de trans- las com até 4,2 kDa difundem-se passivamente através
locaçâo de proteínas para o interior do núcleo. do envoltório nuclear, o que seria compatível com a
Também associada aos filamentos citoplasmáti- existência de canais aquosos com cerca de 9 a 10 nm de
cos está a Trp/p265. Essa proteína apresenta uma grande diâmetro. Componentes de 12 a 50 kDa também difun¬
extensão em a-hélice, capaz de formar coiled-coil, apa¬ dem-se através do envoltório nuclear, porém com velo¬
rentemente estruturando e ancorando os filamentos ci- cidades inversamente proporcionais aos seus tamanhos
toplasmáticos ao complexo de poro. (Quadro I).
Da mesma forma, fundamental ao processo de Entretanto, já na década de 1960, experimentos
translocação de proteínas para o interior nuclear, é a com microcletrodos foram capazes de determinar a
proteína RanBI'2 que se associa aos filamentos cito- existência de uma diferença de potencial estabelecida
plasmáticos do complexo de poro e é capaz de se ligar pelo envoltório nuclear entre o citoplasma e o núcleo.
à CTPase envolvida nesse processo. Isso indicava que o envoltório nuclear não só constituía

A Célula 117
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

RanBP2/Nup358
Can/Nup214

Complexo p62
Citoplasma

POM121
Núcleo

Complexo p62 + Nup93

Complexo p62: p62-p58-p54-45

Figura 7.10 Localização de algumas proteínas do complexo de poro. de


acordo com as principais estruturas Algumas dessas proteínas estão
descntas no texto

lar programada (apoptose), por exemplo. Em várias si¬

m
tuações, foram demonstradas variações na concentra¬
ção nuclear de cálcio durante alterações fisiológicas da
célula. Por outro lado, em outros tipos celulares, como
em alguns oócitos, parece não existir qualquer diferen¬
ça entre as concentrações nuclear e citoplasmática des¬

9E9HH&3
Figura 7.9 Exportação de partículas de nbonuctooproteínas através do
ses ions. Então, pode-se concluir que essas variações re¬
sultem de variações funcionais específicas do tipo celu¬
lar c do momento fisiológico, além de reforçar a ideia
da existência de mecanismos de controle das concentra¬
complexo de poro. Em a são observadas partículas de nbonucleoproteínas ções iónicas associadas ao envoltório nuclear, não
em trànsío na direção do citoplasma de células da glândula salivar de necessariamente exclusivos dos complexos de poro.
Chironomus. As partículas a serem exportadas tém diâmetro bem maior Acredita-se, por exemplo, que o cálcio acumulado no
que aquele do complexo de poro e se deformam para passarem peto anel
distai da estrutura em cesto da face nuclear. Em b são mostradas ascarac¬ espaço perinuclear tenha importância na regulação da
terísticas dos complexos de poro de oòatos de anfíbios preparados da concentração intranuclear de cálcio, sendo necessário,
mesma forma, que carecem de elementos em trânsito tão facilmente iden¬
tificados como na glândula do inseto. c corresponde a duas séries de com¬ para isto, que haja transportadores de cálcio em nível da
plexos de poro selectonados da primeira imagem, demonstrando a pas¬ membrana nuclear interna.
sagem das partículas em direção ao citoplasma E importante lembrar que Embora já tenha sido observado o brotamento de
a deformação dessas partículas não está associada â desnaturação dos vesículas das membranas nucleares, o transporte de
seus componentes. Reproduzido do artigo de Tafcott e Moore (Trends Ceil
Biol 1999: 9. 312). com autorização da tisevier Science. macronioléculas é dependente basicamente das trocas
que ocorrem no complexo do poro. Proteínas e RNA
uma barreira à passagem de íons, mas também man¬ são transportados à custa de gasto de energia através
tinha uma diferença em suas concentrações, apesar da dessas estruturas. Alguns detalhes dos diferentes tipos
existência dos complexos de poro confirmada pela de transporte núcleo citoplasmático são apresentados
microscopia eletrónica. no Quadro I.
Além disso, mais recentemente, grande atenção A translocaçào de componentes na direção nu¬
foi dispensada à identificação dos mecanismos de con¬ clear ocorre cm um processo de duas etapas. A pri¬
trole da concentração nuclear de cálcio, face à impor¬ meira corresponde à ligação com o complexo de poro
tância desse íon na regulação de diversos processos nu¬ e a segunda, à translocaçào propriamente dita através
cleares, destacando a ativaçào de endonucleases, que do canal. Como mencionado, macromoléculas maio¬
tem papel importante em processos como a morte celu- res que o diâmetro do poro são também translocadas,

118 A Célula
w
Figura 7.11 Aspectos da face nocfear do envoltório nuclear.
revelados peia microscopia de força atómica As preparações
sao observadas a fresco, sem fixação. Na ausência de cátao. há
um estreitamento do diâmetro do anel distal do cesto nuclear.
como mostrado pelas setas na imagem e no padrão computado¬

o
rizado obtido pela amostragem de diversas estruturas observa¬
das. Na presença de cálcio, há um relaxamento da estrutura.

&
que apresenta um maior diâmetro, como pode ser observado na
imagem e no padrào computadorizado. A proposta de funciona¬
mento desse anel utiliza um eíemento semelhante a um diafrag¬
ma. localizado no anel distal do cesto nuclear, que se abriria na
presença de cálcio. Reproduzida do artigo de Stoffler et al (J Mol
Sem cálcio Com cálcio Biol 1999; 287: 471). com autorização da fElsevÿer.

sofrendo modificações conformationals necessárias proteína denominada Ran-GTP. Hssa molécula associa-
que ocorrem com gasto de energia. A existência desse se à importina, desfazendo o complexo. A dupla impor-
sistema de duas etapas é confirmada pela demonstra¬ tina- Ran-GTP segue para o citoplasma. No citoplasma,o
ção de que a depleção de energia impede a translo- GTP é hidrolisado a GDP e o complexo se desfaz, dispo¬
cação do material com destino nuclear, mas não a sua nibilizando a importina para um novo ciclo de transpor¬
ligação com o envoltório nuclear (figura 7.12). te para o interior do núcleo (Figura 7.13).
O transporte de proteínas citoplasmáticas para o Outros mecanismos atuam no controle do tráfe¬
núcleo depende da existência de uma sequência de locali¬ go de material no sentido núcleo-citoplasma. No caso
zação /iirt7enr(NLS. nuclearlocalization sequence), que cor¬ do transporte de RNA. a complexação com proteínas é
responde a um conjunto de aminoácidos, geralmente de fundamental, sendo que somente os complexos RNA-
caráter básico, que são reconhecidos por receptores cito- proteínas podem ser translocados para o citoplasma.
plasmáticos. conjuntamente denominados importinas, e No núcleo, ocorrem várias etapas de processamento e
então direcionados ao complexo de poro, o que garante a controle de qualidade dos diferentes tipos de RNA, an¬
sua intemalização. Alguns dos mecanismos reguladores da tes que eles adquiram a estrutura adequada para serem
translocaçáo de proteínas residem na exposição ou blo¬ transportados para o citoplasma. Neste caso, a retenção
queio dessas sequências, o que pode ocorrer por alterações das moléculas imaturas no núcleo tem grande impor¬
na conformação da proteína, promovidas por modifica¬ tância. O RNA 5S, uma das moléculas que faz parte da
ções pós-traducionais ou pela associação com fatores estrutura dos ribossomos é um exemplo da necessidade
específicos (que pode ser um hormònio esteroidal. por de complexação com proteínas para a exportação de
exemplo). Além disso, tem sido demonstrado que modifi¬ RNA do núcleo. O RNA 5S só é transportado para o
cações covalentes por fosforilação também são importan¬ citoplasma após a sua ligação com a proteína ribosso-
tes na regulação do transporte. Se a fosforilação ocorre em mal L5 ou com o fator TFIIIA de transcrição do gene
um dos aminoácidos da sequência de localização nuclear. 5S. Se a interaçâo com esses componentes é inibida,
o transporte é reduzido e a proteína acumula-se no cito¬ existe um acúmulo do RNA 5S no núcleo.Além disso, é
plasma. Se a fosforilação ocorre em sítios adjacentes, mas necessária também a associação com uma classe de mo¬
a uma certa distância tia NLS, o transporte é acelerado. léculas denominadas exportinas. A Ran-GTP também
Hm outras situações, a sequência pode ser apenas está envolvida nesse processo ( Figura 7. 1 3). No caso dos
estrutural e não residir necessariamente na sequência RNA mensageiros, as nucleoporinas interagem com a
primária da proteína. Isso significa que a sequência de cauda poli-A, para que a molécula processada possa ser
localização nuclear somente é formada devido a um transportada para o citoplasma.
arranjo especifico encontrado em uma certa conforma¬ Tanto a importação como a exportação pelo
ção da proteína. Além disso, algumas proteínas podem complexo de poro depende de uma maior concentra¬
também ser transportadas para o interior do núcleo sem ção no interior do núcleo de moléculas de GTP. A
possuir a NLS, atingindo o núcleo por interaçòes com troca da molécula de GDP associada à Ran por GTP
outras proteínas competentes para a translocaçáo. dentro do núcleo é feita pela Rccl/Prp20 (ou GF.F,
O complexo proteína e importina, após ser trans- guanine exchange factor ), que garante um estoque
locado para o núcleo, é desfeito pela associação com uma sempre elevado de Ran-GTP no núcleo. Já no citoplasma,

A Célula 119
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

As vias de transporte de moléculas entre o núcleo e o citoplasma


Diferentes moléculas atravessam os complexos de po¬ equilibrar as suas concentrações nos dois comparti¬
ro. A existência de moléculas que se concentram no mentos. Por outro lado, para aqueles componentes que
citoplasma ou no núcleo demonstra a existência de são concentrados no núcleo, há o processo de impor¬
mecanismos de transporte na direção do comparti¬ tação mediada por sinal (c). Esses componentes náo
mento alvo e/ou mecanismos de retenção, que impe¬ passam por difusão simples através do complexo do
dem o transporteenquanto a molécula náoestá madu¬ poro e dependem de sinais específicos (sinais de locali¬
ra ou mesmo o seu retorno ao compartimento de ori¬ zação nuclear - NLS), reconhecidos por receptores
gem. A figura abaixo resume quatro tipos de transporte citoplasmáticos, que medeiam a sua interação com o
de moléculas através do complexo de pom. Pelo pro¬ complexo de poro e facilitam a sua translocaçào para o
cesso de difusão (a), moléculas que possuem massa núcleo. Da mesma forma, para aqueles componentes
molecular até 50 kDa passam livremente pelo comple¬ que se originam no núcleo e precisam ser transporta¬
xo de poro. estabelecendo um equilíbrio entre os dois dos para o citoplasma, existe o mecanismo de expor¬
compartimentos, a não ser que os mecanismos de re¬ tação mediada por sinal (dependentes do sinal de
tenção, mencionados acima, concent rem-nas num dos exportação nuclear - NES)(d). Neste caso, são trans¬
lados do envoltório nuclear. Quando as moléculas portados, principalmente, os complexos RNA-proteí-
apresentam massa molecular acima de 50 kDa, a sua nas que se destinam ao citoplasma. Esses componentes
passagem pelo complexo de poro depende de outros só entram no sistema de exportação nuclear, quando
fatores além da sua maior concentração em um dos os mecanismos de retenção são removidos, após o
compartimentos. No processo de difusão facilitada (b), apropriado processamento do RNA. Algumas pro¬
as moléculas a serem transportadas interagem com priedades adicionais desses diferentes processos de
componentes do complexo de poro,que auxiliam a sua transporte através do complexo de poro são mostradas
passagem para o outro compartimento. Aparen¬ na figura abaixo. É importante ressaltar que os recep¬
temente, não há restrição de tamanho para a passagem tores (e carreadores associados a eles) são transporta¬
dessas moléculas, cujo transporte depende da açáo do dos de volta para o compartimento de origem, sendo
complexo de poro. mas a passagem se dá no sentido de reutilizados na mesma via de transporte.

Difusão Difusão facilitada


-Náo é inibxlo a 4°C
O Gtoptasma -Inibido a 4°C
-Independente de - Depende de interação com
energia o complexo de poro
- 50 kDa
Tamanho máximo de
- Independente de energia
EnvoUòno - Sem restrição de tamanho
nuclear
<50 KDa o
> 50 kDa O
Proteína que
interage com o
Partató poro
central Cesto
nuclear

Importação mediada por Exportação mediada por sinal


sinal -
Depende de interação com o
- Requer NLS
- Requer receptor para
poro
- Requer NES

-
NLS
Dependente de energia - Requer receptor
Envoltório - Dependente de energia
-Inibido a 4'C
nuclear - - Inibido a 4"C
Material a ser Receptor para
importado exportação
Receptor —i Cesto Material a ser
para importação nudear exportado
Esquema baseado no ooginal pubbeado por Talcott e Moore (Trends Cefl BoM999; 9; 312). com autorização da Elsevier Soence.

120 A Célula
a molécula responsável pela hidrólise do GTP é a Rnal, rocem normalmente paralelos entre si ou na forma de
que ativa a capacidade GTPásica da Ran (Figura 7.13). anéis concêntricos (Figuras 7.14 e 7.15).
Essas estruturas são encontradas em diferentes
tipos celulares animais e vegetais, mas estão marcante¬

__
mente presentes nas células germinativas masculinas e
As lamelas aneladas femininas de inúmeras espécies. As lamelas aneladas
As lamelas aneladas representam conjuntos de mem¬ são também frequentes em células tumorais.
branas empilhadas, formando cisternas, duas a duas. As lamelasaneladas aparecem interligadas a dife¬
Cada dupla de membranas é atravessada por canais ou rentes organelas, mas suas associações com componen¬
poros que se assemelham aos complexos de poro do tes do RE rugoso são as mais proeminentes.
envoltório nuclear. Os conjuntos de membranas apa-


gr
£w
njp /*rvn

citoplasma A i
núcleo
i r i i i
|
£ GDP
gr w
u<U
Figura 7.12 Efeito da depleção de ATP na importação de proteínas para o
núcleo celular, a. Em condições de inibição da sintese de ATP. as proteínas
que lèm localização nuclear são acumuladas no «oplasma. mesmo que a
associação dessas mesmas proteínas com o envoltório nuclear, muito Figura 7 13 Esquema dos processos de importação e exportação por
provavelmente com os complexos de poro (observe o aspecto interrompido meio do complexo de poro. envolvendo a hidrólise de GTP. Há sempre
da marcação na superfioe nudear - setas), não seja afetada b. Se o inibidor uma maior concentração de Ran-GTP no interior do núcleo, o que é
da sintese de ATP é removido, o transporte ocorre normalmente e as proteí¬ garantido peta atividade da GEF. que substitui a molécula de GDP por
nas se acumulam no núcleo. Embora esse efeito seja observado, é bem GTP Jà no citoplasma, a GAP (GTPase-activating protein) ativa a açáo
conhecido que a transkcaçào em si não é dependente de energia Parece GTPásica da Ran. fazendo com que o GTP seja divado em GDP. Esse
que a restituição dos componentes associados ao reconhecimento da NLS e eido é importante para garanbr o transporte da importna [1 e das molécu¬
outras proteínas acessórias e que partiòpam do transporte é a etapa que las a ela associadas.
depende de energia. Reproduzido do artigo de Richardson et al (Cea 1988;
52: 655). com autorização dos autores e da editora

.. . RB .

: ÿ

ÍR"1
Figura 7.14 Lamelas aneladas de oóctos de réptil. Grupos de lamelas Figura 7.15 Lamelas aneladas em oóotos de peixe Nessas células são
aneladas aparecem em arranjos paralelos no citoplasma destas células e frequentemente observadas lamelas aneladas concêntricas. A similari¬
estão associadas à fase de crescimento que ocorre em alguns períodos do dade entre as estruturas individuais com segmentos do envoltório nuclear
ano. em correspondência aos períodos que antecedem a estação reprodu¬ é marcante. Cortesia de Edrmr Carvalho.
tiva. Reproduzido do artigo deAndreuccetti e Taddei (Cell Tissue Res 1990;
259: 475). com permissão dos autores e da editora. RB = "corpos nbosso-
-
mais"; AL = lamelas aneladas: DM "massa densa fibrogranular"

A Célula 121
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

Nos últimos anos, com as facilidades na obtenção A composição da lâmina nuclear é basicamente
de sondas moleculares específicas, foram constatadas protéica, com predomínio das laminas nucleares (lc-se
algumas semelhanças composicionais entre os comple¬ laminas nucleares), lissas proteínas pertencem ao grupo
xos de poro das lamelas aneladas e aqueles do envoltório das proteínas dos filamentos intermediários do citoes-
nuclear. Pode-se também mencionar a presença de pro¬ queleto e suas propriedades estruturais e de agregação
teínas glicosiladas com resíduos de N-acetilglicosamina na formação de filamentos podem ser vistas no Capi¬
(revelados pela lectina do gérmen de trigo - WGA) e de tulo 18. As laminas apresentam-se como dois tipos
algumas outras proteínas constituintes dos complexos principais, distintos nos seus comportamentos durante
de poro nuclear, principalmente a p62 e a p215. a divisão celular. Laminas do tipo A/C são solubilizadas
As funções dessas estruturas permanecem desco¬ da lâmina nuclear quando o envoltório nuclear é deses-
nhecidas,assim como existem controvérsias quanto â sua truturado ao final da prófase ou na pró-metáfase (Figu¬
origem. As funções sugeridas para as lamelas aneladas ra 7.17). As laminas do tipo B também se dissociam da
passam pela concentração de alguns tipos de enzimas, de lâmina, mas permanecem associadas a vesículas resul¬
hormònios esteróides, pela origem de organelas mem- tantes da desestruturação do envoltório nuclear. Tanto
branosas e do próprio envoltório nuclear e pelo armaze¬ as laminas do tipo A quanto as laminas do tipo B sâo
namento de cálcio. Parecem mais plausíveis as funções de aciladas (recebem um radical isoprcnil - veja Capítulo
reservatório de diferentes tipos de biomembranas (prin¬ •I) como modificação pós-traducional. Esses radicais
cipalmente sugerida pelas associações entre as lamelas parecem aluar no destino desses componentes para o
aneladas e diferentes organelas membranosas), e como interior nuclear e na sua ancoragem em membranas.
estoque de RNA mensageiros e de outros complexos Entretanto, o radical isoprenil das laminas do tipo A é
RNA-proteínas (como sugerido pelo constante acúmulo removido logo após a sua associação com a membrana
desses materiais em associação com diferentes regiões interna, enquanto o da lamina B é mantido e parece
das lamelas aneladas, e pela proximidade destas com ele¬ garantir, ao menos em parte, a sua associação com as
mentos do RE). membranas, mesmo quando o envoltório nuclear é de¬
sintegrado durante a divisão celular.
Como já mencionado anteriormente, existe uma
proteína integral da membrana interna, a p58, â qual tem
A lâmina nuclear e a reorganização do sido atribuída a função de receptor da lamina B. Esse re¬
núcleo ao final da divisão celular ceptor aparentemente garante a associação da lamina B
com a membrana em reforço ao radical isoprenil.
A lâmina nuclear corresponde a uma estrutura eletro- Ao final da separação dos lotes cromossómicos,
densa de espessura variável e justaposta â face interna na telófase, inicia-se a reestruturação do envoltório nu¬
do envoltório nuclear (Figura 7.16). A lâmina possui clear. Evidências ultra-estruturaisdemonstram que, nes¬
uma espessura mais frequente com cerca de 10 nm, mas ta fase, existe a associação de pequenas vesículas junto â
podendo atingir até 200 nm em alguns tipos celulares superfície dos cromossomos. Essas vesículas fundem-se
especiais, como alguns protozoários.

Figura 7.17 Imunolocalizaçáo da lamma B em células em cultura. A lami¬


na B locaiiza-se exclusivamente na lâmina nuclear em células interfásicas
Figura 7.16 A lâmina nuclear apresenta-se como uma camada eletroden- (I). Durante a mitose (M), a lâmina nuclear é desintegrada e a marcação
sa, localizada junto ã superfície interna do envoltório nuclear (setas). Na para a lamina B é difusa no citoplasma, embora alguma concentração
maiona das células, esta lâmina é discreta, como nesta célula embnonária junto aos elementos do fuso mitótico possa ser identificada. Reproduzido
de ave. Acredita-se que existam expansões da lâmina para o interior do do artigo de Georgatos et al. (J Ceil Science 1997; 110: 2129). com autori¬
núcleo e que elas façam parte do nucleoesqueieto. zação da Company of Biologist

122 A Célula
Mutações nos genes que lares e, aparentemente, contribuem para diminuir o
II codificam proteínas da lâmina efeito de mutações deletérias nos genes das laminas
nuclear são causas de distrofias A/C. Esse tipo de distrofia pode ser reproduzido expe¬
rimentalmente por meio da produção de camundon¬
São várias as proteínas que fazem parte tia lâmina gos knock out para o gene das laminas A/C.
nuclear. Dentre elas. destacam -se as laminas,discutidas Por outro lado, alguns tipos de mutações nos
neste capitulo. As laminas A/C e uma outra proteína da genes das laminas A/C estão associados a lipodistrofia
lâmina nuclear, a emerina, têm sido implicadas em um familiar do tipo Dunnigan. Não surpreendentemente,
tipo de distrofia muscular, a Distrofia Muscular de os knock out para as laminas A/C também se caracteri¬
Emery- Drevfuss. No caso das mutações nos genes das zam por uma perda progressiva dos adipócitos.
laminas, a distrofia tem caráter autossômico, enquanto Uma outra manifestação da ausência de laminas
a associada à emerina tem caráter ligado ao cromosso¬ A/C funcionais é na neurodegeneraçáo periférica que
mo X. Esse tipo de distrofia muscular atinge adolescen¬ ocorre em pacientes com a síndrome de Charcot-
tes e se caracteriza por encurtamento dos músculos da Marie-Tooth (veja Capitulo 6). Mutações nos genes
perna e do antebraço. Na maioria dos casos, os proble¬ das laminas B também leram a alterações nucleares. A
mas cardíacos manifestam-se entre os 20 c 40 anos. anomalia de Pelger-Huct foi recentemente relacionada
Nos casos mais graves há severa disritmia ventricular a mutações nestes genes. Sua principal característica é
(levando à morte súbita). O aumento de creatinina a presença de granulócitos com núcleos arrendonda-
plasmática revela, na maioria dos casos, lesões nas célu¬ dos, ao invés de apresentarem a típica lobulaçáo obser¬
las musculares. Essas células apresentam tamanho vada nestas células. Os pacientes podem apresentar
variável e as do tipo Isão atróficas. A distrofia muscu¬ também encurtamento de alguns dos ossos longos.
lar decorrente de mutações nos genes de proteínas
associadas à lâmina nuclear não é bem entendida.
Acredita-se que as proteínas da lâmina nuclear (I) in¬
terajam com fatores de transcrição específicos que são
necessários para a manutenção da integridade da célu¬
la muscular, (2) façam parte das estruturas de reforço
do núcleo que protegem a célula muscular do estresse
mecânico e (3) sejam responsáveis pela ancoragem de
heterocromatina à superficie internado núcleo, afetan-
do a expressão génica. Embora todas essas possibilida¬
des ainda não estejam comprovadas, a falha de qual¬
quer uma delas pode ser a responsável pelos danos das
células musculares. Entretanto, uma característica
comum das células afetadas é a desestruturação do
envoltório nuclear e o extravasamento do conteúdo
nuclear para o citoplasma, como observado na figura
ao lado. Uma questão relevante é a razão pela qual as
células musculares são alvo das modificações, uma vez Ultra-estrutura de uma célula muscular de um paciente com distrofia
que todas as células carregam a mesma alteração gené¬ muscular de Emery-Dreyfuss, mostrando a irregularidade do contorno
nuclear, assim comoa ausência do envoltório nuclear em determinados
tica. Uma provável explicação está no fato de que as segmentos do núdeo. expondo o conteúdo nuclear ao citoplasma.
células musculares têm pouquíssimas laminas do tipo Reproduzido do artigo de Fidzianska e Hausmanowa-Petrusewicz (J
B1,que são bastante abundantes nos outros tipos celu¬ Neurol Sei 2003; 210: 47). com autorização da Elsevier.

umas às outras e reconstituem o envoltório nuclear. A fosforilação desestabiliza as associações intermolecula-


Pouco se conhece sobre o comportamento dos comple¬ res das laminas entre si e com outros componentes da
xos de poro durante essa fase de reestruturação do en¬ lâmina nuclear. Quando o envoltório precisa ser refeito,
voltório nuclear, mas algumas proteínas associadas a eles são empregadas laminas do tipo A, que foram desfosfori-
tornam-se difusas no citoplasma, enquanto outras são ladas por fosfatases, também associadas ao ciclo celular.
associadas a pequenos elementos do RE. Esse processo é esquematizado na Figura 7.18.
Já há algum tempo, foi demonstrado que as lami¬ Embora outras proteínas possam estar presentes
nas do tipo A são removidas da lâmina nuclear por sofre¬ principalmente na associação das vesículas que vão reformar
rem fosforilaçòes por cinases especificas do ciclo celular. o envoltório nuclear com os cromossomos, as laminas nu-

A Célula 123
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

m Especializações do
envoltório nuclear
Formas irregulares, sulcos da superfície e recent as trocas núcleo-citoplasmáticas, promovendo
retículo nuclear uma ampliação da superfície nuclear. Em algumas si¬
tuações. fica clara a associação desses canais com do¬
Algumas células, como aquelas das glândulas saliva¬ mínios nucleares específicos, como o nucléolo (c).
res de alguns insetos, apresentam núcleo com forma¬ Análises fisiológicas mais detalhadas demonstraram
to bastante irregular (a). Esse formato é adotado pela a continuidade desses canais com o envoltório
ação do citoesqueleto de actina e sua forma aparen¬ nuclear e com o RE. Além disto, existe um mecanis¬
temente mantida pela lâmina nuclear. Em células de mo de liberação de cálcio para o interior do núcleo,
mamíferos, também são encontradas algumas varia¬ regulado por moléculas sinalizadoras e que permi¬
ções, como sulcos na superfície ou canais que se es¬ tem a disponibilização desse íon, que controla a fun¬
tendem para dentro do núcleo, mantendo-se revesti¬ ção de diversas moléculas para domínios nucleares
dos pelas membranas do envoltório e, às vezes, con¬ específicos, e não para o núcleo como um todo. Este
tendo complexos de poro (b). Em todos esses casos, sistema recebeu o nome de retículo nuclear (d).
acredita-se que se tratem de especializações que favo-

a. Núcleos com formato irregular em células da glândula salivar de b. Núcleo de uma célula epitelial da próstata ventral de rato, mostran¬
lepidóptero. Reproduzido do artigo de Henderson e Locke (Tissue Cell do um sulco profundo (setas).
1991: 23: 867). com autorização da Elsevier.

RE

c. Núcleo de uma célula vegetal, mostrado em reconstrução tridimen¬


sional (à esguerda). que toma vtsivel a existência de sulcos na super- d. Células de mamíferos mostrando a existência do retículo nuclear.
fioe nuclear, após marcação das membranas ótoplasmáticas e con¬ que mostra reaçào semelhante ao do RE (figura da esquerda) e que
sequente idenfcficaçào de suas projeções para o intenor do núcleo (no acumula cálcio (figura da direita). Reproduzido do artigo de Echevarria
meio. G) e sob contraste interferential, mostrando a proximidade entre et al. (Nature Ce* Biol 2003; 5: 440). com autorização de Mchael H.
o sulco (ou canal) observado na figura anterior e o nudéok) (Nc). Nathanson.
Reproduzido do artigo de Coikngs et ai. (Plant Cell 2000; 12: 2425),
com autorização daAmerican Society of Plant Biologists.

124 A Célula
Receptor para
A função de nucleação de microtúbulos em Citoplasma a lamina B
plantas

A divisão celular em vegetais é denominada acêntri-


ca, dada a ausência de centrossomos. lá há algum
tempo, entrctando, foi demonstrado que as molécu¬
.
lamina A. I
lamina B
Proteína onase
las que desencadeiam a polimerização dos microtú-
bulos estão associadas à superfície nuclear (e). Desta rm~
forma, núcleos de células vegetais isoladas são capa¬
zes de nuclear a polimerização de microtúbulos. Foi
também demonstrado que pelo menos algumas das
í m il
moléculas existentes na superfície nuclear das células
vegetais apresentam reação cruzada com anticorpos
produzidos contra moléculas associadas ao centros-
somo das células animais (f). Além disto, foi também
demonstrada a participação de tubulina y, como ele¬ Proteína fosfatase
mento auxiliar, associada à superfície do núcleo.

CROMOSSOMO

Figura 7.18 Controle da estruturação do envoltório nuclear pelo nível de


e. Polimerização de microtúbulos a partir de um núcleo de célula de fosfonlação das lâminas nucleares. A lâmina nuclear é composta princi¬
milho, utilizando tubulma purificada As setas apontam alguns dos palmente por proteínas conhecidas como laminas. Durante a mtérfase. a
microtúbulos. f. Identificação imunootoquimica de moléculas encon¬ lâmina nuclear é estruturada por laminas do tipo A e por laminas do tipo
tradas na superfície do núcleo de células de milho, utilizando um anti¬ B. Estas últimas iigam-se fortemente à membrana nuclear interna por
corpo produzido contra moléculas associadas ao centrossomo de célu¬ meio de um radical isoprenil e pela ligação com um receptor especifico
las de bovinos, e e f, reproduzidas do artigo de Stoppin et al. (Plant Cell (p58). Com o avanço do ckáo celular, ocorre a fosforilaçào das laminas A
1994; 6: 1099). com autorização da American Society of Plant por proteínas cmases específicas do eido celular. Uma vez fosfoniadas.
Biologists. as interações das laminas A enlre si e com a lamina B são enfraquecidas
e a lâmina nuclear é desfeita, o que concorre para a desestruturação das
membranas do envoltório nudear em pequenas vesículas Associadas a
essas vesículas permanecem as laminas B e seus receptores. Já as la¬
cleares apresentam papel fundamental na reestruturação minas A sâo sdubilizadas e dispersas peto dtoplasma. Na anàfase. existe
da lâmina nuclear e do envoltório nuclear conto um todo. um decréscimo da atividade das cmases com um concomitante aumento
da atividade de fosfatases que removem os fosfatos das laminas A A des-
Além desse papel na estabilização e reformação fosfonlação permite a reassociaçáo das laminas A com a superfície dos
do núcleo após a divisão celular, outras funções têm cromossomos, o que favorece o reagrupamento das vesículas contendo
sido atribuídas à lâmina nuclear. Dentre elas estão o laminas B e a reformação do envoltório nudear na superfície dos cromos¬
somosem descondensaçào na telófase.
possível envolvimento na ancoragem da cromatina e
papel na regulação da expressão gènica e duplicação
do DNA. Parte dessas funções é sugerida pelas asso¬ manifestação da distrofia muscular de Emery-
ciações entre componentes da lâmina nuclear e com¬ Dreyfuss (Quadro II).
ponentes da cromatina, assim como com a membra¬ Até o presente, não foram encontradas as laminas
na nuclear interna. Dentre as associações possíveis nem seus genes em células de vegetais superiores.Apesar
está a interação das laminas A/C com a emerina, uma disso, existe uma estrutura semelhante â lâmina nuclear
proteína da membrana nuclear interna. Essa associa¬ c proteínas com comportamento semelhante ao das la¬
ção é bastante importante na estabilidade do núcleo minas, pelo menos no que diz respeito ao comportamen¬
celular. Mutações induzidas no gene das laminas A/C to de associação â lâmina e dispersão durante a divisão
levam a distorções da forma do núcleo, assim como celular, que precisam ser melhor caracterizadas.
uma localização ectópica da proteína emerina, que
passa a ser encontrada no RE (Figura 7.19). Mutações
nos genes das laminas A/C ou da emerina levam à

A Célula 125
Capitulo 7 ENVOLTÓRIO NUCLEAR

Controle

lamina A/C lamina B1

Figura 7.19 Efeito de mutaçào no gene das


laminas A'C na forma nuclear e na localiza¬
ção da lamina B e da emenna Em a. sào
Mutante observadas a forma elipsóide do núcleo
(marcados com DAPI e observados pela
fluorescência azul) e a distribuição uniforme
das laminas AC. B1 e B2 (identificadas por
lamina A/C lamina B1 imunocitoquimica) em uma célula controle.
Em b e c, podem ser observadas as altera¬
ções da forma nudear causadas pela mula-
. a ausência de marcação para laminas
. uma distnbuiçào não uniforme das
laminas B1 e B2. Em c pode-se observar
que a emerina, normalmente restrita ao
Mutante envoltór>o nuclear, apresenta localização
atípica, distribuíndo-se pelo RE. Reproduzi¬
da do artigo de Muchir et al. (Exp Cell Res
2003; 291: 352). com autorização da
lamina B2 Emerina Elsevier.

A desestruturação do envoltório
nuclear no início da divisão celular
Até pouco tempo, acreditava-se que o envoltório nuclear
era desestruturado de maneira uniforme, dada a deses-
truturação da lâmina nuclear, como descrito anterior¬
mente. Alguns estudos demonstraram, entretanto, que o
envoltório nuclear rompe-se inicialmente num ponto
localizado da superfície do núcleo. Esse processo pode
ser observado na Figura 7.20. Foi também demonstrada
uma íntima associação do centrossomo com depressões
da superfície nuclear (Figura 7.21 ). Os estudos demons¬
traram então que a região de rompimento do envoltório
nuclear é diametralmente oposta à região de associação
do centrossomo com o núcleo e que, aparentemente,
nesta associação, ocorre uma distensão do envoltório Figura 7.20 Reconstruções tridimensionais das imagens obtidas por fluo¬
nuclear na região oposta,o que, em associação com a de- rescência. em diferentes momentos do rompimento do envoltório nuciear.
sestruturação da lâmina nuclear,levaria ao rompimento Em verde está a marcação para a lamina 81 e em vermelho, a marcação
para a histona H2B. No núcleo interfásico a lamina B está distnbuida por
do envoltório. Sabe-se também que há uma participação toda a superfície do núcleo e recobre uniformemente a cromatina. onde
bastante ativa dos microtúbulos do fuso em formação, encontra-se a histona H28. Observa-se inicialmente a formação de sulcos
assim como de moléculas de dineína que se ancoram na na superfície do núcleo que progridem para a formação de uma falha que
aumenta progressivamente, deixando mais e mais exposto o conteúdo
superfície nuclear e movimentam-se sobre os microtú¬ nuclear. Reproduzido do artigo de Beaudouin et al. (Celi 2002; 108. 83).
bulos, auxiliando na traçáo das membranas nucleares na com permissão da Elsevier.
direção do sulco em que se encontra o centrossomo. O
esquema da Figura 7.22 resume essas observações.

126 A Célula
v %
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Figura 7 22 Esquema mostrando o rompimenlo do envoltório nuclear no


inicio da mitose, indicando a posição e possível envolvimento do cen-
trossomo, dos microtúbulos e de motores moleculares (semelhantes à di-
neína). Após a duplicação dos centriolos. imda-se a nudeação de micro¬
tubules e a formação de uma invaginação na membrana nudear. onde os
centriolos se alojam. A açào de motores molecularesassociados ao envol¬
tório nudear que utilizam os microtúbulos como tnthos exerce uma força
na direção do centrossomo. o que causa, ou pelo menos contribui, para
que o envoltório se rompa do lado oposto. Após a desestruturaçào, frag¬
mentos do envoltório continuam associados aos microtúbulos. que nesta
fase estão formando o fuso.

A Célula 127
CROMATINA
E CROMOSSOMOS

Maria Luiza S. Mello e Benedicto de Campos Vidal

Cromatina é o complexo de DNA, proteínas histónicas e não-histônicas, presente no núcleo de células em


intérfase.' Moléculas de UNA podem fazer parte temporariamente desse complexo/* Durante a fase de divi¬
são celular, a cromatina sofre alterações em sua morfologia, composição e função, apresentando-se sob a
forma de unidades individualizadas conhecidas por cromossomos.
Nos núcleos interfásicos, a cromatina pode se apresentar diferentemente compactada, granulosa ou
filamentosa e com distribuição textural variada, quando se consideram células de um mesmo tecido ou, até
mesmo, tipos celulares em diferentes momentos fisiológicos, sendo assim identificados diferentes fenótipos
nucleares.
Com frequência, a cromatina se acha ligada à matriz nuclear, uma estrutura filamentosa proteica com
diversos papéis, entre os quais os de compactação e organização da cromatina, o de regulação da expressão
gênica e o da replicação de DNA.I M
Em nível ultra-estrutural, a cromatina mostra-se constituída por uma estrutura filamentosa com cerca
de 10 a 30 nm de espessura, que sofre níveis adicionais de empacotamento. Como esse filamento se encontra
organizado no interior dos núcleos ou mesmo constituindo os cromossomos, somente pôde ser compreen¬
dido com a associação de técnicas bioquímicas, de biologia molecular e de microscopia eletrônica mais moder¬
nas, tendo sido muito importante, em todos os casos, o emprego de enzimas especiais, como as endonucleases.

Composição química número de pares de bases nitrogenadas por volta e o


ângulo que as bases nitrogenadas fazem com o eixo ima¬
DNA ginário, ao redor do qual a macromolécula se estende.
Dentre os componentes da cromatina, o DNA é o banco Existe uma conformação chamada /., facilitada por uma
de informações genéticas da célula e seu vetor pelas vᬠsequência especial de bases (-CGCGCG- ou -ACACA-
rias gerações celulares. O DNA encontra-se na croma¬ CAC-) e com o sentido da hélice voltado para a esquer¬
tina na forma de macromoléculas. Constitui-se de duas da, fazendo com que a disposição do esqueleto açúcar-
cadeias helicoidais de polinucleotídeos complementares fosfato do DNA adquira uma geometria em zig-zag. dai
(purina - pirimidina), que se associam por ligações de sua denominação. O DNA pode ainda se apresentar in
hidrogénio, girando para a direita ao redor de um eixo vitro com outros tipos de estrutura, como é o caso do
central imaginário, lembrando uma escada helicoidal. DNA II (hélice tripla).
Enquanto a disposição das bases nitrogenadas pareadas E importante mencionar que, embora várias
corresponderia aos degraus dessa escada, perpendicu¬ configurações já tenham sido descritas para o DNA, é a
lares ao eixo central, as cadeias de açúcar-fosfato corres¬ configuração B que se admite quando são apresentados
ponderiam ao seu corrimão. Forma-se, assim, um modelos de estrutura cromatínica.
duplex de 20 A de diâmetro, conforme estabelecido no O conteúdo de DNA, no interior de um núcleo di-
modelo clássico de Watson e Crick (ver Capítulo 2). plóide, é razoavelmente constante para as diferentes célu¬
O modelo mencionado refere-se â conformação las de uma mesma espécie. Nas células germinativas (óvulo
B do DNA. Outras conformações são conhecidas, co¬ e espermatozóide), o conteúdo de DNA costuma ser ha-
mo a A e a C, variando-se nestas os graus de hidrata¬ plóide, ou seja, a metade do conteúdo encontrado nas
ção do meio, o passo da hélice da macromolécula, o células diplóides correspondentes.

128 A Célula
Uma célula pode existir com menos de 500 genes é muito rica em lisina, en¬
(em torno de 580.070 pb de DNA), como na pequena quanto as histonas H2A e
bactéria Mycoplasma geniralium, que possui o menor H2B são moderadamente
genoma conhecido.' Embora células de organismos su¬ ricas em lisina, e as histonas
periores tenham conteúdos de DNA várias ordens de H3 e H4 são ricas em argini¬
grandeza maiores do que os de organismos unicelula¬ na (Tabela 8.2).
res, não há uma razão direta entre espécies filogenetica- Em termos de evolu¬
mente superiores e conteúdo de DNA ( Tabela 8.1). ção, as histonas são muito
Assim, insetos de mesma ordem podem diferir em até conservadas, o que significa
10 vezes em valores absolutos de conteúdo de DNA por que variam pouco em se¬
célula diplóide, anfíbios podem apresentar muito mais quencia de aminoácidos nas
DNA do que o ser humano e a cebola, 10 vezes mais diferentes espécies conside¬
DNA do que o gato doméstico (Tabela 8.1 ). radas. No entanto, estão .
Histonas
entre as proteínas mais mo-
dificadas, o que
fern gfl de
acontece proteínas histõrúcas extraídas de
As histonas são proteínas básicas nucleares de alto pon¬ de frango. (Cortesã de
por fosfor ilações, acetila- entrócitos Pmm)
Eason R
to isoelétrico, encontradas nos eucariotos. São impor¬ ções.' mediações e ubiquiti-
tantes componentes da estrutura da cromatina, partici¬ nizaçào. As modificações diminuem as cargas positivas
pando não somente como repressoras, mas também das histonas, alterando as interaçòes DNA-histonas.
como ativadoras* da transcrição do DNA. Como o Muitas das modificações são reversíveis.
DNA, as histonas são sintetizadas na fase S do ciclo celu¬ Dentre as histonas, a mais variável em estrutu¬
lar. A razão de massa DNA/histona é igual a 1,0. ra primária e tamanho é Hl, sendo, pois, a menos
São cinco as classes principais de histonas (Hl, conservada em termos evolutivos. Em contrapartida,
H2A, H2B, H3 e H4) (Figura 8.1), que são classificadas as histonas H3 e H4 são as mais conservadas evoluti¬
com base em seu teor em lisina e arginina. A histona H1 vamente. As histonas H4 de bovinos e ervilhas, espé-

Tabeta 8.1 Conteúdos de DNAe número de cromossomos em diferentes espécies Dados adaptados de revisões."""

Espécies Tamanho genómico Conteúdo C de DNA Número de cromossomos


em Mb' (células haplóides) em picogramas (células haplóides)

Homo sapiens 3.000 2,90 23


Canis familiaris 3.000 3,19 39
Bos taurus 3.000 3,20 30
Felis domesticus - 3,55 19
Mus musculus 3.000 2,50 20
Gallus gallus 1.200 1,28 39
Xenopus laevis 3.000 3,00 18
Triturus viridescens • 36,00 •

Caenorhabditis elegans 100 - 6


Drosophila melanogaster 165 0.85 4
Allium cepa 15.000 39,35 8

Saccharomyces 14 - 16
cerevisiae
Neurospora crassa
- 0,017 7
* milhões de pb

A Célula 129
Capitulo 8 CROMATINA E CROMOSSOMOS

Tabela 8.2 Caracterização de histonas em núcleos interfásicos de timo teínas desempenhem variados papéis na cromatina,
de vitelo." desde o estrutural até o enzimático, participando da re¬
Histonas Razão lisina/ Massa molecular gulação da atividade génica. Fazem parte desse grupo as
arginina (dáltons) enzimas que atuam nos processos de transcrição, repli¬
cação e reparo do DNA e nos processos de condensação
H1 22.00 21.500 e descondensação cromatínica.
H2A 1,17 14.004 A massa molecular das proteínas nucleares NHP
varia de 10 a centenas de kDa, a razão de resíduos áci¬
H28 2,50 13 774
1 ÿ i i
dos/básicos delas varia de 1 ,2 a 1,6 e seu ponto isoelét ri¬
H3 0.72 15.324 co, de 3,7 a 9,0.
I iÿ i j>
H4 0.79 11.282 O número de proteínas nucleares não-histónicas,
analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida
cies que divergiram 1,2 bilhõesde anos atrás, diferem com SDS, varia conforme o tecido num mesmo indiví¬
por apenas dois resíduos." duo, tendo já sido encontrados mais de 1.000 tipos
A molécula da histona Hl apresenta trés regiões dessas frações proléicas.
bem definidas: a amino-terminal, com -10 resíduos de Pouco ainda é conhecido com respeito à dis¬
aminoácidos; a central, globular e hidrofóbica, com cer¬ tribuição das proteínas NHP na cromatina. De certo,
ca de 80 resíduos; e a carboxiterminal, com 108 resíduos
e a mais rica em aminoácidos básicos, especialmente lisi-
na. Os outros tipos de histona apresentam maior quan¬
tidade de aminoácidos básicos na região amino-termi¬
nal e riqueza em aminoácidos hidrofóbicos nas regiões
carboxiterminal e globular.
Em eritrócitos nucleadosde peixes, aves, répteis e
anfíbios, parte da histona 111 aparece substituída por
uma outra proteína da mesma família, H5 (Figura 8.1),
que exerce papel especial na estabilidade fisico-química
e condensação cromatínica dessas células, restringindo
sua atividade génica.
Nos espermatozóides, as histonas somáticas são
substituídas por (ou acrescentadas de) outros tipos de
proteínas nucleares básicas. Essas podem ser do tipo
caracterizado por uma riqueza especial em arginina, a
ponto do polipeptídeo poder ser considerado quase
uma poiiarginina, como acontece no salmão. Nesse
caso, a proteína é conhecida como protamina ou clu-
peína, tem uma massa molecular em torno de 4.000
dáltons e uma afinidade muito alta por DNA em
dupla fita, tornando o complexo DNA-proteína muito
estável e de difícil dissociação.
Em outros tipos de espermatozóides, como nos
mamíferos, pode ocorrer uma proteína rica em arginina,
classificada como "semelhante à protamina" ou querati-
nosa, por conter também o aminoácido cisteína. Má ainda
espermatozóides cm que a proteína nuclear básica é uma
variante de Hl, muito rica em lisina c com variada pre¬
sença de regiões de «-hélice. Este tipo ocorre em ouriço-
do-mar, em abelhas e em alguns anfíbios. Embora se
tenha tentado estabelecer uma correlação entre tipos de
proteína básica nuclear presentes em espermatozóides e
filogénese, até o momento não se logrou êxito.
Figura 82 Microscopia eletrônica de um cromossomo metaíásico de célula
Proteínas não-ltistònicas HeLa. salientando alças de cromatina, onde se detecta a estrutura nu-
deossomal.As alças de cromatina aparecemancoradas em um "arcabouço*
Participam ainda da composição da cromatina as pro¬ proteico. A segunda imagem é detalhe da primeira. Barra, 1 pm (Eamshaw
teínas não-histónicas (NHP). Admite-se que essas pro¬ WE. Laemmli VK. J Celi Biot 1983; 96: 84. com permssào).

130 A Célula
*k linear de pequenas unidades aproximadamente esféri¬
\*>, '• '
:.$£$ 'f •ÿ'
' .«. V'.-' cas {nu -bodies), com um diâmetro de 7 nm, unidas
k
•tór»
-A JÈ entre si por um filamento com 1,5 nm de espessura
(Figura 8.4). Na época, essa estrutura foi chamada de
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! *-/ -V- •/»•*»* '<tsSis?'*' bioquímicos, liderados por Romberg, comprovou que
. *v- * í:ÿ'
a fibra cromatinica era constituída por unidades repe¬
X titivas compostas por duas moléculas de cada uma das
JtLt;JÃápí ' ';-V• ' Sj » a> 5w >
histonas II2A, H2B, H3 e H4 e de cerca de 200 pares de¬
* bases (pb) de DNA.
Em 1975, Oudet et al.' denominaram a unidade
estrutural repetitiva da cromatina de nucleossomo. Fÿte
mostrou ser constituído por um nuclcóidc ( core núcleos-
sõinico) ligado à unidade seguinte por um filamento
espaçador (espaçador intemucleossômico). O nucleóide
estaria composto por 146 pb de DNA, que descreveria 1 e
3/4 de volta de uma hélice ao redor de um octámero de
histonas (2 moléculas de 112A, 2 de 1 12B, 2 de 113 e 2 de
1 14). O filamento espaçador é composto por uma sequên¬
cia variável em número de pb de DNA (Figura 8.4).
Chegou-se à conclusão de que o nucleóide teria
a forma aproximada de um cilindro achatado, com 1 1
nm de largura e 5,5 nm de altura, e que podia ser cli¬
Figura 8.3 "Arcabouço" de proteínas náo-histônícas de cromossomos de vado por uma digestão suave com nuclease microcóci-
células Hela, dos quais íoram extraídos DNA e histonas: observação ao
microscópio etetrónico. A arquitetura cromossòmica se mantêm parcial¬ ca. Graças ao achado de que o DNA do nucleóide é de
mente preservada, sendo que as setas indicam a região centroménca fácil acesso à digestão enzimática por endonucleases,
(cinetocoros). (Earnshaw WE. Laemmli VK. J Celi Btol 1983; 96: 84, com
permissão) como a DNase 1, de origem pancreática, demonstrou-
se que o DNA ocuparia uma posição periférica, em
sabe -sc que, após a ext ração de DNA, histonas e RNA e relação ao octámero de histonas (Figura 8.5). Esta ideia
mesmo de muitas proteínas NHP, permanece um foi confirmada por difraçào de neutrons.
"esqueleto" ou "arcabouço", especialmente visto em cro¬ Segundo a idealização de Oudet, faria parte do
mossomos, cuja arquitetura lembra a das próprias uni¬ nucleossomo a histona 111. No entanto, na literatura
dades cromossómicas. O DNA de regiões precisas da que se seguiu ao trabalho de Oudet, encontra-se muitas
cromatina se ligaria a essas proteínas (Figuras 8.2 e 8.3). vezes sob a definição de nucleossomo a unidade cro¬
matinica, sem se incluir a molécula de Hl. Assim, para
RNA se evitar dúvidas na conceitualização, é preferível que se
O RNA é integrado de modo transitório à estrutura da
cromatina, constituindo em torno de 3% da sua com¬
posição e correspondendo às cadeias recém-transcritas
em várias fases do seu processo de elongaçáo.

Estrutura da cromatina
Embora desde 1936 houvessem sido apresentadas pro¬
postas de como ocorreria a associação do DNA com
proteínas, organizando as fibras de cromatina, somente
a partir de 1974, com os trabalhos de Olins e Olins10 e
de Romberg et ai.," pôde ser estabelecido um modelo
de estrutura cromatinica mais aceito. Olins e Olins, nos
EUA, submeteram núcleos de diferentes tecidos a um
choque osmótico com KG 0,2 M. Esse tratamento Figura 8.4 Micrografia eleiròntca de campo escuro de cromatina de
entróoto de frango após tratamento com KCI 0.2 M. no qual se observa
rompeu os núcleos, liberando fibras de cromatina que, a imagem de "colar de contas* da distribuição dos nu-bodies (cortesia de
ao microscópio eletrónico, exibiam uma distribuição AL OSns e DJ Olins).

A Célula 131
Capitulo 8 CROMATINA I: CROMOSSOMOS

faça referência á unidade repetitiva da cromatina, ao 5 a 6 unidades repetitivas da cromatina por volta de
invés de nucleossomo, e se defina, em termos bioquími¬ hélice, constituindo uma fibra de 20-30 nm denomi¬
cos, o que se está considerando. £ também frequente na nada solenóide (Figura 8.5). Admite-se que o solenóide
literatura moderna, o uso do termo cronmtossomo para seja estabilizado não apenas graças á interaçâo entre
indicar a unidade cromatinica, na qual se inclui uma moléculas de Hl, mas também por interaçâo entre as
cópia de Hl.'* faces superior e inferior das unidades repetitivas, espe¬
Má locais bem definidos de interaçâo do DNA cialmente pelas caudas das histonas dos nucleóides.
com as histonas do core, o que se demonstra pelo aces¬ Tem sido também relatado que, no arranjo das
so do DNA à açào enzimática por DNase I (do pân¬ unidades cromatínicas em sequência, devam fazer
creas) e DNase II (do baço). Quando o DNA não com¬ parte certas regiões curtas descontínuas, geralmente
plexado a histonas é clivado por nucleases, são produzi¬ com 100 a 400 pb de DNA de comprimento, mais
dos fragmentos com tamanhos variados, que se mani¬ acessíveis à clivagem por DNase I e reagentes. Fssas
festam em gel de agarose ou poliacrilamida com um regiões corresponderiam a sítios génicos reguladores,
padrão característico de bandas. No entanto, quando a acessíveis a fat ores de transcrição," podendo estar asso¬
cromatina é submetida ao mesmo tratamento, os frag¬ ciadas á matriz nuclear. Se tais regiões de DNA se asso¬
mentos de DNA são clivados segundo um padrão regu¬ ciarem à matriz nuclear na cromatina de núcleos inter-
lar em múltiplos de 10,4 nucleotídeos, isto porque o fásicos, serão chamadas de MAR ( matrix attachment
DNA está ligado ás histonas em sítios específicos, com regions); se a associação ocorrer em cromossomos de
repetitividade. células em divisão, as regiões serão denominadas de
O DNA espaçador, ou seja, aquela porção da uni¬ SAR {scaffold attachment regions).
dade repetitiva da cromatina não contida no nucleóide, Segundo Woreel," as moléculas de Ml estariam
interage com as histonas H2A e H2B na "entrada" e na com a sua polaridade alternada ao longo do nucleofila¬
"saída" do DNA do nucleóide. Assim, as histonas H2A e mento, ou seja, a região N-terminal de uma molécula de
U2B estariam, de alguma forma, estabilizando a ligação 111 estaria próxima ã região C-terminal de outra, situa¬
DNA-H3H4, mas também se ligando ao DNA espaça¬ da na volta adjacente da super-hélice do nucleofilamen¬
dor. Além disso, há evidências de que as histonas II2A e to. As interações Ml-Ml poderiam, assim, estabilizar a
II2B possam se ligar também à histona Ml. As histonas fibra de 20-30 nm (solenóide).
H2A-H2B apareceriam formando heterodímeros, en¬ Admite-se que, a cada dez unidades repetitivas da
quanto as histonas H3-H4 constituiriam um tetrámero. cromatina, a molécula de Ml apareça substituída pela
F.sse tetrámero é um complexo estável de dois heterodí¬ proteína UH2A (ubiquitina ligada à I12A), o que con¬
meros de H3-H4. feriria maior flexibilidade à fibra solenoidal. O papel de
A posição exata da histona II1 na unidade repeti¬ outras proteínas náo-histónicas na estrutura da cro¬
tiva da cromatina tem sido muito discutida. Embora matina é ainda pouco compreendido.
tenha sido admitido por muito tempo que Hl se posi¬
cionaria lateralmente ao nucleóide, ligando-se ao DNA
espaçador e participando na compactação do filamento
cromatínico, modernamente também se admite que a
histona H 1 possa se ligar ao DNA e as histonas do core,
não por fora, mas por dentro da estrutura nucleossó-
mica" (Figura 8.5).
Apesar do DNA ser menos compactado em croma¬
tina deficiente em histona Ml, o papel dessa histona pa¬ Nucleóide
rece estar mais relacionado com a reunião de complexos
nucleoprotéicos reguladores específicos, que participam
tanto da repressão quanto da ativação da transcrição.

Níveis hierárquicos
de organização cromatinica Figura 8.5 a-c. Representação da undade repetitiva da cromatina onde se
acham esquematizadas as histonas do nudeóóe. o DNA, uma molécula da
Vários níveis de compactação do filamento cromatíni¬ histona H1 (ou H5). Em a. imagem tradicional, com H1 por fora dos giros de
co ocorrem no núcleo intcrfásico. O nucleofilamento é DNA. igando dois de seus pontos. Em b. segundo a proposta de Pruss et al.
a fibra cromatinica de 10 nm de espessura, com a se¬ (Soence 1996; 274; 614). H1 é representada no interior de parte dos giros
de DNA c. Estrutura solenoidal presumindo posição tradicional de Hl
quência linear das unidades repetitivas da cromatina. O [baseado em Cooper GM. The cell ASM Press. 1997).
nucleofilamento sofre uma organização helicoidal com

132 A Célula
de posição dos cromossomos no núcleo, como é o caso
tia posição do cromossomo X em focos epilépticos.
12nm Nas células em divisão, o empacotamento dos
complexos DNA-proteina é maior, a ponto do índice
DNA/cromossomos ser ao redor de 5.000/1, enquanto,
no solenóide, é da ordem de 50:1 e, na unidade repeti¬
tiva da cromatina, 7:1 (Figura 8.6).
Durante a fase S do ciclo celular, ocorre a replica¬
ção do DNA, segundo o modelo semiconservativo. Tam¬
bém nessa fase ocorrerá agregação de novas histonas
nucleofilamento recém-sintetizadas. A natureza dessa agregação tem sido
muito discutida. Uma das hipóteses mais aceitas é a de
que as moléculas de histonas "novas" e "paternas" se dis¬
tribuam ao acaso nos filamentos que se replicam.
Quanto à estrutura cromatinica durante a trans¬
solenóide crição do DNA, há indicações de que as unidades repe¬
titivas da cromatina sofram algum tipo de alteração
Xrtn
estrutural, com reposicionamento do octâmero de his¬
tonas em relação ao DNA ou mesmo completa libe¬
ração do DNA a ser lido pela RNA polimerase.

Xfrrr, Os cromossomos metafásicos


Os cromossomos autossômicos geralmente ocorrem aos
pares (2 lotes cromossòmicos, 2n) nas células somáticas,
tanto de animais como de vegetais. O número de cromos¬
somos de uma espécie é constante e se mantém como tal
?(Xnrn
durante os ciclos repetidos de divisão celular (Tabela 8. 1 ).
Durante a meiose, os cromossomos sofrem redu¬
dobraduras ção em número. No final do processo, serão obtidas
células com um lote croniossómico (células haplóides
ou n). Dado que ocorre o fenómeno de recombinação
!4COnm
dos genes, as unidades cromossómicas, geradas no final
do processo, não serão idênticas ás de origem materna
ou paterna (ver Capitulo 24).
A determinação do número de cromossomos de
uma espécie é geralmente efetuada na metáfase, perío¬
Cromossomo do no qual ocorre a condensação máxima das unidades
cromossómicas, facilitando a contagem. Nas metáfases
Figura 8.6 Níveis crescentes de organização cromatinica Baseado em
Alberts B, et al. Molecular biology of the cell Garland Publ Inc. 2002 meióticas (I ou II), a condensação dos cromossomos é
ainda maior do que na mitose.
O conhecimento sobre os níveis hierárquicos su¬ Os cromossomos apresentam tamanho relativa¬
periores da estrutura cromatinica é ainda limitado (Fi¬ mente constante nas diferentes células de uma mesma
gura 8.6). Existem evidências de que a cromatina esteja espécie, em mesma fase do processo de divisão. No mes¬
dividida em domínios funcionais,'7" cujos limites esta¬ mo lote croniossómico, no entanto, os cromossomos
riam em associação com a matriz nuclear. " podem se apresentar com extrema variabilidade em
Foram alcançados avanços pelo uso da microsco¬ tamanho.
pia de fluorescência tridimensional, associada a sondas O comprimento dos cromossomos pode variar
para regiões cromossómicas ou cromossomos específi¬ de 0,2 a 50 pm e o seu diâmetro de 0,2 a 2 pm. Na espé¬
cos. possibilitando que fosse admitida a organização de cie humana, os cromossomos atingem de 4 a 6 pm de
territórios cromossòmicos e de movimentos e mesmo comprimento.
rotação de unidades cromossómicas e regiões cromossó¬ O conjunto das características morfológicas que
micas no núcleo interfásico. Certas situações pato¬
1
permite a caracterização dos lotes cromossòmicos de
lógicas parecem mesmo estar associadas com mudanças um indivíduo é denominado de cariótipo (Figuras 8.7 e

A Célula 133
Capitulo 8 CROMATINA E CROMOSSOMOS

Extensibilidade cromatínica I
As propriedades físicas da cromatina são importantes
para que melhor se entendam suas alterações estru¬ A extensibilidade cromatínica revela a distri¬
turais segundo vários níveis de organização, associa¬ buição ordenada de marcadores, como zonas hetero-
dos às respectivas mudanças funcionais." * cromáticas, loci génicos identificáveis por hibridação
Quando os núcleos são submetidos a tratamen¬ in situ c proteínas específicas reveladas por iniunoci-
tos extrativos controlados, que deles removemas histo¬ uimica. " Ela varia com o tipo celular conside-
nas e desestabilizam o envoltório nuclear, e seguindo-sc o e seu estado fisiológico, bem como com o desen¬
a ação da gravidade, a cromatina flui sob a forma de volvimento e a diferenciação, em termos de grau de
fibras estendidas. A extensibilidade cromatínica depen¬ resposta aos tratamentos extrativos e padrão de escoa¬
mentoÿ Seu estudo traz,
de das propriedades reoiógicas (viscoclast ic idade) do portanto, informações rele¬
DNA e dos complexos DNA-proteína (considerando- vantes sobre a funcionalidade nuclear e sobre a pró¬
se também a intcraçào do DNA com a matriz nuclear), pria arquitetura cromatínica.
que permanecem após os tratamentos extrativos.

Apôs remoção de histonas e deses-


tabôzaçào do empório nudear, a
cromaúna de núdeos de entrócitos
de frango (a,b) e de hepatóoios de
camundongo (c) flui no sentido da
força da gravidade (setas), a.c Mi¬
croscopia depolarização (Alberto S.
Moraes. Benedtdo de C. Vidal.
Maria luiza S. KteUo). b. Microsco¬
pia eletrcoca (cortesã de Edson R.
Pimentel)

134 A Célula
8.8a). Costuma-se ordenar os cromossomos, fotografados somos utiliza os valores médios do tamanho relativo c da
ou esquematizados, aos pares de homólogos, numa série posição do centròmero obtido por medidas tomadas para
decrescente de tamanho. Esse arranjo do cariótipo, que vários cariótipos de diferentes indivíduos de uma espécie.
revela o número, a forma e os tipos de cromossomo, é A cada uma das metades cromossòmicas observa¬
denominado cariograma (Figura 8.8b). Pode-se também das durante a divisão celular e que irão constituir um
representar o cariótipo esquematicamente, construindo novo cromossomo, se dá a denominação de cromátide.
um idiograma. Essa forma de representação dos cromos- As cromátides serão irmãs, se forem de um mesmo cro¬
mossomo, ou homólogas, se situadas em diferentes cro¬
mossomos do mesmo par (paterno e materno).
Denomina-se cromonema a unidade cromossómica fi¬
lamentosa, ou seja, o próprio cromossomo.
Centròmero*, constrições secundárias e telômeros
são as principais diferenciações morfológicas naturais
dos cromossomos. O centròmero ou constrição primá¬
ria do cromossomo é a região em que se situa o cineto-
coro, estrutura organizadora da polimerização das fibras
cromossòmicas do fuso mitótico. A posição do centrò¬
mero em um determinado cromossomo é constante,
permitindo que este possa ser classificado como meta-
cèntrico, se localizado na porção mediana do cromosso¬
mo, submetacêntrico, se deslocado para um dos braços
cromossòmicos, e acrocentrico ou telocèntrico,se posi¬
cionado em uma das extremidades do cromossomo
(Figura 8.9). Há espécies, como o roedor Calomys sp, em
que a maioria dos cromossomos é acrocén trica. Graças à
obtenção de sondas específicas e ao método de FISI I
( fluorescence in situ hybridization), é possível identificar
a região centromérica de um cromossomo em especial,
Figura 8.7 Cromossomos humanos submetidos ao método de banda C. inclusive em núcleos interfásicos (Figura 8.10).
evidenoando-se as regiões centroméncas Cortese de Chrrstme Hackel.

Figura 8.8 Cromossomos humanos submetidos ao método de banda G. Cortesia de Christine Hackel.

A Célula 135
Capitulo 8 CROMATINA E CROMOSSOMOS

Outras constrições presentes nos cromossomos Com o Projeto Genoma Ilumano, dados de mape-
são chamadas de secundárias e podem aí conter a região amento do DNA do genoma humano puderam ser cruza¬
organizadora do nucléolo, geralmente se associando a dos aos de mapas de bandado cromossômico obtido ao
ele. As extremidades cromossómicas são denominadas nível citogenético. Essa informação se encontra disponi¬
telômeros. Se acidentalmente ocorrer perda de telome¬ bilizada em site do National Center for Biotechnology
res em diferentes cromossomos, estes poderão se fundir.
Os telômeros consistem de sequências de DNA ricas em
G, repetidas centenas de vezes e altamente conservadas
em termos evolutivos (Tabela 8.3). As extremidades dos
cromossomos não se replicam por açâo normal da DNA
polimerase, mas sim por um mecanismo especial que
envolve atividade de uma transcriptase reversa (telo-
merase), que carrega consigo seu próprio molde de
RNA, complementar ás sequências repetitivas de DNA
do telomere. O uso deste RNA permite á telomerase
estender a extremidade 3' do DNA cromossômico de
uma unidade de repetição, para além de seu compri¬
mento original.' A falha na manutenção do número das
repetições teloméricas, por deficiência na ação das telo- Figura 89 Nomendatura para cromossomos em função da posição de seu
merases, parece estar relacionada ao envelhecimento cenírómero (C): acrocéntrico (A), metacènlnco (M), submetacentric© (SM).
celular." Nas células tumorals, a atividade telomerásica
parece se manter elevada e o tamanho do telomere, por
conseguinte, não se altera."
Há métodos especiais de tratamento e de colora¬
ção que permitem identificar nos cromossomos seg¬
mentos ou bandados importantes na sua identificação e
caracterização. As bandas aparecem por diferenças na
distribuição de componentes cromatínicos ou mesmo
por diferença na composição química da cromatina ao
longo do cromossomo. As bandas Q aparecem fluores¬
centes com quinacrina. As bandas G aparecem como seg¬
mentos mais corados com Giernsa, após tratamento com
tripsina ou tampão fosfato (Figura 8.8). As bandas C
aparecem após tratamento com soluções ácidas ou alca¬
linas, seguido de tratamento com solução salina 2SSC e
coloração com Giernsa. De fato, a denominação de ban¬
da C se baseia nas primeiras observações de que o méto¬
do evidenciava regiões centroméricas (Figura 8.7).
As alterações nos padrões de distribuição de ban¬
das geralmente estão associadas a anomalias de caráter
genético. Os padrões de banda também permitem estu¬
dos de filogênese animal e vegetal.

Tabela 8.3 Sequência telomérica em algumas diferentes espécies.

Organismos Repetições teloméricas


Homo sapiens AGGGTT
Neurospora (fungo) AGGGTT
Trypanosoma (protozoário) AGGGTT
Tetrahymena (protozoário) GGGGTT Figura 8.10 Hibndaçào in srfu fluorescente (FISH) evidenoando, em ver¬
Arabidopsis (planta) melho, a região centromérica do cromossomo Xe, em verde, parte do cro¬
AGGGTTT mossomo Y. em ser humano, a Placa metafásica. b. Núcleos interfásicos
Chlamydomonas (alga unicelular) (CEPRX SpectrumOrangeTM/Y SpectrumGreenTM DNA Probe Kit
AGGGTTTT (Vysis) - cortesia de Ana LP Monteiro, labocatóoo Fleury, São Paulo).

136 A Célula
Information (USA) (http://www.ncbi.nih.gov). Como os cada cromômero é independente e distinguível da
genes por cromossomo são muito numerosos para serem dos demais, por este representar um locus gènico.
representados em sua totalidade, as imagens fornecidas Os cromossomos plumosos estão tão espessa¬
buscam informar algum aspecto particular no qual o mente recobertos por RNA e proteína que o seu DNA
pesquisador tenha interesse. Por exemplo, no cromosso¬ chega a representar apenas 1% de sua massa seca total.
mo humano 17 foram localizados 1.679 genes distribuí¬ O padrão de transcrição simultânea de muitas
dos segundo as suas diferentes regiões; destes genes, ape¬ moléculas de RNA, nesses cromossomos, lembra as
nas uma parte tem função conhecida. Os detalhes de lo¬ imagens de "árvore de Natal" vistas no nucléolo, duran¬
calização dos genes no respectivo mapa cromossómico te a transcrição do precursor maior dos RNAr pesados
mostram que, dentre muitos que poderiam ser citados,o
gene que codifica para a queratina 15 se situa na região
1 7q2 1 .2. o que codifica o antígeno 5 associado ao esper¬
matozóide, na região I7ql 1 .1 e o que codifica a seri- 17pl3.3
na/treonina cinase 12, na região 17pl3.l (Figura 8.1 1).
17pl3.2

17pl3. 1
Os cromossomos gigantes:
plumosos e politênicos 17pl2

Tanto os cromossomos plumosos quanto os politênicos


apresentam-se com tamanhos muito acima dos comu- 17pll.2
mente observados. Os plumosos chegam a atingir
800 pm de comprimento. Os politênicos atingem 150 a
250 pm de comprimento, porém, se as células em que 1?P 11. 1
ocorrerem estiverem infectadas por vírus ou microspo- 17*11.1
rídeos, chegam a atingir 1.500 pm.
Os cromossomos plumosos foram descobertos 17*11.2
em 1892 por Ruckert, em oócitos de tubarão. Podem
17*12
também ocorrer em oócitos de outros peixes, bem co¬
mo de anfíbios e répteis, em algumas células vegetais e 17*21.1
no espermatócito de Drosophila (cromossomo Y). Tam¬ 17*21.2
bém, em espermatócilos de gafanhoto, a estrutura cro-
mossômica, quando vista ao microscópio de luz, lem¬ 17*21.31
bra o aspecto plumoso.
Os cromossomos politênicos ocorrem em células 17*21.32
somáticas de vários tecidos de dípteros (Drosophila, 17*21.33
Rhynchosciara, Sciara, Chironornus e outros), em insetos 17*22
colembolideos, em protozoários ciliados e no ligamen¬ 17*23. 1
to suspensor do feijão.
17*23.2
Os cromossomos plumosos ocorrem na prófase
meiótica (diplóteno), quando são observados dois 17*23.3
homólogos mantidos unidos por quiasmata. Distri¬ 17*24.1
17*24.2
buídas ao longo dos cromossomos, aparecem centenas
de regiões granulosas, com maior espiralização de 17*24.3
nucleofilamentos, os chamados cromômcros. Quando os 17*2S.l
cromómeros se desespiralizam, projetam-se alças finas,
17*25.2
distribuídas aos pares, simétricas e com características
morfológicas próprias e constantes. Alças se desespi¬
ralizam de ambas cromátides de cada homólogo 17*25.3
(Figura 8.12).
Nas alças dos cromossomos plumosos, há uma
intensa síntese de RNAm, que será liberado do cro¬
Figura 8.11 visão esquemática de um cromossomo humanosubmetacen¬
mossomo no interior de micronucléolos e irá coman¬ tric© (17) no qual diferentes regiões sáo identificadas em seu braço menor
dar a síntese de proteínas. Nas alças, portanto, são (p) e maior (q). conforme dados divulgados peto National Center for
incorporados precursores de RNA. A atividade de Biotechnology Information (USA).

A Célula 137
Capitulo 8 CROMATINA E CROMOSSOMOS

Par de cromossomos plumosos pareados

quiasma

cromòmero
eixo (duas
cromátides)

Figura 8.12 Vtsáo esquemáti¬


ca de fragmento de cromosso¬
mos plumosos de anfíbio evi¬
denciados na fase mestiça de
d>ptoteno. salientando-se varia¬
ção na morfologia de suas
aiças.

(ver Capítulo 9). Além disso, é possível que uma mesma Essas unidades iniciam, então, uma série de ciclos de
alça possua diversas unidades de transcrição. Às vezes, é replicação, sem que as cromátides se separem (parea-
vista uma alça desespiralizada apenas em um dos lados da mento secundário).
estrutura plumosa, indicando diferente manifestação de O número de ciclos de replicação varia con¬
dois genes alelos em um indivíduo heterozigoto (herança forme o tecido c a espécie considerados. Em glândulas
mendeliana simples). Muito desenvolvidas nos oócitos salivares de DrosophUa virilism de Rhynchosciara ameri¬
jovens, as alças desaparecem com o decorrer da ovogé- cana ocorrem 10 ciclos, originando mais de 1.000
nese, quando da liberação das fibrilas de RNP de suas cromátides por cromossomo politénico (2 = 1.024);
matrizes no nucleoplasma e consequente retração do fila¬ em Seiara coprophila ocorrem 12 ciclos e em
mento de DNA-proteína. Nas alças dos cromossomos Chironomus, 13.
plumosos cujo DNA transcreve para RNAm de histonas,
foi observado que este RNA ocupa apenas um curto seg¬
mento do transcrito. Não se conhece o significado do
restante da cadeia de RNA transcrita em cada fibrila.
O cromossomo plumoso Y, da prófase meiótica
de DrosophUa, apresenta ao menos 5 pares de alças es¬
senciais para a diferenciação do espermatozóide viável.
Comprovou-se que a ausência de uma dessas alças in¬
duz o aparecimento de espermatozóides com encurta¬
mento de cauda e com imperfeições no axonema e nos
derivados mitocondriais.
|á em relação aos cromossomos politénicos, estes
originam-se por parcamento ponto por ponto dos cro¬
mossomos homólogos de modo que, embora em uma Figura 8.13 Setores de cromossomos politénicos de glândula salivar de
espécie o número 2n de cromossomos possa ser igual a Tnchosia pubescens. evidenciando regiões de bandas (b). interbandas (ÿ)
8, ocorram 4 unidades morfológicas individualizadas. e puíes (p).

138 A Célula
Geralmente, ocorre um grau de politcnizaçào permitem a obtenção de alguns dados sobre a fisiologia
mais elevado nas glândulas salivares. O volume dos nú¬ cromossómica c sua regulação.
cleos com cromossomos politénicos aumenta na medi¬ Em poucos casos pôde ser estabelecida uma rela¬
da em que aumentam os ciclos de politenização. Da ção direta entre um pufe e uma função específica. Um
mesma forma, aumenta o tamanho das células e dos exemplo clássico foi a observação de Beermann, em
órgãos em que se encontram. 1961, de que quatro células específicas das glândulas
Foram já registrados casos em que a politenização salivares de Chironomus pallidivittatus apresentavam o
não é permanente, ou seja, pode ser seguida por uma cromossomo IV com o anel de Balbiani BR4 bem desen¬
fase em que as cromátides se separam e se dispersam, volvido, ao mesmo tempo em que essas células secreta-
dando ao núcleo um aspecto interfásico mais usual. Nos vam grânulos de proteína. Em Chironomus teutons, não
insetos colembolídeos, os homólogos não se pareiam; foi constatado anel de Balbiani nem secreção de grânu¬
politenizam-se em separado. los protéicos nas células correspondentes às de C. pal-
Ao longo do comprimento dos cromossomos po¬ iulivittatus. O híbrido dessas espécies exibia anel BR4
liténicos, ocorrem regiões com maior espiralização cro- apenas num dos lados do cromossomo politênico IV,
matínica (cromómeros) alternadas com regiões de me¬ bem como metade da secreção protéica verificada em C.
nor espiralização. Durante a politcnizaçào, os cromó¬ pallidivittatus. Assim, a herança desses grânulos protéi¬
meros de cromátides dispost