Anda di halaman 1dari 7

Hipoksia Centrum Germinativum dan regulasi kualitas antibodi oleh

sistem respons hipoksia

Germinal centres (GCs) meningkatkan kekebalan humoral dan kemanjuran


vaksin. Dalam GC, limfosit B diaktifkan oleh antigen (Ag) yang berproliferasi.
Dalam GC, limfosit B diaktifkan oleh antigen (Ag) yang berproliferasi, yang
dipilih untuk antibodi afinitas (Ab) tinggi, mendorong perubahan golongan Ab,
dan menghasilkan sel B memori. Sementara lingkungan sitokin telah lama dikenal
untuk mengatur fungsi efektor yang mencakup pilihan golongan imunoglobulin,
baik pemrograman metabolik otonom dan ekstrinsik telah muncul sebagai
modulator dari imunitas yang diperantarai sel T. Saat ini kami menunjukkan
bahwa zona cahaya GC hipoksik dan rendah oksigen (pO2) dapat mengubah
fisiologi dan fungsi sel B. Selain mengurangi proliferasi dan meningkatkan
kematian sel B, pO2 rendah mengganggu perubahan golongan Ab ke isotipe Ab
IgG2c pro-inflamasi dengan membatasi ekspresi AID sitosin deaminase. Hipoksia
menginduksi faktor transkripsi HIF dengan membatasi aktivitas prolyl hydroxyl
dioxygenases (PHD), enzim yang menghidroksilasi HIF-1α dan HIF-2α untuk
mendestabilisasi HIF melalui pengikatan protein Von Hippel-Landau (pVHL).
Penipisan pVHL spesifik-sel B menyebabkan stabilisasi HIF konstitutif,
menurunkan sel-sel B spesifik-Ag GC dan merusak generasi IgG afinitas tinggi,
beralih ke IgG2c, sel B memori awal, dan mengingat respon Ab.

Induksi HIF dapat memprogram ulang ekspresi gen faktor metabolisme


dan pertumbuhan. Hipoksia berkelanjutan atau induksi HIF melalui defisiensi
pVHL menghambat aktivitas mTOR kompleks 1 (mTORC1) dalam limfoblas B,
dan sel haploinsufisiensi mTORC1 telah mengurangi ekspansi klon, ekspresi AID,
dan kapasitas untuk menghasilkan IgG2c dan Ab dengan afinitas tinggi. Dengan
demikian, fisiologi normal dari pusat germinal melibatkan variegasi regional
hipoksia, dan dan merasa HIF-dependen oksigen mengatur fungsi vital sel B.
Kami mengusulkan bahwa pembatasan oksigen dalam organ limfoid, yang dapat
diubah dalam keadaan patofisiologis, memodulasi imunitas humoral.
Mikro-anatomi organ limfoid sekunder dan proliferasi limfosit teraktivasi
yang cepat di dalamnya memicu pengujian untuk hipoksia. Menggunakan flow
cytometry, kadar HIF ditemukan meningkat dalam sel-sel GC-fenotipe B (GCB)
dibandingkan dengan limfosit B lainnya dalam limpa tikus yang diimunisasi
(Gambar 1a; Gambar 1a). Mikroskopi fluoresensi imun mengungkapkan bahwa
HIF paling tinggi pada pusat germinal (Gbr. 1b; Gbr. 1b). Oksigen rendah
menginduksi HIF. Namun, subunit HIF α dapat distabilkan pada pO2 normoxic,
jadi kami menggunakan probe kimia untuk menandai sel hipoksia in vivo. Limpa,
kelenjar getah bening, dan Patch Peyer dianalisis setelah injeksi pimonidazole
atau EF5 dan pewarnaan dengan Ab yang mengikat produk dari reaksi adisi antara
dua senyawa. (Gbr.1c – e; Extended Data Fig. 1b – h). Fluoresensi yang
menunjukkan hipoksia terlokalisasi dominan pada GC dan sinyal untuk masing-
masing agen lebih lemah di zona IgD+. Flow cytometry hanya mendeteksi EF5
dengan sel GL7+ GCB (Gbr. 1e), dan tanda gen yang terkait hipoksia meningkat
dalam sel B GC (Extended Data Fig.1i). EF5 dan pimonidazole hanya memberi
tanda sebagian GC, yang dibagi lagi menjadi zona terang dan gelap di mana sel B
berputar secara iteratif untuk mempromosikan Ab dengan afinitas tinggi.
Pelabelan EF5 sebagian besar tumpang tindih penanda sel dendritik folikular
(CD35) terbatas pada zona cahaya (Gbr. 1f). Limfoblas B berproliferasi dengan
cepat di zona gelap, sedangkan siklus sel menurun di zona terang. Sel GC B yang
paling positif EF5 telah memasuki fase S dengan laju yang lebih rendah (% BrdU)
(Gambar 1 g, h) dan lebih sering mengaktifkan caspase pengeksekusi (Gambar
1i). Dengan demikian, sel B yang teraktivasi mengalami hipoksia dalam GC,
terutama di zona cahaya mereka. Yang mengejutkan, sel-sel GCB yang lebih
hipoksik berproliferasi lebih sedikit dan telah meningkatkan pemberian isyarat
apoptosis. Untuk menguji dampak hipoksia terhadap perpindahan kelas Ab, sel B
yang diaktifkan yang dikultur dalam hipoksia (pO2 1%) dibandingkan dengan
kontrol yang dikultur pada atmosfer (∼21%) atau vena (5%) pO2, menggunakan
kondisi yang mendukung IgG1 atau isotipe pro-inflamasi IgG2c (Gbr. 2a; Data
Gbr. 2). Hipoksia membatasi pertumbuhan populasi sel B (Gambar 2a, b), dengan
peningkatan aktivasi caspase-3 dan penggabungan BrdU yang lebih rendah
(Extended Data Gambar. 2a, b). Dengan demikian, kecukupan O2 mendorong
proliferasi sel B dengan meningkatkan kelangsungan hidup dan meningkatkan
siklus sel. Efek-efek ini disandingkan dengan perubahan keseimbangan dalam
metabolisme sel, karena hipoksia mendorong laju glikolitik yang lebih tinggi
(Extended Data Gambar. 2c) dalam sel B teraktivasi. Selain itu, frekuensi sel IgG
+ B berkurang pada 1% pO2 (Gambar 2a; Gambar Extended Data. 2f). Sistem
imun enterik adalah tempat hipoksia fisiologis; terutama, hipoksia tidak
mengurangi frekuensi sel B IgA+ dalam kondisi yang memdukung
pembentukkan IgA (Gbr. 2a; Gambar Extended Data. 2f). Perubahan
membutuhkan beberapa bagian dari sel B. Ketika partisi fluoresens dianalisis
bersama dengan peralihan ke IgG2c, hipoksia mengurangi perubahan oleh sel B
pada nomor divisi yang sama (Gbr. 2b). Dengan demikian, hipoksia pada tingkat
zona cahaya GC mengubah pergantian golongan Ab dengan pengaruh langsung
pada pilihan golongan selain mengurangi proliferasi dan pemrograman ulang
metabolisme sel B dan kelangsungan hidupnya.

CSR dijalankan oleh deaminase yang diinduksi aktivasi (AID), yang


disandikan oleh gen Aicda. Dalam kondisi perubahan IgG, protein Aicda mRNA
dan AID dikurangi oleh hipoksia (Gambar 2c, d; Data Lanjutan Gambar. 2g).
Sebaliknya, AID tidak berkurang oleh hipoksia dalam kondisi perubahan IgA
(Gbr. 2d). Rekominasi perubahan diarahkan ke bagian rantai berat Ig dengan
faktor transkripsi yang membuat aksesibilitas ditandai oleh transkrip germ line
(GLT). DMOG mengurangi proliferasi dan meningkatkan apoptosis sel B yang
dikultur pada 21% pO2 dan sangat terbatas untuk beralih ke IgG2c, sedangkan
untuk IgA menunjukkan lebih sedikit kerusakan (Extended Data Gambar. 3a, b).
Suatu penghambat stabilisasi HIF mengurangi reduksi sel B yang berganti IgG2c
dengan oksigen rendah (1% pO2) (Extended Data Fig.3c). Sejalan dengan
hipoksia, penghambatan PHD dan stabilisasi HIF mengganggu induksi AID, T-
bet, dan Iγ2c GLT di hadapan IgG2c switch cytokine IFN-γ (Gbr. 2c, e, f;
Extended Data Gambar. 4a-c). Sebaliknya, RNA untuk RORα dan Iα GLT lebih
tinggi pada sel yang diobati dengan DMOG dibandingkan pada kontrol (Gambar
2c). Dengan demikian, hipoksia mengurangi induksi AID dan GLT dalam kondisi
yang mendukung IgG2c sedangkan level Iα dan AID dipertahankan dalam IgA,
konsisten dengan efek relatif pada reseptor perubahan golongan antigen sel B
(BCR).

pVHL mendestabilkan HIF dengan menargetkan subunit alfa


terhidroksilasi untuk degradasi proteasom cepat di sebagian besar lingkungan
yang cukup oksigen. Untuk model pengisyaratan hipoksia persisten in vivo, kami
menggunakan eksperimen hilangnya fungsi Vhl bersyarat. Sel-sel B matang yang
mengalami penghapusan Vhl menghasilkan lebih sedikit sel-sel GCB yang
mengikat Ag setelah imunisasi, lebih sedikit IgG2c Ab, dan penurunan substansial
dalam sel-sel yang mengeluarkan IgG2c spesifik-Ag dalam respons primer (10)
(Gbr. 3a-c; Expanded Data Gambar. 5 , 6). Siklus antara zona terang dan gelap
dalam GC meningkatkan Ab afinitas yang lebih tinggi sehingga sangat
mengejutkan bahwa untuk penipisan IgM dan IgG1 pVHL hanya mengganggu
generasi Ab-NP anti-NP afinitas tinggi (Gbr. 3b). Kekurangan dalam tanggapan 10
secara substansial mengurangi IgG2c dari semua afinitas (Gambar 3b; Expanded
Data Gambar. 6a), sedangkan IgA Ag-spesifik tidak terpengaruh (Expanded Data
Gambar Gambar 6b). Efek dari penipisan pVHL pada respon IgG2c dan afinitas
tinggi IgG1 Ab bergantung pada HIF (Gambar 3b). Kecacatan dari respon Ab
dipertinggi dalam daya ingat (20) bila dibandingkan dengan 10 respons (Extended
Data Gambar. 5c, d dibandingkan dengan Gambar. 3a). Kehilangan pVHL
mengurangi populasi sel yang mengikat Ag-binding-memory-fenotipe B (Bmem),
sebuah efek yang dimitigasi oleh penurunan HIF secara bersamaan (Gbr. 3c,
Extended Data Gbr. 6d). Induksi mRNA Aicda dalam sel B teraktivasi terganggu
dalam sel dengan peningkatan HIF karena berkurangnya Vhl (Gambar 3d;
Extended Data Gambar. 4c, d). Untuk menguji signifikansi penurunan AID dan T-
bet, kami memaksakan ekspresi protein ini dalam sel B teraktivasi. Untuk menguji
signifikansi penurunan AID dan T-bet, kami memaksakan ekspresi protein ini
dalam sel B teraktivasi. T-bet tidak meningkatkan frekuensi sel IgG2c-positif B
selama penghambatan PHD, meskipun melewati kebutuhan untuk IFN-γ dengan
kontrol sel B (Gambar. 3e, Extended data Gambar. 4e). Sebaliknya, memaksa
ekspresi AID menormalkan sproses perubahan dalam tes ini (Gbr. 3e; Extended
Data Gbr. 4e). Kami menyimpulkan bahwa poros PHD / HIF / VHL mengatur
kualitas respon Ab, dengan modulasi level AID sebagai mekanisme utama untuk
pengaruh hipoksia pada preferensi golongan Ig.

Aktivasi sel B, CSR, dan pengembangannya menjadi sel yang mensekresi


Ab dipengaruhi oleh reseptor yang merangsang target mamalia dari rapamycin
(mTOR). Hipoksia dan HIF-1 telah terbukti menghambat atau meningkatkan
aktivitas mTORC1 dalam tumor atau sel endotel. Dalam sel B yang diobati
dengan hipoksia dan DMOG, keterlibatan BCR menimbulkan lebih sedikit
fosforilasi protein di hilir dari mTORC1 (Gbr. 4a;

Extended Data Gambar. 7a). Penipisan pVHL juga mengurangi mTORC1


yang distimulasi BCR oleh mekanisme yang bergantung pada HIF (Gbr. 4b).
Dengan demikian, hipoksia menahan mTORC1 dalam sel B normal. Eksperimen
in vitro menunjukkan bahwa pembatasan yang dimediasi oleh HIF untuk
peningkatan transpor asam amino berkontribusi terhadap efek ini. Aktivasi sel B
meningkatkan penyerapan leusin dan ekspresi transporter yang digunakan untuk
penyerapan nutrisi; Stabilisasi HIF mengganggu induksi ini (Extended Data Fig.

7b – e). Selain itu, pasokan leusin yang memadai sangat penting, dan
sebagian memadai, untuk aktivasi kembali BCR mTORC1 dalam limfoblas B
(Extended Data Gambar. 7f). Penipisan HIF tidak sepenuhnya mengembalikan
respon Ab atau penyerapan asam amino menjadi normal dalam sel B yang
kekurangan pVHL. Namun, dua mekanisme tambahan yang sebelumnya
ditunjukkan untuk menekan mTORC1 muncul dalam sel B hipoksik in-vitro -
steady-state ATP pools dibelah dua, disertai dengan peningkatan aktivitas AMPK,
dan ekspresi gen Redd1 meningkat (Extended Data Gambar. 8a-c).

Gangguan fungsi mTOR dengan cara yang merusak mTORC2 dan


mTORC1 mengubah keseimbangan antara perubahan golongan dan IgM Ab
terhadap Ag tertentu. Sebaliknya, stabilisasi HIF hanya menghambat sebagian
mTORC1 dan mTORC2 yang terhindar (Extended Data Gambar. 8d, e). Oleh
karena itu, kami menguji apakah aktivitas mTORC1 yang berkurang sebagian
berdampak pada produksi Ab dengan afinitas tinggi, proliferasi, tingkat AID, atau
bias perubahan golongan Ig menggunakan gangguan Rptor, yang mengkode
protein esensial untuk mTORC1. Haploinsufisiensi pada sel B mengurangi
aktivitas mTORC1 (Extended Data Fig. 9a) dan menghasilkan hasil switching in
vitro dan respon humoral in vivo (Gambar 4c, d; Extended Data Gambar. 9) mirip
dengan yang diperoleh dengan hipoksia dan PHD / Sumbu HIF / VHL.
Kehilangan mTORC1 parsial mengurangi peralihan ke IgG2c (Extended Data Fig.
10a) dan menekan produksi IgG1 Ab afinitas tinggi (Gbr. 4d). Kondisi perubahan
IgG1 mendorong ekspresi alel pelacak yang lebih tinggi, AID-GFP, yang sebagian
dikurangi oleh Rptor hemizygositas (Gbr. 4e), sedangkan kondisi IgG2c
menyebabkan lebih sedikit AID dalam sel kontrol dan pengurangan lebih besar
pada sel Rptor + / Δ B. Selain itu, haploinsufisiensi Rptor menyebabkan
berkurangnya T-bet, dan menurunkan Tbx21 dan Aicda mRNA dalam sel B
teraktivasi (Extended Data Gambar. 10b, c). Penghambatan farmakologis dari
mTOR dengan rapamycin secara substansial mengurangi kadar AID (Gbr. 4f) dan
peralihan ke IgG2c, efek yang dimitigasi oleh ekspresi AID dan T-bet yang
dipaksakan (Extended Data Gambar. 10d-f) Secara keseluruhan, hipoksia
terlokalisasi dan induksi HIF adalah fitur normal mikrofisiologi pusat germinal
yang memodulasi output dari folikel limfoid, efek yang mirip dengan yang
membatasi aktivitas mTORC1.

Oksigen yang rendah berhadapan dengan sel B di pusat germinal selama


respons imun. Temuan ini mengungkapkan bahwa suplai oksigen terbatas atau
induksi persisten faktor transkripsi HIF dalam sel B membatasi proliferasi,
perpindahan isotipe, dan kadar Ab dengan afinitas tinggi. Sel-sel GC B menjalani
seleksi berulang untuk meningkatkan afinitas antibodi sehingga sel-sel B yang
paling cocok bertahan, semakin matang, dan terus berlipat ganda. Dengan
demikian, pembatasan pO2 dari GC dapat memperlambat proliferasi dan
menetapkan ambang yang lebih ketat untuk sinyal survival yang kritis. Selain itu,
isotipe IgG2c memiliki fungsi khusus dalam respon anti-mikroba dan peradangan
karena afinitas wilayah konstan dengan spektrum reseptor Fc pada sel. Banyak
pasien yang menderita penyakit paru-paru hipoksemik menunjukkan IgG serum
yang lebih rendah dan meningkatkan kerentanan terhadap infeksi pernapasan.
Hipoksia juga telah diakui sebagai aspek utama peradangan pada kondisi
penyakit. Pembatasan oksigenasi intra-tumoral menimbulkan efek tidak langsung
pada fungsi kekebalan pada kanker dan mungkin juga bertindak langsung pada
limfosit T. Selain itu, hipoksia dan jaringan neo-limfoid atau struktur limfoid
tersier dengan GC, sel plasma, dan produksi Ab lokal sekarang diakui dalam
berbagai pengaturan inflamasi yang lanskap oksigennya belum dieksplorasi.
Program respon hipoksia dalam sel epitel usus membatasi peradangan lokal,
memberikan regulasi melawan neutrofil yang diaktifkan. Analog dengan ini,
kerentanan IgG2c terhadap hipoksia dapat mewakili cara lain untuk membatasi
patologi dari peradangan tidak terkendali dalam kekebalan tubuh normal .