Metode MPN (Most Probable Number)

Metode penentuan jumlah mikroorganisme dengan metode MPN ini digunakan luas
dilingkungan sanitasi untuk menentukan jumlah kuman koliform didalam air, susu, dan
makanan lainnya. Metode ini adalah metode statistik yang didasarkan pada teori
kemungkinan. Serangkaian sampel diencerkan sampai titik akhir, yaitu tidak ada lagi
mikroorganisme hidup. Untuk mendapatkan titik akhir, serangkaian pengenceran dibiakkan
didalam media pertumbuhan yang cocok. Selanjutnya, perkembangan atau perubahan sifat-
sifat yang mudah diamati, seperti pembentukan asam atau kekeruhan, dipakai untuk
mengetahui adanya pertumbuhan bakteri. Pertumbuhan bakteri pada masing-masing tabung
disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan konsentrasi mikroorganisme didalam
sampel asli.

Metode hitungan cawan dengan menggunakan medium padat, tetapi metode MPN
menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkkan pada
jumlah tabung yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu
dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati
timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas didalam tabung kecil (tabung Durham) yang terletak
pada posisi yang terbalik, yaitu untuk jasa renik yang membentuk gas. Untuk setiap
pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung
yang digunakan menunjukkan keteliatian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi)
yang digunakan juga lebih banyak.

Dalam metode MPN, pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran
pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan
dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung jasad renik, beberapa tabung
mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain tidak mengandung sel
sama sekali. Dengan demikian, setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada
beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung psitif, sedangkan tabung lainnya negatif.

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba didalam sampel
yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang terbentuk padat
dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari sampel tersebut. Kelompok renik yang
dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan
untuk pertumbuhan. Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-
masing dimasukkan 1 ml masing-masing kedalam tabung yang berisi medium, dimana untuk
setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah di inkubasi dengan waktu
tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif, kreteria tabung yang positif atau tidak ditandai
dengan timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham. Misalnya, pada pengenceran
pertama 3 tabung mengahsilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran kedua tabung 2
tabung positif, pada pengenceran ketiga 1 tabung positif, dan pada pengenceran terakhir
tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0, dan jika diambil pengenceran 3
pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini kemudian dicocok
dengan tabel MPN. Tabel tersebut misalnya Daftar Hoskin atau daftar Mac. Grady; kemudian
nilai MPN sampel dapat dihitung sebagai berikut:

1
MPN sampel = nilai MPN dari Tabel x
pengenceran tabung tengah

Tabel digunakan untuk menentukan nilai MPN dari seri 3 tabung berbeda dengan
tabel untuk 5 seri tabung. Kombinasi dipilih dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih
semua tabung positif, sedangkan pada pengenceran yang berikutnya ada tabung yang negatif.
Kombinasi yang diambil terdiri dari 3 pengenceran. Jika pada pengenceran yang keempat
atau seterusnya masih ditemukan tabung yang menghasilkan postif, maka jumlah tabung yang
positif tersebut ditambahkan pada angka kombinasi ketiga sampai mencapai jumlah
maksimum. Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba tertentu yang
terdapat diantara campuran mikroba lain. Misalnya, jika digunakan medium kaldu laktosa,
ditunjukkan dengan terbentuknya gas dalam tabung durham. Cara ini dapat digunakan untuk
menentukan MPN kelompok bakteri Koliform, termasuk juga bakteri-bakteri yang dapat
memfermentasikan laktosa.

Tabel MPN (Most Probable Number)

Bakteri Coliform

Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih
tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran
bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah
koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi
Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain.
Contoh bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi, coliform
adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan coliform, artinya kualitas air semakin
baik.

Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting kualitas air minum.

Kelompok bakteri coliform terdiri atas Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, Citrobacter
fruendii, dan bakteri lainnya. Meskipun jenis bakteri ini tidak menimbulkan penyakit tertentu
secara langsung, keberadaannya di dalam air minum menunjukkan tingkat sanitasi rendah.
Oleh karena itu, air minum harus bebas dari semua jenis coliform. Semakin tinggi tingkat
kontaminasi bakteri coliform, semakin tinggi pula risiko kehadiran bakteri-bakteri patogen
lain yang biasa hidup dalam kotoran manusia dan hewan. Salah satu contoh bakteri patogen-
yang kemungkinan terdapat dalam air terkontaminasi kotoran manusia atau hewan berdarah
panas adalah Shigella, yaitu mikroba penyebab gejala diare, deman, kram perut, dan muntah-
muntah.
 Kelompok bakteri coliform antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan
Citrobacter fruendii. Keberadaan bakteri ini dalam air minum juga menunjukkan adanya
bakteri patogen lain, misalnya Shigella, yang bisa menyebabkan diare hingga muntaber.
Bakteri coliform dapat dibedakan menjadi dua bagian, yaitu :

1. Coliform fekal, misalnya E. coli, merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan
atau manusia.
2. Coliform non-fekal, misalnya E. aeroginosa, biasanya ditemukan pada hewan atau
tanaman yang telah mati.

Bakteri E. coli memiliki kemampuan untuk memfermentasikan kaldu laktosa pada

temperatur 37° Celcius dengan membentuk asam dan dan gas dalam waktu 48 jam. Sejak
diketahui bahwa E. coli tersebar dalam semua individu, analisis bakterialogis terhadap air
minum ditunjukkan dengan kehadiran bakteri tersebut. Walaupun adanya bakteri tersebut
tidak dapat memastikan adanya bakteri patogen secara langsung, namun dari hasil yang
didapat memberikan kesimpulan bahwa E. Coli dalam jumlah tertentu dalam air dapat
digunakan sebagai indikator adanya bakteri yang patogen.

Aerobacter dan Klebsiela yang biasa disebut golongan perantara, memiliki sifat Coli,
dan lebih banyak didapatkan dalam habitat tanah dan air daripada dalam usus, sehingga
disebut “nonfekal” dan umumnya tidak patogen. Pencemaran bakteri fekal tidak dikehendaki,
baik dari segi estetika, sanitasi, maupun kemungkinan terjadinya infeksi yang berbahaya. Jika
dalam 100 ml air minum terdapat 500 bakteri Coli, mungkin terjadi penyakit gastroenteritis
yang segera dapat mengalahkan mekanisme pertahanan tubuh, sehingga dapat tinggal dalam
blander (cystitis) dan pelvis (pyelitis), ginjal dan hati.

Adapun jenis-jenis bakteri patogen dalam air, diantaranya sebagai berikut :

1. Salmonella

Salmonella adalah enterobacteriaceae yang terdistribusi secara luas di dalam

lingkungan, dan meliputru lebih dari 200 tipe. Salmonella thypi adalah agen infeksi
demam tipus, suatu penyakit yang tidak segera diobati dapat menyebabkan kematian.
Salmonella thypi tersebut menghasilkan endoktrin yang dapat menyebabkan demam,
mual dan diare.
 2. Shigella
Shigella secara pintas ada;ah agen disentri bacillus, suatu penyakit diare yang
menyebabkan berak darah sebagai akibat peradangan dan pendarahan selaput atau
dinding uasus. Ada empat spesies shigella yang bersifat patogen yakni shigella
flexneri, shigella dysentriae, shigella boydii, dan shigella sonnei. Keempat shigella
patogen tersebut dapat berpindah dengan cara kontak langsung dengan penderita yang
telah terinfeksi, yang mana orang yang terkena infeksi mengeluarkan shigella di
dalam tinjanya dengan konsentrasi lebih dari 109 shigella per gram tinja. Dosis infeksi
dari shigella relatif kecil yakni sekitar 10 organisme.

3. Vibrio cholerae
Vibrio cholerae adalah bakteri gram-negativ yang berbentuk batang
melengkung, bakteri ini berpindah melalui air. Vibrio cholera mengeluarkan suatu
endoxtrin yang menyebabkan diare ringan sampai diare hebat, muntah, dan dapat
menyebabkan kehilangan cairan dengan cepat, serta dapat menyebabkan kematian
dalam wktu yang relatif sungkat.

4. E. coli
Banyak strain E. coli yang beberapa diantaranya tidak berbahaya, terdapat
pada saluran gastrointensinal pada manusia atau hewan berdarah panas. Tetapi ada
beberapa kategori E. coli yang bersifat beracun, dan dapat menyebabkan diare.

Media Pertumbuhan

a. Media LB (Lactose Broth)

Media yang digunakan untuk mengetahui ada tidaknya kehadiran bakteri
coliform (bakteri Gram negatif) berdasarkan terbentuknya asam dan gas yang
disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coli. Terbentuknya asam
dilihat dari kekeruhan pada media laktosa dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam
tabung durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif coliform jika
terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung durham.

b. Media EMB (Eosin Methylene Blue)

 Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa
dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti
S.aureus, P.aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa
menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan
mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen
blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini
digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P.aerugenosa
dan Salmonella sp. dapat menimbulkan keraguan. Bagaimanapun media ini sangat
baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli.
Agar EMB merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan
jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang
menggunakan eosin dan metilen blue sebagai indikator memberikan perbedaan yang
nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan tidak. Untuk mengetahui jumlah
bakteri E.coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama
MPN (Most Probable Number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel
tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri E.coli dalam 100 ml
dan 0,1 ml contoh air.

Tahap –Tahap Uji MPN

a. Uji Penduga (Presumptive test)

Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri coliform
berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh
bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa
dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara.
Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di
dalam tabung durham. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat
dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas
dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung
jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam
hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 350C. Jika
dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung durham, dihitung sebagai
hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. MPN
penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN.
 b. Uji Penguat (Confirmed Test)
Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif
terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1 x 24 jam, suspensi ditanamkan
pada media Eosin Methylen Blue Agar ( EMB ) secara aseptik dengan menggunakan
jarum inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan
dengan kilat metalik atau koloni berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok
coliform lainnya.

c. Uji Pelengkap (Completed Test)

Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji kelengkapan untuk menentukan
bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji ketetapan diinokulasikan
ke dalam medium kaldu laktosa dan medium agar miring Nutrient Agar ( NA ),
dengan pada suhu 37o C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan
gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli.
Dari media agar miring NA dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia coli
menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan bakteri
golongan coli dari bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinja hewan berdarah
panas), pekerjaan dibuat duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu 37o C (untuk
golongan coli) dan satu seri diinkubasi pada suhu 42o C (untuk golongan coli fekal).
Bakteri golongan coli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42 o C, sedangkan
golongan coli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420 C.

https://www.academia.edu/8723246/Metode_MPN_fix