TERAPI GEN

PENDAHULUAN

Tubuh manusia terdiri dari berbagai protein. Hampir semua penyakit manusia
adalah hasil dari kesalahan produksi atau kesalahan fungsi protein. Molekul kecil obat
biasanya berinteraksi dengan protein seperti enzim, hormon, dan faktor transkripsi
untuk mengaktifkan potensi terapeutik mereka.

Terapi gen adalah penggunaan asam nukleat sebagai agen untuk mengobati
penyakit. Berbeda dengan molekul kecil obat atau obat protein yang biasanya
diformulasikan dalam bentuk kapsul atau tablet, terapi asam nukleat dikemas dalam
vektor khusus untuk masuk ke dalam sel di dalam tubuh.

Potensi penggunaan asam nukleat sebagai terapi telah menarik perhatian besar
untuk mengobati penyakit parah dan melemahkan penyakit genetik. Dibandingkan
dengan molekul kecil obat-obatan, terapi gen tidak akan menyebabkan resistensi obat
bahkan setelah perawatan berulang sebab target pengobatan gen bukanlah reseptor
tertentu tetapi gen yang menyandikan mereka.

VEKTOR UNTUK TRANSFER GEN

 Komponen Dasar Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler, untai ganda yang mengandung coding
sequence DNA komplementer (cDNA) untuk gen terapeutik dan beberapa elemen
genetik lainnya termasuk elemen bakteri, Transcription Regulatory Elements (TRE),
Multiple Cloning Site (MCS), Untranslated Regions (UTR), intron, urutan
polyadenylation (polyA), dan fusion tags, yang semuanya memiliki dampak besar pada
fungsi produk genetik akhir. Setelah membangun plasmid, metode penyaringan
tertentu diperlukan untuk memvalidasi. Misalnya, sekuensing DNA, Polymerase Chain
Reaction (PCR), dan Southern blot berguna untuk memvalidasi struktur konstruksi.
Southern Blot dan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) berguna untuk
mengkonfirmasi fungsi konstruksi gen.

- Elemen Bakteri

Elemen pertama yaitu origin of replication (Ori), yang merupakan urutan DNA
spesifik yang mengikat faktor-faktor pengatur replikasi plasmid dan pada gilirannya
mengendalikan jumlah salinan plasmid per bakteri. Elemen kedua yang diperlukan
adalah selectable marker, biasanya pada gen yang memberikan resistensi terhadap
antibiotika. Marker membantu dalam pemilihan bakteri yang memiliki ekspresi gen
plasmid yang menarik. Escherichia coli (E. coli) adalah bakteri yang umum digunakan
untuk menyebarkan plasmid. E. coli memiliki properti untuk ditransfer oleh DNA, baik
dengan konjugasi bakteri, transduksi, atau transformasi.

- Transcription Regulatory Elements (TRE)

Plasmid yang mengekspresikan gen mengandung Transcription Regulatory

Elements (TRE) untuk mengontrol transkripsi. Berbagai TRE (promotor, enhancer,
operator, silencer, isolator, dll.) Berinteraksi dengan mesin molekuler (faktor transkripsi
umum, aktivator, co-aktivator, dan repressor) untuk mengontrol pola ekspresi gen.

Promoter adalah urutan DNA yang memungkinkan gen untuk ditranskripsikan.

Promoter dikenali oleh RNA polimerase dan faktor transkripsi. Mutasi apapun yang
terjadi di wilayah ini akan mencegah pengikatan RNA polimerase, transkripsi
selanjutnya dan hasil terjemahannya. Pemilihan yang tepat dari promoter menentukan
kekuatan dan durasi ekspresi transgenik. Cytomegalovirus (CMV), Rous Sarcoma
Virus (RSV), dan Simian Virus 40 (SV40) adalah beberapa contoh di antara promoter
virus terkuat yang diketahui. Potensi promoter dapat spesifik pada sel dan jaringan.
Bukti yang luar biasa menunjukkan bahwa promoter CMV secara mengejutkan
dihambat di kedua Embryonic Stem Cells (ES) dan sel induk dewasa lainnya, sehingga
membuat promoter seperti itu tidak cocok untuk terapi gen berbasis sel induk baru
(stem cells) yang berkembang.

Enhancer adalah urutan DNA pendek yang bisa mengikat faktor transkripsi atau
aktivator untuk ditingkatkan tingkat transkripsi gennya dalam kluster gen. Sementara
kebanyakan enhancer biasanya dekat dengan promoter dan gen. Enhancer
(peningkat) tertentu mengontrol ekspresi gen dari jarak yang jauh atau bahkan dari
kromosom yang berbeda.

TRE yang lain termasuk isolator, operator, dan silencers. Isolator merupakan
elemen pembatas genetik untuk memblokir interaksi enhancer-promoter atau
menghilangkan hambatan terhadap kromatin protein. Operator dan silencers biasanya
adalah sekuens pendek DNA yang dekat dengan promoter yang memiliki ikatan
afinitas dengan seperangkat protein bernama repressor dan inducer. Berdasarkan
interaksi ini, sistem dapat diinduksi atau ditekan untuk menambah atau mengurangi
transkripsi tergantung pada kebutuhan.
 -Untranslated Regions (UTR)

Pada gen molekuler, UTR dibagi 2 daerah tiap daerah pengkode pada mRNA. 5’
UTR terletak pada daerah transkripsi mRNA di antara daerah cap dan kodon inisiasi,
yang terdapat bagian regulator yang berfungsi mengatur ekspresi gen. Bagian tersebut
meliputi binding site protein untuk mengatur stabilitas struktur mRNA, riboswitches
untuk regulasi aktivitas translasi mRNA, binding sequence untuk stabilisator atau
inhibitor proses translasi-inisiasi dan intron untuk mengatur pemotongan dan export
mRNA. 3’ UTR juga mempunyai peran penting untuk stabilisasi mRNA. 3’ UTR terdiri
dari binding site protein, a polyadenilation tail untuk export inti sel, translasi dan
stabilisasi mRNA dan binding site miRNA.

 Intron

Intron ditranskripsi dengan exon pengkode protein menjadi pre-mature mRNA

dan dihilangkan oleh mRNA splicing. Intron dimasukkan pada daerah transkripsi 5’
UTR.

 PolyA Sequence

Sekuen Polyadenilasi merupakan sekuen penting yang berfungsi untuk

mengeluarkan inti sel, translasi dan stabilisasi mRNA dan mencegah mRNA rusak oleh
degradasi enzim. Pada akhir transkripsi, ujung 3’ baru yang dibuat pada RNA dipotong
pertama kali oleh protein tertentu. Protein ini akan mensintesis ujung polyA pada ujung
3’ RNA. Situs pengenalan polyA terdiri dari hexamer AAUAAA terletak sepanjang 10-30
nukleotida hingga ujung 5’ dan daerah kaya GU- dan U- terletak maksimal 30
nukleotida hingga ujung 3’.

 Tag Fusi

Tag fusi adalah protein atau peptida yang terletak di C- atau N-terminal protein
target untuk mengarahkan fungsi yaitu peningkatkan ekspresi, kelarutan, deteksi,
pemurnian, atau penempatan.
VEKTOR VIRUS

Semua virus mengikat dan mengenalkan materi genetik pada sel host. Untuk
menghasilkan vektor virus, gen berperan dalam replikasi virus dan sifat patogenisitas
dihilangkan. Lalu, gen virus rekombinan dimasukkan pada plasmid lalu dipindah dalam
sel untuk menghasilkan vektor virus rekombinan. Vektor terdiri dari sekuen terminal
(ITRs / LTRs), the packaging signal (ψ), dan the transgene cassette. The packaging
signal (ψ), berfungsi meregulasi proses perpindahan materi genetik ke kapsid virus
selama replikasi.
 Retrovirus
Retrovirus adalah virus RNA yang terselubung mengandung 2 kopi dari sebuah
genom 1 untai RNA. Retrovirus memiliki diameter antara 80-100 nm dan punya genom
sebesar 7-10 kb, terdiri dari kode-kode gene antigen grup-spesifik (gag) untuk protein
inti dan struktural dari virus; kode gen polimerase (pol) untuk transkriptase terbalik,
protease, dan integrase; dan kode gen selubung (env) untuk protein selubung
retrovirus. Long terminal repeats (LTRs) mengontrol ekspresi dari gen virus, karenanya
berperan sebagai enhancher-promoter. Elemen terakhir pada genom, sinyal packaging
(ψ), membantu membedakan RNA virus dari RNA host.
 Kecocokan retrovirus sebagai vektor untuk gen transfer
 Untuk menghasilkan vektor replikasi-defisiensi retrovirus sekuens pengkode
protein virion (gag, pol, dan env) bertanggung jawab untuk replikasi virus dan
patogenisitas diganti dengan transgen. Tansgene bisa dikontrol dengan LTRs alami
atau sekuens enhancer-promoter exogenous yang dapat direkayasa kedalam genome
bersama dengan transgen. Genom chimerik nantinya dikenalkan pada jalur packaging
sel, biasanya sel HEK293 untuk produksi vektor retrovirus.
Vektor retrovirus mempunyai beberapa fitur untuk aplikasi transfer gen, vektor
retrovirus dapat mengakomodasi kaset transgen 8 kb. Retrovirus vektor berguna pada
integrasi kedalam host genome. Maka dari itu retrovirus dapat memproduksi ekpresi
transgene yang stabil dan jangka panjang dalam pembelahan sel dengan potensial
imunogenik rendah. Retrovirus bisa juga digunakan untuk langsung
bertransdiferensiasi dari sel stem atau memprogram kembali sel somatik yang
berdiferensiasi untuk mempunyai sifat seperti sel stem. fungsi seperti itu membuat
retrovirus sebuah alat yang berharga dalam sebuah area yang baru muncul bernama
“Terapi gen berbasis sel stem” dalam 2 dekade lalu.
Limitasi utama dari terapi gen berdasarkan retrovirus adalah retrovirus secara
acak memasukkan materi genetik kedalam genome host. Jika material genetik
dimasukkan di tengah sebuah gen dari sel host, gen ini akan terganggu (mutagenesis
insertional). Jika gen ini secara langsung mengatur divisi sel, dapat terjadi sel tidak
terontrol (oncogenesis insertional). Untungnya, masalah ini sudah mulai ditangani
dengan zinc finger nucleases (ZFNs) atau dengan manipulasi genetik pada LTRs dari
viral genome.
 Adenovirus
 Biologi
Adenovirus
non- envelope
(bagian luar tanpa
bilayer), icosahedral,
virus DNA litik
yang tersusun
dari
nukleokapsid dan linear double-stranded genom). Adenovirus mampu menginfeksi sel
pembagi dan tidak membelah. Lima puluh serotipe adenovirus telah diidentifikasi saat
ini. Mereka dikelompokkan menjadi 7 sub kelompok (A-G) berdasarkan ukuran genom,
komposisi, hemagglutinating properti, dan onkogenitas. Adenovirus serotipe 2 dan 5
adalah yang paling banyak dipelajari dan Pertama digunakan sebagai vektor untuk
terapi gen. Gen awal menyandi protein yang diperlukan untuk replikasi virus,
sedangkan gen akhir mengkode protein untuk berkumpul menjadi partikel virus.
 Kesesuaian Adenovirus sebagai Vektoruntuk Transfer Gen
Untuk membangun vektor adenoviral untuk terapi gen, Wilayah E1 dan wilayah
E3 dari genom virus sering dihapus untuk mencegah replikasi virus dan
mengakomodasi transgen. Baru-baru ini, adenovirus dengan E1 dan E3 menyisipkan
secara bersamaan mengungkapkan dua terapi gen. Apalagi adenovirus dengan E1,
E3, dan E4 penghapusan dan bahkan adenovirus “gutless” (adenovirus tanpa wilayah
kode virus) telah dibangun untuk mendorong ekspresi transgen.
Upaya signifikan telah dilakukan untuk mengatasi masalah kekebalan sistemik
yang diinduksi adenovirus. Adenovirus dengan lebih banyak penghapusan di gen awal
dan bahkan adenovirus yang bergantung pada usus "tanpa usus" telah dibangun untuk
mengurangi respon inflamasi dan mengakomodasi lebih banyak transgen kaset.
Strategi lain yang terlibat penggabungan asam arginin-glisin-aspartat (RGD) urutan
dan jaringan ligan spesifik ke permukaan partikel virus untuk mengurangi sistemik
respon imun dan meningkatkan efisiensi transfer gen. Namun, tidak satu pun dari
strategi ini memberikan penghapusan penuh dari respon imun. Pemberian bersama
agen imunosupresif seperti siklofosfamid, FK506, dan cyclosporin A memperpanjang
durasi ekspresi transgen, tetapi tidak mencegah pengembangan antibodi penawar.
Adenovirus berlapis "Stealth" dengan polietilen glikol (PEG) atau polimer lainnya juga
dirancang untuk mengurangi imunogenisitas, meningkatkan waktu sirkulasi darah, dan
memperpanjang ekspresi transgen.
Adenovirus kompeten yang dapat direplikasi (RCA) adalah masalah lain
menggunakan adenovirus di tubuh manusia. Meskipun gen awal bertanggung jawab
atas replikasi dan patogenisitas virus sudah dihapus dalam proses konstruksi vektor,
RCA masih dapat dihasilkan oleh rekombinasi homolog jika ada tumpang tindih antara
urutan dalam genom virus dan sel kemasan. Beberapa kelompok telah mengamati
produksi RCA dari sel HEK293 karena urutan tumpang tindih.
- Penggunaan Klinis dari Vektor Adenovirus
 Saat ini, sekitar 23% dari semua uji klinis terapi gen melibatkan adenovirus
rekombinan, yang menjadikannya vektor yang paling banyak digunakan untuk transfer
gen. Namun, beberapa terobosan dalam terapi gen berbasis adenovirus telah dibuat.
Dengan bantuan strategi penyampaian spesifik jaringan yang ditargetkan, generasi
baru vektor adenoviral cenderung memengaruhi kekebalan sistemik yang parah.
Sebagai contoh, administrasi aerosol dari adenovirus rekombinan yang
mengekspresikan cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)
kepada pasien fibrosis kistik menunjukkan keamanan dan membuktikan konsep terapi
gen berbasis adenovirus

 Adeno-Associated Virus (AAV)

- Biologi

Genom AAV adalah molekul DNA 4,7 kb linier, beruntai tunggal yang terdiri dari
dua frame pembacaan terbuka (ORF), rep, cap, dan dua pengulangan terminal terbalik
(ITR) yang menentukan awal dan akhir genom virus dan urutan pengemasan. Gen rep
mengkode protein yang bertanggung jawab untuk replikasi virus, sedangkan gen cap
mengkode protein kapsid struktural. ITR diperlukan untuk replikasi, pengemasan, dan
integrasi genom.

- Kecocokan Virus yang Terkait Adeno untuk Transfer Gen

Vektor AAV rekombinan dengan cepat mendapatkan popularitas untuk aplikasi

terapi gen dalam dekade terakhir, karena kurangnya patogenisitas dan kemampuan
untuk membentuk ekspresi gen jangka panjang. Genom virusnya sederhana, sehingga
mudah dimanipulasi. Virus ini tahan terhadap tantangan fisik dan kimia selama
pemurnian dan penyimpanan jangka panjang. Kemampuan virus untuk berintegrasi
dalam kromosom manusia adalah masalah awal, tetapi akhirnya ternyata AAV hanya
berintegrasi ke lokasi kromosom manusia yang telah diperbaiki dan frekuensi integrasi
AAV rekombinan cukup rendah.

- Penggunaan Klinis Vektor Virus Adeno-Associated

Penggunaan klinis pertama AAV rekombinan adalah untuk memindahkan cystic

fibrosis transmembran conductance regulator (CFTR) cDNA ke epitel pernapasan
untuk mengobati fibrosis kistik.

VEKTOR NONVIRAL
 Vektor nonviral secara signifikan kurang imunogenik dan tidak cenderung
menginduksi mutagenesis insersi dan rekombinasi homolog yang tidak diinginkan
setelah penyerapan oleh sel. Mereka juga relatif mudah untuk dimanipulasi, diproduksi,
dan dimurnikan dalam skala besar dibandingkan dengan rekan-rekan virus mereka.
Terapi gen nonviral meliputi pemberian plasmid telanjang secara lokal atau
menggunakan pembawa khusus untuk mengirim plasmid ke area ini. Namun, utilitas
klinis mereka masih terhambat oleh efisiensi transfeksi yang rendah, yang berasal dari
pengambilan vektor yang tidak spesifik oleh hambatan epitel dan matriks ekstraseluler
dan pengiriman yang buruk ke target terapi.

 Metode Pengiriman untuk Transfer Gen Nonviral

- Metode Fisik untuk Transfer Gen

Metode fisik melibatkan transfer plasmid telanjang dengan gangguan langsung

(target) membran sel. Metode kimia meningkatkan penyerapan plasmid oleh sel-sel
yang ditargetkan menggunakan pembawa berbasis lipid, peptida, atau polimer.

- Lipid kationik

Sejak penemuan lipofectamine pada tahun 1987, banyak lipid kationik telah
disintesis dan diuji untuk pengiriman gen. 2, 3-dioleyloxypropyl-1-trimethyl ammonium
bromide (DOTMA) dan 3-β [N (NV, NV- dimethylaminoethane) -carbamoyl] kolesterol
(DC-Chol) adalah dua lipid kationik yang umum digunakan dengan struktur yang
berbeda. Lipid kationik biasanya dicampur dengan ko-lipid netral seperti
dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) pada rasio molar tertentu untuk mengurangi
toksisitas dan meningkatkan pengiriman gen. PEGilasi poliplex sering digunakan untuk
mengurangi pengikatan plasma dan meningkatkan waktu sirkulasi liposom kationik.

- Peptida

Sama seperti lipid kationik, peptida kationik memadatkan DNA dengan cara yang
serupa dan dapat digunakan sebagai pembawa pengiriman gen. Poly (L -lysine) (PLL),
suatu polydisperse, pengulangan sintetis dari asam amino lisin, adalah salah satu
peptida kationik pertama yang menghantarkan gen. Namun, peningkatan panjang PLL
menyebabkan peningkatan sitotoksisitas. Selain itu, PLL menunjukkan efisiensi
transfeksi terbatas dan membutuhkan penambahan agen endoosmolitik seperti peptida
fusogenik untuk memfasilitasi pelepasan plasmid ke dalam sitoplasma. Karena
masalah ini, banyak peneliti telah beralih ke pengembangan PLL yang mengandung
peptida "aktif" dan telah menemui beberapa keberhasilan.

- Polimer

Polimer kationik sintetik dan yang terjadi secara alami merupakan kategori lain
dari pembawa gen. Polyethyleneimine (PEI) telah menjadi yang paling luas polimer
kationik yang digunakan untuk pengiriman gen yang terakhir dua dekade. Boussif et al.
pertama kali melaporkan bahwa PEI terkondensasi dengan oligonukleotida dan bentuk
plasmid dari partikel koloid (1 - 1.000 nm) yang merupakan efek yang sangat efisien
sistem pengiriman, baik in vitro dan in vivo. Namun, PEI, terutama PEI dengan tinggi
berat molekul (> 25 kD), sangat sitotoksik. PEI menginduksi membran yang
menyebabkan kematian dan gangguan sel nekrotik segera membran mitokondria
setelah internalisasi menyebabkan apoptosis. PEI mengikat komponen darah, matriks
ekstraseluler, dan sel yang tidak ditargetkan setelah injeksi intravena. Kation modifikasi
PEI adalah diusulkan untuk mengatasi masalah ini.

 Penggunaan Klinis Nonviral Vektor

Tidak mungkin, dengan teknologi nonviral saat ini, untuk cocok dengan efisiensi
transduksi tinggi dan tingkat tinggi ekspresi yang dilaporkan dengan metode viral
tertentu di vivo.

Saat ini ada 333 uji klinis menggunakan DNA plasmid untuk mengobati sejumlah
penyakit. Banyak dari uji coba ini masih dalam tahap I pengujian sejauh ini. Secara
kolektif, studi-studi klinis ini memberikan "prinsip pembuktian" untuk terapi gen nonviral
tetapi juga menyoroti perlunya pengembangan formulasi dengan peningkatan efisiensi
transfeksi dan efisiensi terapeutik - kation. Juga harus disebutkan bahwa mayoritas uji
coba ini tidak terkontrol, label terbuka, fase I desain terutama menyelidiki keamanan
dan kelayakan. Kemungkinan efek plasebo yang kuat tidak dapat diabaikan dalam uji
coba ini. Efektivitas hasil dari ini studi harus ditafsirkan dengan hati-hati dan hanya bisa
dinilai dengan melakukan uji coba fase II / III lebih lanjut.

TERAPI GEN BERBASIS STEM

Terapi gen berbasis sel induk muncul dari baru-baru ini kemajuan dalam terapi
sel dan terapi gen. Sel terapi menggambarkan proses memperkenalkan sel-sel baru ke
dalam jaringan untuk mengobati penyakit. Kemajuan terbaru dalam sel terapi, terutama
berkembang wawasan dasar dalam sel induk perilaku, mendorong terobosan dalam
kedokteran regeneratif, yang merupakan proses penggantian atau regenerasi sel
manusia, jaringan, atau organ untuk memulihkan atau membangun fungsi normal.
Terapi gen berbasis sel punca adalah proses multistep, dimulai dengan isolasi batang
sel dari pasien. Langkah ini diikuti oleh ex vivo ekspansi sel induk dan transduksi
dengan gen mentransfer vektor. Akhirnya, sel-sel induk yang ditransfusikan adalah
diinfuskan kembali ke pasien untuk mengobati penyakit tertentu.

TERAPI SEL STEM

Sel induk ada di semua organisme multisel dan berbagi dua sifat karakteristik.
Mereka telah memperpanjang atau kapasitas pembaruan diri yang tak terbatas dan
potensi untuk berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel khusus. Itu sel induk paling
awal dalam kehidupan manusia adalah batang embrionik sel (ESC), berasal dari
massa sel bagian dalam blastokista dan mampu berdiferensiasi menjadi semua
turunan dari tiga lapisan benih primer: ektoderm, endoderm, dan mesoderm. Selain
ESC, yang bisa hanya diisolasi dari embrio awal, ada yang lain jenis sel punca pada
jaringan dewasa semua umur mamalia, sel induk dewasa. Sel induk dewasa memiliki
kapasitas pembaharuan diri tak terbatas dan lebih terbatas potensi diferensiasi.
Mereka berkembang biak dengan pembelahan sel untuk mengisi sel yang sekarat dan
regenerasi yang rusak tisu.

STEM SEL SEBAGAI PEMBAWA DALAM PENGIRIMAN GEN

Kemajuan dalam terapi gen dalam dua dekade terakhir telah berdampak besar
pada bagaimana sel punca dapat digunakan untuk mengobati penyakit tertentu. Sejak
pertama berhasil pada kasus terapi gen di mana gen ADA dimasukkan ke dalam
limfosit T autologous untuk mengobati defisiensi ADA yang diinduksi SCID, beberapa
kelompok memiliki tujuan yang ambisius untuk memperbaiki kekurangan ADA secara
permanen dengan memasukkan gen ADA ke dalam sel progenitor hematopoietik dari
sumsum tulang dan darah tali pusat. Meskipun hasil keseluruhan mengecewakan,
ekspresi transgen di sel-sel progenitor hematopoietik memang memberikan
keuntungan dalam kelangsungan hidup, pertumbuhan, dan diferensiasi yang selektif
untuk keturunan limfosit.
Terapi gen berbasis sel punca juga menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam
uji klinis X-SCID pada tahun 1999. Protokol terdiri dari isolasi sel progenitor CD34
sumsum tulang yang dipanen dari puncak iliaka pasien dan transduksi ex vivo dengan
retrovirus yang mengkode sitokin-reseptor γ-rantai (γc). Empat dari lima pasien, infus
sel CD34+ yang ditransduksi menyebabkan generasi transduksi-fungsional sel T pada
orang-orang dengan usia dalam 6-12 minggu. Terapi gen tradisional (seperti yang
dibahas sebelumnya) berfokus pada pengantar bahan genetik dalam sel matang untuk
mengobati keturunan, penyakit genetik, sedangkan terapi gen berbasis sel induk
mungkin merupakan pengobatan permanen untuk penyakit genetik ini.

SEL STEM SEBAGAI OBAT REGENERATIF

Sel punca dapat diprogram ulang atau ditransdiferensiasi dengan modifikasi
genetik untuk mengisi kembali sel atau jaringan yang rusak. Fitur-fitur ini secara
genetik memodifikasi sel punca sebgai alat yang ampuh dalam pengobatan
regeneratif. Vektor virus secara efisien mentransduksi sel punca dan mengarahkan
diferensiasi mereka. Peng dan rekan kerjanya, pertama kali menunjukkan bahwa sel
punca turunan otot secara genetik direkayasa dengan retrovirus untuk
mengekspresikan human bone morphogenetic protein-4 (BMP4) dan VEGF
menginisiasi pembentukan tulang dan penyembuhan tulang pada a model tikus
Vektor virus adalah alat yang paling populer mengarahkan diferensiasi sel induk
secara regeneratif obat. Namun, karena risiko insersi mutagenesis dan generasi
replikasi-kompeten virus, vektor nonviral juga dipelajari dalam terapi gen berbasis stem
sel.
Sumber untuk sel punca adalah masalah lain untuk terapi gen berbasis stem
cell. iPSC diinduksi dari sel somatik menawarkan alternatif potensial untuk ESC dan
sel punca dewasa lainnya yang persediaannya terbatas. Namun, pembentukan
teratoma dan immunogenisitas tetap menjadi masalah yang belum terselesaikan yang
menghambatnya aplikasi luas iPSCs

SASARAN PENYAKIT BAGI TERAPI GEN

Saat ini ada 1.786 terapi gen aktif yang mengalami uji klinis di seluruh dunia.
Sekitar 65% dari uji coba ini untuk pengobatan kanker. Pengobatan penyakit
monogenetik, penyakit kardiovaskular, dan penyakit menular masing-masing
mengambil ~ 10% dari jumlah uji klinis aktif. Pengobatan penyakit neurologis, yang
telah berkembang sangat cepat dalam 5 tahun terakhir, adalah tujuan 2% dari uji klinis
aktif. Saat ini, percobaan terapi gen terutama dilakukan di Amerika Serikat (64% dari
semua uji coba), Inggris (11%), dan Jerman (4,5%).
TERAPI GEN KANKER
 Mayoritas uji klinis terapi gen saat ini adalah dikhususkan untuk mengobati
kanker. Ada dua manfaat potensial menggunakan terapi gen untuk mengobati kanker:
(a) berbasis gen perawatan dapat menyerang kanker yang ada di tingkat molekul,
menghilangkan kebutuhan untuk obat-obatan, radiasi, atau bedah (b) mengidentifikasi
gen kerentanan kanker di individu atau keluarga mungkin memiliki dampak yang
signifikan untuk mencegah penyakit sebelum terjadi.
Strategi untuk mencapai tujuan-tujuan ini termasuk (a) koreksi mutasi genetik
yang berkontribusi pada fenotip yang ganas dengan mengganti gen yang hilang atau
mengubah. gen cacat dengan gen sehat, (b) peningkatan respons imun pasien
terhadap kanker (imunoterapi), (c) penyisipan gen ke dalam sel kanker untuk
membuatnya lebih sensitif terhadap kemoterapi konvensional dan radioterapi atau
perawatan lain, (d) pengenalan dari "gen bunuh diri" ke dalam sel kanker pasien yang
bisa secara enzimatik mengaktifkan prodrug dalam sel-sel ini untuk menghancurkan
mereka, dan (e) membunuh tumor secara langsung virus oncolytic.
 Koreksi Mutasi Genetik
Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk mengoreksi mutasi genetik
berkontribusi pada fenotip ganas oleh mengganti gen yang hilang atau menghilangkan
gen cacat. Memahami kanker pada tingkat molekuler adalah platform untuk koreksi
gen dalam terapi kanker. Itu inaktivasi atau aktivasi gen tertentu dapat berkontribusi
pada pertumbuhan tumor. Meskipun prosesnya kompleks, perkembangan dan
pertumbuhan tumor membatasi kegunaan dari strategi ini, sekitar 12% dari gen kanker
yang percobaan klinisnya melibatkan ekspresi berlebih dari gen penekan tumor seperti
p53, MDA-7, dan
 Imunoterapi
Dalam pendekatan ini, terapi gen digunakan untuk merangsang kemampuan
alami tubuh untuk menyerang sel kanker. Pada salah satu studi, limfosit darah perifer
autologus direkayasa secara genetika dengan vektor retroviral yang mengkodekan
melanoma spesifik reseptor sel T (TCR) adalah diberikan kepada pasien dengan
melanoma metastasis. Limfosit T yang direkayasa secara genetika kemudian
mengenali antigen pada permukaan sel tumor melalui TCR dan membunuh sel-sel
tumor.
• Sensitisasi Tumor
Dalam pendekatan ini, gen dimasukkan ke dalam sel kanker untuk membuatnya
lebih sensitif terhadap kemoterapi konvensional dan radioterapi atau perawatan lain.
Kami sebelumnya menyebutkan bahwa ekspresi transgen p53 membuat kepekaan
tumor terhadap efek terapi kemoterapi dan radioterapi konvensional

• Terapi Enzim-Prodrug yang Disutradarai Gen

Dalam pendekatan ini, terapi gen bertujuan untuk memaksimalkan efek obat
beracun dan meminimalkan efek sistemiknya dengan menghasilkan obat in situ di
dalam tumor. langkah pertama dalam prosedur ini, gen untuk enzim eksogen dikirim
dan diekspresikan dalam sel tumor. Selanjutnya, prodrug diberikan dan dikonversi
menjadi obat aktif (metabolit toksik) oleh enzim asing yang diekspresikan di dalam atau
di permukaan sel tumor. Gen bunuh diri biasanya berasal dari virus atau prokariotik
tanpa homolog manusia. Namun,hal ini bukan persyaratan mutlak asalkan prodrug
tidak diaktifkan pada tingkat signifikan oleh enzim seluler asli. Dalam studi praklinis,
Chen et al. pertama melaporkan kombinasi yang berhasil dari sistem gen bunuh diri /
prodrug dan imunoterapi untuk mengobati metastasis hati pada tikus. meningkatkan
sistem ke sistem gen bunuh diri ganda sebagai mekanisme keamanan untuk
menghapus sel tumor dengan cara yang dapat diandalkan. Ada beberapa varian terapi
enzim-prodrug yang diarahkan ke gen. Dalam uji klinis fase II dengan Cerepro, waktu
kelangsungan hidup rata-rata pasien meningkat menjadi 15 bulan dibandingkan
dengan 7,4 bulan pada pasien yang diobati dengan terapi retroviral atau 8,3 bulan
dengan adenovirus yang tidak efektif.

• Virus Oncolytic (Viroterapi)

Dalam pendekatan ini, virus oncolytic secara langsung dimasukkan ke dalam
tumor untuk menginduksi kematian sel melalui replikasi virus, ekspresi protein
sitotoksik, dan lisis sel. Virus Vaccinia, herpes simplex tipe-I (HSV), reo virus, virus
penyakit Newcastle, poliovirus, dan adenovirus sering dipilih untuk aplikasi ini karena
mereka secara alami menargetkan kanker dan mengandung genom yang dapat
dengan mudah dimanipulasi. Meskipun ada beberapa keberhasilan klinis, tindakan
pencegahan keamanan yang signifikan harus diambil, membuat uji klinis dengan virus
ini sangat mahal dan rumit. Pembersihan virus oleh imunitas seluler dan antibodi
penetralan yang sudah ada sebelumnya akan berdampak negatif pada sebagian besar
efektivitas viroterapi.
 Terapi gen nonviral

Dalam dua dekade terakhir, terapi gen telah banyak digunakan dalam uji klinis
untuk pengobatan kanker dan hasilnya cukup menggembirakan. Sebagian besar uji
klinis menggunakan terapi gen berbasis vektor virus, mungkin karena efisiensi
transfeksi yang tinggi dari strategi ini. Terlepas dari kenyataan bahwa terapi gen
berbasis nonviral relatif lebih aman dan kurang tumorigenic, pekerjaan yang luas masih
diperlukan untuk lebih mengoptimalkan strategi ini (meningkatkan ekspresi transgen,
mengurangi pengikatan protein plasma, meloloskan diri dari sistem retikuloendotelial
(RES) dan endosom, dll.) Agar dapat diterima secara klinis.

PENYAKIT MONOGENETIK

Keberhasilan terapi gen terbesar saat ini telah dicapai dalam mengobati penyakit
monogenetik, yang merupakan kelompok penyakit terbesar kedua yang diobati oleh
terapi gen, terdiri dari 8,5% semua uji klinis terapi gen aktif. Tujuan terapeutik utama
terapi gen untuk penyakit monogenetik adalah mengganti gen cacat secara permanen
dengan salinan yang baik untuk mengembalikan fungsi normal dan membalikkan
proses penyakit secara permanen. Sampai saat ini, uji klinis belum memenuhi tujuan
ini. Dari 151 uji coba klinis terapi gen aktif untuk penyakit monogenetik, sekitar
sepertiga ditargetkan cystic fibrosis (CF), penyakit genetik bawaan paling umum di
Eropa dan Amerika Serikat. Sampai sekarang, gabungan sindrom imunodefisiensi
parah, yang terdiri dari 20% uji coba untuk kelainan bawaan, adalah satu-satunya
kelompok penyakit di mana terapi gen telah menunjukkan manfaat terapeutik yang
bertahan lama, bermakna secara klinis.

Masalah yang mengahalangi keberhasilan transfer gen untuk penyakit

monogenetik sampai saat ini termasuk (a) kurangnya teknologi pengiriman gen yang
cocok, (b) interaksi yang tidak menguntungkan antara inang dan vektor transfer gen,
(c) biologi kompleks dan patologi penyakit monogenetik dan organ target, dan (d)
kurangnya langkah-langkah yang relevan untuk menilai efikasi klinis transfer gen.
Tantangan terbesar yang masih ada dalam mengobati penyakit monogenetik adalah
untuk menginduksi ekspresi gen secukupnya untuk memperbaiki fenotipe klinis tanpa
pengendapan respon imun inang dan meminimalkan risiko mutagenesis insersional
untuk mengintegrasikan vektor dalam membagi target seluler. Peningkatan dalam
teknologi vektor dan kemajuan dalam pemahaman proses seluler akan sangat
meningkatkan metode untuk koreksi penyakit genetik.

PENYAKIT KARDIOVASKULAR

Penyakit kardiovaskular adalah kelompok penyakit terbesar ketiga yang diobati

secara aktif dengan uji klinis terapi gen. Pemahaman saat ini tentang mekanisme
molekuler penyakit kardiovaskular telah mengungkap sejumlah besar gen yang bisa
berfungsi sebagai target potensial untuk terapi molekuler. Misalnya, ekspresi berlebih
dari gen yang terlibat dalam vasodilasi seperti endotelial nitric oxide synthase (eNOS)
dan heme oxygenase-1 (HO-1) atau penghambatan molekul yang terlibat dalam
vasokonstriksi (angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensinogen (AGT)) telah
berkurang tekanan darah pada model hewan hipertensi. Kebanyakan uji klinis untuk
penyakit kardiovaskular dirancang untuk mengobati iskemia koroner dan perifer.
Ekspresi berlebihan faktor pro-angiogenik seperti faktor pertumbuhan endotel vaskular
(VEGF), faktor pertumbuhan fibroblast (FGF), dan faktor pertumbuhan hepatosit (HGF)
telah efektif dalam iskemia miokard dan perifer pada studi praklinis. Meskipun
kurangnya manfaat yang signifikan dalam beberapa uji klinis sebelumnya, terapi gen
VEGF memang menunjukkan profil keamanan yang sangat baik dan peningkatan
gejala pada pasien setelah adenovirus atau pemberian intramyocardial plasmid dalam
kedua studi percontohan dan tindak lanjut jangka panjang. Namun, keberhasilan yang
terbatas dialami dalam menggunakan terapi gen untuk mengobati penyakit
kardiovaskular dibandingkan dengan daerah lain. Percobaan yang lebih besar,
tersamar ganda, acak, dan terkontrol diperlukan untuk meminimalkan potensi bias
terhadap efek plasebo yang diduga terjadi dalam beberapa percobaan. Kriteria ketat
untuk pemilihan pasien diperlukan karena banyak dengan penyakit kardiovaskular
sering memiliki kondisi mendasar yang dapat mempengaruhi hasil. Titik akhir untuk
menilai kemanjuran dan langkah-langkah untuk menilai potensi komplikasi jangka
pendek dan jangka panjang juga harus dibakukan di antara kelompok-kelompok
penelitian. Kemanjuran terapi gen untuk penyakit kardiovaskular kemungkinan besar
akan ditingkatkan dengan strategi yang menggabungkan beberapa target gen dengan
pendekatan berbasis sel.

PENYAKIT MENULAR

Seratus empat puluh dua uji klinis untuk mengobati penyakit menular telah diinisiasi,
terdiri dari 8% dari jumlah total uji klinis terapi gen. Transfer gen untuk memperoleh
sindrom imunodefisiensi (AIDS) yang didapat adalah aplikasi utama dalam kategori ini.
Banyak uji coba terapi gen untuk AIDS melibatkan transfer materi genetik secara ex
vivo ke sel T autologous menggunakan vektor virus yang secara inaktivasi atau
bereplikasi secara kondisional untuk meningkatkan sistem kekebalan pasien

PENYAKIT NEUROLOGIS

Kemajuan yang signifikan telah dibuat dalam terapi gen untuk penyakit neurologis
dalam 5 tahun terakhir. Dua penyakit neurologis yang paling umum yang ditargetkan
oleh terapi gen adalah penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson. Pada tahun 2005,
uji coba fase I pengiriman gen faktor pertumbuhan syaraf eks vivo (NGF) pada delapan
orang dengan penyakit Alzheimer ringan dilakukan di University of California di San
Diego. Secara singkat, fibroblas autologous yang diperoleh dari biopsi kulit kecil pada
setiap individu secara genetik dimodifikasi untuk menghasilkan dan mensekresi NGF
manusia menggunakan vektor retroviral dan ditanamkan kembali ke otak depan. Hasil
menunjukkan peningkatan dalam tingkat penurunan kognitif, peningkatan yang
signifikan dalam konsentrasi 18-fl uorodeoxyglucose kortikal (pencitraan PET), dan
respon pertumbuhan saraf yang kuat untuk NGF. Pada 2007, uji klinis terapi gen
pertama dilakukan di Rumah Sakit Presbyterian New York. Secara singkat, dosis serial
virus yang terkait dengan adeno (AAV) yang mengkode glutamic acid decarboxylase
(GAD) dimasukkan ke dalam nukleus subthalamic pasien dengan penyakit Parkinson.
Hasil menunjukkan bahwa terapi gen AAV-GAD aman dan ditoleransi dengan baik oleh
pasien dengan penyakit Parkinson lanjut. Meskipun label terbuka ini, studi fase I
nonrandom tidak termasuk kelompok palsu dan tidak dirancang untuk menilai
efektivitas terapi gen, data awal memberikan harapan, menunjukkan peningkatan
substansial dalam Skala Penilaian Penyakit Parkinson (UPDRS) Unified Parkinson,
dimulai pada 3 bulan setelah operasi dan berlanjut sampai akhir percobaan (12 bulan
setelah operasi).

SIMPULAN PENUTUP

Dalam 20 tahun terakhir, bidang terapi gen telah datang jauh dari bangku ke
samping tempat tidur. Banyak vektor dikembangkan untuk transfer gen sekarang telah
diuji diklinik. Tiga produk (Gendicine dan Oncorine diCina, Cerepro di Eropa) telah
diberi persetujuan pemasaran dan beberapa lainnya sedang dalam tahap akhir
pengujian. Meskipun biologi vektor transfer gen dapat dipahami dengan baik, beberapa
hambatan harus diatasi untuk mengubah gen menjadi terapi. Kekebalan tubuh
tanggapan dan mutagenesis insersi vektor virus dan kurangnya efisiensi transgen dari
nonviralvektor adalah hambatan terapi gen yang paling signifikan.
Target pengiriman sistem ekspresi gen dan kontrol spasial dan temporal ekspresi
transgen ditarget jaringan berdasarkan tingkat keparahan dan prosespenyakit ini juga
penting untuk keberhasilan banyak genaplikasi terapi. Meskipun uji klinis
telahmenunjukkan keamanan dan kemanjuran jangka pendek, pengawasan jangka
panjang selama beberapa dekade kurang, dankeamanan dan kemanjuran obat genetik
sejauh inihanya divalidasi dalam populasi pasien terbatas.Faktor-faktor lain seperti
penggunaan obat bersamaandan kondisi medis bersamaan, penilaian objektif
perbaikan dan titik akhir, dan penilaian efek plasebo perlu distandarisasi untuk
mendapatkanhasil yang andal dan dapat direproduksi di antara yang berbedakelompok
penelitian. Selain itu, analisis efektivitas biaya harus dianggap sebagai produksi
genvektor terapi itu sendiri mahal dan membutuhkan spesialisasiperalatan dan
personel. Di masa depan, lebih jauhpengembangan obat-obatan genetik yang bisa
luasdigunakan akan sangat bergantung pada kolaborasi antara lembaga akademik dan
mitra komersial dariindustri farmasi dan bioteknologi.