MICROSCOPIA

INTRODUCCIÓN.

Para poder estudiar en detalle los componentes de las células y tejidos, es necesaria
la utilización de un instrumento que permita obtener una imagen aumentada de estas muestras. El
instrumento utilizado por los primero biólogos para estudiar la célula y los tejidos, fue el
microscopio. Su nombre proviene del griego mikrós, que significa pequeño y skopéo, que significa
observar. Es decir, el microscopio es un instrumento que sirve para observar objetos o estructuras
pequeñas.

Su invención es atribuida a los hermanos Hans y Zacarías Janssen (1590), aunque no

se sabe con exactitud si otras personas contribuyeron a su invención. Desde esa época a la fecha,
se han realizado varios avances en el perfeccionamiento de las lentes y técnicas empleadas en
microscopía, permitiendo mejorar la calidad de la imagen recibida. Existe una gran variedad de
tipos de microscopios, que permiten realizar observaciones con distinta resolución, posibilitando el
estudio de diversos niveles de organización celular. Algunos de ellos son: fotónico, contraste de
fase, de interferencia, de fondo oscuro, de fluorescencia, electrónico de transmisión (MET),
electrónico de barrido (MEB), confocal, entre otros. Al margen de estos avances, las bases del
funcionamiento de los distintos tipos microscopios ópticos siguen siendo los mismos.

Existen dos tipos de microscopios que emplean la luz como fuente de energía para
formar imágenes aumentadas y detalladas de los objetos:

a) Microscopio fotónico simple o lupa: consiste en la utilización de una o más lentes

convergentes en un solo sistema óptico. Las lupas pueden ampliar las imágenes de los objetos
desde 5, 8, 10, 12, 20 y hasta 50 veces. Forman una imagen de mayor tamaño, derecha y
virtual.

b) Microscopios fotónico compuesto: se denominan compuestos porque la imagen se forma

mediante la utilización de tres sistemas de lentes, cada uno de ellos constituidos por lentes
convergentes y divergentes. Los sistemas de lentes son el condensador, los objetivos y los
oculares. Forman una imagen de mayor tamaño, invertida y virtual.

A pesar que existir una variedad de microscopios con mayores ventajas que el
microscopio óptico convencional, éste último siguen siendo de vital importancia en centros de
investigación y de enseñanza. Por lo cual, se debe conocer bien su estructura y los principios
básicos de cómo se forma la imagen a través de él.

Para poder formar imágenes aumentadas de un objeto, el microscopio fotónico

necesita de dos elementos: luz y lentes.

La luz blanca (visible) es una forma de energía, de naturaleza corpuscular y

ondulatoria, que comprende una mezcla de radiaciones electromagnéticas de longitud de onda (λ)
entre 380 a 780 nm, que estimula las células de la retina del ojo provocando sensaciones visuales.
Las lentes son cuerpos transparentes, formado por un material ópticamente homogéneo, limitado
por lo menos por una superficie esférica.
¿Cómo se forma la imagen en el Microscopio?

La imagen que entrega el microscopio, corresponde a la combinación formada por los

dos sistemas de lentes: objetivo y ocular. Cuando el objeto (preparación histológica), se sitúa fuera
de la distancia focal del lente objetivo, se forma una imagen real, aumentada e invertida en relación
al objeto. La imagen primaria se forma dentro de la distancia focal de la lente ocular y pasa a ser el
objeto de ella. Esta lente forma una imagen virtual, aumentada y derecha respecto a la imagen
primaria. Esta imagen virtual constituye el objeto del ojo y se forma la imagen final en la retina del
observador. Por lo tanto, la imagen que percibe el observador es virtual, invertida y de mayor
tamaño comparándola con el objeto.

Esquema de la formación de la imagen en el microscopio.

Eje óptico
CO CO

Objeto
Objetivo
Imagen Ocular
real

Imagen virtual

Propiedades o poderes de las lentes.

Los lentes poseen propiedades o poderes que contribuyen a obtener una imagen con mejor
calidad.

 Poder de aumento: Es la capacidad del microscopio para generar una imagen aumentada del
objeto y corresponde a la razón existente entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto.
Como el microscopio tiene dos sistemas de lentes, objetivos y oculares, capaces cada uno de
agrandar la imagen, el aumento total corresponde al producto del aumento de ambos
sistemas:

AUMENTO TOTAL = AUMENTO OBJETIVO X AUMENTO OCULAR

El cálculo se facilita ya que cada lente lleva impreso su aumento de la siguiente manera: 4x,
10x, 40x, 100x.
 Poder de definición: Es la capacidad del instrumento que permite visualizar una imagen
nítida y de contornos bien definidos. Este poder es mayor en las lentes de mayor aumento y
además se incrementa en la medida que se corrijan las aberraciones esféricas y cromáticas.

 Poder de penetración: Es la capacidad del microscopio que permite observar

simultáneamente varios planos de una muestra u objeto con una posición de enfoque. El
poder de penetración disminuye a medida que incrementa el poder de aumento de las lentes.

 Poder de resolución: Es la capacidad del microscopio para formar imágenes separadas y

definidas de 2 estructuras o puntos que están muy próximos entre sí.

Estructura del microscopio fotónico.

El microscopio fotónico compuesto está integrado por tres tipos de componentes:

1. Sistema mecánico: Corresponden a todos aquellos componentes que sirven de sostén,

movimiento y apoyo de los sistemas ópticos y de iluminación.

a) Pie o base: Soporte amplio y sólido, con forma variable dependiendo del modelo y en el cual
se apoyan el resto de las partes del microscopio.

b) Columna o brazo: Parte articulada del microscopio unida a la base. Soporta al tubo óptico, a
la platina y el revólver. Es utilizado también para permitir el traslado del microscopio.

c) Platina: Superficie plana de posición horizontal que posee una perforación circular central que
deja pasar los rayos luminosos. En ella se apoya la preparación (lamina portaobjetos que
contiene la muestra que se va a examinar) que se sujeta a la platina mediante pinzas y el
carro vernier, que permiten desplazar la preparación. En el lado derecho posee un tubo
metálico en el cual va acoplado un tornillo que permite mover la preparación hacia adelante y
atrás.

d) Carro vernier: Dispositivo ubicado sobre la platina, cuya función es sujetar y mover la
preparación es estudio. Debajo del tubo de la platina se encuentra un tornillo que permite
mover la preparación de derecha a izquierda.

e) Subplatina: Pieza en forma de anillo que se ubica debajo de la platina y que sustenta la lente
condensador, el diafragma y en algunos modelos el anillo porta-filtro y filtro. Posee un tornillo
en el lado izquierdo de microscopio, que permite mover todos los elementos que porta,
acercándolos o alejándolos de la platina.

f) Tubo o cañón: Es un cilindro hueco que lleva en su extremo inferior el revólver y en el

superior la o las lentes oculares.

g) Revólver: Componente que gira alrededor de un eje con la finalidad que los objetivos que
sostiene coincidan de manera perpendicular con la perforación central de la platina. De esta
manera los objetivos se van moviendo de manera secuencial, de menor a mayor. En la
superficie inferior posee varios agujeros donde se atornillan los objetivos.
h) Tornillos de precisión y desplazamiento: Elementos que permiten deslizar las lentes del
microscopio para asegurar la observación nítida de un objeto. Se ubican entre la unión del pie
y la columna. Pueden estar separados (en los microscopios antiguos) o el tornillo micrométrico
está incorporado en la circunferencia del tornillo macrométrico (microscopios actuales).

- Tornillo macrométrico: Produce movimientos evidentes y rápidos de la platina, permitiendo

variar rápidamente la distancia entre la lente objetivo y la platina.

- Tornillo micrométrico: Produce movimientos imperceptibles de la platina, modificando muy

lentamente la separación entre lente objetivo y la platina, facilitando la obtención de una
imagen perfecta y nítida.

- Tornillo de subplatina: Acerca o aleja verticalmente la subplatina a la platina.

2. Sistema de Iluminación: Encargado de entregar, seleccionar y regular la calidad, cantidad e

intensidad de la luz que llega a la muestra. Las partes que lo componen son:
a) Fuente de luz: Puede ser natural o artificial. Cuando es natural (solar) o procede de un foco
luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge la luz del medio y la refleja a través
del objeto y sistema de lentes. La luz artificial blanca la constituye generalmente una
ampolleta de vidrio ubicado en el microscopio y conectado a un circuito eléctrico de bajo
voltaje.

b) Filtro de luz: Vidrio coloreado que deja pasar la radiación de onda que se desea usar
absorbiendo las restantes. El más usado en el filtro azul celeste.

c) Diafragma iris: Se encuentra ubicado entre la fuente de luz y el condensador,

inmediatamente debajo de la platina. Su función es regular la cantidad de luz que llega a la
preparación ya que s diámetro es regulable, esto se realiza a través de una palanca
horizontal.

d) Condensador: Es un sistema de lentes localizado en la subplatina y que permite concentrar

los rayos luminosos en la muestra. El más usado es el condensador de Abbé y está
compuesto por una lente inferior convexa y una superior plana convexa.

3. Sistema óptico: Formado por dos conjuntos de lentes convergentes, proporciona una imagen
aumentada del tamaño del objeto.
a) Lente Ocular: En cantidad de una o dos se encuentra ubicadas en la parte superior del tubo,
próxima al ojo del observador. Están destinadas a recoger la imagen dada por el objetivo para
lo cual está formada por dos lentes plano convexo y un diafragma entre ellos. La lente inferior
de campo o colector recibe y refracta la imagen proporcionada por el objeto, formando a su
vez una imagen en el campo del diafragma. La lente superior u ocular recoge la imagen en el
campo del diafragma y forma la imagen definitiva del microscopio. Las más usadas tienen un
aumento de 6x, 8x, 10x, 12x, 15x.
 b) Lentes objetivos: Son de aumento variable: 4x, 10x, 25x, 40x y 100x, y se hallan localizadas
secuencialmente en un dispositivo giratorio, revólver, en la parte inferior del tubo. Son los
llamados objetivos parafocales, ya que al girarlos quedan, automáticamente, dentro de la
distancia útil y basta hacer un pequeño ajuste del micrométrico para lograr el enfoque preciso.
Los lentes objetivos están considerados los elementos más importantes en la formación de
imágenes, ya que establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez y la capacidad
que tienen de captar los detalles de la misma (poder de resolución)

Por la manera de utilizarse se distinguen los siguientes tipos de lentes objetivos:

- Objetivos a seco: Son aquellos en que entre el preparado y la lente objetivo se interpone
el aire.
- Objetivos a inmersión: Aquellos en que entre el objetivo y el preparado se ubica un líquido
trasparente que posee un índice de refracción superior al del aire (n = 1), y se aproxima al
del vidrio (n = 1.52). El más utilizado es el aceite de cedro (n= 1.515), y se usa con el
objetivo 100x.
Las lentes, frecuentemente, llevan impresas las especificaciones ópticas básicas como:
poder de aumento, apertura numérica, longitud (mm), total del tubo de microscopio y espesor
(mm), del cubreobjeto.

Manejo del microscopio.

Coloque el microscopio en una posición que le permita estar cómodo para trabajar en
su mesón. Para esto el microscopio NO DEBE ARRASTRARLO, ya que puede dañar alguna
estructura, sino que lo debe levantar y acercar a su puesto de trabajo.

Una vez enchufado y encendido el microscopio, se debe colocar la iluminación con

una intensidad lo suficientemente fuerte para iluminar el campo visual y por lo tanto la preparación,
pero sin que dañe o moleste la vista. Por otro lado, siempre debe comenzar a enfocar la
preparación con los pasos que se describen a continuación:

1. Gire el revólver hasta que el objetivo de menor aumento quede en posición de trabajo, o sea
que quede alineado con los oculares. Usted sentirá un golpecito (como un clic) cuando el
objetivo llegue a su posición de uso, de lo contrario no verá todo el campo visual iluminado.

2. Lleve la subplatina a su posición más alta. Esto lo puedo lograr manipulando el tornillo
macrométrico.

3. Lleve el condensador a su posición más alta. Para esto suba la subplatina al límite con el tornillo
de la subplatina que se encuentra al lado izquierdo del microscopio, por debajo de la platina.

4. Deje el diafragma abierto. Para esto mueva la palanca que se encuentra en la subplatina.

5. Una vez lograda una correcta iluminación coloque el preparado sobre la platina. La preparación
debe quedar bien fija con la pinza del carro vernier y usted debe guardar cuidado que el
cubreobjeto de la preparación se encuentre hacia arriba. Además debe dejar la muestra bajo el
haz de luz para comenzar a enfocar.
6. Mirando a través del ocular comience a bajar suavemente el tornillo macrométrico, si el objeto
está bien centrado aparecerá su imagen en el campo visual. Déle nitidez al enfoque accionando
el tornillo micrométrico. Mueva el carro en diferentes direcciones para seleccionar el mejor
campo posible. Puede controlar la intensidad de la luz, mediante el diafragma o el regulador de
la intensidad de la luz de la bombilla.

7. Una vez obtenido el enfoque correcto con menor aumento (4X), mueva el revólver y coloque en
posición de trabajo el siguiente lente objetivo (10X). Si su microscopio está bien calibrado debe
aparecer enfocada la imagen del objeto. Este enfoque se refina accionando el tornillo
micrométrico.

8. Una vez logrado el enfoque con el objetivo 10X, recién puede pasar a enfocar con el siguiente
objetivo seco (40X). Gire el revólver dejando sobre la muestra este objetivo y mejore la nitidez
con el tornillo micrométrico.

9. Si usted ha finalizado su observación con aumento total 400X (lente objetivo 40X), para
retirar la muestra debe retroceder al lente objetivo 10X y finalmente al lente objetivo 4X.
Sólo con el objetivo 4X, usted puede retirar la preparación de microscopio.

10. Si usted va a enfocar con el aumento máximo del microscopio 1000X (lente objetivo 100X), una
vez que haya enfocado nítidamente con aumento total 400X, gire el revólver de tal manera que
la preparación quede entre los lentes objetivos 40X y 100X, y agregue sobre la muestra aceito
de inmersión. Una vez que agregó este aceite, recién puede girar el revólver al objetivo 100X.
Para retirar la preparación, NO DEBE RETROCER AL OBJETIVO 40X, sino que debe girar el
revólver directamente al lente objetivo 4X.

Recomendaciones para el buen uso y cuidado del microscopio:

1. El microscopio es un instrumento costoso y de precisión, con muchas partes delicadas, por lo

tanto, debemos darle el mejor cuido posible. Si su Microscopio presenta algún defecto, consulte
con su profesor. No trate de arreglarlo Usted.

2. Las lentes del microscopio, sobre todo los objetivos, son una de las partes más costosas del
microscopio. Por lo cual, es de vital importancia seguir las instrucciones del profesor, manejar
correctamente el microscopio y cooperar con su limpieza y mantención, ya que son varios los
cursos que se benefician con su utilización.

3. Mantenga las lentes limpias. No toque las lentes con los dedos, ya que el sudor las daña.
Limpie las lentes del microscopio según las indicaciones que le entregue el profesor cuando sea
necesario.

4. No permita que líquidos, especialmente ácidos o alcoholes, se pongan en contacto con su

microscopio. Use siempre cubre-objetos cuando observe en agua u otros líquidos.

5. Localice siempre el objeto con el objetivo de menor aumento.

6. Los sedimentos de grasa, el aceite de inmersión y los residuos de estos productos deben
eliminarse inmediatamente con un poco de disolvente como éter, xilol o alcohol 70%. Nunca se
debe emplear alcohol absoluto, ya que disuelve el cemento utilizado en la fabricación de los
lentes. La limpieza final es más efectiva usando un poco de agua destilada.
7. Cuando no se esté usando el microscopio, debe mantenerse siempre cubierto con una funda.

8. Al finalizar sus actividades de laboratorio, tenga en cuenta lo siguiente:

 Antes de apagar la fuente de luz, llevar el dispositivo que regula la intensidad luminosa hasta
O (cero).
 Dejar el microscopio con el objetivo de menor aumento en la posición de enfoque y la platina
en su máxima posición superior.
 Desenchufar el microscopio y colocarle la funda protectora.

OBJETIVOS
1. Identificar las diferentes partes del microscopio y reconocer las funciones de cada una de
ellas.
2. Conocer algunas propiedades y poderes de las lentes.
3. Aplicar los conocimientos de estructura y cuidados del microscopio para su correcto manejo y
utilización.
4. Evaluar el correcto empleo del microscopio.

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es concepto actual de la naturaleza de la luz?
2. ¿Qué es una lente?
3. Defina los poderes del microscopio, en base a las propiedades de las lentes
4. .¿Qué es el microscopio óptico?
5. Enumere que sistemas componen el microscopio e identifique sus partes en el esquema
adjunto
6. Describa brevemente cada una de las partes que constituyen cada sistema.
7. Compare los objetivos a seco y los a inmersión.
8. Describa la forma de proceder para enfocar una preparación con el objetivo 100x.
Esquema del microscopio fotónico
ACTIVIDADES

1. Imagen del microscopio y análisis de los poderes de las lentes:

a) Coloque una preparación con un centímetro cuadrado de papel milimetrado, en el cual está
escrito el Nº 6. Enfoque como corresponde con objetivo menor, con 10x y 40x. Esquematice
según las indicaciones del profesor. ¿Qué tipo de imagen se forma? ¿Qué imagen observa?
¿Qué poderes de las lentes puede analizar con esta muestra?

Nombre preparación:

Propósito:

Tinción:

Aumento total:

Descripción:

b) Calcule el diámetro real del campo, observando y contando el Nº de líneas que caben en el
campo convirtiendo luego su valor en mm, y luego en micrones (m).

AUMENTO OBJETIVO DIAMETRO CAMPO DIAMETRO CAMPO

MILIMETROS (mm) MICRONES (m)
c) Con el objetivo de menor aumento enfoque una zona del preparado en que se observe el
entrecruzamiento de hilos verdes y blancos. Con este aumento comprobará que ambos hilos
se ven nítidos.
Cambie a objetivo de 10x ubicando siempre la zona de entrecruzamiento de ambos hilos.
Enfoque la preparación. Observe diferencias con respecto a la imagen anterior.
Cambie a objetivo de 40x. Enfoque. ¿Aparecen ambos hilos enfocados simultáneamente?
¿Por qué?
¿Cuál de los objetivos tiene mayor profundidad de foco?

Nombre preparación:

Propósito:

Tinción:

Aumento total:

Descripción: