ESPECTROFOTOMETRIA

INTRODUÇÃO

O espectrofotômetro é um instrumento frequentemente usado no laboratório de

bioquímica. O espectrofotômetro pode ser um instrumento separado usado para técnicas
químicas manuais ou pode estar incorporado a um analisador automático bioquímico.
Muitos métodos da bioquímica usam os princípios da espectrofotometria.

PRINCÍPIOS DE ESPECTROFOTOMETRIA

Espectrofotômetros são usados para determinar a concentração de soluções

coloridas. Essa determinação é feita por passar um fino feixe de luz através de uma
solução. A maioria dos espectrofotômetros usados em laboratório medem a luz desde a
faixa ultravioleta (UV) através da faixa do visível (aproximadamente 250 a 700 nm). A
porção de luz que passa através da solução colorida é transmitância percentual (T%). A
luz que não passa é absorvida pela solução e é medida como unidade de absorbância
(A). Soluções concentradas deixam passar menos luz que soluções diluídas.assim,
podemos dizer que quanto mais concentrada a solução maior é sua absorbância e menor
a transmitância. Tanto a transmitância quanto a absorbância podem ser lidas de muitos
espectrofotômetros.
Para a maioria das soluções coloridas a absorbância cresce com a concentração.
Essas soluções são ditas que seguem a lei Beer, uma relação matemática que mostra que
absorbância de uma solução colorida é diretamente proporcional à sua concentração.
Esta relação é linear. Para a maioria das soluções coloridas, transmitância decresce
como a concentração cresce; esta relação é geométrica.

PARTES DE ESPECTROFOTÔMETRO

O espectrofotômetro varia no desenho externo, mas tem essencialmente as

mesmas partes. Cada uma dessas partes tem uma função na medição da concentração
das soluções.
Uma fonte de luz do espectrofotômetro fornece um feixe de luz que passa por
um monocromador. O monocromador tem uma grade de difração que dispersa a luz em
um espectro. Ele também possui uma fenda que isola um feixe estreito de luz
monocromática, luz de um só comprimento de onda. O comprimento de onda desejado é
selecionado pelo operador usando um controle do instrumento. A luz monocromática é
direcionada para passar através da cubeta de amostra que contém o líquido colorido. A
cubeta é um tubo especialmente fabricado segundo especificações técnicas rígidas.
Uma porção da luz monocromática será absorvida pelas moléculas da solução e uma
porção de luz vai passar através da solução.
A luz que passa através da solução é detectada pela célula fotoelétrica, que a
converte em corrente elétrica. Essa corrente é medida e registrada por um
galvanômetro., ou convertida em uma leitura digital. Esta informação pode ser
apresentada em unidades de absorbância (A) ou em transmitância percentual (T%) no
painel de leitura do espectrofotômetro.
RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO E ABSORBÂNCIA

Uma curva padrão pode ser construída e usada para determinar as concentrações
de soluções diluídas que sigam a lei Beer. Diluições de um padrão conhecido reagem
com um reagente que forma uma cor diretamente proporcional a conecentração da
substância padrão. A absorbância, ou transmitância percentual, destas soluções são lidas
em um espectrofotômetro.
O resultado (A ou T%) é colocado em um gráfico contra as concentrações dos
padrões diluídos, e uma linha é desenhada através dos pontos. A absorbância é colocada
em papel de gráfico linear. Se for medida em transmitância , é necessário usar papel
semilog para obter-se uma linha reta. Este gráfico, a curva padrão, pode ser usado para
encontrar as concentrações de desconhecidos da mesma substância.

PREPARANDO UMA CURVA PADRÃO DE HEMOGLOBINA

Uma curva padrão pode ser preparada facialmente usando hemoglobina como
padrão. A hemoglobina quando misturada com o reagente de Drabkin, é convertida
cianometemoglobina, um pigmento que absorve a luz a 540nm.
Um curva padrão de hemoglobina pode ser feita usando diluições de um padrão
de hemoglobina. Esse padrões estão disponíveis em diversas concentrações e as
instruções dos fabricantes devem ser seguidas no processo das diluições padrões das
concentrações. O padrão de hemoglobina também pode ser comprado na forma de pó
para ser reconstituído com o reagente de Drabkin ou com uma solução pronta para uso.
O reagente de Drabkin contém cianeto e deve ser manuseado com cuidado.
Preparando os padrões de hemoglobina. As diluições dos padrões de
hemoglobina são feitas com o reagente de Drabkin, o regente usada na dosagem de
hemoglobina. para uma preparação de 20 g/dL, quatro tubos consistindo em 5, 10, 15 e
20 g/dL , são preparados, conforme o guia de desempenhos no final da lição.
Determinando as absorbâncias dos padrões. O comprimento de onda dos
espectrofotômetro é colocado em 540 nm. A absorbância zero é lida usando a solução
de Drabkin com branco reagente. O branco reagente é uma solução que contem o
reagente do teste mas sem a substância a ser medida. Os padrões diluídos são
transferidos para as cubetas e a absorbância de cada uma é medida e registrada.
Colocando os dados em um gráfico. Usando papel milimetrado comum, as
absorbâncias são colocadas no eixo Y e as concentrações no eixo X como mostrado na
figura 3-11. uma linha é traçada através dos quatros pontos no gráfico. Se as diluições
forem feiras corretamente e as absorbâncias corretamente lidas, a linha traçada unindo
os quatros pontos deverá ser uma reta e deve passar pela origem (0,0). Se todos os
pontos não caem em uma linha única, uma régua pode ser usada para desenhar uma
linha de “consenso”, que uma a maioria dos pontos. A curva padrão está pronta para ser
usada na determinação da concentração de hemoglobina em amostras de sangue.
Determinando a concentração de um desconhecido usando a curva padrão.
A absorbância de um desconhecido é lido e o valor é marcado na absorbância da curva.a
concentração é lida diretamente no gráfico. Este método é válido somente quando a
substância segue a lei Beer ( se for lida a transmitância percentual dos padrões, deverá
ser usado papel semilog para traçar a curva padrão e obter-se uma reta).

CUIDADOS DO ESPECTROFOTOMETRO E DAS CUBETAS

O espectrofotômetro deve ser conservado coberto quando não em uso, para

protegê-lo do pó ou derramamentos. Cuidados devem ser tomados para evitar sacudidas
no instrumento. Os mesmos cuidados que são seguidos quando se usa qualquer
instrumento elétrico devem ser observados.
As cubetas devem ser mantidas de arranhaduras. Elas devem ser ladavadas
cuidadosamente evitando o uso de abrasivos, enxaguadas em água destilada e secas no
ar ambiente. As cubetas devem ser armazenadas invertidas para evitar poeira. Elas
devem ser seguras apenas na borda superior e no lado externo das cubetas devem ser
limpas as impressões digitais antes do uso.