Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias de la Vida.

Escuela de
Medicina Veterinaria. Patobiología Molecular Experimental 2019.

Profesores: Francisca Álvarez y María Jesús Serrano.

EXTRACCIÓN DE ADN
OBJETIVO GENERAL
Conocer los fundamentos y la metodología utilizada para la
extracción de ADN utilizando un kit comercial.
INTRODUCCIÓN
La extracción del ADN frecuentemente es un paso previo a
procedimientos de diagnóstico utilizados para detectar bacterias y
virus en el ambiente, o también para diagnosticar enfermedades y
desórdenes genéticos, test de paternidad, policía forense, etc. Dentro
de estos procedimientos se encuentran (aunque no son las únicas) el
PCR y secuenciación del genoma completo.
La purificación del ADN se basa en las características fisico-químicas
de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de
nucleótidos que se encuentran unidas entre sí que forman una doble
hélice. Los nucleótidos por su parte, están formados por un azúcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina,
guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre
el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando
lugar al esqueleto de la molécula y las bases de cadenas opuestas se
unen mediante puentes de hidrógeno que mantienen estable la
estructura helicoidal (Figura 1).
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Fig. 1: Estructura del ADN: Se encuentra formada por una doble hélice unidas por puentes de
hidrógeno entres las bases nitrogenadas y por un enlace fosfodiéster que une cada nucleótido. Los
grupos fosfatos son la parte hidrofílica del ADN y poseen carga negativa.

Los grupos fosfatos presentes se encuentran cargados negativamente

y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo
hace altamente polar, características que son aprovechadas para su
extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse,
debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en
soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la
molécula, pero que en presencia de etanol, la capa hidratante se rompe
y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se
favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas
repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN
precipite. Además, la carga neta negativa del ADN le permite unirse
a moléculas y matrices inorgánicas que están cargadas positivamente.
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Existen diferentes metodologías para la obtención de ADN que

difieren en la cantidad y calidad (ej. Extracción fenol-cloroformo,
perlas magnéticas) En la actividad de hoy, nos centraremos en kits
comerciales de extracción que utilizan matrices inorgánicas
compactas cargadas positivamente como las membranas de sílice, las
cuales son capaces de retener varios microgramos de ADN y
separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo la obtención de
un extracto libre de inhibidores. Durante la extracción, el ADN
cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de
manera reversible que se mantiene unido a ésta durante la remoción
de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, y posteriormente la
molécula se libera de la matriz. Los kits comerciales disminuyen la
extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos
del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de cada
proveedor, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la
recuperación del ADN como la eliminación de contaminantes son
muy eficientes.
La recolección de la muestra y su manejo adecuados son
indispensables para la extracción de ADN integro y sin
contaminantes, los cuales afectan la acción de las enzimas durante la
reacción de PCR (inhibidores del PCR). Cada tejido tiene sus
consideraciones propias y siempre será necesario conocerlas para
llevar a cabo una correcta recolección y extracción.
ETAPAS DE LA EXTRACCION DE ADN
La extracción de ADN independiente de la muestra que se utilice
(animal, vegetal, etc) se puede dividir en 5 etapas (Fig 2) :
1. Homogenización de la muestra : Generalmente se realiza
mediante agentes químicos, donde la muestra se mantiene en solución
a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes
caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso
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pueden perforar la membrana celular. La disgregación química es

recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o
sangre. En tejidos más complejos, se requiere agregar un paso previo
de disrupción mecánica para optimizar el proceso.
2. Lisis celular : Durante el proceso de lisis las interacciones entre las
moléculas que conforman la pared y la membrana celular se
modifican permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Para esto,
se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que
permiten disolver la membrana celular, como también inhibidores
para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones
de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con los
iones de Mg+ 2 e impide el funcionamiento de las DNAsas. Los
componentes celulares no solubles como las proteínas que
permanecen en solución, se separan del ADN por centrifugación.
3. Unión del ADN a la membrana de sílice: En algunos casos a la
mezcla de lisis se le añade la solución de unión a la membrana de
sílice que tiene un pH específico. Antes de pasar la solución de lisis a
través de la columna, se adiciona etanol a la solución para eliminar la
capa hidratante del ADN y exponer sus grupos fosfato, facilitando con
ello la adsorción de la molécula a la membrana cargada
positivamente.
4. Lavados: Los lípidos y proteínas no son afines a la membrana y se
eliminan con ayuda de las soluciones de lavado y ciclos de
centrifugación, mientras que el material genético permanece unido a
la matriz.
5. Recuperación del ADN de la matriz: Al pasar las soluciones de
lavado y los ciclos de centrifugación, la membrana y el ADN se
deshidratan, por lo que se recomienda centrifugar nuevamente la
columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las
soluciones. Posteriormente, es necesario liberar al ADN de la matriz
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lo que logra adicionando agua o solución amortiguadora al centro de

la membrana, se espera unos minutos hasta que el ADN se hidrate y
se centrifuga para recuperarlo de la matriz (elución). Este ADN puede
ser almacenado a 4°C si se utilizará en un tiempo breve o a -20°C para
tiempos más prolongados.
Es necesario saber que la mayoría de los kits tienden a ser generales
a la hora de su aplicación, pero se diseñan con un propósito específico.
Por ejemplo, un kit para extraer ADN de sangre total, considera la
presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el proceso. Este
método será más agresivo en comparación con un kit diseñado para
extraer ADN de células o tejidos animales.

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La obtención de ADN integro y puro es una parte fundamental para

el buen desempeño de las técnicas utilizadas en biología molecular.
En los últimos años ha aumentado el uso de los de métodos de
extracción comerciales debido a que la matriz permite capturar
selectivamente al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta
pureza con moléculas íntegras; al tiempo que se reduce el número de
pasos en la extracción y se disminuye la posibilidad de contaminación
con ADN o ARN exógeno Extractos con estas características
aumentan la sensibilidad y reproducibilidad de las técnicas
moleculares, con lo que se garantiza la obtención de resultados
confiables. Aunque se sacrifique el rendimiento en algunas ocasiones,
las técnicas actuales de biología molecular no requieren de grandes
cantidades de material genético. Independientemente del método de
extracción que se utilice, lo importante es realizar cada paso con
precaución para obtener ADN integro y puro que permita llevar a cabo
las técnicas posteriores.
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Fig 2. Esquema de trabajo con el kit de extracción ADN

ACTIVIDAD PRACTICA
De todas las muestras biológicas que podemos someter a un proceso
de extracción de ADN, las suspensiones bacterianas, son quizás las
que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza del
material. En particular, para realizar extracción de ADN utilizando
bacterias Gram positivo se debe considerar la utilización de lisozima
para hidrolizar el peptidoglicano de la pared celular de bacterias,
siendo las bacterias Gram positivas más susceptibles que las bacterias
Gram.
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Extracción de ADN genómico desde suspensiones bacterianas con

kit comercial.
Previo al procesamiento de la muestra se deben preparar todos los
materiales que serán utilizados, así como también se debe tener claro
el protocolo a seguir.
Para el uso del kit comercial de este trabajo práctico se debe preparar
la solución de lavado de columna (CWA). Agregar etanol 95% hasta
la marca indicada en el frasco CWA, marcar que el etanol fue
agregado y mantener a temperatura ambiente. (Preparado por los
profesores).
1. Agregue 1.0 ml del cultivo bacteriano en un tubo eppendorf de 1.5
mL y centrifugue por 5 min a 13000 x g (rcf). Elimine con una
micropipeta todo el sobrenadante cuidando de no resuspender el
pellet, agregue 1.0 mL de PBS 1X, resuspenda el pellet y centrifugue
por 5 min a 13000 x g (rcf). Elimine con una micropipeta todo el
sobrenadante cuidando de no resuspender el pellet. Fig 3

Fig.3 Eliminación del sobrenadante del cultivo bacteriano para la obtención del pellet.
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2. Agregue un volúmen de 150 μl de Buffer de Lisis al pellet y mezcle

pipetando varias veces hasta disolver completamente.
3. Para cada muestra que se desea purificar se debe ensamblar una
columna (montar columna en tubo de recolección), rotular el tubo de
colección.
4. Traspasar la muestra lisada desde el tubo eppendorf a la columna
ensamblada.
5. Centrifugar la muestra en la columna ensamblada 3 minutos a
13000 x g (rcf), si quedan remanentes de la muestra en la columna
repetir centrifugación por 1 minuto.
6. Remueva la columna del tubo de recolección, descartar el líquido
del tubo y vuelva a ensamblar la columna.
7. Agregue 650 μl de solución de lavado de columna (CWA) a la
columna ensamblada.
8. Centrifugue la muestra a 13000 x g (rcf) durante 1 minuto.
9. Desensamble la columna y elimine el líquido del tubo de
recolección.
10. Repita los pasos 7, 8 y 9 tres veces para un total de cuatro lavados
con CWA.
11. Después del último lavado y vaciado del tubo de recolección,
vuelva a ensamblar la columna y centrifugue 2 minutos a 13000 x g
(rcf) para secar la membrana de la columna.
12. Desensamble la columna y transfiérala a un tubo eppendorf de 1,5
mL, rotúle el tubo (DNAg, fecha, nombre grupo).
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13. En un nuevo tubo eppendorf de 1,5 mL mézcle 2 µL de RNAsa

con 250 µL de Agua libre de nucleasas y caliente hasta los 65°C
utilizando la placa calefactora (thermoblock).
14. Agregue 250 µL de la mezcla de RNAsa con agua libre de
nucleasas a 65°C sobre la columna e incube durante 2 minutos a
temperatura ambiente.
15. Transcurridos los 2 minutos de incubación centrifugue la muestra
durante 1 minuto a 13000 xg (rcf).
16. Remueva la columna del tubo eppendorf y almacene a -20 °C
hasta su uso.

GLOSARIO
Agentes caotrópicos: molécula capaz de romper enlaces
no-covalentes ej. Guanidina
EDTA: ácido EtilenDiamino TetraAcético es una sustancia utilizada
como quelante de metales pesados en una solución.
REFERENCIAS
1. Wizard® SV Genomic DNA Purification System Technical
Bulletin #TB302

2. Sambrook Molecular Cloning: a Laboratory Manual