UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

FACULTAD DE MEDICINA ALBERTO HURTADO

ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA
PRACTICAS No 02
INSTRUMENTOS Y EQUIPOS EN LABORATORIO II

ESPECTROFOTOMETRIA: Preparación de curvas de calibracion

CONCEPTOS

Espectro de luz

Espectro Optico:

Región Intervalo de longitud de onda

UV 180 – 390/400 nm
Visible 390 /400– 780 nm
IR cercano 0.78 – 2.5 um
IR medio 2.5 – 50 um

Todo analito molecular es capaz de absorber ciertas longitudes de

onda característica de la radiación electromagmanética.

LEYES FUNDAMENTALES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA

Ley de Lambert .- “ Cuando un rayo de luz monocromática atraviesa un

medio absorbente, su intensidad (I) decrece en forma exponencial al
espesor del medio (b)”.
Ley de Beer .- “ La intensidad de un rayo de luz monocromática (I)
disminuye exponencialmente conforme aumenta la concentración ( c ) del
material absorbente”.

Ambas leyes pueden fusionarse en una sola ley conocida como la Ley de
Lambert y Beer
 Log I° / I = A = a bc

Log Io/I = (A) = Absorbancia o Densidad Óptica (O.D.).

I° = rayo incidente
I = rayo trasmitido
a = constante: índice de absorbancia o "coeficiente de
extinción" para el compuesto particular
b = Longitud de la cubeta
c = Concentración

A = amcl

Transmitancia

Log %T = 2 - Absorbancia

Problemas con la curva estandar

#1 Ejemplo #1 – debe hacerse una nueva
curva o usar regresion lineal

Errors in preparing the 0.25 and

0.50 ppm standards perhaps ?
#2

Ejemplo #2 – es lineal hasta 0-1000

y la 2nd linea de 1200-2000
ugN/L no lo es
Usar ecuaciones non-lineales es lineal hasta ABS ~
cuadraticaspara 0-2000 ugN/L 1.0 (~ 1000 ugN/L)
Diluir la muestra
MATERIALES Y METODOS
Materiales:
Espectrofotómetro
Solucion stock
Agua Destilada
Tubos de Ensayo
Cubetas de Espectrofotómetro
Micropipetas
Papel Toalla

A. Preparación de una cruva de Calibración y calculo de la

ecuación de la recta, pendiente y del factor

Procedimiento:

1. Se entregará una solucion stock ( azul)

2. Realizar 5 diluciones sucesivas a partir de la solucion stock. Al final
tendremos 6 tubos ( 1 tubo concentrado y 5 tubos diluidos)

3. Si consideramos que el tubo stock es una solucion concentrado como

1, mencionar que diluciones serian los tubos siguientes diluidos.
4. Con los datos de la practica anterior, utilizar la longitud de onda ideal
para realizare la lecturas de abs
5. Graficar en un papel milimetrado ( abs vs diluciones- de menor dilucion
a mayor dilucion)
6. Si la solución concentrada estuviera a una concentracion de 2000
mg/dL de cromogeno, calcular las concentraciones de cada tubo diluido
7. Con los datos de la practica anterior, utilizar la longitud de onda ideal
para realizare la lecturas de abs y Graficar en un papel milimetrado ( abs
vs concentracion mg/dL-de menor concentración a a mayor
concentracion)
8. De esta ultima curva calcular la ecuación de la recta, pendiente y el
factor, sabiendo que el factor es igual a la inversa de la pendiente
Y la ecuación de la recta :

y= mx + b

donde :
y es igual a absorbancia
m es iguala a la pendiente
x es iguala a la concertación
b es el intercepto de la recta con el eje de las X, para una curva donde el
tubo de concentración O, tiene una abssorbacia de 0 entonce b es iguala
a cero

Absorbancia y Color (cromogeno)

Concentration

Cuestionario:

1. Mencione otras manera del calculo de la pendiente

2. Que significa realizar el analisis de regresion lineal, para ajustar
nuestra curva de calibración
3. Definir el rango lineal de la curva de calibración
4. Calcular la concentración de solñuciones que presentan el mismo
cromogeno y que tienen los siguientes datos de absorbancia
a. 0.250 c.1.578 e. 0.589
b. 0.123 d. 0.856