Patologia Ednacristianedamatta

UNIVERSIDADE PAULISTA
Edna Cristiane da Matta
DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA

PERITONITE INFECCIOSA FELINA EM GATOS.
SÃO PAULO
2018
DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em
Patologia Experimental e Ambiental da
Universidade Paulista para obtenção do
título de Mestre
Orientador: Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell´Armelina Rocha
São Paulo
2018
Matta, Edna Cristiane da.
Diagnóstico da peritonite infecciosa felina em gatos na cidade de
São Paulo, SP, Brasil / Edna Cristiane da Matta. - 2018.
60 f. : il. color. + CD ROM.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista, São Paulo, 2018.
Área de Concentração: Patologia Veterinária.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell’Armelina Rocha.
1. PIF. 2. Imuno-histoquímica. 3. Gatos. 4. Imunomediada. I. Rocha,

Paulo Ricardo Dell’Armelina (orientador). II. Título.
Ficha elaborada pela Bibliotecária Maria Aládia S. F. de Braga CRB8-2264

DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICOS DA

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em
Patologia Experimental e Ambiental da
Universidade Paulista para obtenção do
título de Mestre
Aprovado em: 18/12/2018
BANCA EXAMINADORA
_______________________________/_/__
Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell’Armelina Rocha
Universidade Paulista - UNIP
_______________________________/_/__
Profa. Dra. Leoni Villano Bonamin
Universidade Paulista - UNIP
_______________________________/_/__
Profa Dra. Gisele Fabrino Machado
UNESP - Araçatuba
Dedicatória
Ao meu Orientador;
A minha família, em especial, à Caroline por me entusiasmar sempre, desde

pequena.
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus por ser a base das minhas conquistas;
Aos Professores: Eduardo Fernades Bondan, Maria Anete Lallo, Leoni Villano
Bonamin e Gisele Fabrino Machado, e a discente de Graduação Gabriela Alkmin,
pelas colaborações e amizades.
Ode ao gato
(…)”Não há unidade como ele,
Não tem
a lua nem a flor
tal contextura:
é uma coisa
só como o sol ou o topázio,
e a elástica linha em seu contorno
firme e sutil é como
a linha da proa de uma nave.
Os seus olhos amareloa
deixaram uma só
ranhura
para jogar as moedas da noite.
(...) Eu não subscrevo.
Eu não conheço o gato.
Tudo sei, a vida e o seu arquipélago,
o mar e a cidade incalculável,
a botânica
o gineceu com os seus extravios,
o pôr e o menos da matemática,
os funis vulcânicos do mundo,
a casca irreal do crocodilo,
a bondade ignorada do bombeiro,
o atavismo azul do sacerdote,
mas não posso decifrar um gato.”
Pablo Neruda
Tradução: Elaine Zagury
LISTA DE ABREVIATURAS
AGP: Glicoproteína ácida α1

CMI: Imunidade mediada por células
CoVs: Coronavirus
CRFK: Rim felino de Grandell-Reese
CTLs : Linfócitos T citotóxicos
DCs : Células dendríticas
FCoV : Coronavirus felino
FeLV: Vírus da leucemia felina
FIPV: Vírus da peritonite infecciosa felina
FIV: Vírus da imunodeficiencia felina
FSCV: Doença associada ao coronavirus sistemico do Ferret
IFNs: Interferons
IHQ: imuno-histoquímica
IL-6: Interleucina 6
ISGs: Genes estimulados por Interferon
MAPK: kinases de proteínas ativadas por mitógeno
PIF: Peritonite infecciosa felina
Proteína S: Proteína de espícula
PRRs: Receptores de reconhecimento de padrões
RT-qPCR: Reação de cadeia em polimerase pela transcriptase reversa quantitativa
RNA: Ácido ribonucleico
RT-nPCR: nested PCR transcriptase reversa
SARS: Síndrome respiratória aguda severa
SARS-CoV: Coronavirus da SARS
SARSr-Rh-Bat-CoV
SNC: Sistema nervoso central
T CD8+: Linfócitos T CD8+
TCD4+ : Linfócitos T CD4+
TGF-β: Fator de crescimento tumoral beta
TLRs : Receptores “toll-like”
TNF: Fator de necrose tumoral
VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ilustração da estrutura do Coronavirus felino (FCoV)
Figura 2 – Macroscopia do fígado de gato (animal nº. 8)
Figura 3 – Macroscopia dos linfonodos de gato (animal nº. 1)
Figura 4 – Macroscopia dos rins de gato (animal nº. 4)
Figura 5 – Macroscopia do baço de gato (animal nº. 2)
Figura 6 – Macroscopia dos intestinos de gato (animal nº. 3)
Figura 7 – Macroscopia do pâncreas de gato (animal nº. 2)
Figura 8 – Macroscopia do encéfalo de gato (nº. 9)
Figura 9 – Macroscopia dos olhos de gato (nº. 9)
Figura 10 – Microscopia e IHC para FIPV do rim de gato
Figura 11 – Microscopia e IHC para FIPV do intestino de gato
Figura 12 – Microscopia e IHC para FIPV do linfonodo de gato
Figura 13 – Microscopia e IHC para FIPV dos pulmões de gato
Figura 14 – Microscopia e IHC para FIPV do fígado de gato.
Figura 15 – Microscopia e IHC para FIPV da medula espinhal de gato.
Figura 16 – Microscopia e IHC para FIPV do pâncreas de gato.

Sumário
1. Capítulo 1..................................................................................................................................... 10
1.1. Considerações Gerais ........................................................................................................... 10
1.1.1. Vírus de RNA de fita simples ............................................................................................ 10
1.1.2. Coronavirus ......................................................................................................................... 11
1.1.3. As Coronaviroses ............................................................................................................... 12
1.1.4. A peritonite infecciosa felina (PIF) ................................................................................... 12
1.1.5. PIF x Resposta imune........................................................................................................ 21
1.1.6. PIF x Imunidade humoral .................................................................................................. 22
1.2. Referências ............................................................................................................................. 22
2. Capítulo 2..................................................................................................................................... 30
2.1. Diagnóstico e caracterização anatomopatológica da peritonite infecciosa felina em
gatos. ................................................................................................................................................... 30
2.1.1. Resumo ................................................................................................................................ 30
2.1.2. Abstract ................................................................................................................................ 31
2.1.3. Introdução ............................................................................................................................ 31
2.1.4. Métodos ............................................................................................................................... 32
2.1.4.1. Animais e amostras de material biológico .................................................................. 32
2.1.4.2. Necrópsia ......................................................................................................................... 32
2.1.4.3. Microscopia...................................................................................................................... 33
2.1.5. Resultados ........................................................................................................................... 35
2.1.6. Discussão ............................................................................................................................ 50
2.1.7. Conclusões .......................................................................................................................... 55
2.2. Referências ............................................................................................................................. 55
9
1 Capítulo 1
1.1 Considerações Gerais
A população de felinos vem crescendo vertiginosamente no Brasil (1) e desde

a década de 80 ultrapassou a população de cães nos EUA (2).
Assim como aconteceu na Europa, espera-se que no Brasil o gato (Felis

catus) deva se tornar o animal de estimação preferido. Isto por vários motivos, como
custo menor, comportamento independente e rápida adequação a ambientes
menores (2,3).
Após a segunda grande guerra mundial, as áreas urbana e suburbana

expandiram, assim como o número de gatos ferais e semi-ferais. À época, houve um
constante crescimento na população felina como “pets”, e gatis se popularizaram.
Nos anos seguintes, estabeleceu-se um grande número de organizações de abrigos
e resgate de gatos adultos e filhotes (4). Este quadro favoreceu a disseminação de
diversas doenças infecciosas entre gatos, como a peritonite infecciosa felina (PIF). A
PIF é uma doença progressiva, severa e fatal em gatos; sem tratamentos efetivos
(5,6). A PIF é uma importante doença infecciosa de gatos, cuja patogenia ainda não
foi totalmente esclarecida (7).
Além disso, o estudo da patogenia da peritonite infecciosa felina também

pode ser interessante como um modelo biológico, para estudos de doenças
inflamatórias e infecciosas em humanos, visto que os gatos possuem porte médio
(em comparação a outros animais) (2).
1.1.1 Vírus de RNA de fita simples
Utilizando-se a biologia molecular e a metagenômica, descobriu-se que há

uma diversidade de famílias (e grande diversidade genética) de vírus de RNA de fita
simples. Estes vírus são encontrados em diversos hospedeiros, como os morcegos e
aves (8, 9, 10, 11).
10
1.1.2 Coronavirus
A PIF é causada pelo Coronavírus felino. Os Coronavírus pertencem à família

Coronaviridae (5, 7, 12), à ordem Nidovirales, se recombinam entre si e formam
novos vírus (Figura 1). São vírus envelopados, de senso-positivo e genomas de
RNA de fita simples. Os vírus de fita simples são potencialmente mais virulentos
devido as maiores chances de mutações (8, 9, 10, 11, 13). Os Coronavírus são
bastante similares na organização genômica e estratégia de replicação, mas,
diferem consideravelmente na complexidade genética e arquitetura do virion. As
subfamílias Coronavirinae consistem de três gêneros (Alphacoronavirus,
Betacoronavirus e Gammacoronavirus) (13). Em 2008, um Coronavirus altamente
divergente foi descoberto em belugas e agrupado como Deltacoronavirus. Além dos
mamíferos, os Coronavírus também infectam aves domésticas e selvagens (13).
Figura 1 – Ilustração da estrutura do Coronavírus felino (FCoV).
Proteínas Espículas
Proteínas da membrana
Proteínas de envelope
Proteínas de nucleocapsídeo
Genoma de RNA
Membrana bilipídica
Legenda: esquemático do virion (partícula viral) do Coronavírus felino (FCoV), proteínas do

nucleocapsídeo cobrem o genoma do RNA. As proteínas espículas, membrana e envelope estão
ancoradas na membrana bilipídica de origem celular. Fonte: Traduzido de Drechsler et al (2011).
Devido à facilidade de adaptação, os Coronavírus infectam hipoteticamente

todas as aves e mamíferos (14). A maioria dos novos vírus foi identificada em
morcegos e aves selvagens, isto leva à hipótese de que os Coronavírus humanos e
11
animais tenham se originado em morcegos e aves. Até o ano 2000, o interesse da

pesquisa pelo Coronavírus era grande, mas limitado aos felinos, suínos, bovinos e
aves domésticas (15).
1.1.3 As Coronaviroses
Segundo a literatura científica, um grande número de mamíferos é suscetível

às Coronaviroses. Esses vírus geralmente causam infecção em uma diversidade de
animais, com diferentes graus de severidade, em diferentes sistemas, tendo sido
mais frequentemente associados a doenças respiratórias, neurológicas e entéricas
em humanos e em animais domésticos. Em humanos, a principal Coronavirose é a
síndrome respiratória aguda severa (SARS), uma doença intratável e fatal que foi
causada por uma nova cepa de Coronavírus (13).
A variação genética do hospedeiro é conhecida por contribuir para diferentes

mecanismos pós-infecção. Modelos em camundongos permitiram identificar os
fatores genéticos do hospedeiro responsáveis pela susceptibilidade a SARS. Há
linhagens de camundongo altamente susceptíveis a infecção pelo Coronavírus da
SARS, demonstrando, por exemplo, que a pneumonia contribui para a perda de
peso e hemorragia pulmonar (16).
1.1.4 A peritonite infecciosa felina (PIF)
Coronavírus felino (FCoV)
A ordem Nidovirales, a qual pertence o FCoV, é um grupo de grandes vírus,

de RNA de fita simples e esféricos. O FCoV possui genoma de 27 a 32 kb, que
codifica uma poliproteína de cerca de 750 kDa, até cinco proteínas não estruturais e
quatro proteínas estruturais (13,17). O Coronavirus felino possui pelo menos três
proteínas estruturais principais: espícula (S), envelope (E), e membrana (M) (Figura
1). Este vírus é resistente ao ácido e a tripsina, mas é inativado facilmente pela
maioria dos desinfetantes, incluindo solventes de lipídios (13).
12
O FCoV é um patógeno intracelular obrigatório (5). O FCoV pode causar

desde uma gastroenterite transitória, com diarreia autolimitante, até uma doença
fatal em gatos (7). Os agentes infecciosos, em geral, apresentam tropismo por
células, por tecidos e por hospedeiros (18). Os Coronavirus tem marcadamente um
tropismo pelas células epiteliais dos tratos respiratório e entérico. No caso da PIF, o
FIPV tem tropismo pelos enterócitos e macrófagos (13). Além disso, foram
identificadas mutações pontuais no gene S (da proteína de espícula), que tem
associação com maior virulência. Entretanto, ainda não foi esclarecido se somente
esta mutação pode causar a doença (17). Devido as maiores chances de mutações,
há diferenças genômicas entre Coronavirus felinos (7). O FIPV é um FCoV que
sofreu mutação, que pode ser de muitos genes diferentes. Além disso, duas
substituições de aminoácidos da proteína de espícula foram observadas em tecidos
de gatos com PIF. Estas possíveis mutações e a interação com a resposta imune
são responsáveis pelo desenvolvimento da PIF (19).
Devido grande variação dos sinais clínicos na PIF, é desafiante o diagnóstico

antemortem (20). Isso se deve devido ao fato de o Coronavirus felino possuir dois
sorotipos (I e II), baseados na estrutura da proteína de espícula e ambos possuírem
dois biótipos, que são muito próximos geneticamente e um deles é o vírus da PIF -
FIPV (que teoricamente sofre mutação). O FCoV causa infecção assintomática e
auto limitante em gatos (20,21) e o FIPV, causa a PIF, uma doença fatal associada
aos gatos que vivem em ambientes com múltiplos gatos (20,21).
Doença
A peritonite infecciosa felina (PIF) é uma doença severa imunomediada, para

a qual os tratamentos atuais não são efetivos (5). A PIF ocorre em felídeos (19,22).
O desenvolvimento da PIF é dependente da relação hospedeiro/vírus (17). Esta
doença tem uma patogenia complexa e ainda não completamente elucidada, que
envolve a replicação do FCoV nos macrófagos, além dos enterócitos, provavelmente
devido a mutação (13,14). Por se tratar de um vírus envelopado, na fase de
constituição do envelope viral, ocorre a incorporação de proteínas adquiridas de
vários compartimentos de células do hospedeiro parasitadas. Estes constituintes do
hospedeiro adicionados podem ajudar a sobrevivência do vírus em face às defesas
13
do hospedeiro. As células alvo do FIPV são monócitos/macrófagos, que tem uma

afinidade específica pelo endotélio de veias no omento, pleura, serosa, meninges e
trato uveal, provavelmente por se localizarem em locais pelos quais o vírus tem
maior tropismo, que são o trato gastrointestinal, respiratório e sistema nervoso
central (SNC) (13,14), sendo necessários mais estudos a respeito. E, de forma
importante, estes macrófagos quando ativados, induzem a vasculite, efusões em
cavidade do corpo e lesões inflamatórias fibrinosa e granulomatosa (7,23-28).
Susceptibilidade
Todos os gatos domésticos são hipoteticamente susceptíveis à PIF,

independente da idade e gênero. Os filhotes são o grupo de gatos mais susceptíveis
a PIF (29). Esta maior ocorrência da doença em gatos jovens, além de idosos, está
relacionada a imunidade adaptativa e o seu papel protetivo e, em animais jovens, a
imunidade adaptativa é menos eficiente (30).
Além disso, também existe uma predisposição genética para desenvolvimento

da PIF, conforme já demonstrado em gatos da raça sagrado da birmânia, pêlo curto
britânico, devon rex e abissínio (29, 31, 32).
Distribuição
O FCoV é um vírus entérico e ubíquo, ou seja, ocorre no mundo todo

(4,5,13,20). Ocorre mais onde há condições de maior estresse e contato entre os
gatos, (4), ou seja, são agentes que comumente afetam gatos de abrigo (30). As
exceções são somente áreas isoladas, como as Ilhas Galápagos e Falkland (33).
Reservatório
As fontes de infecção do FCoV estão relacionadas a persistência subclínica

por mais de um ano, e gatos portadores infectados persistentemente, são
considerados reservatórios dos vírus (13).
14
Transmissão
O FCoV dissemina-se eficientemente pela via oro-fecal (13); o patógeno

infecta os gatos principalmente nas caixas de areia coletivas de gatis (4).
Morbidade e mortalidade
Sobre a morbidade da doença, sabe-se que cerca de 5 a 10% dos animais

positivos nos testes diagnósticos para FCoV desenvolvem PIF (20,34,35,36). A
mortalidade é de 100% (5).
Patogenia e Patologia
A PIF é uma doença viral imunomediada (13). De fato, a inflamação

granulomatosa e/ou piogranulomas em ambas as formas (seca ou úmida),
juntamente com linfopenia de células T, contribuem para a mortalidade dos gatos
com PIF. Na PIF, ocorre diminuição de linfócitos no sangue e nos linfonodos
(14,15,16), e a depleção linfoide tem sido a característica desta doença, sendo
induzida principalmente pela produção excessiva da citocina TNFα. Os macrófagos
de gatos infectados com FIPV aumentam a produção de TNF-α in vitro (22). O TNF-
α produzido pelos macrófagos infectados pelo FIPV é responsável pela indução de
apoptose de células T não infectadas, primariamente células TCD8+ in vitro, em
felinos (37). Além disso, ocorre aumento anormal da resposta imune inata, devido a
infecção de células, como monócitos e macrófagos (4). O FIPV se replica com maior
eficiência em macrófagos, ocorrendo deposição de imunocomplexos em diversos
órgãos, inclusive no SNC (17).
Os abrigos de gatos (gatis) favorecem o estresse, com a liberação de

mediadores imunossupressores, como a costicosterona, diminuindo a imunidade
inata e adaptativa, com neutropenia, monocitose, eosinopenia e linfopenia (20),
aumentando a susceptibilidade a PIF. Além disso, por ter havido mais contato, os
gatos podem ter sido infectados por outros agentes (18,19,21).
15
A patogenia da PIF é complexa e os sinais clínicos são associados à

replicação viral, que é geralmente secundária a algum evento imunossupressor. O
aumento da replicação viral resultou na emergência da variante vírus da peritonite
infecciosa felina (FIPV), que se replica com mais eficiência nos macrófagos (13).
Dentre os componentes estruturais do FIPV, a proteína espícula é considerada o
regulador para ligação e entrada do vírus na célula. Ela também está envolvida no
tropismo e virulência, assim como na mudança da doença entérica para PIF (22). Há
a teoria de que qualquer coronavirus felino (FCoV) possa causar a PIF (23-28).
Estudos recentes revelaram funções de muitas proteínas virais, bem como

diferentes especificidades de receptores para FCoV tipo I e tipo II. FECV e FIP
também possuem diferenças funcionais, uma vez que a replicação dos FECVs
ocorre principalmente no epitélio intestinal e são eliminados nas fezes, e os FIPVs
replicam-se nos monócitos/macrófagos. Além disso, os principais eventos na
patogenia da PIF são: infecção sistêmica com FIPV, replicação viral efetiva e
sustentável, e ativação de monócitos infectados. Adicionalmente, a genética do
hospedeiro e o sistema imunológico também desempenham papéis importantes.
Interessantemente, é a ativação de monócitos e macrófagos que ocasiona as
alterações anatomopatológicas características da PIF (7,23-28).
No desenvolvimento da PIF, formam-se piogranulomas em ambas as formas

(seca ou úmida) (13,14,38), com a aglomeração de imunocomplexos (FIPV e
anticorpos), que se depositam na parede dos vasos. Estes piogranulomas podem
ocorrer principalmente no baço, fígado, pulmões, olhos, linfonodos e SNC, e são
mais frequentemente encontrados nas serosas das vísceras abdominais (13). A
forma úmida da PIF é a mais comumente reportada, devido à observação do sinal
clínico de efusão peritoneal. A forma não efusiva está associada com resposta da
imunidade mediada por células (IMC), para diminuir a replicação viral através da
formação de um (pio)granuloma (39,40). Gatos com a forma seca da PIF tem uma
maior resposta imune pró-inflamatória, com importante participação da resposta da
IMC. Já em gatos com a apresentação da forma úmida, também foi identificado
envolvimento da resposta imune anti-inflamatória (41,42).
A PIF é uma doença viral imunomediada, por isso tem-se feito a abordagem
imunológica da doença. O conhecimento dos complexos papéis dos mediadores
16
inflamatórios na imunopatogenia ainda não foram completamente elucidados. O

vírus causa uma doença auto-limitante, embora esteja relacionada a magnitude ou
aumento da resposta imune. Os gatos com resposta imune robusta mediada por
células parecem ser mais resistentes à doença (43), ao contrário daqueles com
resposta adaptativa, com deposição de imunocomplexos e vasculite associada à
hipersensibilidade do tipo III (20). Isto leva a forma efusiva da doença, que é a mais
comum. A forma seca tem sido associada à resposta mediada por células no
indivíduo, com formação de (pio) granulomas, compostos principalmente por
macrófagos, linfócitos B e T, plasmócitos e neutrófilos (13,20,39,40).
Os mediadores inflamatórios são substâncias que facilitam a comunicação

entre as células, entre eles as citocinas, quimiocinas e metaloproteinases, que estão
relacionados à patogenia em doenças infecciosas. Por exemplo, a expressão
relativa de genes da quimiocina CXCL10 (proteína induzida por IFNγ 10) em células
infectadas de rim felino de Crandell-Reese (CRFK) aumentou cerca de 8,8 milhões
de vezes em 72 horas de infecção pelo vírus da PIF. A CXCL10 é secretada por
monócitos, macrófagos, células endoteliais e fibroblastos e atrai células T, NK e
dendríticas (20,44).
As infecções pelo Coronavírus não tem um marcador imune para distinguir

possíveis diferenças entre FECV e FIPV vírus antemortem, já que, de acordo com a
literatura, o Coronavírus sofre mutação da forma entérica para a
macrofágica/sistêmica. Quando o antígeno viral é fagocitado, ele é apresentado às
células “naïve“ (linfócitos), desencadeando a resposta adaptativa ao FIPV. Além
disso, o padrão de citocinas difere entre gatos assintomáticos e aqueles com PIF.
Em gatos infectados pelo FCoV sem sintomatologia, foi observado aumento de IL-10
no baço, o que sugere habilidade no controle da inflamação desencadeada pelos
macrófagos, ou seja, resposta anti-inflamatória (20,44). A depleção linfoide tem sido
a principal característica da PIF, e a resposta inflamatória é induzida principalmente
pela produção excessiva da citocina TNFα (20). Em contraste, embora as citocinas
pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e IFNγ) tenham aumentado em gatos infectados
experimentalmente com FIPV, pode ser que haja proteção contra a PIF associada as
citocinas IFNγ e IL-1β, (20). Neste experimento (in vitro e in vivo), foi observado um
aumento de citocinas do tipo pró-inflamatórias, como IL-12/p40, que junto ao IFNγ,
foram associadas à diminuição de IL-4 no tecido linfoide (20). Além disso, um estudo
17
recente que utilizou a abordagem transcriptômica de células CRFK infectadas com

FIPV, mostrou que houve maior produção de outras citocinas pró-inflamatórias como
IL-6, TNFα e quimiocinas M1P1α e RANTES em casos clínicos de PIF (20). Ainda, o
mesmo estudo demonstrou que ao menos 96 transcrições gênicas (1) da resposta
imune (exemplos MX1, TRIM25), (2) da apoptose (por exemplo, TNFα) e (3) da
resposta inflamatória (por exemplo CXCL10, CCL-8 e CCL-17) aumentaram (20).
Por último, adicionalmente, como esperado, este estudo detectou alta expressão de
citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, principalmente GM-CSF, IFNγ, IL-8, KC,
RANTES e MCP1, as quais são secretadas principalmente por
monócitos/macrófagos. Portanto, em gatos o FIPV causa dano celular e tecidual,
com a participação de diferentes fatores de inflamação, como citocinas e
quimiocinas. Baseada na patogenia da PIF, o acúmulo de fluidos na cavidade
peritoneal destes gatos é mais provável que seja devido o acúmulo de macrófagos
infectados no espaço entre a parede dos vasos sanguíneos (39). Monócitos ativados
e infectados pelo FIPV podem induzir a flebite através de ação parácrina e autócrina
de CD18, IL-1β e TNFα (40). Adicionalmente, a maior secreção de fator de
crescimento endotelial vascular – (VEGF) foi associada ao incremento das efusões
abdominal e pleural em gatos com PIF (21).
Em trabalho experimental com células renais, ocorreu aumento de várias

citocinas inflamatórias e quimiocinas (19). A CXCL8 (IL-8), por exemplo, é um
potente quimiotático de neutrófilos, produzida por macrófagos (44,45). Isto indica
que além do tropismo, o FPIV causa dano celular ao órgão acometido.
Diagnóstico
Diagnóstico clínico da PIF
A PIF é uma doença de difícil diagnóstico clínico, e é fatal, sendo quase

impossível a prevenção em locais com muitos gatos (5, 7, 46, 47).
Os principais sinais clínicos da PIF são: febre persistente (flutuante), perda de

peso, letargia, dispneia, distensão abdominal (embora altamente variáveis devido a
refletirem o tecido afetado pela doença) (13). Além disso, sinais neurológicos (como
18
anisocoria) e uveíte, lesões granulomatosas (ao exame ultrassonográfico) e fluído

torácico e abdominal (ao exame ultrassonográfico e radiográfico) (17). O
envolvimento ocular é menos comum na forma puramente efusiva e a forma
neurológica pode ocorrer em combinação com a doença ocular ou cada
manifestação pode ocorrer de forma isolada (42). É uma vasculopatia com efusões
(acima de 80% dos casos), lesões com massas (seca) ou a combinação de ambas.
Os sinais de PIF também incluem anorexia, falha em ganhar peso em gatos jovens,
a pirexia não responde a antibióticos ou antiinflamatórios não-esteroidais, icterícia e
linfadenomegalia (33).
Até o presente momento, não existe um manejo efetivo da PIF no longo

prazo. O diagnóstico sensível e específico é muito importante, e o diagnóstico
antemortem é extremamente desafiante. Deve-se em primeiro lugar analisar a
efusão de um gato com suspeita de PIF, porque é um método minimamente invasivo
e muito mais sensível que os testes de sangue. Nos gatos sem efusão, que vieram
de gatis, devem ser considerados alguns parâmetros, como o histórico, sinais
clínicos, alterações laboratoriais e a titulação de anticorpos, para auxiliar na tomada
de decisão sobre métodos mais invasivos para confirmação do diagnóstico etiológico
(17). Adicionalmente, recomenda-se que os gatos sejam testados para possíveis
coinfecções com outros vírus, como o vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus
da leucemia felina (FeLV), através da sorologia com o uso de testes diagnósticos
rápidos (IDEXX Labs., USA) (20).
Diagnóstico Laboratorial da PIF
Exame antemortem e post-mortem: microscópico, macroscópico,

diagnóstico por imagem e biologia molecular
Antemortem
Diversas metodologias de laboratório podem ser utilizadas para a detecção do

Coronavírus felino em gatos. Os tecidos apropriados para colheita e diagnóstico
variam de acordo com os sinais clínicos de cada gato, podendo ser utilizados desde
a citologia até o diagnóstico por imagem (37,48,49). As efusões podem ser
19
constatadas por técnicas relativamente fáceis e minimamente invasivas. Das

amostras de sangue, podem ser usados sangue total, plasma ou soro (50). Estes
incluem imagem de ressonância magnética, em animais com sinais clínicos
neurológicos. Além disso, a reação em cadeia de polimerase (ou biologia molecular)
pela transcriptase reversa (RT-PCR) para o FCoV pode ser feita em amostras de
tecido, efusão, sangue, líquido cérebro espinhal - LCE (37,51) e humor aquoso para
detecção do FPIV (33).
Ainda, sugere-se que a RT-PCR possa ser utilizada como teste adicional em
gatos com sinais neurológicos, e o resultado positivo suporta o diagnóstico de PIF.
Esta última pode ser realizada em amostras de tecido lesionado, como fígado, rins
ou linfonodos mesentéricos, que podem ser colhidos por biópsia percutânea guiada
por ultrassom. Reação de cadeia em polimerase pela transcriptase reversa
quantitativa (RT-qPCR, em inglês) pode ser feita em amostras de tecido embebido
em parafina (33,52).
Adicionalmente, a imuno-citoquímica é uma metodologia recomendada para o

diagnóstico antemortem da PIF em gatos com efusões (53).
Postmortem
Recomenda-se a necrópsia, histopatologia, imuno-histoquímica (IHC). A RT-

qPCR só é recomendada se o animal for necropsiado algumas horas após o óbito,
pois o FIPV pode morrer com a autólise do corpo do gato, gerando um resultado
falso negativo (33,54).
Biologia molecular
Os métodos mais recomendados para o diagnóstico etiológico da PIF são os

testes de biologia molecular. Em amostras de gatos com PIF, a biologia molecular se
mostrou altamente sensível e específica para confirmação da doença (22,24).
Quando possível, o uso complementar da IHC permite maior sensibilidade no
diagnóstico (52), principalmente quando o RT-qPCR for negativo, mesmo com
anatomopatologia característica da PIF (47). Além disso, devido as constantes
mutações dos Coronavírus, em casos onde o resultado para a RT-qPCR for negativo
20
para FIPV, recomenda-se o uso de outros pares de oligonucleotídeos e sondas para

detecção do FIPV em gatos (55,56). As alternativas aos testes que precisam de
ciclos de temperatura são os métodos isotérmicos (57).
Tratamentos
As principais substâncias utilizadas na terapia contra o FCoV, antivirais são:

ribavirina, um análogo de nucleosídeo (58), neste tratamento os animais morreram
de PIF; melfalan junto com predinisona, amplicilina e estreptoquinase em que o
animal respondeu bem, morrendo 9 meses após, por doença mieloproliferativa. Além
disso, já se utilizou: IFNα, e IFNβ felino não reduzindo a mortalidade, IFNα em
combinação com Propionibacterium acnes prolongou significativamente a média de
tempo de sobrevivência e por fim IFN ω felino, que pode ser usado por longos
períodos (IFN é espécie-específico), com resultados promissores em ensaio não
controlado. Para diminuir a inflamação (moduladores imunológicos) se utilizam a
tilosina junto com a prednisolona, tendo o gato sobrevivido até 210 dias. Além disso,
gatos que receberam ampicilina, prednisolona e ciclofosfamida ou dexametasona e
ampicilina ou IFNα humano ou um indutor de paraimunidade, puderam sobreviver 3
anos (de 29 a 80%) dependendo de qual combinação de tratamentos (17). Apesar
dos recentes avanços com relação ao tratamento da PIF com antivirais, o FPIV pode
causar a encefalite, porém, até o presente momento, os tratamentos de gatos não
foram eficazes para eliminar o vírus do SNC, como por exemplo, o inibidor de
protease tipo 3C (59).
1.1.5 PIF x Resposta imune
Os vertebrados têm as duas maiores defesas contra patógenos: a imunidade

inata e a adaptativa. A imunidade inata é composta por inúmeros fatores humorais
circulantes no sangue, como as citocinas, quimiocinas e complemento, e uma
variedade de leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos e células matadoras
naturais (Natural Killer, em inglês, NK), assim a resposta é rápida e diversa, o que é
considerado em geral vantajoso (60).
21
Os receptores “Toll-like” (TLRs) são receptores da imunidade inata capazes

de reconhecer a infecção viral e induzir a produção de interferons (IFNs) do tipo I,
além de outras citocinas e quimiocinas. O reconhecimento viral pelos TLRs e outros
receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) são específicos para diferentes
linhagens celulares. Os TLRs tem papel chave na ligação entre a imunidade inata e
a imunidade adaptativa (60). As células dendríticas (CDs) são a ligação crítica entre
a imunidade inata e a imunidade adaptativa. Elas apresentam os antígenos aos
linfócitos TCD4+, ação necessária ao reconhecimento de antígenos e essencial para
a resposta imune adaptativa. As CDs são ativadas pelos TLRs. Quando a infecção
ocorre pela primeira vez, estima-se que um em cada 100 mil linfócitos T citotóxicos -
CTLs - reconheça e responda ao antígeno viral (60). Como isto ocorre em outras
infecções, sugere-se que ocorra com o FIPV.
Na SARS, o TLR3 reconhece padrões moleculares associados a patógenos

virais e inicia programas de sinalização antivirais de IFNs, citocinas, e quimiocinas. A
sinalização dos TLRs leva a ativação de Interferons tipo I (α e β), citocinas pró-
inflamatórias (IL-6, TNF, IFN- γ, e CCL5), e genes estimulados por Interferon (ISGs)
na infecção pelo Coronavirus da SARS - SARS-CoV (61).
A MAPK p38 é uma família de proteínas componentes de vias de sinalização

internas, que respondem a estímulos externos às células. Um estudo sobre esta
família de proteínas identificou que células infectadas com o FCoV aumentam a
produção de mediadores inflamatórios, como o TNFα (38). Além disso, perfil de
resposta imune pró-inflamatória é teoricamente protetivo contra a PIF (62). O IFN-γ é
um dos principais mediadores inflamatórios da resposta mediada por células (63). O
IFN-γ induz quimiotaxia e resposta pró-inflamatória, com consequente aumento da
resposta imune citotóxica devido à ativação dos macrófagos e células T CD8+. Esta
ativação protege o hospedeiro do desenvolvimento da doença ou até mesmo da
infecção de novos gatos (63,64).
22
1.1.6 PIF x Imunidade humoral
Na PIF, a imunidade humoral parece aumentar a severidade da doença, isso

geralmente ocorre quando há uma depressão da resposta mediada por células, e os
gatos desenvolvem a forma efusiva da doença (65).
23
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30
2 Capítulo 2
2.1 Diagnóstico e caracterização anatomopatológica da peritonite infecciosa

felina em gatos.
2.1.1 Resumo
A peritonite infecciosa felina (PIF) é uma doença severa e imunomediada, sem

tratamento eficaz até o presente momento, e causada pelo Coronavirus felino
(FIPV). Causa vasculite imunomediada, hepatite, nefrite, meningoencefalite,
serosite, uveíte, pericardite, linfoadenite, esplenite e pneumonia. Quando há
suspeita de PIF, as amostras de tecidos devem ser colhidas para exame
histopatológico. A metodologia imuno-histoquímica (IHQ) pode ser utilizada para
diagnóstico etiológico post-mortem em amostras de tecido, localizando os antígenos
do FIPV, associados às lesões inflamatórias. O objetivo deste trabalho foi realizar a
caracterização anatomopatológica e diagnóstico da PIF em gatos. Foram incluídos
no estudo 12 gatos, que vieram a óbito. Os animais foram submetidos à necropsia,
avaliação histopatológica e IHQ para FIPV. Foram observadas lesões
anatomopatológicas características de PIF, principalmente no fígado (92%), pulmões
(75%), intestinos (75%), linfonodos mesentéricos (67%), rins (58%), baço (58%),
pâncreas (58%), encéfalo (58%) olhos (50%), e coração (8%) dos gatos. Na
histopatologia, foi observado infiltrado inflamatório misto, composto por macrófagos,
linfócitos, plasmócitos e neutrófilos, multifocal, com intensidade variada, por vezes
associados à necrose e exsudato fibrinoso em diferentes órgãos e sistemas. Neste
trabalho, a IHQ demonstrou associação das lesões anatomopatológicas com a
marcação do FIPV. O diagnóstico da PIF tem sido negligenciado no Brasil. Portanto,
estudos que identifiquem a doença são fundamentais para a qualidade do serviço
Médico Veterinário no Brasil.
Palavras chave: PIF, gatos, anatomopatologia, diagnóstico, IHQ

31
2.1.2 Abstract
Feline Infectious Peritonits (FIP) is a severe and immunomediated disease, without

an effective treatment to date, caused by Feline coronavirus (FIPV). It causes
immune-mediated vasculitis, hepatitis, nephritis, meningoencephalitis, serositis,
uveitis, pericarditis, lymphadenitis, splenitis and pneumonia. When FIP is suspected,
tissue samples should be collected for histopathological examination.
Immunohistochemistry (IHC) is recommended for post-mortem etiological diagnosis
from tissue samples, locating the FIPV antigens associated with inflammatory
lesions. The objective of this work was the anatomopathological analysis and
diagnosis of FIP in cats. The study included 12 cats that died naturally. The animals
were submitted to necropsy, histopathological evaluation and IHC for FIPV. The
anatomopathological lesions in the animals of the present study were characteristic
of PIF, mainly in the liver (92%), lungs (75%), intestines (75%), mesenteric lymph
nodes (67%), kidneys (58%), spleen (58%), pancreas (58%), brain (58%), eyes
(50%), and heart (8%) of the cats. Hitopathology showed a mixed inflammatory
infiltrate, composed mainly by macrophages, lymphocytes, plasmocytes and
neutrophils, with varying intensity, sometimes associated with necrosis and fibrinous
exudate in different organ and systems. In the present study, IHC showed an
association of anatomopatological lesions with FIPV immunolabeling. The diagnosis
of FIP has been neglected, and therefore, studies that identify the disease are
fundamental to the quality of the veterinary medical service in Brazil.
Key words: PIF, cats, anatomopathology, diagnosis, IHC

32
2.1.3 Introdução
A PIF é uma doença severa e imunomediada, sem tratamento até o presente

momento (1). Esta doença ocorre em felídeos domésticos e selvagens (2,3). Além
disso, é uma doença causada pelo Coronavirus felino (cepa FIPV), que causa
vasculite imunomediada, hepatite, nefrite, meningoencefalite, serosite, uveíte,
pericardite, linfoadenite, esplenite e pneumonia (1,4).
Após a eutanásia de animais com suspeita de PIF, na necrópsia, as amostras
de tecidos devem ser colhidas para exame histopatológico (5).
A imuno-histoquímica (IHC, do inglês) é útil para marcar o Coronavirus em

mamíferos (5,6,7). A IHC pode ser utilizada para o diagnóstico etiológico post-
mortem em amostras de tecido. Através dela, se faz a detecção do complexo
antígeno-anticorpo (5,8), podendo ser realizada em tecido fixado em formalina. Esta
técnica permite visualizar os antígenos do FIPV, associados às lesões inflamatórias
(5).
No Brasil, o diagnóstico da PIF tem sido negligenciado, portanto, estudos que

identifiquem a doença são fundamentais para o avanço da qualidade do serviço
médico veterinário no Brasil e consequente saúde dos gatos (9,10,11). Logo, o
objetivo deste trabalho foi diagnosticar a PIF em gatos da cidade de São Paulo,
através da realização da necropsia (análise macroscópica), avaliação
histopatológica, e identificação do FIPV, utilizando a IHC, com a finalidade de
localizar e categorizar as alterações anatomopatológicas, e correlacionar as lesões
com a marcação para o FIPV.
33
2.1.4 Métodos
Animais e amostras de material biológico
Foram incluídos neste estudo 12 gatos, que vieram de abrigos, da cidade de

São Paulo, SP, Brasil (protocolo de Aprovação da Comissão de Ética no Uso de
Animais – CEUA da Universidade Paulista – UNIP sob número: 035/18). Os animais
foram recebidos congelados ou refrigerados, para posterior realização da necropsia.
Necrópsia
Os animais foram submetidos à necrópsia de rotina com documentação

fotográfica para avaliação das alterações macroscópicas e colheita de material.
Foram descritas as lesões macroscópicas e microscópicas em todos os
órgãos com alterações, como fígado, rins, pulmões, baço, coração, intestinos
delgado e grosso, pâncreas, encéfalo e olhos. Estes foram colhidos, submergidos e
fixados em formol 10% tamponado por até 48 horas.
Microscopia
Histopatológico
As seções fixadas em formol foram processadas rotineiramente, diafanizadas,

e incluídas em blocos de parafina. Posteriormente, foram realizados cortes de 4 µm
dos tecidos, que foram em seguida corados pela coloração Hematoxilina Eosina
(HE).
O exame histopatológico permitiu a classificação das lesões segundo a
intensidade do infiltrado inflamatório, cada uma das seções (12) e realização do
diagnóstico morfológico.
34
Imuno-histoquímica
Foi executada a IHC para identificação ou localização do complexo antígeno -

anticorpo (5), com a finalidade de localizar o Coronavirus felino nos tecidos com
lesões (5,7,8).
Foram realizados cortes de 4 µm de tecidos com lesões microscópicas. A IHC
foi realizada através da incubação com anticorpo (Ac) primário monoclonal anti-FIPV
de camundongo (anticorpo monoclonal contra Pan-Coronavirus (FIPV3-70,
Thermofisher Scientific, Cat. No. MA1-82189). As secções foram desparafinizadas
em xilol. A recuperação antigênica foi efetuada com tampão citrato pH 6,0 em panela
à vapor por 15 minutos. Para inibir a peroxidase endógena, as seções foram
incubadas com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos duas vezes e lavadas
três vezes com PBS 1x pH 7,4. Os anticorpos primários contra o FIPV (1:100) foram
incubados pelo período de 18-20h a 4ºC. As seções foram lavadas três vezes em
PBS 1x pH 7,4, incubadas com o anticorpo secundário produzido em coelho anti-
camundongo, ligado ao polímero e a peroxidase (kit de detecção de polímero
Superpicture™, HRP, ThermoFisher Scientific, Número de catálogo 878963;
ImmPRESS™ Universal Reagent Anti-Mouse/Rabbit IgG, Vector Laboratories,
Peroxidase, Número de catálogo MP-7500) por 10 minutos em câmara úmida. A
reação foi revelada com a diaminobenzidina (DAB, DAKO, Denmark). Os cortes
foram corados com hematoxilina de Harris, e montadas com cola Entelam®. Para
controle interno da IHC, os mesmos tecidos que foram incubados com o anticorpo
primário também foram incubados com solução PBS 1x pH 7,4. Além disso, cortes
histológicos de tecidos de gatos sem lesões microscópicas também foram incluídos
e incubados com o anticorpo primário. Por último, todas as lâminas foram
examinadas pela microscopia de luz em microscópio e fotografadas (Nikon Eclipse
E200) nas objetivas de 4x, 10x, 20x e 40x.
35
2.1.5 Resultados
2.1.5.1 - Necrópsia
Os resultados de anatomopatologia, tanto da macroscopia quanto da

microscopia e IHC, mais significativos e representativos, estão nas figuras e tabelas
a seguir.
Figura 2 – Macroscopia do fígado de gato (animal nº. 8).
Legenda. Figura 2 – Gato 8. Fígado, aumento de volume, com bordos arredondados e superfície
capsular recoberta com exsudato fibrinoso difuso.
36
Figura 3 – Macroscopia dos linfonodos mesentéricos de gato (animal nº. 1).
Legenda. Figura 3 – Gato 1. Cadeia de linfonodos mesentéricos, com linfadenomegalia (centro em

destaque medindo 3,0x1,5cm), associada a nódulos esbranquiçados multifocais na cápsula, além de
edema difuso do mesentério.
Figura 4 – Macroscopia dos rins de gato (animal nº. 4).
Legenda. Figura 4 – Gato 4. Rins. A: Superfície subcapsular. Nódulos macios, esbranquiçados e

glomerulonefrite intersticial. B: superfície de corte: nódulos macios, esbranquiçados por vezes
coalescentes, multifocais no córtex e medula.
37
Figura 5 – Macroscopia do baço de gato (animal nº. 2).
Legenda. Figura 5 – Gato 2. Baço. Superfície subcapsular. Nódulos multifocais. Nódulo multifocal
medindo cerca de 1 cm de diâmetro (seta).
Figura 6 – Macroscopia dos intestinos de gato (animal nº. 3).
Legenda. Figura 6 – Gato 3, enterite. Intestinos. Granulomas multifocais branco-bege (setas), friáveis,
distribuídas por toda a serosa intestinal e associadas a maior evidenciação dos vasos sanguíneos.
38
Figura 7 – Macroscopia do pâncreas de gato (animal nº. 2).
Legenda. Figura 7 – Gato 2. Pâncreas, pancreatite multifocal. Observam-se nódulos branco-bege

(setas), macios, multifocais. Na microscopia foram observados piogranulomas e necrose.
Figura 8 – Macroscopia do encéfalo de gato (animal nº. 9).
Legenda. Figura 8 – Gato 9. Encéfalo, meningite. Hiperemia, difusa. Na microscopia foi constatada
meningite mononuclear multifocal.
39
Figura 9 – Macroscopia dos olhos de gato (animal nº. 9).
Legenda. Figura 9 – Gato 9. Olho. Uveíte difusa e acentuada no olho direito.
2.1.5.1 – Microscopia - Histopatológico e IHC para FIPV

40
A Tabela 1 resume os principais achados macroscópicos dos gatos necropsiados.
Nesta pesquisa foram realizados exames histopatológicos de 12 gatos com alterações anatomopatológicas compatíveis com
PIF. Foram selecionados órgãos com (pio) granulomas, que são as principais lesões que ocorrem na PIF (13,14,15,16)
Tabela 1. Resumo dos órgãos com lesões macroscópicas dos gatos necropsiados, com o total e porcentagem das lesões sugestivas de PIF.
Linfonodos
Órgãos Fígado Rins Pulmões mesentéricos Intestinos Pâncreas Coração Encéfalo Olhos Baço
Gato 1 + + + - - - - - - -
Gato 2 + + + - + - + - - +
Gato 3 - - - - - - - - - -
Gato 4 - - - - - - - - - -
Gato 5 - - - - - - - - - -
Gato 6 - - - - - - - - - -
Gato 7 + - - + + - - - - +
Gato 8 + - - + + - - - + +
Gato 9 - - - - - - - + + -
Gato 10 + - - + + - - - - +
Gato 11 + - + - - - - - - -
Gato 12 - + - + - - - - - +
Total 6 3 3 4 4 0 1 1 2 5
% 50 25 25 33 33 0 8 8 17 42
41
As lesões anatomopatológicas nos animais do presente estudo foram

características, o que sugeriu que o animal estivesse com a PIF. A IHC confirmou a
doença PIF. Os resultados representativos do estudo estão ilustrados nas figuras a
seguir:
Figura 10 – Microscopia e IHC para FIPV do rim de gato.
Legenda. Figura 10 – Gato, rins. A, B, C (1) observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto,
predominantemente linfoplasmocitário acentuado, por vezes associado à necrose com fibrina (setas),
em glomérulos e interstício, em córtex e medula. Distribuição: multifocal. A1: microscopia 40 x, B1:
microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV,
positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas
áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e
hematoxilina d e Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400.
42
Figura 11 – Microscopia e IHC para FIPV do intestinos delgado e grosso de gato.
C2
Legenda. Figura 11 – Gato, intestino. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório

misto, predominantemente linfoplasmocitário (setas), multifocal e acentuado, por vezes associado à
necrose na serosa, com fibrina. A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x.
HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de
seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose
adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2:
microscopia x100 e C2: microscopia x400.
43
Figura 12 – Microscopia e IHC para FIPV do linfonodo de gato.
C2
Legenda. Figura 12 – Gato, linfonodo. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório

misto, predominantemente linfoplasmocitário (setas), difuso e acentuado, por vezes associado à
necrose, com fibrina na cápsula. A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400
x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de
44
Figura 13 – Microscopia e IHC para FIPV dos pulmões de gato.
C2
Legenda. Figura 13 – Gato, pulmões. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório

misto, predominantemente linfoplasmocitário, multifocal acentuado em brônquios, bronquíolos,
parênquima e pleura (setas). A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x.
HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de
45
Figura 14 – Microscopia e IHC para FIPV do fígado de gato.
C2
Legenda. Figura 14 – Gato, fígado. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto,
predominantemente linfoplasmocitário, multifocal, acentuado (setas). A1: microscopia 40 x, B1:
microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV,
positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas
áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e
hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400. Animal
com diagnóstico morfológico de colangiohepatite piogranulomatosa, multifocal acentuada.
46
Figura 15 – Microscopia e IHC para FIPV da medula espinhal de gato.
Legenda. Figura 15 – Gato, medula espinhal. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado

inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário, multifocal, acentuado associado a necrose
e com fibrina (setas). A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B,
C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no
citoplasma de macrófagos (seta), bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose
microscopia x100 e C2: microscopia x400. Animal com diagnóstico morfológico de mengite
piogranulomatosa, multifocal acentuada.
47
Figura 16 – Microscopia e IHC para FIPV do pâncreas de gato.
Legenda. Figura 16 – Gato, pâncreas. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório

predominantemente mononuclear, multifocal, acentuado associado a necrose e com fibrina (setas).
A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-
histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de
macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo
peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2:
microscopia x400. Animal com diagnóstico morfológico de pancreatite necrosante, multifocal
acentuada.
48
A tabela 2 resume os principais achados microscópicos.
Tabela 2. Resumo dos órgãos com lesões microscópicas dos gatos necropsiados, com o total e porcentagem das lesões sugestivas de PIF.
Órgãos Fígado Rins Pulmões Linfonodos Intestinos Pâncreas Coração Encéfalo Olhos Baço
Gato 1 + + + + - - - + + -
Gato 2 + - + + + + + + - +
Gato 3 + + - + + - - + - +
Gato 4 + + + - + + - + + +
Gato 5 + + + - + + - + + +
Gato 6 + + + + + - - - + -
Gato 7 + + + + + + - - - +
Gato 8 + - + + + + - - - +
Gato 9 - - - - - - - + + -
Gato 10 + - - + + + - + + +
Gato 11 + - + - - - - - - -
Gato 12 + + + + + + - - - -
Total 11 7 9 8 9 7 1 7 6 7
% 92 58 75 67 75 58 8 58 50 58
49
A tabela 3 resume os principais achados de IHQ.
Tabela 3. Tabela relacionando os gatos aos órgãos com lesões microscópicas que foram selecionados para a IHC e foram positivos para o FIPV na imuno-
histoquímica.
Órgãos Fígado Rins Pulmões Linfonodos Intestinos Pâncreas Coração Encéfalo Olhos Baço
Gato 1 - + + + - - - - - -
Gato 2 - - + - - - + - - +
Gato 3 - + - - - - - - - -
Gato 4 - - + - - - - - - -
Gato 5 + - - - - - - - - -
Gato 6 - + - + - - - - - -
Gato 7 - - - - + - - - - -
Gato 8 - - - - + + - - - -
Gato 9 - - - - - - - - + -
Gato 10 + - - - + - - - - -
Gato 11 - - + - - - - - - -
Gato 12 - - + - - - - - - -
- = Não foi realizada IHQ.
50
2.1.6 Discussão
Foram examinados macroscopicamente e microscopicamente 12 gatos, a fim

de confirmar o diagnóstico etiológico e descrever as lesões anatomopatológicas. Os
resultados confirmaram a infecção pelo FIPV nos animais que apresentaram lesões
macroscópicas e microscópicas, através da análise histopatológica e de IHC (5,7,8).
Neste estudo, os animais também apresentaram vasculite, e pode ser que estes
desenvolveram sinais de acordo com (1) órgão-alvo afetado por estas lesões
piogranulomatosas e (2) vasculite, que pode causar ascite e efusão torácica (17).
Os gatos eram provenientes de abrigos, o que corrobora com a hipótese da
superpopulação de felinos favorecer a disseminação do FCoV, aumentando a
susceptibilidade no desenvolvimento da PIF (18).
Com relação ao processo inflamatório na PIF, a citocina TNFα já foi
evidenciada como importante e associada à inflamação no fígado (18), pâncreas
(19), nos linfonodos mesentéricos, baço (20) e no SNC (21).
A linfopenia é provavelmente a resposta leucocitária mais comum à maioria
das doenças sistêmicas. O estresse fisiológico é uma resposta do corpo mediada
pela liberação de hormônio adrenocorticotrófico pela glândula pituitária (hipófise),
que resulta na liberação de cortisol pela glândula adrenal. Isso ocorre em resposta à
maioria das condições como a doença inflamatória, com alterações nos vários tipos
celulares (22). Sugere-se que ocorra na PIF, doença inflamatória causada pelo
FIPV.
No presente estudo, em 92% dos gatos houve lesões no fígado, sendo o

órgão mais acometido. Observou-se hepatite multifocal, predominantemente
linfoplasmocitária, por vezes associada à deposição de fibrina e necrose,
principalmente na cápsula e tríade portal. Outros achados microscópicos incluíram
colangite linfoplasmocitária, colangio-hepatite e peri-hepatite. Estes achados
microscópicos estão de acordo com a literatura cientifica da PIF (17,23,24,25,26).
Nos gatos com icterícia, o FIPV provavelmente induza a hiperbilirrubinemia,
diminuindo o transporte transmembrana, o metabolismo e excreção de bilirrubinas
no sistema biliar e a necrose hepática por hipóxia (causada por anemia severa e
efusões) (18,26). Quando ocorre inflamação no fígado, a PIF é fatal ou o prognóstico
51
é pobre (27,28). Com relação à hepatite, podem ser considerados os seguintes

diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma gondii), colangite linfocítica
(com efusão abdominal e às vezes há icterícia) (5) icterícia hepática causada por
linfoma hepático, e lipidose ou necrose hepática focal, devido a infecção pelo
FeLV.(29)
Nos intestinos, delgado e grosso, foram observadas alterações

anatomopatológicas em 75% dos gatos. Na maioria dos casos, na camada serosa,
observou-se serosite mista, focalmente extensiva e multifocal, acentuada associada
ao exsudato fibrinoso. Os achados anatomopatológicos estão de acordo com
estudos anteriores, com formação de piogranulomas perivasculares em vários
órgãos (4,23,24,30). As inflamações nos intestinos são predominantemente
linfoplasmocitárias, porém podem também ser piogranulomatosas, associadas às
efusões multicavitárias e polisserosite fibrinosa (26).
Nos pulmões dos gatos do presente estudo (75% dos gatos), observou-se
pneumonia, broncopneumonia e pleurite piogranulomatosa multifocal, concordando
com estudos anteriores (4,30). Os alvéolos pulmonares são compostos pela lamina
basal, células endoteliais e pelos pneumócitos tipo I (43). O FIPV, assim como
outros Coronavirus, são agentes epiteliotrópicos, que infectam os pulmões,
estimulando a produção de fatores de inflamação, como VEGF, em diferentes
órgãos e sistemas, incluindo os pulmões (15,44,45). A tuberculose é uma das
doenças consideradas no diagnóstico diferencial da pneumonia na PIF, e é causada
pelo Mycobacterium tuberculosis. Nas infecções com micobactérias, os gatos
apresentam lnfoadenopatia, sinais respiratórios e/ou uveíte, feridas, podem ficar
relativamente bem até um episódio de dispneia, por exemplo. Além disso, as
micobactérias afetam o parênquima pulmonar, diferentemente da PIF onde há
efusões pleurais. No diagnóstico da PIF, nota-se severa hiperglobulinemia ou razão
albumina:globulina reduzida e nas infecções por micobacteriais isso geralmente não
ocorre (5). Com relação à pneumonia, podem ser considerados os seguintes
diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma gondii), piotórax
(possivelmente bacteriano) (5) e pneumonia (infecções secundárias) em gatos
infectados por FeLV (29).
Foram observadas lesões em 67% dos linfonodos mesentéricos dos gatos,
apresentando depleção linfoide e linfopenia, provavelmente associados aos
52
macrófagos infectados, que leva a apoptose das células T (20), assim como
linfoadenite linfoplasmocitária multifocal acentuada. Estes achados microscópicos
estão de acordo com a literatura cientifica (17,23,24,25,26).
Os rins foram acometidos em 58% dos casos. Nos rins, na maioria dos casos
foi observado infiltrado inflamatório predominantemente linfoplasmocitário, por vezes
associado à necrose, exsudato fibrinoso, multifocal e acentuado. O diagnóstico
morfológico de glomerulonefrite piogranulomatosa multifocal corrobora com a
literatura científica (1,4,17,18,23,24). O Coronavírus felino (FIPV) infecta células
renais de gato, ocorrendo significativa modulação na expressão de citocinas (23). A
glomerulopatia pode ter ocorrido devido à deposição de imunocomplexos. A
estimulação de células B pela interleucina 6, produzida na PIF pode ser que
contribua para o aumento de γ-globulinas (28). Além disso, relaciona-se a formação
de complexos em presença do FIPV e anticorpos, que se depositam seletivamente
na membrana basal dos capilares glomerulares, estimulando a fixação de
complemento. A continuidade das lesões ocorre com a infiltração de monócitos nos
glomérulos (31).
No presente estudo, verificamos presença de linfócitos B nas lesões
microscópicas de inflamação mista dos gatos diagnosticados com PIF. Sabe-se que
a citocina IL-1 é produzida por linfócitos B, e provavelmente a partir da chegada do
antígeno do FIPV no linfonodo haja estímulo destas células B, que se diferenciam
em plasmócitos, produzindo IL-1. Essa citocina induz a febre, liberação de
histamina, vasodilatação e inflamação local (22), ou seja, tem consequências em
diferentes sistemas. Além disso, TNFα e IL-17, as quimiocinas CXCL1, CXCL2,
CXCL5 e a deposição de imunocomplexos induzem, conjuntamente, a infiltração de
monócitos, linfócitos e neutrófilos, pois induzem a vasodilatação e aumentam a
permeabilidade vascular (32).
No presente estudo, foram encontradas lesões microscópicas no pâncreas

em 58% dos casos, com diagnóstico morfológico de pancreatite piogranulomatosa. A
histopatologia é o padrão-ouro para o diagnóstico de pancreatite (19). Como o FIPV
se espalha sistemicamente, formam-se complexos antígeno-anticorpo no endotélio
dos pequenos vasos. Subsequentemente, ocorre edema e necrose. Na forma
efusiva, a inflamação granulomatosa é comum em serosa de vísceras abdominais
(órgãos parenquimatosos), como o pâncreas (7,17,18,23,25). De fato, a pancreatite
53
é uma consequência da infecção pelo FIPV em gatos e furões (33,34). Além disso, a
pancreatite aguda resulta da liberação e ativação inadequada de enzimas
pancreáticas que destroem o tecido pancreático e estimula uma reação inflamatória
aguda, e lesão reversível (35).
Nos gatos, mesmo a pancreatite leve pode levar a resposta inflamatória
sistêmica, associada ao FIPV, provavelmente a causa primária seja a ativação de
neutrófilos e a liberação de citocinas (19), (p. ex., fator de ativação plaquetária, óxido
nítrico) liberadas sistemicamente (19). Em envolvimento pancreático, podem ser
considerados os seguintes diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma
gondii) (5), parasitose por trematódeo (família Opisthorchidae e Dicrocoelidae) (36),
Hipertrigliceridemia, Dieta, trauma e causa idiopática (90%) (19)
Foram observadas lesões do baço em 58% dos casos, principalmente
esplenomegalia, e exsudato fibrinoso na cápsula, com diagnóstico morfológico de
esplenite linfoplasmocitária, com depleção linfoide. Estes achados microscópicos
estão de acordo com a literatura cientifica (17,23,24,25,26). Estes achados podem
estar associados, dentre outros, aos macrófagos infectados, que levando à apoptose
das células T (20). Com relação a esplenite e periesplenite, podem ser considerados
os seguintes diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma gondii) (5). Além
disso, aspergilose (Aspergillus spp.), leishmaniose (Leishmania spp.) e peritonite
pós-cirúrgica (periesplenite) (37).
No encéfalo (58%), observou-se meningoencefalite, multifocal e acentuada,

associada a plexo coroidite e ependimite (15,30,25). A PIF é a doença infecciosa
mais comum do sistema nervoso central (SNC) causadora de óbitos em gatos (40).
A infecção pelo FIPV causa inflamação no plexo coroide e epêndima, estruturas
onde lesões são raras. Estas lesões inflamatórias podem causar obstrução e
hidrocefalia não comunicante hipertensiva. A plexo-coroidite e a ependimite são os
achados microscópicos mais comumente associados a infecção do SNC pelo FIPV
em gatos. De fato, o vírus tem predileção pelo epêndima de todo o sistema
ventricular, incluindo o plexo coróide (40). Na infecção pelo FIPV, pode ocorrer
obstrução do aqueduto mesencefálico e a expansão do terceiro ventrículo e
ventrículos laterais (35). Interessantemente, macrófagos residentes do SNC
(micróglia) podem ser infectados por Coronavírus neurotrópicos, como o vírus da
hepatite murina (MHV). Adicionalmente, o mesmo estudo comprovou que a
54
supressão da micróglia não evita a migração de células inflamatórias para o SNC

(41). A infecção do SNC pelo FIPV provavelmente esteja relacionada ao tropismo
viral determinado pela citocina IFN tipo I, que já foi demostrado e cujo mecanismo
antiviral é desconhecido (42). Além disso, esta citocina, ao contrário de outras
citocinas, regula a atividade de quimiocinas que atraem células T para o SNC (21).
Com relação à encefalite, meningite, plexo-coroidite e ependimite, podem ser
considerados os seguintes diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma
gondii), raiva (vírus da raiva) (5) e alterações comportamentais em co-infecção por
FIV e Cryptococcus neoformans, ou FIV e FeLV. Além disso, polineuropatia ou
linfomas que levam a anisocoria, ataxia e alterações comportamentais por infecção
por FeLV (29).
Em 50% dos gatos, foi observada uveíte mononuclear focal acentuada,

predominantemente linfohistiocitária. O FPIV pode ter alcançado os olhos pela via
hematógena (12,24,25,26). Também foi observada associação entre uveíte e neurite
do nervo óptico. Essa manifestação é conhecida como PIF neuro-ocular e pode
ocorrer sem manifestação sistêmica, ou combinada com a forma seca. A inflamação
pode ocorrer em conjunto com o SNC ou isoladamente (38). Com relação ao
diagnóstico diferencial de uveítes em felinos, a infecção pelo FIPV, vírus da
imunodeficiência felina (FIV, feline immunodeficiency vírus, do inglês) e herpesvírus
felino tipo 1 (29) constituem-se as principais causas diferencias de uveíte (39). Em
envolvimento ocular, podem ser considerados os seguintes diagnósticos diferenciais:
doença conjuntival (Chlamydia felis) e tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) (5,
29).
Com relação ao coração, há apenas relato de um caso de epicardite causada

pelo FIPV na literatura (26). No presente estudo, em um gato (8%) foi observado no
epicárdio, infiltrado inflamatório misto. As lesões foram compostas principalmente
por macrófagos, plasmócitos e linfócitos, depósito de fibrina e neutrófilos,
associados à necrose e fibrina, com diagnóstico morfológico de epicardite mista
acentuada. Além da PIF, outras doenças podem causar cardiopatias, como
pericardite granulomatosa, embora a literatura seja escassa. Estas doenças incluem:
botriomicose (causada pelo Staphylococcus aureus em processo de infecção
sistêmica); coccidiomicose que algumas vezes pode se estender dos pulmões
(piogranulomas) ao coração, causada pelo fungo Coccidioides immitis (46).
55
2.1.7 Conclusões
O FIPV causou lesões nos fígado (92%), pulmões (75%), intestinos (75%),
linfonodos mesentéricos (67%), rins (58%), baço (58%), pâncreas (58%), encéfalo
(58%), olhos (50%), e coração (8%) dos gatos. A variedade de tecidos submetidos à
IHC para o FPIV constatou a disseminação da doença sistêmica causada pelo vírus
em gatos.
O diagnóstico da PIF tem sido negligenciado, não se tem conhecimento a

respeito, portanto, estudos que identifiquem a doença são fundamentais para a
qualidade do serviço médico veterinário, incluindo o Brasil. Além disso, tem crescido
o interesse pelos felinos e é importante aprimorar o diagnóstico desta enfermidade
na Medicina Veterinária. Essas pesquisa poderão contribuir para o desenvolvimento
de tratamentos efetivos contra a PIF em felídeos.
56
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UNIVERSIDADE PAULISTA

Edna Cristiane da Matta

DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA

DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA

Dissertação de mestrado apresentada ao

Orientador: Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell´Armelina Rocha

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós

Área de Concentração: Patologia Veterinária.

1. PIF. 2. Imuno-histoquímica. 3. Gatos. 4. Imunomediada. I. Rocha,

Ficha elaborada pela Bibliotecária Maria Aládia S. F. de Braga CRB8-2264

DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICOS DA

Dissertação de mestrado apresentada ao

Aprovado em: 18/12/2018

Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell’Armelina Rocha

Universidade Paulista - UNIP

Profa. Dra. Leoni Villano Bonamin

Universidade Paulista - UNIP

Profa Dra. Gisele Fabrino Machado

A minha família, em especial, à Caroline por me entusiasmar sempre, desde

AGP: Glicoproteína ácida α1

Figura 1 – Ilustração da estrutura do Coronavirus felino (FCoV)

Figura 2 – Macroscopia do fígado de gato (animal nº. 8)

Figura 3 – Macroscopia dos linfonodos de gato (animal nº. 1)

Figura 4 – Macroscopia dos rins de gato (animal nº. 4)

Figura 5 – Macroscopia do baço de gato (animal nº. 2)

Figura 6 – Macroscopia dos intestinos de gato (animal nº. 3)

Figura 7 – Macroscopia do pâncreas de gato (animal nº. 2)

Figura 8 – Macroscopia do encéfalo de gato (nº. 9)

Figura 9 – Macroscopia dos olhos de gato (nº. 9)

Figura 10 – Microscopia e IHC para FIPV do rim de gato

Figura 11 – Microscopia e IHC para FIPV do intestino de gato

Figura 12 – Microscopia e IHC para FIPV do linfonodo de gato

Figura 13 – Microscopia e IHC para FIPV dos pulmões de gato

Figura 14 – Microscopia e IHC para FIPV do fígado de gato.

Figura 15 – Microscopia e IHC para FIPV da medula espinhal de gato.

Figura 16 – Microscopia e IHC para FIPV do pâncreas de gato.

1.1 Considerações Gerais

A população de felinos vem crescendo vertiginosamente no Brasil (1) e desde

Assim como aconteceu na Europa, espera-se que no Brasil o gato (Felis

Após a segunda grande guerra mundial, as áreas urbana e suburbana

Além disso, o estudo da patogenia da peritonite infecciosa felina também

1.1.1 Vírus de RNA de fita simples

Utilizando-se a biologia molecular e a metagenômica, descobriu-se que há

A PIF é causada pelo Coronavírus felino. Os Coronavírus pertencem à família

Figura 1 – Ilustração da estrutura do Coronavírus felino (FCoV).

Legenda: esquemático do virion (partícula viral) do Coronavírus felino (FCoV), proteínas do

Devido à facilidade de adaptação, os Coronavírus infectam hipoteticamente

animais tenham se originado em morcegos e aves. Até o ano 2000, o interesse da

Segundo a literatura científica, um grande número de mamíferos é suscetível

A variação genética do hospedeiro é conhecida por contribuir para diferentes

1.1.4 A peritonite infecciosa felina (PIF)

Coronavírus felino (FCoV)

A ordem Nidovirales, a qual pertence o FCoV, é um grupo de grandes vírus,

O FCoV é um patógeno intracelular obrigatório (5). O FCoV pode causar

Devido grande variação dos sinais clínicos na PIF, é desafiante o diagnóstico

A peritonite infecciosa felina (PIF) é uma doença severa imunomediada, para

do hospedeiro. As células alvo do FIPV são monócitos/macrófagos, que tem uma

Todos os gatos domésticos são hipoteticamente susceptíveis à PIF,

Além disso, também existe uma predisposição genética para desenvolvimento

O FCoV é um vírus entérico e ubíquo, ou seja, ocorre no mundo todo

As fontes de infecção do FCoV estão relacionadas a persistência subclínica

O FCoV dissemina-se eficientemente pela via oro-fecal (13); o patógeno

Sobre a morbidade da doença, sabe-se que cerca de 5 a 10% dos animais