2346-2358 Nucleic Acid Research, 2009, Vol. 37, No.

Diterbitkan online 26 Februari 2009

doi: 10,1093 / nar / gkp098

Peraturan pasca transkripsi dari angiotensin II

ketik 1 reseptor ekspresi oleh gliseraldehida
dehidrogenase 3-fosfat
Michael Backlund, Kirsi Paukku 1, Laurent Daviet2, Rudolf A. De Boer 3, Erkka Valo4,
Sampsa Hautaniemi4, Nisse Kalkkinen5, Afshin Ehsan6, Kimmo K. Kontula1 dan Jukka Y.
A. Lehtonen7, *

1Biomedicum Helsinki dan Departemen Kedokteran, Universitas Helsinki, Helsinki,

Finlandia, 2Hybrigenics SA, 3-5 Kebuntuan Reille, 75014 Paris, Prancis, 3Department
Kardiologi, University Medical Center Groningen, Groningen, Belanda, 4Computational
Sistem Laboratorium Biologi, Institut Biomedis dan Genome-Skala Biologi Program
penelitian, 5Protein Chemistry Research Group, Institut Bioteknologi, University of Helsinki,
Finlandia, Medical Center 6Tufts-New England, Boston, MA 02111, USA dan 7Department
of Cardiology, Rumah Sakit Pusat Universitas Helsinki, Helsinki, Finlandia

Menerima November 13, 2008; Revisi 4 Februari 2009; Diterima 6 Februari 2009

ABSTRAK
Peraturan angiotensin II tipe 1 reseptor (AT1R) memiliki peran patofisiologi hipertensi,
aterosklerosis dan gagal jantung. Kami mulai dari pengamatan bahwa wilayah 3'
diterjemahkan (3'-UTR) dari AT1R mRNA ditekan terjemahan AT1R. Menggunakan
pemurnian afinitas untuk pemisahan dari 3'-UTR mengikat protein dan spektrometri massa
untuk identifikasi mereka, kami menjelaskan gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase (GAPDH)
sebagai AT1R protein 3'-UTR mengikat. mobilitas elektroforesis RNA bergeser analisis
dengan GAPDH dimurnikan lebih lanjut menunjukkan interaksi langsung dengan 3'-UTR
sementara GAPDH immunoprecipitation menegaskan hal ini interaksi dengan endogen AT1R
mRNA.GAPDH binding situs dipetakan ke 1-100 dari 3'-UTR.GAPDH-terikat Target mRNA
diidentifikasi oleh ekspresi berbagai hibridisasi. Analisis sekunder struktur dibagi di antara
target GAPDH dipimpin untuk identifikasi motif RNA kaya adenines dan urasil.
Pembungkaman GAPDH meningkatkan ekspresi baik endogen dan transfected AT1R.
Demikian pula, penurunan ekspresi GAPDH oleh H2O2 menyebabkan peningkatan tingkat
ekspresi AT1R. Konsisten dengan GAPDH memiliki pusat peran dalam regulasi AT1R H2O2
dimediasi, baik penghapusan situs GAPDH-mengikat dan GAPDH berlebih dilemahkan efek
H2O2 pada AT1R mRNA. Secara bersama-sama, GAPDH adalah translasi sebuah
penindasan AT1R dan memediasi efek H2O2 pada AT1R mRNA

PENGANTAR
Angiotensin II adalah regulator fisiologis penting dari tekanan darah, garam dan homeostasis
cairan, dan kardiovaskular Struktur (1). Angiotensin II memiliki dua reseptor yang
memediasi efek. Angiotensin tipe II 1 reseptor (AT1R) adalah reseptor G-protein-coupled
yang menganugerahkan sebagian besar efek merusak dari angiotensin II, sedangkan jenis 2
reseptor menganugerahkan efek pelindung (2,3). memicu angiotensin-II-dimediasi AT1R
memiliki peran penting dalam patogenesis ginjal kronis gagal, gagal jantung, hipertensi dan
aterosklerosis. Selain itu, banyak uji klinis telah menunjukkan efek menguntungkan dari
terapi farmakologis yang mengurangi aktivitas AT1R di berbagai kardiovaskular
gangguan (1).AT1R diatur pada beberapa tingkat termasuk transkripsi, sintesis protein,
degradasi dan sinyal transduksi. Regulasi ekspresi AT1R adalah mekanisme penting yang
memodulasi aktivitas reninangiotensin sistem. ekspresi permukaan sel AT1R diatur oleh
internalisasi reseptor dan ini modulated oleh beberapa protein termasuk arrestins dan ATRAP
(4). regulator transkripsi gen AT1R termasuk glukokortikoid dan interleukin 1b (5).
Posttranscriptional Peraturan transkrip AT1R mRNA memiliki dibentuk untuk menjadi
mekanisme peraturan penting ekspresi AT1R oleh insulin, statin dan estrogen (6-11). Namun,
mekanisme molekuler dari mRNA berdasarkan regulasi ekspresi AT1R kurang dikenal.
kontrol posttranscriptional ekspresi gen eukariotik terdiri dari beberapa tingkatan peraturan
seperti pengolahan mRNA, ekspor, omset dan terjemahan. Setiap langkah regulasi
melibatkan berbagai kombinasi RNA-binding protein yang membentuk ribonucleoproteins
utusan dinamis. Kami menemukan bahwa transfer AT1R 30-UTR untuk gen reporter
mengarah ke bawah-regulasi reporter ekspresi gen oleh dua mekanisme: penghambatan
terjemahan dan penurunan stabilitas mRNA. Oleh karena itu, 30-UTR memiliki unsur-unsur
baik untuk pengaturan terjemahan dan omset mRNA. Dalam kebanyakan kasus transkrip
selektif regulasi transkripsi, kontrol translasi ditentukan dengan mengikat protein RNA
mengikat ke cis bertindak struktural elemen dalam mRNA. AT1R 30-UTR memiliki AU-
kaya unsur destabilisasi di bagian distal dari AT1R yang 30-UTR. Situs mengikat untuk
calreticulin dan AUF-1 terletak di ini daerah kaya AU (6,12). Calreticulin mengikat yang
sangat dilestarikan 20 basis terakhir dalam 30-end reseptor tikus AT1A 30-UTR dan
menengahi angiotensin II-induced down-regulasi tikus AT1R mRNA (6) sedangkan efek
AuF1 mengikat masih belum jelas, Namun, secara umum mendestabilkan mRNA (12,13).
Kita telah menemukan bahwa p100 mengatur stabilitas AT1R mRNA dan terjemahan (14).
Kami memfokuskan upaya kami untuk menjelaskan mekanisme molekuler dari AT1R 30
UTR dimediasi penindasan translasi. Gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) adalah
mRNA mengikat protein seluler yang menekan terjemahan mRNA virus dan pengaruh
stabilitas dari beberapa mRNA seluler (15-17). GAPDH multifungsi sebuah protein terkenal
karena glikolitik penting yang Fungsi (18-21) dan telah ditemukan untuk menampilkan
sejumlah fungsi independen yang tidak terkait dengan yang glikolitik fungsi. Ini termasuk
peran dalam apoptosis (22), mikrotubulus Organisasi (23) dan RNA-binding (17). Ini jelas
bagaimana fungsi nonglycolytic yang diatur tapi perubahan lokalisasi dan interaksi protein-
protein memiliki telah disarankan untuk memainkan peran (19). GAPDH terlibat dengan
hipoksia seluler dan respon oksidatif dan itu adalah down-diatur oleh stres oksidatif (24,25).
Untuk menggambarkan mekanisme molekuler dari AT1R regulasi mRNA, kami
menggunakan pemurnian afinitas dan massa spektrometri untuk mengisolasi dan mengenali
mRNA mengikat protein. Kami mengidentifikasi GAPDH sebagai AT1R mRNA mengikat
protein yang menekan AT1R terjemahan dan menemukan penindasan ini diatur oleh oksidatif
menekankan. Pada artikel ini kita menggambarkan penindasan translasi sebagai mekanisme
baru regulasi AT1R mRNA dan mengidentifikasi GAPDH sebagai mediator dari efek ini.

BAHAN DAN METODE

kultur sel, luciferase uji dan ekstraksi protein Koroner arteri pembuluh darah sel-sel otot
polos (VSMC) dibeli dari Lonza Bioscience dan berbudaya di pertumbuhan otot polos
menengah-2 dengan janin sapi 5% serum (FBS). sel HEK293 ditumbuhkan pada plastik
piring di DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS, ampisilin / streptomisin dan glutamin.
sel yang digunakan untuk 6-10 ayat-ayat sebelum penggantian dengan segar Saham bagian
awal. Konstruksi yang transiently transfected dalam sel HEK293 menggunakan standar
Fugene 6 protocol (Roche Diagnostics). alat peredam bunyi GAPDH dan negatif kontrol si
RNA (Ambion) transfected menggunakan Lipofectamine 2000 reagen (Invitrogen) sesuai
dengan instruksi pabrik. VSMC transfected seperti yang dijelaskan (26). Sel dipanen 24-72
jam setelah transfeksi dan kunang-kunang kegiatan luciferase diukur menggunakan Dual
Luciferase Assay System (Promega). Itu Kegiatan luciferase itu dinormalisasi untuk aktivitas
cotransfected renilla luciferase plasmid atau total protein konten. lysates protein disusun
menggunakan NE-PER kit (Pierce) dan lysates disiapkan sesuai untuk rekomendasi pabrikan.
konsentrasi protein ditentukan oleh Bradford assay (Bio-Rad). pengobatan H2O2 dilakukan
seperti yang dijelaskan (24).

KONSTRUKSI
Konstruksi yang digunakan telah dijelaskan sebelumnya (14).

mutagenesis acak
Genemorph II EZClone Domain Mutagenesis kit (Stratagen) digunakan untuk membuat
perpustakaan acak mutan. primer Mutagenesis dirancang untuk subjek yang 1-100 30-UTR
dari AT1R untuk mutagenesis acak. Sequencing dari sampel acak dari termutasi konstruksi
menegaskan bahwa jumlah substitusi nukleotida per cDNA berkisar dari dua hingga empat.
Dalam urutan untuk mencari mutan dengan diubah mRNA mapan tingkat 100 konstruksi
diuji. Lima klon menunjukkan menarik hasil baik meningkat atau menurun SteadyState
aktivitas luciferase.

Real - time PCR

Dalam RNA percobaan paruh, sel direndam di Media segar mengandung 1 mg / ml (0,8mM)
aktinomisin D (Tocris) untuk menghambat transkripsi dan diinkubasi pada 378C. Pada waktu
yang ditunjukkan, sel dipanen dan RNA seluler Total diisolasi dengan RNA Nucleospin kit II
(Macherey-Nagel). RNA diperlakukan dengan Dnase Saya (Ambion). CDNA pertama-untai
disintesis dengan Sistem Sintesis Superscript II First Strand untuk RT-PCR dan oligo (dT)
12-18 primer (Invitrogen). urutan primer digunakan untuk PCR amplifikasi luciferase,
GAPDH dan gen b-aktin telah dipublikasikan sebelumnya (27-29). AT1R oligos digunakan
adalah gcacaatgcttgtagccaaa (upstream) dan ccctatcggaagggttgaat (hilir). Setelah yang
pertama strand cDNA sintesis, pengenceran serial dibuat. Itu Reaksi PCR dilakukan dalam
alat LightCycler menggunakan LC Fast Start DNA MasterPLUS SYBR Hijau Kit (Roche
Diagnostics). Thermocycling untuk setiap reaksi dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik.
Suhu annealing yang 568C untuk luciferase, 598C untuk oligos GAPDH dan 608C untuk
oligos AT1R. Waktu perpanjangan dihitung dengan membagi ukuran amplikon dengan 25.
fluoresensi dipancarkan oleh SYBR Green saya diukur dalam setiap siklus di akhir dari
langkah elongasi. Maksimum turunan kedua Metode yang digunakan untuk menentukan nilai
crossing-point. Konsentrasi sampel tidak diketahui kemudian dihitung dengan menetapkan
titik persimpangan mereka untuk standar melengkung. Untuk normalisasi tingkat ekspresi,
yang ekspresi GAPDH atau b-aktin diukur. Itu Tingkat ekspresi relatif diperoleh dengan
membagi nilai untuk gen yang diinginkan dengan GAPDH atau nilai b-aktin. Selain
informasi kurva leleh diperoleh dari LightCycler, produk PCR dijalankan di 1,5% gel agarosa
elektroforesis untuk memastikan bahwa hanya produk yang tepat berukuran diamplifikasi.

persiapan RNA Probe

cDNA digunakan sebagai template untuk reaksi PCR dimana T7 RNA polimerase promotor
urutan ditambahkan ke 50-akhir semua fragmen. transkrip RNA yang disintesis dari template
PCR yang dihasilkan termasuk konstruksi berikut: 1-100, 1-300, 1-600, 1-847 sebagai serta
100-300, 300-600 dan 600-887 (Megascript, Ambion), Tabel 1. Dalam in vitro reaksi
transkripsi, kami menggunakan rasio biotin-UTP untuk UTP standar 1: 3. RNA probe dengan
atau tanpa label biotin yang dihasilkan oleh kit shortscript MEGA menurut produsen instruksi
(Ambion). Protokol telah dijelaskan secara rinci (14).

RNA pemurnian afinitas

pemurnian RNA afinitas dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (14).

Spektrometri massa
Perak bernoda pita protein bunga dipotong dari yang poliakrilamida gel dan 'di-gel' dicerna
dasarnya seperti yang dijelaskan oleh Shevchenko dkk. (30). protein yang dikurangi dengan
DTT dan teralkilasi dengan Iodoacetamide sebelum pencernaan dengan tripsin (Sequencing
kelas Dimodifikasi Trypsin, V5111, Promega). peptida pulih yang, setelah desalting
menggunakan Millipore C18 ZipTipTM, mengalami matriks-dibantu laser yang desorpsi /
ionizationtime terbang (MALDI-TOF) analisis spektrometri massa. MALDI-TOF spektrum
massa untuk sidik jari massa dan MALDI-TOF / TOF spektrum massa untuk identifikasi oleh
analisis ion fragmen diperoleh menggunakan Ultraflex TOF / TOF instrumen (Bruker-
Daltonik GmbH, Bremen, Jerman). identifikasi protein dengan yang dihasilkan data
dilakukan dengan menggunakan Mascot? Peptida Mass Sidik Jari dan MS / MS Ion Cari
program (http: // www.matrixscience.com).
Western blotting
Western blotting dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (14).

Analisis RNA electromobility pergeseran (REMSA)

Ramses dilakukan dengan probe terbiotinilasi dan dimurnikan protein GAPDH manusia
(Sigma). Secara singkat, 150 GAPDH ng diinkubasi dengan? 10 fmol dari 30-UTR

Tabel 1. Primer yang digunakan dalam generasi produk PCR yang berfungsi sebagai
template dalam transkripsi in vitro (penomoran dimulai dari awal 30-UTR)
AT1R 30-UTR akal primer (nomor menunjukkan nukleotida pertama dari 30-UTR
termasuk dalam oligo yang)
1 TAATACGACTCACTATAGGG catgttc gaaacctgtc cataaagtaa ttttgtgaaa
gaagg
100 TAATACGACTCACTATAGGG gaattga gcattatgtgg aggagaaaat

300 TAATACGACTCACTATAGGG agcctgc ttttgtcctg ttatttttta tttccacata aagg

600 TAATACGACTCACTATAGGG gtataat ggtgttacta aagtcacata taaaagttaa ac

AT1R 30-UTR antisense primer (nomor menunjukkan nukleotida terakhir termasuk
dalam oligo yang)

100 ctgaaaagta gctaatgctc atttggtagt gaag

300 cagtaaaatt tctcaaatca acacattcat cgagtttc

600 attgttttgg cagtgtaaac ctataagaca caggttg

847 tataactttg ccagatttta atcaattaac AGC

887 tgcaataaaattattttattttaaagtaaatataactttgcc

Control (bagian dari wilayah luciferase coding)

S TAATACGACTCACTATAGGG gcgccattctatccgctggaagatggaacc
AS Cgcccaacaccggcataaagaattgaagag
probe 5mm Hepes (pH 7,9), 7.5mm KCl, 0.5mm MgCl2, 0.1mm EDTA, 0.5mm DTT, 0,1 mg
/ ml ragi tRNA, 0,1 mg / ml BSA selama 30 menit di atas es. Dalam kontrol eksperimen,
kelebihan 100 kali lipat dari pesaing berlabel probe digunakan. Delapan persen gliserol
ditambahkan ke campuran dan sampel dipisahkan oleh 6% HALAMAN asli dengan 0,5? Tris
borat-EDTA (TBE) berjalan penyangga. REMSA dilakukan seperti yang dijelaskan
sebelumnya (14).

Protein immunoprecipitation (IP)

Uji ini dilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan (31). Dalam pengujian ini, GAPDH
itu immunoprecipitated dari a 30mg lisat sitoplasma dibuat dari HEK293 sel dengan
menggunakan 1 mg poliklonal antibodi anti-GAPDH atau 1 mg monoklonal anti
siklooksigenase 2 (Cox-2) antibodi. Sampel diklarifikasi terlebih dahulu dengan protein G-
sepharosa manik-manik (Sepharose, Pharmacia Biotech), GAPDH itu immunoprecipitated,
protein G-agarosa manik-manik ditambahkan untuk mengikat dengan antibodi, dan ekstensif
dicuci dengan 100 mM KCl, 5mm MgCl2, 10mm HEPES, pH 7,0, 0,5% NP-40, 1mM DTT
dan 100 U / ml RNasin RNAse inhibitor serta 2mm vanadyl ribonucleoside kompleks solusi
dan protease dan fosfatase inhibitor koktail. Protein dicerna dengan 0,1% SDS dan 30 mg
proteinase K diikuti oleh ekstraksi RNA dengan fenol-kloroform-isoamil alkohol campuran.
RNA diendapkan dengan 10 mg tRNA ragi sebagai pembawa. transkripsi terbalik dari
immunoprecipitated materi dilakukan dengan oligos poli-T dan PCR dengan primer
menargetkan coding wilayah AT1R mRNA untuk 29 siklus (seperti yang dijelaskan dalam
kuantitatif PCR bagian). Produk dipisahkan pada agarose 2% gel memproduksi sebuah band
di 163 bp.

ekspresi profiling
Atau, RNA immunoprecipitated digunakan untuk Ekspresi profiling. Terbiotinilasi Crna
disiapkan, dimurnikan dan terfragmentasi menurut protokol Affymetrix (Expression Analisis
Teknis Manual, Affymetrix). Human Genome U133 Plus 2.0 seluruh genom manusia
ekspresi Array. GeneChips dicuci dan bernoda di Fluidics Station Affymetrix 400 dan
dipindai menggunakan yang Affymetrix GeneChip Scanner 3000. Citra Data dianalisis
dengan microarray Suite versi 5.0. (MAS5) menggunakan Affymetrix pengaturan analisis
standar dan global skala sebagai metode normalisasi.
analisis komputasi
data microarray dianalisis menggunakan R (32) dan Bioconductor (33). Pertama, probe
dipetakan untuk menyelidiki set mewakili ID transkrip Ensembl dengan adat Probe set
definisi (34) dan kemudian dinormalisasi dengan Metode RMA kuantil normalisasi (35).
Transkrip diperintahkan sesuai dengan nilai ekspresi mereka untuk mencari target GAPDH
diduga paling kuat diperkaya. Urutan 30-UTR yang diambil untuk transkrip bila tersedia dari
database Ensembl (36). Itu kumpulan data pelatihan dari mana motif berasal adalah dibangun
sebagai berikut. Pertama, kami menggunakan hanya urutan dengan panjang antara 50 dan 500
bp karena komputasi kompleksitas dengan urutan lagi. Kedua, jika Urutan adalah
subsequence sama atau parsial urutan lain itu dikeluarkan dari analisis karena hampir urutan
identik parah dapat bias motif menemukan proses. Dari urutan ini kami memilih n transkrip
memiliki nilai ekspresi tertinggi untuk pelatihan kumpulan data. CMFinder digunakan untuk
menurunkan motif dari urutan unaligned (37). Ukuran yang digunakan untuk pelatihan Data
set adalah 10, 20, 30, 50, 100, 150 dan 200. urutan 1-100 bp dari ATIR ditambahkan ke
pelatihan Data diatur untuk memandu proses motif temuan. Dari potensi motif mereka yang
melanda urutan ATIR dengan setidaknya skor sedikit 10 dipilih untuk analisa lebih lanjut.
Arti penting dari motif diduga diuji dengan menghitung rasio jumlah hits per kilobases antara
kumpulan data pelatihan dan data referensi. Data referensi ditetapkan termasuk semua
tersedia 30-UTR yang urutan dari transkrip pada microarray. Program Infernal
(http://infernal.janelia.org/) digunakan untuk pencarian memukul dengan setidaknya skor
sedikit 10 terhadap urutan set. Motif dengan rasio pengayaan tertinggi dianggap paling
menarik.

Ligan mengikat assay

AT1R mengikat diukur menggunakan sel subconfluent tumbuh di piring 24-baik. Uji ini
dilakukan sebagai dijelaskan sebelumnya (38).

Dalam terjemahan vitro

Dalam reaksi terjemahan vitro dilakukan dengan menggunakan flexi kelinci sistem retikulosit
lisat (Promega) seperti yang dijelaskan oleh produsen. Protein disintesis in vitro yang label
dengan terbiotinilasi lisin tRNA. manusia dimurnikan GAPDH dibeli dari Sigma dan 50 dan
150 ng ditambahkan ke reaksi terjemahan saat yang tepat. Hasil dievaluasi dengan uji
luciferase serta dengan blotting Barat. Dalam blot barat, dalam produk terjemahan vitro
terdeteksi menggunakan streptavidin- HRP menurut protokol pabrik
HASIL
AT1R 3'-UTR menurun ekspresi protein Untuk menguji hipotesis bahwa cis-acting elemen
dalam AT1R 30-UTR memiliki peran penting dalam posttranscriptional regulasi, kami
mengukur aktivitas luciferase dan tingkat mRNA di tidaknya AT1R 30-UTR. Konstruksi
yang terkandung luciferase urutan coding dengan atau tanpa AT1R 30-UTR urutan dan SV40
akhir poli (A) sinyal. The full-length AT1R 30-UTR berkurang aktivitas luciferase oleh 70
80% bila dibandingkan dengan 30-UTR-kurang membangun. Hasil Western blotting yang
mirip dengan kegiatan luciferase (data tidak ditampilkan). Kuantitatif PCR mengungkapkan
ekspresi RNA luciferase menjadi menurun 50% oleh AT1R 30-UTR. Kebalikan pelengkap
dari segmen AT1R 30-UTR kloning ke dalam vektor pGL3-Promotor hilir luciferase yang
coding region. Kegiatan luciferase membangun berkurang ini oleh 10% dari kontrol promotor
atau sekitar onesixth pengurangan disebabkan orientasi akal dari 30-UTR membangun
(Gambar 1A). Sebuah vektor pGL3 dibangun di mana gen luciferase digantikan oleh AT1R
coding region. Demikian pula untuk luciferase-AT1R 30-UTR fusion membangun, tingkat
mRNA lebih rendah dengan panjang penuh AT1R konstruk dibandingkan dengan AT1R
coding wilayah saja (Gambar 1B). Hasil ini menunjukkan bahwa 30-UTR mengatur baik
tingkat mRNA dan protein ekspresi. AT1R 30-UTR menurun mRNA paruh dan menekan
mRNA terjemahan. Untuk memahami mekanisme dari AT1R 30-UTR-dimediasi penurunan
protein ekspresi, mRNA paruh dan terjemahan dievaluasi. Dalam rangka untuk mempelajari
pengaruh 30-UTR pada mRNA stabilitas, transkripsi dihentikan oleh termasuk aktinomisin
D pada media. Setelah berbagai periode inkubasi reaksi diakhiri dan luciferase mRNA adalah
diekstrak dan dianalisa oleh PCR kuantitatif. Data ini menunjukkan bahwa 30-UTR
meningkatkan laju degradasi mRNA (Gambar 1C). Untuk menguji apakah AT1R 30-UTR
memiliki efek pada terjemahan, terjemahan vitro dilakukan di hadapan dan tidak adanya 30-
UTR. Luciferase aktivitas produk terjemahan diukur. Di Selain itu, produk terjemahan
dipisahkan oleh SDS- HALAMAN, electroblotted dan terjemahan berlabel biotin produk
yang terdeteksi oleh streptavidin-HRP. Ukuran dari band ini 60 kDa konsisten dengan
luciferase berat molekul. Hasil ini menunjukkan 60% penghambatan terjemahan luciferase
oleh AT1R 30-UTR (Gambar 1D). Berdasarkan percobaan ini, AT1R 30-UTR menurun
ekspresi reseptor oleh mendestabilisasi mRNA dan dengan menekan mRNA terjemahan.
AB
CD

Gambar 1. 30-UTR dari AT1R adalah regulator negatif ekspresi AT1R.

(A) Pengaruh AT1R 30-UTR pada aktivitas luciferase (bar putih). Tiga konstruksi yang
berbeda dipelajari: luciferase, luciferase dengan AT1R 30-UTR dan luciferase menyatu
dengan AT1R 30-UTR dalam orientasi terbalik. HEK293 sel transfected dengan luciferase
dan renilla plasmid luciferase. Sel-sel segaris dan diuji untuk kegiatan kunang-kunang dan
renilla luciferase. Untuk mengevaluasi tingkat mRNA, luciferase dan tingkat GAPDH mRNA
diukur dengan PCR kuantitatif. Dikoreksi nilai ekspresi luciferase mRNA dihitung dengan
membagi luciferase mRNA oleh GAPDH mRNA ekspresi (bar hitam). Nilai-nilai yang
dinormalisasi untuk kegiatan atau mRNA tingkat reporter luciferase kurang AT1R 30-UTR
untuk memperhitungkan efek dari 30-UTR. P <0,05 dibandingkan luciferase tanpa 30-UTR.
(B) Pengaruh 30-UTR pada AT1R mRNA dievaluasi. Kami membandingkan tingkat mRNA
dari AT1R coding daerah dengan atau tanpa 3'-UTR. AT1R dan GAPDH tingkat mRNA
ditentukan dengan PCR kuantitatif menggunakan AT1R coding oligos spesifik daerah.
Ekspresi AT1R dikoreksi oleh GAPDH ekspresi. Data dinormalkan aktivitas AT1R konstruk
kurang 30-UTR. Hasil mewakili berarti SD dari rata-rata tiga percobaan independen
dilakukan dalam rangkap tiga untuk masing-masing konstruk. P <0,05 dibandingkan AT1R
tanpa 30-UTR.
(C) Pengukuran tingkat degradasi mRNA luciferase. sel HEK293 yang secara sementara
transfected dengan luciferase konstruk dengan atau tanpa panjang penuh AT1R 30-UTR. Sel
transfected kemudian diperlakukan dengan aktinomisin D selama 5 menit, 10 menit, 15 menit
dan 30 menit. PCR kuantitatif dilakukan dengan luciferase dan GAPDH oligos spesifik dan
luciferase mRNA ekspresi itu dinormalisasi dengan GAPDH. Pengukuran mRNA untuk
masing-masing konstruk yang dinormalisasi untuk ekspresi konstruk pada waktu nol.
Hasilnya ditunjukkan sebagai fit linear. Hasil merupakan sarana rata-rata tiga independen
uji coba yang dilakukan sebagai rangkap tiga untuk masing-masing konstruk.
(D). Pengukuran tingkat terjemahan luciferase pada kelinci lysates retikulosit. In vitro
terjemahan dari konstruksi luciferase chimeric dengan dan tanpa 30-UTR dibandingkan. Dari
in vitro terjemahan campuran reaksi luciferase Kegiatan diukur (panel atas) dan analisis
western blot dilakukan (panel bawah). protein diterjemahkan terdeteksi dengan streptavidin-
HRP sistem deteksi P <0,05 dibandingkan luciferase tanpa 30-UTR.
GAPDH mengikat AT1R mRNA
Selanjutnya, kami berusaha untuk mengidentifikasi AT1R 30-UTR mRNA berinteraksi
protein yang akan memediasi 30-UTR tergantung efek. Kami diuji keberadaan seperti RNA-
binding protein dengan menggunakan pemurnian afinitas. Probe sesuai dengan 30-UTR
konstruksi 1-100, 1-300, 1-600 dan 1-847 basis disalin dan poli-A ekor dimasukkan sebagai
bagian dari primer yang digunakan dalam PCR-reaksi. Karena masalah di mentranskripsikan
full-length RNA membangun, yang polyadenylated terpanjang RNA transkrip digunakan
dalam pemurnian afinitas tidak termasuk 40 bp terakhir di 30-akhir 30-UTR. Skema
representasi dari probe dijelaskan pada Gambar 2A. Disintesis mRNA dengan poly-A yang
terikat ke poli-T manik-manik, diinkubasi dengan lysates sitoplasma diikuti dengan mencuci
luas. Gambar 2B adalah gel perak bernoda menunjukkan pola protein dari fraksi dielusi dari
AT1R 30-UTR mRNA. Band paling melimpah bermigrasi di? 36 kDa dan band ini hadir
dengan semua probe AT1R 30-UTR digunakan. Binding tidak terdeteksi dalam reaksi
menggunakan fragmen luciferase wilayah coding sebagai kontrol negatif. Protein itu
dipotong dari gel dan dicerna dalam gel 'oleh tripsin. peptida yang dihasilkan diekstraksi dan
sasaran analisis spektrometri massa. Database (MSDB) pencarian dengan gabungan MALDI-
TOF sidik jari massa peptida dan MALDITOF / TOF Data ion fragmen peptida diidentifikasi
(Mascot skor 238,0) protein sebagai GAPDH manusia. Manusia GAPDH adalah protein
dasar dan hasil dalam 36 tryptic peptida. Hanya delapan memiliki berat molekul antara 1000
dan 2500 Da. Lima dari peptida ini ditemukan di fingerprinting massa berhubungan dengan
suatu cakupan intensitas

Gambar 2. GAPDH berinteraksi dengan AT1R 30-UTR.

(A) Skema AT1R mRNA transkrip serta dihapus dan dipotong transkrip digunakan dalam
pemurnian afinitas dan pergeseran gel tes.
(B) Cari protein RNA-mengikat yang membentuk kompleks dengan AT1R 30-UTR. Rincian
pemurnian diberikan di bawah 'Bahan dan Metode' bagian. Lane 1: Luciferase Template
wilayah coding digunakan sebagai kontrol. Lanes 2-5: In vitro ditranskripsikan fragmen
dipotong dari AT1R 3'-UTR digunakan dalam pemurnian afinitas. berbeda-beda yang
menyatakan 36 protein kDa dipotong, dicerna, dan peptida yang dihasilkan diakui oleh
spektrometri massa.
(C) REMSA. Setelah reaksi mengikat, RNA terikat kelebihan dicerna. Di jalur 1A kontrol
terbiotinilasi penyelidikan dari luciferase coding daerah tanpa GAPDH digunakan. Lane 2
memiliki penyelidikan kontrol yang sama seperti jalur 1 tapi 150 ng protein GAPDH
dimurnikan ditambahkan. Jalur 3 telah terbiotinilasi 30-UTR 1-100 transkrip tanpa GAPDH,
jalur 4 memiliki 150 ng dari GAPDH dan jalur 5 memiliki kedua 150 ng dari GAPDH serta
kelebihan 100 kali lipat dari penyelidikan unlabelled termasuk dalam campuran mengikat.
(D) Pengikatan GAPDH endogen dengan endogen AT1R mRNA terdeteksi oleh RT-qPCR
assay dengan AT1R primer spesifik materi yang diperoleh IP dari fraksi sitoplasma. Dari
59,3%. Kedua peptida (1 762 795 dan 1 410 783 Da) sasaran analisis MALDI-TOF / TOF
juga secara individual diidentifikasi protein sebagai GAPDH manusia dengan Mascot MS /
MS Ion Cari Program skor 130 dan 94,70, masing-masing. Hasil pemurnian afinitas
dikonfirmasi oleh Western blot menggunakan antibodi GAPDH poliklonal (data tidak
ditampilkan). Sebagai probe terpanjang kami tidak memiliki 30-end basis 30-UTR,
calreticulin tidak dimurnikan dengan afinitas pemurnian. Kami amati pengikatan AUF-1
untuk AT1R 30-UTR konsisten dengan publikasi sebelumnya (data tidak ditampilkan) (12).

GAPDH mengikat AT1R endogen dan rekombinan mRNA

Kami pertama kali diuji apakah GAPDH mengikat langsung ke AT1R 30-UTR, REMSA
dilakukan dengan GAPDH dimurnikan protein. Untuk tujuan ini, transkrip mencakup 1-100
wilayah dari AT1R 30-UTR disintesis tetapi tidak ada poli-A ekor ditambahkan. Kontrol
transkrip ditranskrip dari luciferase coding daerah tidak menunjukkan pergeseran gel dengan
GAPDH. Sebaliknya, 1-100 fragmen AT1R 30-UTR mRNA menunjukkan pergeseran
dengan GAPDH yang berkompetisi dengan 100 kali lipat lebih dari penyelidikan berlabel.
pergeseran gel dengan dimurnikan protein konsisten dengan interaksi langsung (Gambar 2C).
REMSA dilakukan dengan protein murni memiliki dua band dan adalah mungkin bahwa
band atas adalah karena GAPDH dimer atau oligomer (41). Percobaan ini juga menunjukkan
yang polyadenylation dari transkrip tidak diperlukan untuk interaksi GAPDH dengan mRNA.
Kedua, ribonucleoprotein (RNP) IP dilakukan untuk mempelajari asosiasi dari GAPDH
dengan endogen AT1R mRNA. Itu pengayaan relatif AT1R mRNA dalam reaksi RNP IP
juga diuji oleh RT, diikuti oleh PCR konvensional amplifikasi dan kemudian divisualisasikan
pada gel agarosa. RNP tes IP mengungkapkan pengayaan kuat AT1R mRNA dengan
GAPDH dalam reaksi antibodi anti-GAPDH relatif itu reaksi IP kontrol (IgG dan cox-2)
(Gambar 2D). Hasil ini menunjukkan bahwa bentuk GAPDH RNP kompleks dengan endogen
AT1R mRNA. Ketiga, kami ingin mengidentifikasi AT1R 30-UTR daerah mRNA terlibat
dalam bergaul dengan GAPDH. Untuk tujuan ini, beberapa transkrip polyadenylated
mencakup mRNA yang berbeda daerah disintesis. Berikut in vitro mengikat tes dengan lisat
sel, interaksi antara transkrip dan ekstrak sitosol dinilai dengan afinitas pemurnian diikuti
oleh blotting Barat. observasi ini didukung skema mengikat AT1R 30-UTR dimana GAPDH
terkait istimewa dengan proksimal 100 bp dari 30-UTR (Gambar 2E). untuk menentukan
situs GAPDH mengikat secara lebih rinci, kami melakukan mutagenesis acak 1-100 wilayah
panjang penuh AT1R 30-UTR. mutagenesis berbasis PCR digunakan untuk memperkenalkan
rata-rata 2-4 mutasi di setiap klon. Kami mengisolasi klon di mana residu 9 dan 11 (Dihitung
dari awal 30-UTR) dihapus memiliki peningkatan 4 kali lipat luciferase (data tidak
ditampilkan). Kami berhipotesis bahwa ini akan terjadi karena hilangnya GAPDH mengikat
ke 30-UTR. Dalam sebuah in vitro mengikat assay GAPDH mengikat berkurang konsisten
dengan gagasan bahwa peningkatan ekspresi mutan Del 9/11 adalah dimediasi oleh hilangnya
penekanan terjemahan GAPDH-dimediasi, Gambar 2F. Hilangnya interaksi dengan
penghapusan residu 9 dan 11 dalam panjang penuh AT1R 30-UTR dikonfirmasi oleh
pergeseran gel, Gambar 2G. Menariknya, REMSA dilakukan dengan HEK293 protein
sitoplasma lisat hanya memiliki satu band yang bukan dua dilihat dengan GAPDH
dimurnikan (Gambar 2C). GAPDH murni mungkin memiliki dengan tidak adanya
kecenderungan mitra protein lain yang lebih tinggi untuk membentuk dimer protein.
Bersama-sama, temuan ini mengindikasikan yang GAPDH khusus mengikat AT1R mRNA,
baik endogen dan in vitro ditranskrip, dan bahwa mengikat terjadi di 1-100 wilayah AT1R
30-UTR.

Urutan dan struktur diprediksi motif GAPDH-mengikat

Sebuah koleksi mRNA yang target GAPDH adalah diidentifikasi. GAPDH itu
immunoprecipitated dari HEK293 dan mRNA terikat itu exctracted dan membalikkan
ditranskrip, dan produk yang dihasilkan adalah hibridisasi untuk array Affymetrix. IgG
digunakan sebagai kontrol dan jumlah mRNA immunoprecipitated bawah Kondisi kami
sangat rendah. transkrip yang sesuai 6% dari semua gen pada array secara substansial
diperkaya di GAPDH IP dibandingkan dengan IgG IP. RNA urutan menjadi sasaran analisis
komputasi (seperti dijelaskan dalam 'Bahan dan Metode' bagian) untuk mengidentifikasi
GAPDH motif berdasarkan struktur sekunder. Itu urutan keselarasan motif representasi relatif
frekuensi nukleotida pada setiap posisi dan contoh dari struktur sekunder GAPDH diduga ini
motif diperlihatkan pada Gambar 3A dan B. Analisis ini mengungkapkan motif kaya AU.
Frekuensi GAPDH motif dalam database adalah 0,08 hits / kb yang mirip dengan yang Hur
(39). Struktur sekunder perwakilan mRNA dengan motif GAPDH mengikat serta del 11/09
membangun disajikan pada Gambar 3C. hasil kami menunjukkan bahwa GAPDH motif
tampaknya lokal sebagian besar untuk 30-UTR, adalah mungkin bahwa di beberapa transkrip
motif GAPDH terlokalisir di wilayah coding.

Gambar 3. Urutan dan struktur motif GAPDH diprediksi, seperti yang diidentifikasi antara
transkrip GAPDH-terikat.

(A) Probabilitas matriks (grafis logo) dari motif GAPDH menunjukkan frekuensi relatif
menemukan setiap residu pada setiap posisi dalam motif, seperti dijelaskan dari arrayderived
yang Data eksperimental set.

(B) penyelarasan Struktur dari empat contoh GAPDH motif di mRNA spesifik.

(C) struktur sekunder dari empat contoh wakil dari motif GAPDH di mRNA spesifik. RPL14,
ribosom protein L14; PABP1, poli (A) -binding protein 1; PABP3, poli (A) -binding protein
3; AT1R, angiotensin II tipe 1 reseptor. Selanjutnya, del 9/11 dari AT1R 30-UTR
ditampilkan.

Perlu dicatat bahwa beberapa mRNA GAPDH diidentifikasi pada array tampaknya tidak
mengandung motif dijelaskan dalam penelitian ini menunjukkan motif lain mungkin juga
eksis yang tidak diidentifikasi dalam analisis ini

GAPDH membungkam meningkatkan ekspresi AT1R

Untuk menilai signifikansi fungsional GAPDH-AT1R 30-UTR interaksi, tingkat GAPDH

berkurang interferensi RNA. GAPDH down-regulasi telah sangat pengaruh yang kecil (non
signifikan) pada aktivitas luciferase sebuah membangun kurang situs GAPDH mengikat. Di
luciferase yang membangun dengan GAPDH mengikat situs, membungkam GAPDH
menyebabkan peningkatan 2,5 kali lipat dalam aktivitas luciferase saat dibandingkan dengan
kontrol (Gambar 4A, panel atas). Kapan GAPDH tidak mengikat AT1R 30-UTR (tidak ada
30-UTR dan del 9/11 konstruksi), penurunan ekspresi GAPDH tidak mengubah aktivitas
luciferase. Hasil ini menunjukkan bahwa adenines di posisi 9 dan 11 dari 30-UTR sangat
penting untuk GAPDH mengikat dan untuk efek fungsional GAPDH. Peningkatan aktivitas
luciferase ini bisa berpotensi dimediasi oleh stabilisasi mRNA atau dengan lega penekanan
translasi pada GAPDH pembungkaman. Dalam rangka untuk mengevaluasi mekanisme
molekuler efek GAPDH-dimediasi, kami mengukur RNAresponse yang untuk GAPDH
membungkam. Untuk mengendalikan siRNA membungkam efisiensi, kami mengukur
ekspresi GAPDH di sampel dan diamati penurunan 8 kali lipat dalam GAPDH mRNA
dibandingkan dengan kontrol (data tidak ditampilkan). Sebaliknya ke tingkat protein,
GAPDH membungkam sederhana penurunan mRNA dari luciferase menyatu dengan AT1R
30-UTR, yang diukur dengan PCR kuantitatif (Gambar 4A, panel yang lebih rendah). Hal ini
menunjukkan bahwa efek dominan dari GAPDH pada ekspresi protein tidak dimediasi oleh
perubahan dalam pembusukan mRNA melainkan ada kemungkinan bahwa GAPDH
menghambat terjemahan AT1R dengan mengikat nya 30-UTR. Untuk menguji secara
langsung peran penerjemahan sebagai molekul mekanisme penurunan GAPDH diinduksi
dalam ekspresi AT1R, kami melakukan dalam terjemahan vitro. Untuk menguji lebih lanjut
mekanisme molekuler efek GAPDH, luciferase membangun dengan dan tanpa AT1R 30-
UTR adalah in vitro diterjemahkan. Reaksi terjemahan dilakukan dengan adanya berbagai
konsentrasi dimurnikan GAPDH. Produk yang dihasilkan diukur untuk luciferase kegiatan
serta dipisahkan pada gel SDS-PAGE dan dideteksi dengan streptavidin-HRP. Sesuai dengan
Efek membungkam GAPDH pada ekspresi protein, sintesis protein menghambat GAPDH
dari konstruk luciferase dengan AT1R 30-UTR dalam konsentrasi bergantung cara (Gambar
4B). Hanya ada perubahan kecil di luciferase terjemahan dalam ketiadaan 30-UTR
menunjukkan

Gambar 4. Pengaruh RNAi-dimediasi GAPDH knockdown pada ekspresi AT1R. sel HEK293
yang cotransfected dengan vektor luciferase dan dengan 30nm gen spesifik GAPDH siRNA
(bar hitam) atau jumlah yang sama dari kontrol siRNA (bar putih).
(A) panel atas: kegiatan Luciferase dari luciferase wilayah coding saja atau menyatu dengan
panjang penuh AT1R 30-UTR atau bermutasi full-length 30-UTR del 9/11. Pengukuran
luminometer untuk ini dan percobaan berikutnya dinyatakan sebagai kali lipat dari kontrol
promoter tanpa 30-UTR dalam satuan cahaya relatif luciferase kunang-kunang. Hasil
mewakili berarti SD dari rata-rata tiga percobaan independen dilakukan sebagai rangkap tiga
untuk masing-masing konstruk. b-Tubulin diukur untuk mengendalikan pemuatan protein. P
<0,05 dibandingkan sel siControl-diobati. panel bawah: Luciferase mRNA dihitung dengan
PCR kuantitatif. Semua hasilnya dinormalisasi untuk ekspresi b-aktin. P <0,05 dibandingkan
sel siControl transfected.
(B) GAPDH menekan AT1R terjemahan 30-UTR. Transkrip yang sama seperti pada Gambar
1 yang digunakan. meningkatnya jumlah GAPDH ditambahkan ke dalam campuran reaksi
(putih bar 0 ng, bar hitam 50 ng dan bar abu-abu 150 ng). Produk diterjemahkan dievaluasi
dengan dua metode. Pertama, aktivitas luciferase dari campuran terjemahan diukur (panel
atas). Kedua, lisat dipisahkan pada SDS-PAGE gel, dihapuskan dan terdeteksi pada membran
dengan streptavidin-HRP (panel bawah). Percobaan dengan dan tanpa AT1R 30-UTR
mewakili eksposur berbeda dan perbedaan karena dasar antara dua konstruksi ini tidak dapat
dibandingkan. Hasil mewakili berarti SD dari rata-rata tiga percobaan independen. P <0,05
dibandingkan reaksi kontrol tanpa GAPDH. bahwa efek GAPDH dimediasi oleh AT1R 30-
UTR. Pencantuman BSA sebagai protein kontrol tidak punya efek pada terjemahan (data
tidak ditampilkan). Hasil ini mendukung pandangan bahwa fungsi GAPDH sebagai translasi
suatu represor dari AT1R.

GAPDH membungkam meningkatkan ekspresi endogen AT1R

Untuk menguji pentingnya GAPDH pada ekspresi AT1R endogen di VSMC arteri koroner,
kami dibungkam ekspresi GAPDH. Untuk mengendalikan siRNA membungkam efisiensi,
kami mengukur ekspresi GAPDH dalam sampel dan mengamati penurunan 8 kali lipat dalam
GAPDH mRNA sebagai dibandingkan dengan kontrol (data tidak ditampilkan). Seperti
ditunjukkan dalam Gambar 5A (panel atas), penggunaan siRNA penargetan GAPDH
peningkatan ekspresi protein AT1R yang diukur oleh ligan mengikat dan dengan demikian
GAPDH efek fungsional sejenis di sel HEK293 dan VSMC arteri koroner. tingkat protein
GAPDH secara signifikan menurun 72 jam setelah transfeksi dari siRNA GAPDH
penargetan. Demikian pula untuk sel HEK293, siGAPDH sederhana menurun AT1R 30-UTR
mRNA di VSMC arteri koroner, seperti diukur dengan analisis PCR kuantitatif (Gambar 5A,
panel yang lebih rendah). GAPDH menstabilkan AT1R mRNA dalam cara yang sama seperti
yang telah dijelaskan untuk mempengaruhi beberapa mRNA lain (15). Kami menguji apakah
peningkatan AT1R ekspresi akan menyebabkan peningkatan MAPK fosforilasi oleh
angiotensin II di arteri koroner VSMC. AT1R stimulasi oleh angiotensin II menyebabkan
ERK fosforilasi. sel GAPDH-dibungkam menunjukkan fosforilasi kuat ERK MAPKs dalam
menanggapi angiotensin II, Gambar 5B. Hasil ini melibatkan GAPDH dalam peraturan
ekspresi AT1R.
GAPDH memediasi efek ofH2O2 di AT1R

Paparan dari VSMC arteri koroner untuk hidrogen peroksida menyebabkan down-regulasi
tergantung dosis dari GAPDH sementara itu peningkatan ekspresi AT1R (24,25), Gambar
6A. Beberapa bukti mendukung peran GAPDH dalam regulasi H2O2 diinduksi AT1R.
pemurnian afinitas assay menunjukkan bahwa H2O2-pengobatan sel lysates berkurang
GAPDH mengikat kedua full-length AT1R 30-UTR dan 1-100 dari 30-UTR, Gambar 6B. Di
Gambar 6B kita melihat penurunan yang lebih kecil dengan H2O2 di fulllength 30-UTR
ekspresi (dari? 1,5 sampai 2 kali lipat) sedangkan dengan 1-100 ada pengurangan lebih besar.
Panjang penuh AT1R 30-UTR dapat dikenakan menangkal tambahan mekanisme pengaturan.
Berbeda dengan sel utuh, tingkat protein GAPDH tidak berubah di lisat sel terkena H2O2.
Pada Gambar 6C, REMSA dilakukan dengan lysates H2O2-diperlakukan menunjukkan
penurunan GAPDH mengikat 30-UTR dari AT1R dalam H2O2-konsentrasi

Gambar 5. Peran GAPDH dalam regulasi AT1R endogen.

(A) panel atas: Pengaruh GAPDH pembungkaman ekspresi AT1R pada awal Bagian (3-5)
VSMC arteri koroner. VSMC transfected dengan 30nm GAPDH siRNA atau jumlah yang
sama dari kontrol siRNA. ekspresi AT1R dihitung dengan ligan mengikat. The blot western
bawah ini menunjukkan efek GAPDH siRNA pada ekspresi GAPDH. panel bawah: AT1R
mRNA dihitung dengan RT-qPCR. Semua hasilnya dinormalisasi untuk ekspresi b-aktin.P
<0,05 dibandingkan sel siControl transfected.

(B) Aktivasi ERK MAPKs di VSMC arteri koroner manusia dengan angiotensin II. VSMC
arteri koroner yang transfected baik dengan siGAPDH atau mengendalikan siRNA. Sel-sel ini
serum kelaparan selama 24 jam sebelum stimulasi oleh 10 7M angiotensin II. Sel flash beku
pada waktu yang tepat poin, protein diekstraksi dan hasil dianalisis dengan western blotting
menggunakan antibodi anti-phospho-ERK, antibodi GAPDH, dan antibodi b-tubulin cara
bergantung. Dengan demikian, penurunan GAPDH mengikat untuk AT1R 30-UTR tidak
sepenuhnya karena berkurangnya Ekspresi GAPDH tetapi juga karena penurunan GAPDH
mengikat afinitas. Untuk menentukan apakah GAPDH interaksi dengan 30-UTR adalah
diperlukan untuk peningkatan H2O2-induced dalam ekspresi AT1R, kami menguji efek dari
menghapus GAPDH mengikat situs pada gen reporter. sel HEK293 transfected dengan
luciferase membangun baik dengan atau tanpa AT1R 30-UTR. Demikian pula untuk AT1R
endogen, pengobatan H2O2 menurun luciferase-AT1R aktivitas 30-UTR. Penghapusan
GAPDH-mengikat situs dalam 30-UTR menyebabkan dilemahkan Menanggapi hidrogen
peroksida (Gambar 6D). Kami transiently transfected GAPDH untuk membalikkan H2O2-
induced penurunan ekspresi GAPDH dan memang menemukan bahwa GAPDH berlebih
dilemahkan tanggapan ini. Diambil bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa penurunan
GAPDH mengikat AT1R 30-UTR dalam menanggapi H2O2 meningkat ekspresi AT1R.

DISKUSI
Kami menemukan bahwa GAPDH terikat AT1R mRNA dan terpengaruh terjemahannya,
bahwa pengobatan H2O2 menurun (GAPDH-AT1 mRNA) kompleks. GAPDH adalah
berlimpah protein yang terletak terutama tetapi tidak secara eksklusif dalam sitoplasma sel.
Hal ini penting untuk glikolisis, tetapi bukti terbaru menunjukkan mungkin memiliki
beberapa fungsi sel penting lainnya. GAPDH mengikat RNA melalui wilayah NAD-
mengikat, bagaimanapun, tidak banyak yang diketahui tentang urutan spesifisitas GAPDH
mengikat (17). Data kami menunjukkan bahwa efek GAPDH pada AT1R ekspresi diatur oleh
cis-elemen di AT1R mRNA dan dimediasi oleh interaksi GAPDH-mRNA langsung.
pergeseran gel menunjukkan bahwa interaksi GAPDH dengan AT1R 30-UTR adalah
langsung dan membutuhkan tidak Mirna atau protein lain. GAPDH mengikat tertentu
berdasarkan kompetisi eksperimen dalam pergeseran gel serta penghapusan dan analisis
mutagenesis persyaratan urutan untuk GAPDH mengikat dalam 30-UTR. Penghapusan basis
di 9 dan 11 menyebabkan hilangnya GAPDH mengikat AT1R 30-UTR. Meskipun tampaknya
ada banyak fleksibilitas dalam protein situs mengikat RNA-mengikat, mutasi tunggal telah
terbukti menurunkan protein mengikat mRNA (40). Sangat mungkin bahwa suatu perubahan
di sekunder struktur AT1R oleh dua penghapusan Menghapus basa tunggal elemen struktur
penting dari situs GAPDH mengikat. Ekspresi AT1R dimodulasi oleh tingkat GAPDH
mengikat AT1R mRNA. Dalam sebuah in vitro assay GAPDH dosis dependen menghambat
terjemahan AT1R. Penghapusan situs GAPDH mengikat dari 30-UTR meningkatkan reporter
aktivitas gen konsisten dengan hilangnya GAPDH-dimediasi

Gambar 6. (A) Pengaruh H2O2 pada ekspresi AT1R di arteri koroner manusia VSMC.
VSMC tersebut terkena berbagai konsentrasi H2O2 selama 15 jam. Blot Western diperiksa
dengan antibodi yang sesuai.
(B) GAPDH mengikat AT1R 30-UTR dievaluasi dengan pemurnian afinitas menggunakan
30-UTR 0-847 sebagai probe (sama seperti pada Gambar 2B dan E) dan blotting barat protein
diisolasi oleh antibodi GAPDH. ekspresi GAPDH dievaluasi secara total lysates selular yang
dibuat dari sel HEK293 terkena 150 mM H2O2 selama 15 jam (panel bawah, kanan). b-
Tubulin diukur untuk kontrol untuk memuat protein.
(C) pengobatan H2O2 mengurangi GAPDH mengikat AT1R. Paparan dari lisat protein untuk
H2O2 tidak mempengaruhi protein tingkat tetapi menurun GAPDH mengikat 30-UTR secara
dosis-tergantung. sisi kiri REMSA memiliki kontrol blot (jalur 1-2) dan kanan pihak
memiliki percobaan (jalur 3-5) di mana protein lisat terkena H2O2 selama 1 jam.
(D) GAPDH memediasi efek H2O2-induced pada Peraturan posttranscriptional dari AT1R.
Konstruksi luciferase yang sama seperti pada Gambar 4A digunakan. sel HEK293 transfected
dengan baik bgalactosidase (Kiri panel) atau vektor ekspresi GAPDH (panel kanan) bersama-
sama dengan konstruksi luciferase dengan (30-UTR, 1-100) atau tanpa GAPDH mengikat
situs (ada 30-UTR, 1-100 del 9/11). Sel terkena 150 mM H2O2 selama 15 jam (bar hitam)
atau kendaraan (bar putih), segaris dan diuji untuk kegiatan luciferase. Nilai-nilai yang
dinormalisasi untuk aktivitas yang tidak diobati luciferase konstruksi. Hasil mewakili berarti
SD dari rata-rata tiga percobaan independen dilakukan dalam rangkap tiga untuk masing-
masing konstruk. P <0,05 dibandingkan AT1R tanpa 30-UTR.

penekanan terjemahan. Efek yang sama dicapai dengan mengurangi ekspresi GAPDH.
GAPDH membungkam berkurang GAPDH mengikat AT1R mRNA dan meningkatkan
AT1R ekspresi. Pembalikan terjemahan GAPDH-dimediasi penghambatan oleh penghapusan
situs GAPDH mengikat dalam waktu 30-UTR, lebih jauh berpendapat untuk kekhususan
indah interaksi GAPDH dengan yang ditetapkan 30-UTR urutan dari AT1R mRNA
menyebabkan penghambatan terjemahan.
GAPDH membungkam dan 30-UTR mutasi del 9/11 peningkatan AT1R ekspresi dengan
mengurangi GAPDH mengikat 30-UTR, sehingga memberikan argumen yang kuat untuk
hubungan langsung antara GAPDH dan ekspresi AT1R. Seperti yang ditunjukkan dalam
laporan ini, pengobatan H2O2 menurun GAPDH mengikat AT1R mRNA, sehingga
meningkatkan ekspresi AT1R. Dengan demikian, hilangnya GAPDH mengikat Situs dalam
30-UTR mengakibatkan hilangnya respon H2O2, sementara berlebih dari GAPDH
dilemahkan H2O2 tanggapan. Demikian pula untuk percobaan GAPDH pembungkaman,
penurunan ekspresi GAPDH oleh stres oksidatif yang dipimpin penurunan GAPDH mengikat
AT1R mRNA. Ini tampaknya karena berkurangnya ekspresi GAPDH dan mengubah struktur
GAPDH akibat stres oksidatif (41).Stres oksidatif elemen responsif dan GAPDH mengikat
situs yang sama dengan 30-UTR mutan kurang baik GAPDH mengikat dan stres oksidatif-
respon, menyediakan argumen lebih lanjut untuk hubungan antara GAPDH dan regulasi
AT1R. Penurunan GAPDH mengikat AT1R 30-UTR oleh RNA, menghapus GAPDH
mengikat situs, atau oleh stres oksidatif menyebabkan peningkatan ekspresi AT1R
memberikan argumen yang kuat untuk peran GAPDH dalam kontrol posttranscriptional
dari AT1R. Selain stres oksidatif, GAPDH mungkin mengatur ekspresi basal AT1R.
Menariknya, ada perbedaan 15 kali lipat dalam GAPDH mRNA di dasar Ekspresi antara
jaringan tertinggi dan terendah mengungkapkan (42). Dengan demikian, tingkat
transcriptspecific GAPDH diinduksi penindasan translasi AT1R bervariasi dari jaringan ke
jaringan. penindasan translasi transkrip khusus telah dijelaskan untuk berbagai transkrip
termasuk reseptor b-adrenergik (43), cox-2 (44) dan tumor necrosis factor a (45), misalnya.
Meskipun ada beberapa protein yang menghambat terjemahan dengan mengikat 30-UTR
termasuk TIA-1 dan Ago1, mekanisme molekuler inhibisi terjemahan oleh 30-UTR-protein
pengikat masih belum jelas. analisis komputasi mRNA GAPDH mengikat menyebabkan
Penjelasan AU kaya motif hadir di GAPDH mRNA sasaran. GAPDH mengikat motif yang
ditemukan di AT1R mRNA juga dapat ditemukan di? 3% dari transkrip menunjukkan bahwa
ia memiliki peran yang lebih umum dalam mRNA seluler peraturan. Dua RPBS baik
ditandai, Hur dan Tiar, memiliki mRNA target jumlah besar dan itu bisa bahwa RBP punya
target spesifisitas yang cukup luas (39,40). Tergantung pada target mRNA, GAPDH baik
Menagatur stabilitas mRNA atau terjemahan (46). Tampaknya menjadi umum untuk RPBS
memiliki mRNA tergantung fungsional efek. Dalam banyak kasus, yang sama protein RNA-
binding menengahi kedua destabilisasi RNA dan translasi membungkam (47,48). Sebuah
baik ditandai The Embrio Lethal Visi Abnormal (ELAV) -seperti protein Hur mengatur
kestabilan mRNA dan terjemahan dari mRNA ia mengikat. Singkatnya, kami
mengidentifikasi AT1R manusia 30-UTR sebagai regulator negatif ampuh ekspresi mRNA
melalui penghambatan terjemahan dan destabilisasi mRNA. Peraturan posttranscriptional dari
AT1R adalah interaksi yang rumit regulator positif seperti p100 (14) dan negatif regulator
seperti GAPDH, calreticulin (6) dan AuF1 (12). penindasan translasi AT1R mRNA dengan
mengkonversi ke bentuk diterjemahkan atau kurang diterjemahkan oleh interaksi dengan
GAPDH mengurangi AT1R mRNA terjemahan. Kemampuan untuk mengatur ekspresi AT1R
oleh efisiensi terjemahan mengubah akan menjadi cepat dan cara yang efisien untuk
mengendalikan ekspresi reseptor, terutama dalam respon terhadap stres oksidatif pada ginjal,
pembuluh darah dan jantung.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada Ms Susanna Tverin, Ms Saara Nyqvist, Ms Tuula Soppela dan
Gunilla Ronnholm untuk terampil teknis bantuan.

PENDANAAN
Finlandia Academy, Yayasan Finlandia untuk Kardiovaskular Research, Sigrid Juselius
Yayasan (Untuk K.K dan J.L.), Finlandia Medis Foundation dan Yayasan Penelitian
Instrumentarium (untuk J.L.).Pendanaan untuk biaya akses terbuka: Finlandia Jantung
Dasar. Konflik pernyataan bunga. Tak satu pun diumumkan.

REFERENSI
1. Dzau, V. (2005) The kardiovaskular kontinum dan renin-angiotensin aldosteron blokade. J.
Hypertens. Suppl., 23, S9-S17.
2. Horiuchi, M., Akishita, M. dan Dzau, V.J. (1999) kemajuan terbaru di angiotensin II tipe 2
penelitian reseptor di sistem kardiovaskular. Hipertensi, 33, 613-621.
3. Lehtonen, J.Y., Daviet, L., Nahmias, C., Horiuchi, M. dan Dzau, V.J.(1999) Analisis
domain fungsional angiotensin II tipe 2 reseptor yang terlibat dalam apoptosis. Mol.
Endocrinol., 13, 1051-1060.
4. Daviet, L., Lehtonen, J.Y., Tamura, K., Griese, D.P., Horiuchi, M. dan Dzau, V.J. (1999)
Kloning dan karakterisasi ATRAP, sebuah protein novel yang berinteraksi dengan
angiotensin II tipe 1 reseptor. J. Biol. Chem., 274, 17058-17062.
5. Elton, T.S. dan Martin, M.M. (2007) Angiotensin II tipe 1 reseptor regulasi gen: transkripsi
dan mekanisme posttranscriptional.Hipertensi, 49, 953-961.
6. Nickenig, G., Michaelsen, F., Muller, C., Berger, A., Vogel, T.,Sachinidis, A., Vetter, H.
dan Bohm, M. (2002) Destabilisasi dariAT (1) mRNA reseptor oleh calreticulin. Circ. Res.,
90, 53-58.
7. Nickenig, G. dan Murphy, T.J. (1994) Down-regulasi oleh pertumbuhan Faktor gen
reseptor angiotensin otot polos pembuluh darah ekspresi. Mol. Pharmacol., 46, 653-659.
8. Nickenig, G. dan Murphy, T.J. (1996) angiotensin Ditingkatkan Jenis reseptor degradasi 1
mRNA dan induksi polyribosomal mRNA mengikat protein oleh angiotensin II di pembuluh
darah halus sel-sel otot. Mol. Pharmacol., 50, 743-751.
9. Nickenig, G., Sachinidis, A., Michaelsen, F., Bohm, M., Seewald, S. dan Vetter, H. (1997)
peningkatan regulasi vaskular angiotensin II ekspresi gen reseptor oleh low-density
lipoprotein di pembuluh darah sel otot polos. Sirkulasi, 95, 473-478.
10. Nickenig, G., Roling, J., Strehlow, K., Schnabel, P. dan Bohm, M. (1998) Insulin
menginduksi peningkatan regulasi gen reseptor AT1 vaskular Ekspresi oleh mekanisme
posttranscriptional. Sirkulasi, 98, 2453-2460.
11. Nickenig, G. dan Bohm, M. (1998) Interaksi antara insulin dan reseptor AT1. Relevansi
untuk hipertensi dan arteriosklerosis. Dasar Res. Cardiol., 93 (Suppl. 2), 135-139.
12. Pende, A., Giacche, M., Castigliola, L., Contini, L., Passerone, G.,Pembungkus, M.,
Pelabuhan, J.D. dan Lotti, G. (1999) Karakterisasi pengikatan AuF1 protein RNA-mengikat
manusia AT (1) reseptor mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 609-614.
13. Zhang, W., Wagner, B.J., Ehrenman, K., Schaefer, A.W.,DeMaria, C.T., Kawah, D. et al.
(1993) Pemurnian, karakterisasi, dan cDNA kloning dari suatu protein elemen RNA-
mengikat kaya AU,AuF1. Mol. Sel Biol., 13, 7652-7665.
14. Paukku, K., Kalkkinen, N., Silvennoinen, O., Kontula, K.K. dan Lehtonen, J.Y. (2008)
p100 meningkatkan ekspresi AT1R melalui interaksi dengan AT1R 30-UTR. Asam Nukleat
Res., 36, 4474-4487.
15. Bonafe, N., Gilmore-Hebert, M., Folk, N.L., Azodi, M., Zhou, Y. Dan Chambers, S.K.
dehidrogenase (2005) Gliseraldehida-3-fosfat mengikat AU-Kaya 30 diterjemahkan wilayah
koloni-merangsang Faktor-1 (CSF-1) RNA pada kanker ovarium manusia Sel: mungkin
berperan dalam CSF-1 peraturan posttranscriptional dan tumor fenotipe. Kanker Res., 65,
3762-3771.
16. Dollenmaier, G. dan Weitz, M. (2003) Interaksi glyceraldehyde- dehidrogenase 3-fosfat
dengan RNA sekunder dan tersier elemen struktur hepatitis A virus 30 diterjemahkan dan
non-diterjemahkan daerah. J. Jenderal Virol., 84, 403-414.
17. Nagy, E. dan Rigby, W.F. (1995) Gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase selektif mengikat
RNA AU kaya di NAD (+) - wilayah mengikat (Rossmann lipat). J. Biol. Chem., 270, 2755-
2763.
18. Sirover, M.A. (1999) Wawasan baru ke dalam protein tua: fungsional keanekaragaman
mamalia dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat. Biochim. Biophys. Acta., 1432, 159-184.
19. Sirover, M.A. (2005) fungsi nuklir baru dari protein glikolitik, gliseraldehida-3-fosfat
dehidrogenase, dalam sel mamalia. J. Sel Biochem., 95, 45-52.
20. Hara, M.R., Agrawal, N., Kim, S.F., Cascio, M.B., Fujimuro, M.,Ozeki, Y. et al. (2005)
GAPDH S-nitrosylated memulai sel apoptosis mati oleh translokasi nuklir berikut Siah1
mengikat. Nat. Sel Biol., 7, 665-674.
21. Hara, M.R., Cascio, M.B. dan Sawa, A. (2006) GAPDH sebagai sensor stres NO.
Biochim. Biophys. Acta., 1762, 502-509.
22. Barbini, L., Rodriguez, J., Dominguez, F. dan Vega, F. (2007) dehidrogenase
gliseraldehida-3-fosfat diberikannya biologis yang berbeda kegiatan di apoptosis dan
proliferasi hepatosit menurut lokalisasi subselular nya. Mol. Sel Biochem., 300, 19-28.
23. Andrade, J., Pearce, S.T., Zhao, H. dan Barroso, M. (2004) Interaksi antara p22,
dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat dan mikrotubulus. Biochem. J., 384, 327-336. Asam
Nukleat Penelitian, 2009, Vol. 37, No. 7 2357
24. Sukhanov, S., Higashi, Y., Shai, S.Y., Itabe, H., Ono, K.,Parthasarathy, S. dan
Delafontaine, P. (2006) efek Novel dari teroksidasi low-density lipoprotein: selular deplesi
ATP via downregulation dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat.Circ. Res., 99, 191-200.
25. Li, D., Saldeen, T., Romeo, F. dan Mehta, J.L. (2000) LDL teroksidasi meregulasi
angiotensin tipe II ekspresi 1 reseptor di berbudaya arteri koroner manusia sel endotel:potensi
peran faktor transkripsi NF-kappaB. Sirkulasi, 102, 1970-1976.
26. Grifoni, S.C., Gannon, K.P., STEC, D.E. dan Drummond, H.A. (2006) ENaC protein
berkontribusi migrasi VSMC. Saya. J. Physiol.Jantung. Circ. Physiol., 291, H3076-H3086.
27. Fan, X., Roy, E., Zhu, L., Murphy, T.C., Kozlowski, M., Nanes, M.S.et al. (2003) donor
oksida nitrat menghambat ekspresi luciferase dalam promotor-independen fashion. J. Biol.
Chem., 278, 10232-10238.
28. Masuda, H., Fukabori, Y., Nakano, K., Shimizu, N. Dan Yamanaka, H. (2004) Ekspresi
tulang morfogenetik protein-7 (BMP-7) dalam prostat manusia. Prostat, 59, 101-106.
29. Minami, M., Daimon, Y., Mori, K., Takashima, H., Nakajima, T., Itoh, Y. dan Okanoue,
T. (2005) Hepatitis B-virus terkait insersional mutagenesis pada pasien hepatitis B kronis
sebagai drastis awal perubahan genetik yang menyebabkan hepatocarcinogenesis. Onkogen,
24,4340-4348.
30. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. dan Mann, M. (1996) Mass spektrometri
sequencing protein poliakrilamida perak bernoda gel. Anal. Biochem., 68, 850-858.
31. Peritz, T., Zeng, F., Kannanayakal, T.J., Kilk, K., Eiriksdottir, E., Langel, U. dan
Eberwine, J. (2006) Immunoprecipitation dari kompleks mRNA-protein. Nat. Protoc., 1, 577-
580.
32. Tim, R.D.C. (2007) R: Bahasa dan Lingkungan untuk Komputasi statistik. R Yayasan
statistik Computing. Wina, Austria.
33. Gentleman, R.C., Carey, V.J., Bates, D.M., Bolstad, B., Dettling, M.,Dudoit, S., Ellis, B.,
Gautier, L., Ge, Y., Gentry, J. et al. (2004) Bioconductor: pengembangan perangkat lunak
Open untuk biologi komputasi dan bioinformatika. Genome Biology, 5, R80.
34. Dai, M., Wang, P., Boyd, A.D., Kostov, G., Athey, B., Jones, mis.,Bunney, W.E., Myers,
R.M., Kecepatan, T.P., Akil, H. et al. (2005) Berkembang definisi gen / transkrip secara
signifikan mengubah penafsiran data GeneChip. Asam Nukleat Res., 33, E175.
35. Irizarry, R., Bolstad, B., Collin, F., Cope, L., Hobbs, B. dan Kecepatan, T. (2003)
Rangkuman dari Affymetrix GeneChip Data tingkat penyelidikan. Asam Nukleat Res., 33,
E15.
36. Hubbard, T., Andrews, D., Caccamo, M., Cameron, G., Chen, Y., Clamp, M., Clarke, L.,
Coates, F., Cox, T., Cunningham, F. et al.(2006) Ensemble 2005. Nucleic Acid Res., 33,
D447-D453.
37. Yao, Z., Weinberg, Z. dan Ruzzo, W. (2006) CMfinder - Sebuah kovarians Model RNA
berdasarkan algoritma motif temuan. Bioinformatika.,22, 445-452.
38. Akishita, M., Ito, M., Lehtonen, J.Y., Daviet, L., Dzau, V.J. dan Horiuchi, M. (1999)
Ekspresi reseptor AT2 program perkembangan ekstraseluler sinyal-diatur aktivitas kinase dan
pengaruh pertumbuhan pembuluh darah janin. J. Clin. Menginvestasikan.,103, 63-71.
39. Lopez de Silanes, aku., Zhan, M., Lal, A., Yang, X. dan Gorospe, M.(2004) Identifikasi
motif RNA target untuk RNA-mengikat protein Hur. Proc. Natl Acad. Sci. USA., 101, 2987-
2992.
40. Kim, H.S., Kuwano, Y., Zhan, M., Pullman, M. Jr.,Mazan-Mamczarz, K., Li, H.,
Kedersha, N., Anderson, P.,Wilce, M.C., Gorospe, M. et al. (2007) A: Penjelasan dari C-kaya
motif tanda tangan di mRNA target RNA-mengikat Tiar protein. Mol. Sel Biol., 27, 6806-
6817.
41. Nakajima, H., Amano, W., Fujita, A., Fukuhara, A., Azuma, Y-T., Hata, F., Inui, T. dan
Takeuchi, T. (2007) The Site Aktif Sistein dari Protein proapoptotik Gliseraldehida-3-
fosfat dehidrogenase Apakah penting di oksidatif Stressinduced Agregasi dan Cell Death. J.
Biol. Chem., 282,26.562-26.574.
42. Barber, R.D., Harmer, D.W., Coleman, R.A. dan Clark, B.J. (2005) GAPDH sebagai gen
housekeeping: analisis GAPDH mRNA ekspresi dalam sebuah panel 72 jaringan manusia.
Physiol. Genomik, 21,389-395.
43. Kandasamy, K., Joseph, K., Subramaniam, K., Raymond, J.R. dan Tholanikunnel, B.G.
(2005) kontrol Translational dari beta2-adrenergik reseptor mRNA oleh intraseluler T-cell-
dibatasi antigen terkait protein. J. Biol. Chem., 280, 1931-1943.
44. Sureban, S.M., Murmu, N., Rodriguez, P., Mei, R., Maheshwari, R.,Dieckgraefe, B.K. et
al. (2007) antagonisme Fungsional antara RNA mengikat protein Hur dan CUGBP2
menentukan nasib COX-2 terjemahan mRNA. Gastroenterologi, 132,1055-1065.