JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
APRIL 2019
UJI KANDUNGAN PROTEIN
A. TUJUAN
1. Mampu menjelaskan secara umum protein berdasarkan struktur, sifat, dan reaksi
kimianya serta pemahaman yang mendasari prosedur identifikasi protein dan asam amino.
2. Mampu melakukan uji identifikasi protein serta melaporkan lisan dan tertulis hasil uji
tersebut baik secara ringkas atau uraian.
B. DASAR TEORI
Protein adalah unsur pokok alat tubuh dan jaringan lunak tubuh. Zat tersebut digunakan
sebagai zat pembangun, perbaikan & pertumbuhan sel, sebagai penyeimbang asam & basa,
sebagai pembentuk atau menstimulasii enzim & hormon (Anggorodi, 1995). Sedangkan
menurut (Katili,2009) protein adalah makromolekul yang tersusun dari bahan dasar asam
amino. Protein terdapat dalam sistem hidup semua organisme baik yang berada pada tingkat
rendah maupun organisme tingkat tinggi.
a. Protein Sederhana
b. Protein Kompleks
Protein dapat dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan bentuk dan sifat-sifat
tertentu, yaitu protein globuler dan protein serabut. Pada protein globuler, rantai polipeptida
berlipat-lipat rapat menjadi bentuk globuler atau bulat padat. Sedangkan protein serabut
merupakan molekul serabut panjang dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu
sumbu dan tidak berlipat menjadi bentuk globuler (Lehninger, 1997)
Pada dasarnya, protein tersusun atas asam amino-asam amino, yang diikat oleh ikatan
peptida. Pengadaan dan penyediaan asam amino terjadi amat penting oleh karena senyawa
tersebut dipergunakan sebagai satuan penyusun protein. Kemampuan jasad hidup untuk
membentuk asam amino tidak sama. Asam amino digolongkan de dalam asam amino nir-
esensial adalah alanin, prolin, glisin, serin, sistein, tirosin, asparagin, glutamin, asam aspartat,
dan asam glutamat. Jasad hidup tingkat tinggi tidak dapat mensintesa asam amino esensial.
Mekanisme reaksi pembentukanya disusun dari biosintesa asam tersebut adalah valin, leusin,
isoleusin, fenilalanin, triptofan, metionin, treonin, ornitin, arginin, histidin (Martoharsono,
2000).
Setiap protein memiliki jumlah dan urutan asam amino yang spesifik. Perubahan posisi
asam amino dalam rantai akan menghasilkan protein baru dengan struktur dan fungsi yang
berbeda. Struktur protein merefleksikan fungsi biologisnya.Struktur protein dapat dilihat
sebagai hirarki, yaitu berupa struktur primer (tingkat satu), sekunder (tingkat dua), tersier
(tingkat tiga), dan kuartener (tingkat empat). (Murray, 1999). Struktur primer protein
merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida
(amida). Sementara itu, struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dan
berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen (Wahjudi,
2003).
Protein berfungsi memindahkan berbagai senyawa melalui aliran darah dan melewati
membran. Fungsi terpentingnya yaitu sebagai enzim (katalisator) untuk mempercepat reaksi
biokimia. Fungsi lainnya yaitu sebagai pemicu otot untuk berkontraksi. Protein dalam bentuk
antibodi dan komponen lain dalam sistem kekebalan, dapat melindungi dari infeksi organisme
asing. Protein juga mampu mencegah kehilangan darah dengan membentuk serangkaian proses
yang diakhiri dengan pembentukan pembekuan darah.
Protein dapat diuji dengan beberapa percobaan, yang dapat dipelajari dalam ilmu
Biokimia. Pengujian protein antara lain uji Biuret, uji Molisch, uji Xanthoproteic, uji
Ninhydrine, uji Millon, uji Hopkins Cole, uji Amonium sulfat.
Uji Biuret. Uji biuret dilakukan untuk mengetahui adanya ikatan peptida dalam protein.
Larutan peptida yang ditambahkan NaOH dan CuSO4 menghasilkan warna ungu.
Uji Millon. Uji Millon dilakukan untuk mengetahui adanya asam amino tirosin pada
protein. Larutan albumin yang ditambahkan HgSO4 yang sudah dididihkan dengan cara
pemanasan selama 10 menit, kemudian didinginkan dengan mengalirkan air kran lalu
ditambahkan kristal NaNO3 kemudian dipanaskan kembali , menghasilkan endapan berwarna
merah bata yang menunjukkan bahwa reaksinya positif.
Uji Hopskin Cole. Uji Hopskin Cole dilakukan untuk mengetahui adanya asam amino
triptpophan pada asam amino. Reaksi yang terjadi menghasilkan warna biru tua keunguan.
Uji Molisch. Uji Molisch dilakukan untuk mengidentifikasi gugus karbohidrat pada
protein. Albumin yang ditambah reagen Molisch dan H2SO4 pekat menghasilkan larutan
berwarna merah hati yang mengandung sedikit gelembung dan terdapat warna ungu yang
membentuk semacam cincin.
Uji Ninhydrin atau tes ninhydrin digunakan untuk menunjukkan adanya asam amino
dalam zat yang di uji. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna
biru/keunguan.
Uji Amonium Sulfat. Hasil positif ditandai dengan adanya endapan pada larutan yang
telah direaksikan dengan amonium sulfat. (Ridwan, 1990)
a) Alat
1. Tabung Reaksi
2. Rak Tabung
3. Pipet Tetes
4. Beaker glass
5. Kassa
6. Spiritus
7. Gelas ukur 10ml
8. Penjepit tabung
9. Serbet
10. Cawan
11. Spatula
12. Kaki tigas
b) Bahan
1. Kertas label
2. Daging ikan
3. Susu sapi
4. Susu kedelai
5. Albumin telur
6. Larutan NaOH 10%
7. Larutan CuSO4
8. Larutan alpha-haftol
9. Larutan H2SO4
10. Larutan HNO3 pekat
11. Larutan NaOH 40%
12. Millon
13. Larutan NaNO2
14. Larutan Ninhydrin
15. Reagen Hopkins Cole
16. Larutan HCl 2%
17. Larutan Asam Sulfanilat 2%
18. Reagen Asam Trichloasetat
19. Reagen Asam Fosfotungstat
20. Reagen Asam Fosfomolidat
21. Reagen Asam Sulfosalisidat
22. Reagen alkohol 95%
23. Reagen perak nitrat 2%
24. Reagen tembaga sulfat 2%
25. Reagen terri klorida 2%
26. Reagen merkuri klorida 2%
27. Amonium sulfat padat
28. Akuades
29. Larutan asam asetat 1N
30. Indikator brom kesol hijau
31. Gelatin
32. Es batu
33. Kurma
34. Alpukat
35. Kacang tanah
36. Kacang hijau
37. Singkong
38. Bawang putih
D. CARA KERJA
1. Uji Biuret
Bahan uji
Diambil bahan uji secukupnya
Hasil
2. Uji Molish
Bahan uji
Dimasukkan 2 ml bahan uji ke tabung reaksi
Hasil
3. Uji Xanthoprotein
Bahan Uji
Dimasukkan 1 ml bahan uji ke dalam tabung reaksi
Hasil
4. Uji Ninhydrine
Bahan uji
Dimasukkan 1ml bahan uji ke dalam tabung reaksi
Hasil
5. Uji Millon
Bahan uji
Dimasukkan 4 ml bahan uji
Ditambahkan 1-3 tetes reagen millon dan diaduk sampai terbentuk endapan
putih
Hasil
6. Pengendapan oleh garam amonium sulfat
Bahan Uji
Disiapkan 2ml larutan bahan uji
Hasil
Bahan uji
Disiapkan 1 ml bahan uji, 1 ml reagen hopkins, dan 1 ml asam sulfat (H2SO4)
Ditambahkan asam sulfat kedalam campuran bahan uji dan reagen hopkins
dengan hati-hati
Hasil
1. Uji Biuret
Perubahan Warna Keterangan
No Bahan Uji Reagen
Sebelum Sesudah Hasil (+/-)
1. Kacang tanah Putih Ungu +
2. Susu sapi Putih Ungu +
NaOH +
3. Susu kedelai Putih Ungu +
CuSO4
4. Ikan Putih keruh Ungu +
5. Albumin telur Bening Ungu +
2. Uji Molisch
Perubahan Warna Keterangan
No Bahan Uji Reagen
Sebelum Sesudah Hasil (+/-)
1. Kacang tanah Putih Cincin ungu +
2. Susu sapi Putih Cincin ungu +
Reagen Molish
3. Susu kedelai Putih Cincin ungu +
+ H2SO4
4. Ikan Putih keruh Cincin ungu +
5. Albumin telur Bening Cincin ungu +
3. Uji Xantoprotein
Perubahan Warna Keterangan
No Bahan Uji Reagen
Sebelum Sesudah Hasil (+/-)
1. Kacang tanah Putih Oren +
2. Susu sapi Putih Oren +
HNO3 dan
3. Susu kedelai Putih Oren +
NaOH
4. Ikan Putih keruh Oren +
5. Albumin telur Bening Oren +
4. Uji Nihidrin
Perubahan Warna Keterangan
No Bahan Uji Reagen
Sebelum Sesudah Hasil (+/-)
1. Kacang tanah Putih Ungu +
2. Susu sapi Putih Ungu +
3. Susu kedelai Putih Ungu +
Nihidrin
Biru
4. Ikan Putih keruh +
Kehitaman
5. Albumin telur Bening Biru pekat +
5. Uji Millon
Perubahan Warna Keterangan
No Bahan Uji Reagen
Sebelum Sesudah Hasil (+/-)
1. Kacang tanah Putih Merah +
2. Susu sapi Putih Merah +
3. Susu kedelai Reagen Millon Putih Putih -
+ NaNO2 Jingga
4. Ikan Putih keruh +
kemerahan
5. Albumin telur Bening Jingga +
7. Uji Hopkins-cole
Perubahan Warna Keterangan
No Bahan Uji Reagen
Sebelum Sesudah Hasil (+/-)
1. Kacang tanah Putih Cincin ungu +
2. Susu sapi Putih Cincin ungu +
Reagen
Merah
3. Susu kedelai Hopkins + Putih -
jambu
H2SO4
4. Ikan Putih keruh Cincin ungu +
5. Albumin telur Bening Putih -
F. ANALISIS DATA
G. PEMBAHASAN
1. Uji Biuret
Uji biuret merupakan jenis pengujian untuk identifikasi protein secara umum. Berarti uji
Biuret akan selalu memberikan hasil positif untuk semua jenis protein. Prinsipnya adalah
pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks berwarna ungu yang terjadi bila protein
bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa. Reagen biuret terdiri dari CuSO4 dalam
aquadest, KI dalam aquadest, Na-sitrat, Na2CO3 dan NaOH. CuSO4 sebagai penyedia ion
Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. KI berfungsi untuk mencegah
terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Na-sitrat dan Na2CO3 berfungsi
sebagai buffer dan NaOH berfungsi sebagai penyedia suasana basa. Suasana basa akan
membantu membentuk Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-. Hal ini
membantu untuk membentuk kompleks dengan nitrogen dari karbon dari ikatan peptida dalam
larutan basa. Perubahan pada warna sampel uji akan memberikan hasil yang positif atau
negatif. Terjadinya warna ungu terbentuk dari ikatan antara Cu dan N, unsur N terdapat pada
peptida menghasilkan CuN yang terjadi dalam suasana basa. Makin panjang suatu ikatan
peptida, maka warna ungu yang terbentuk makin jelas dan makin pekat.
Protein terdapat pada semua sel dan merupakan komponen terpenting dalam semua
reaksi kimia, rata - rata 2/3 dari berat kering suatu sel terdiri dari protein. Setiap protein
merupakan polimer asam amino. Asam - asam amino dalam protein disambung dengan ikatan
peptida yang merupakan ikatan kovalen amida yang terbentuk oleh gugus α-karboksil dan α-
amino.
Pada praktikum uji protein ini akan diamati adanya protein pada larutan putih telur
melalui uji biuret. Pada uji biuret, awalnya larutan putih telur berwarna putih bening, kemudian
ketika ditambahkan dengan 2 mlNaOH, larutan tidak berubah warna putih bening, setelah itu
ketika ditambahkan dengan 2 ml CuSO4, larutan berubah menjadi berwarna ungu pada bagian
atasnya. Dalam hal ini terbentuknya warna ungu menunjukkan bahwa pada larutan putih telur
tersebut mengandung protein.
Pada uji biuret dihasilkan warna violet/ungu. Hal ini disebabkan penambahan CuSO4
sehingga terbentuk kompleks antar Cu2+ dengan gugus amino dari protein. makin kuat
intensitas warna ungu yang dihasilkan ini menunjukan makin panjang ikatan peptidanya.
Dengan perubahan warna ungu yang diperoleh ini menunjukan bahwa uji ini positif terhadap
biuret.
Larutan yang digunakan pada identifikasi protein, terutama pada uji biuret adalah kacang
tanah, susu sapi, susu kedelai, ikan, dan albumin. Semua bahan tersebut terdeteksi memiliki
senyawa protein. Albumin didapat dari larutan putih telur ,telur sebagai sumber protein
mempunyai banyak keunggulan antara lain,kandungan asam amino paling lengkap
dibandingkan bahan makanan lain seperti ikan,daging,ayam,tahu,tempe,dll.
2. Uji Molisch
Prinsip dari uji Molisch ini adalah berdasarkan kepada reaksi karbohidrat dengan
H2SO4 sehingga terbentuk senyawa hidroksimetil furfural dengan α-naftol akan membentuk
senyawa kompleks berupa cincin ungu. Dalam larutan mollisch ini mengandung alcohol.
Fungsi dari alcohol ini yaitu untuk melindungi partikel-partikel karbohidrat dari kontak
langsung asam sulfat pekat sehingga tidak terjadi kerusakan langsung senyawa karbohidrat
dalam sampel dan sebagai pelarut α-naftol. α-naftol. Merupakan pewarna spesifik karbohidrat
sehingga dengan senyawa furfural yang akan dibahas selanjutnya. α-naftol. Bersifat tak
larut,maka dari itu, selain untuk melindungi senyawa karbohidrat alcohol berfungsi untuk
melarutkan α-naftol.
Mekanisme terbentuknya cincin ungu adalah karbohidrat oleh asam sulfat pekat akan
dihidrolisa menjadi monosakarida, lalu monosakarida tersebut mengalami dehidrasi oleh asam
sulfat menjadi furfural. Jika senyawa berupa heksosa maka senyawa yang terbentuk berupa
senyawa hidroksimetil furfural. Furfural tersebut dengan adanya α-naftol akan berkondensasi
membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Dehidrase pentose akan menghasilkan
furfural,dehisrase heksosa akan menghasilkan hidroksimetil furfural sedangkan dehidrasi
ramnosa membentuk metal furfural ( Sudarmadji,2010)
Gambar. Pembentukan Furfural ( David J Holme,1998)
Apabila asam pekat ditambahkan pada larutan sampel secara hati-hati melalui dinding
tabung reaksi,akan terbentuk dua lapisan zat cair. Pada batas kedua larutan cair ini akan
terbentuk cincin ungu karena kondensasi furfural dengan α-naftol (Poedjiadi,1994). Jika
langsung ke larutan maka kan merusak langsung karbohidrat dan yang terbentuk adalah warna
ungu pada larutan. Selain itu,pemberian melalui dinding akan memberikan bentuk cincin yang
sempurna.
Pada Uji Mollisch cincin ungu yanbg sudah terbentuk harus dihindari dari guncangan
karena bila terkena guncangan maka partikel alcohol yang melindungi karbohidrat akan terurai
dan asam pekat akan masuk lalu merusak karbohidrat yang ada. Pemanasan tidak dilakukan
karena asam pekat bersifat panas sehingga apabila dilakukan pemanasan, reaksi kondensasi
cincin ungu akan terlalu cepat sehingga tidak dapat terlihat dan karbohidrat akan rusak terlebih
dahulu.
Uji Mollisch yang sudah dilakukan terhadap bahan kacang tanah,susu sapi,susu
kedelai,ikan dan albumin telur hasil yang didapatkan adalah semua bahan mengandung
karbohidrat,dimana terdapat senyawa kompleks berupa cincin ungu.
3. Uji Xantoprotein
4. Uji Nihidrin
5. Uji Millon
Pada uji ini terjadi reaksi millon. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein,
akan menghasilkan endapan putih dan apabila dipanaskan dapat berubah menjadi merah. Uji
Millon dilakukan untuk mengetahui adanya asam amino tirosin pada protein. Tirosin
merupakan asam amino yang mengandung gugus fenol pada rantai sampingnya (gugus R-nya).
Pereaksi Millon mengandung merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrit dan asam nitrat.
Gugus fenol pada tirosin ini akan terhitrasi membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon
yang akan membentuk kompleks berwarna merah. (Poediadi,2007).
Larutan uji yang sudah dididihkan dengan cara pemanasan selama 10 menit, kemudian
didinginkan dengan mengalirkan air kran lalu ditambahkan kristal NaNO3 kemudian
dipanaskan kembali, menghasilkan endapan berwarna merah bata yang menunjukkan bahwa
reaksinya positif. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya
senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Endapan yang terbentuk masih
bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perubahan struktur tersier ataupun kuartener,
sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan struktur tersier protein ini tidak dapat diubah
kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.
Dalam uji ini digunakan 5 bahan yaitu kacang tanah, susu sapi, susu kedelai, ikan dan
albumin telur. Hasil dari uji Millon pada kacang tanah, susu sapi, ikan dan albumin telur
menunjukkan positif setelah diberi reagen dan dilakukan sesuai prosedur uji, menghasilkan
endapan berwarna merah. Dari hasil percobaan diketahui bahwa kacang tanah,susu sapi,ikan
dan albumin telur mengandung protein,sedangkan pepton mengandung tirosin. Sebagai salah
satu asam penyusunnya. Pada bahan uji susu kedelai menunjukkan hasil negative setelah diberi
reagen dan dilakukan sesuai prosedur uji, dimana menghasilkan endapan berwarna putih
orange. Dari hasil percobaan diketahui bahwa susu kedelai tidak terdapat senyawa asam amino
tirosin. Protein susu kedelai mempunyai susunan asam amino terdiri atas asam amino
esensial yaitu lisin, triptofan, fenilalanin, leusin, isoleusin, treonin, metionin, dan valin.
(Santoso, 1994 : 15-16).
6. Uji Amonium Sulfat
Uji Amonium sulfat merupakan uji dengan menambahkannya garam Amonium sulfat
sampai larutan protein mengendap membentuk endapan putih. Pengendapan protein dengan
garam dilakukan dengan menambahkan sedikit demi sedikit garam amonium sulfat ke dalam
larutan protein secara kontinyu sampai larutan jenuh.
Pembentukan senyawa tak larut antara protein dengan ammonium sulfat. Apabila
terdapat garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi dalam larutan protein(albumin dan
gelatin), maka kelarutan protein akan berkurang sehingga terjadi pengendapan protein. Teori
menyebutkan bahwa sifat tersebut terjadi karena ion garam mampu mengikat air (terhidrasi)
sehingga berkompetisi dengan molekul protein dalam mengikat air. (Riawan, 1990)
Berdasarkan hasil Uji Amonium Sulfat pada bahan kacang tanah,susu sapi,susu kedelai,
ikan dan albumin (putih telur) bahwa hasil yang diperoleh positif terdapat endapan putih.
Mengendapnya protein disebabkan karena adanya kompetisi antara ion-ion garam amonium
dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena ion-ion dari garam amonium lebih mudah
dalam mengikat air, menyebabkan kelarutan protein dalam air berkurang. Dengan penambahan
garam secara kontinyu, molekul air akan keluar dari larutan dan mengendap. Proses ini disebut
dengan salting out.
7. Uji Hopkins-Cole
Uji Hopkins-Cole merupakan uji kimia yang digunakan untuk menunjukkan adanya asam
amino triptofan. Pereaksi yang dipakai mengandung asam glioksilat. Kondensasi 2 ini induk
dari triptofan oleh asam glioksilat akan menghasilkan senyawa berwarna ungu. Reaksi positif
ditunjukkan dengan adanya cincin ungu pada bidang batas. Triptofan merupakan salah satu
asam amino essensial yang tidak bisa diprosuksi sendiri oleh tubuh. Gugus fungsional tritofan
adalah Indol, yang tidak dimiliki oleh asam amnino lainnya membuat triptofan menjadi
prekusor dan banyak senyawa penting tubuh seperti melatnin (hormone perangsang tidur),
Scrotonin (suatu transmitter pada system saraf) dan niasin (suatu vitamin).
Triptofan dapat berkondensasi dengan beberapa aldehida dengan bantuan asam kuat dan
membentuk senyawa yang berwarna. Larutan protein yang mengandung triptofan dapat
direaksikan dengan pereaksi Hopkins–Cole hingga membentuk lapisan di bawah larutan
protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan
tersebut (Anna Poedjiadi, 1994).
Untuk bahan uji yang menghasilkan hasil negative didasarkan bahwa asam amino
penyusun albumin telur tidak terdapat asam amino triptofan. Oleh sebab itu,tidak terdapat
cincin ungu pada hasil percobaan albumin telur.
H. KESIMPULAN
I. DAFTAR PUSTAKA
Anggorodi, H. R. (1995). Nutrisi Aneka Ternak Unggas. Jakarta: PT Gramedia Pustaka
Utama.
Katili, A. S. (2009). Struktur dan Fungsi Protein Kolagen. Jurnal Pelangi Ilmu, Vol 2 No 5.
Wahjudi, I., & Parlan, S. M. (2003). Kimia Orgnaik II. Malang: Universitas Negeri Malang
Press.
J. LAMPIRAN