2018

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REPLICACION DEL ADN

Prof. Felipe Carlos Martin Zoppino Ph.D.

Biología Celular y Molecular
Facultad de Ciencias Médicas-UNCuyo

TEORIA CELULAR

ROBERT HOOKE
(1665) (1635-1703)

ANTON VAN LEEUWENHOEK MATTHIAS JAKOB SCHLEIDEN THEODOR SCHWANN RUDOLF VIRCHOW (1850) (1821-1902)
(1673) (1632-1723) (1837) (1804-1881) (1839) (1810-1882) “omnis cellula ex cellula”

Teoría Celular, enunciados:

1- Todo ser vivo está formado por una o más células.

2- La célula es lo más pequeño que tiene vida propia: es la unidad anatómica y fisiológica del
ser vivo.

3- Toda célula procede de otra célula preexistente.

4- El material hereditario pasa de la célula madre a las hijas.
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REPLICACION DEL ADN

Es el proceso por el cual el ADN se copia para

poder ser transmitido a las nuevas células.

Estabilidad Duplicación
genómica fiel del ADN

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REPLICACION DEL ADN

Semiconservativa

James Watson Francis Crick

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Frederick Wilkins Rosalind Elsie Franklin
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REPLICACION DEL ADN

Protagonistas (en orden alfabético):

• ADN polimeras (en eucariotas: α, δ, etc.)

• dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

• Helicasas

• Ligasas

• Primasas

• Proteínas de unión al ADN de hebra única

• Topoisomerasas (I y II)
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REPLICACION DEL ADN

DNA polimerasas requisitos:

Primer Dirección 5’ à 3’

DNA templado

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REPLICACION DEL ADN

¿Donde comienza la replicación del ADN?

bidireccional

Orígenes de replicación (ori): es una secuencia de ADN particular en los genomas donde la
replicación del ADN es iniciada. En procariotas hay uno en el cromosoma circular, en
eucariotas existen muchos en cada cromosoma.
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REPLICACION DEL ADN

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REPLICACION DEL ADN

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REPLICACION DEL ADN

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REPLICACION DEL ADN

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REPLICACION DEL ADN

semidiscontinua

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FUNCION DE LAS TOPOISOMERASAS O GIRASAS

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Replicación en Eucariotas
•  Más de 27 proteínas involucradas
•  DNA Polimerasas (α, β, δ, ε, γ, δ, ζ, η, θ, ι, κ, ζ, φ y Rev1)
•  Múltiples orígenes de replicación (entre 20 y 80 por cromosoma)

Arthur Kornberg
(1918-2007)
Nobel Prize in
Physiology or Medicine
1959
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REPLICACION EN EUCARIOTAS
Proteína Función
Helicasa Separación de la doble hélice
Topoisomerasas Alivia la tensión por superenrollamiento
Proteína A Unión al ssDNA
Primasa Síntesis de primers
ADN pol α Síntesis de los primeros 20 nucleótidos
Factor C de replicación (RFC) Desplazamiento de complejo Primasa-ADN pol α
PCNA (Ag Nuclear de C prolif) Fija a la ADN pol δ
ADN pol δ Síntesis de ADN
ARNasa HI Degradación de los primers
ADN Ligasa Une los fragmentos
ADN pol ε Síntesis y reparación
ADN pol γ Síntesis del ADN mitocondrial
ADN pol β Reparación

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Características de las Polimerasas

Los eucariotas tienen al menos 15 ADN polimerasas:

Pol α: actúa como una primasa luego la ADN Pol α añade unos 20 nucleótidos para ser
continuada la polimerización asumida por Pol ε (en la cadena principal) y δ (en la cadena
rezagada). Carece de actividad exonucleasa 3´->5´

Pol β: Participa en la reparación del ADN, la reparación por escisión de bases y la síntesis de
llenado de espacios en blanco.

Pol γ: Réplicas y reparación del ADN mitocondrial y corrección 3'-> 5 'exonucleasa.

Pol δ: Alta procesividad y corrección 3'-> 5 'exonucleasa. Se le considera la polimerasa principal
en la síntesis de hebra rezagada.

Pol ε: Alta procesividad y corrección 3'-> 5 'exonucleasa. Polimerasa principal implicada en la
síntesis de hebra principal.

Hay también otras polimerasas eucariotas conocidos, que no son tan bien caracterizados: θ, λ,
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Características de las Polimerasas

•  Procesividad: es una característica de las enzimas que actúan sobre sustratos poliméricos. En
el caso de la ADN polimerasa, el grado de procesividad se refiere al número promedio de
nucleótidos que se añaden cada vez que la enzima se une a un molde de ADN.

•  Actividad exonucleasa 3´-5´ permite la hidrólisis del último nucleótido en el extremo 3´ del
ADN. Otorgando la capacidad de corregir errores (bases mal apareadas) durante la
replicación. Esta correción es conocida como ”proofreading”.

•  Actividad exonucleasa 5´-3´ permite la hidrólisis del último nucleótido en el extremo 5´ del
ADN. Esta acción es necesaria para eliminar los primers utilizados durante la replicación del
ADN, es conocida como “nick translation”
5´

3´
5´
3´ 5´

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Características de las polimerasas procariotas

Function Reparación Reparación Replicación

(elongación
Escisión de SOS de la cadena)
primer

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TELOMEROS
• Región de secuencias repetitivas de nucleótidos en cada extremo de las
cromátides (Humanos, ratón y Xenopus TTAGGG, repetidas unas 2000 veces)

• Protegen el extremo del cromosoma del deterioro o de la fusión con

cromosomas vecinos.

• En ausencia de telómeros, los genomas progresivamente pierden información

luego de cada división celular. Esto es debido a que la síntesis de hebras de
Okazaki requiere primers de ARN por delante de la hebra rezagada que se va a
sintetizar. Biología Celular y Molecular. FCM-
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TELOMERASA

• Enzima ribonucleoproteica que añade repeticiones de secuencia de ADN ("TTAGGG" en todos los vertebrados) al
extremo 3 'de las hebras de ADN de los telómeros.
• La telomerasa es una transcriptasa inversa que posee una molécula de ARN, la cual utiliza como plantilla durante
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el alargamiento de los telómeros.
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PCR

•  La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, polymerase chain reaction)

revolucionó las ciencias de la vida proporcionando un medio sensible, fiable y
eficiente para obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en
particular.

•  Inventado en 1983 por Kary Mullis, quien ganó el Premio Nobel en 1993.

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PCR

La PCR utiliza Secuencia blanco

5’ 3’
oligonucleotidos sintéticos
como primers que Forward Primer Reverse Primer
flanquean la secuencia
blanco.

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PCR

Secuencia blanco
La PCR utiliza
5’ 3’
oligonucleotidos sintéticos
como primers que delimitan Forward Primer Reverse Primer
la secuencia blanco.

Taq
Polimerasa

La sintesis de ADN es
T

catalizada in vitro por una Reverse Primer

Forward Primer
polimerasa estable al calor
(Taq polimerasa de Thermus Taq
aquaticus) Polimerasa

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PCR
}  Pasos del ciclo de PCR
5’ 3’
Desnaturalización del ADN
(94°C)
3’ 5’

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PCR
}  Pasos del ciclo de PCR
5’ 3’
Desnaturalización del ADN
(94°C)
3’ 5’

5’ 3’
Hibridación del primer
(~50 = 65°C) Forward Primer Reverse Primer

5’

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PCR
}  Pasos del ciclo de PCR
5’ 3’
Desnaturalización del ADN
(94°C)
3’ 5’

5’ 3’
Hibridación del primer
(~50 = 65°C) Forward Primer Reverse Primer

5’

5’ 3’

Extensión Reverse Primer

(72°C) Forward Primer

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PCR
}  Pasos del ciclo de PCR

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PCR (video)

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PCR
Protagonistas (en orden alfabético)

• ADN polimerasa (resistente al calor ej. Taq polimerasa de Thermophilus aquaticus)

• ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

•  Buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

•  cebadores o iniciadores (dos) (en inglés, primers): oligonucleótidos (18-22 nucleótidos)

complementarios cada uno a una de las dos hebras del ADN, que delimitan la zona de ADN a
amplificar.

• Desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTPs), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

• Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2). Actúan como cofactores de la polimerasa.

• Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que
conforman un ciclo.
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PCR: temperaturas del ciclo

Inicio
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C que se mantiene durante
1-9 minutos con el objeto de facilitar la separación de hebras largas de ADN.

1- Desnaturalización
Se separan las dos cadenas del ADN por calentamiento de la muestra (94-95 °C).
2- Alineamiento o unión del cebador
El cebador se une a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 40-68 °C permitiendo así la hibridación.
3- Extensión o elongación de la cadena
La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los
dNTPs complementarios en dirección 5'→ 3. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima
actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C).

Las etapas 1-3 se repiten 25-35 veces

Elongación final
Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último
ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente
amplificado.
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Mathematics of PCR 2 2= 4
The basic equation describing PCR amplification is: 2 3= 8
NC = N0·(E + 1)C1 230= 1.07 x 109

where C is the number of thermocycles, E is amplification efficiency (also expressed as %E = E ×100%),

NC is the number of amplicon molecules and N0 is the initial number of target molecules.

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