PENGERTIAN UJI ELISA

Enzyme-nzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang

terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen
dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis,
patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah
antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah
oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan
solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui
penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain
yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen
diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi
pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh
antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate
harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi
yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik
untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel.
Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru
mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

KEGUNAAN UJI ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,
karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi
kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi
allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, digunakan dalam bidang
toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat. Selain itu uji Elisa juga
digunakan untuk mendeteksi adanya daging babi pada produk makanan.
Kegunaan lain dari ELISA meliputi:
1. Deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.
2. Deteksi rotavirus dalam tinja.
3. Deteksi penanda hepatitis B dalam serum.
4. Deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

KELEBIHAN UJI ELISA

Kelebihan dari UJI ELISA antara lain :
1. Teknik pengerjaan relatif sederhana
2. Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
3. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
4. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut
sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat
sangat spesifik)
5. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

KEKURANGAN UJI ELISA

Kekurangan dari UJI ELISA antara lain :
1. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi
monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
2. Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
3. Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif
yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking
sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut
enzim signal dan menimbulkan signal.
4. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus
dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan
larutan untuk menghentikan reaksi).

PRINSIP KERJA UJI ELISA

Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa
microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non
spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan
menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang
diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen
spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila
sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa
antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga
dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas
permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada
saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya,
enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

Uji Sampel Bakso dengan Metode ELISA (Enzyme-linked Immunsorbet Assay)

Uji identifikasi kandungan daging babi pada produk makanan olahan secara kuantitatif dengan
metode ELISA.
1) Sampel : 25 gram sampel bakso ( 4 sampel bakso )
2) Metode : Elisa
Tujuan : Mengidentifikasi adanya daging babi pada produk olahan makanan secara kualitatif dan
kuantitatif (penentuan MBM pada sampel).
a. Alat
- Elisa Kit
- Polystyrene 96 well microtitter plate (microplate)
 - Micropipette (100-200 µL)
- Microplate shaker
- Microtube (1-1,5 mL)
- Microplate washer
- Baker glass
- ELISA reader (elektrofotometer)
b. Bahan
- Sample daging bakso (25 gr daging + 100 ml aquades / NaCl)
- Wash solution (96 well) (100 ml wash concentrate + 900 ml aquades)
c. Cara kerja
1. Bakso sebanyak 25 gram yang sudah matang dimasukkan plastik dan di beri aquades
100 ml dan di remas-remas sampai hancur

Sampel berupa bakso yang akan

diuji cobakan

2. 100 µL sampel diletakan pada mikroplate diambil menggunakan Micropipette

1= Bagian kontrol positif menggunakan pork positif control
sebanyak 100 µL
2= Bagian kontrol negatif menggunakan cow sebanyak 100 µL
3 = Bagian kontrol negatif menggunakan chicken sebanyak 100 µL
4 = Bagian sampel di isi sampel A
5= Bagian sampel diisi sampel B
6= Bagian sampel diisi sampel C

Well yang digunakan untuk

meletakkan reagen dan sampel.

Mikropipet yang digunakan untuk

mengambil reagen maupun sampel
yang sudah dilarutkan.
 Mikropipet yang dilengkapi dengan
mikrotip

Reagen yang mengandung antigen

babi dan kontrol.

3. Di inkubasi selama 45 menit pada suhu 37˚C / suhu ruang

4. Cuci menggunakan wash salution kemudian dibuang, langkah ini dilakukan sebanyak
3x.

Wash Solution yang digunakan

untuk mencuci well
 Multichanel micropipet

5. Ditambahkan anti spesies yaitu pork biotin 50 μL

6. Di inkubasi selama 45 menit pada suhu 37˚C / suhu ruang

7. Cuci menggunakan wash salution kemudian dibuang, langkah ini dilakukan sebanyak 3x
8. Ditambahkan conjugate 50 μL
9. Di inkubasi selama 15 menit pada suhu 37˚C / suhu ruang
10. Cuci menggunakan wash salution kemudian dibuang, langkah ini dilakukan sebanyak
3x.
11. Ditambahkan substrat 100 μL.

12. Di inkubasi selama 45 menit pada suhu 37˚C/ suhu ruang

13. Dilakukan pemeriksaan visual.
14. Ditambahkan dengan stop solution 50 μL.
15. Dibaca menggunakan microplate reader.

3) Pembacaan Hasil
1. Visual
Kontrol positif akan bewarna hijau.
Kontrol negatif bewarna kuning.
Sampel positif mengandung daging babi apabila warnanya berubah menjadi hijau.
2. Pembacaan menggunakan mikroplate reader.
1 = nilai MPN pada kontrol positif.
2 = nilai MPN pada kontrol negatif.
3 = nilai MPN pada kontrol positif