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FILIAL LA MERCED

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

E. F. P. EN INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

COLIMETRIA: MÉTODO DE NÚMERO MAS


PROBABLE (NMP)
Práctica No. 03

CATEDRA:
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
CATEDRATICO:
Mg. Blgo. IBAÑEZ OJEDA Julio
ALUMNO:
RUBIN TORRES, Jerson David

CICLO : “VI”

LA MERCED – CHANCHAMAYO
2018

I. INTRODUCCION
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

El método del Número Más Probable (NMP), o llamado también llamado método de los
tubos múltiples, es un método alternativo que permite efectuar el recuento de cifras
bajas de microorganismos, viables, por ejemplo, menos de uno por ml. Proporciona una
idea aproximada del número de bacterias vivas presentes en una muestra de alimento,
que pueden multiplicarse en una medio de cultivo líquido determinado. El medio de
cultivo a elegir depende del tipo de microorganismo que se desea contar, por tanto se
pueden utilizar medios de enriquecimiento selectivos, o medios de propagación.
El método del NMP, es útil para determinar el número de diversos tipos de
microorganismos presentes en una muestra de alimento. Así, utilizando los medios de
cultivo apropiados, se puede determinar el número de coliformes y E. Coli, enterococos,
estafilococos, salmonella, etc.
El método se fundamente en la determinación de la presencia o ausencia de un
determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan
determinada reacción en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra en la que
todavía hay crecimiento microbiano.
Este método es útil para determinar cargas microbianas bajas, pero tamicen puede
emplearse para determinar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Así
mismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvo sin
solubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni recomendable el de placas
debido a la presencia de partículas. Se prefiere también este método cuando los
microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones
adversas (temperatura alta, desecación, etc.).

II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
 Adiestrar en los métodos y procedimientos de preparación, lectura e
interpretación de los análisis microbiológicos.

2.2. Objetivo Especifico


 Conocer el procedimiento de determinación de Coliformes Totales,
Coliformes Termotolerantes y E. coli a través del método del Numero Mas
Probable, a partir de muestras de alimentos sospechosos.
 Determinar si la muestra de alimento usado para este fin es apto o no para
el consumo humano y está dentro de los parámetros permisibles.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. MATERIALES

 Incubadora
 Muestra: Agua industrial
 Caldo Lauril sulfato triptosa (LST), Agar Mac-Conkey.
 Pipetas
 Caldo Verde Brillante (caldo BRILA)
 Autoclave
 Tubos de ensayo de 150 x 15
 Agitador Magnético
 Bombilla Propipeta Universal u otra
 Mechero de alcohol

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 Espátula de Drigalski
 Campanas de Durham
 Asa Koll
 Autoclave
 Agar Violeta Rojo Bilis (VRBA)
 Diluyente: (agua peptonada 0,1%, Citrato de sodio 2%; Buffer fosfato o
solución salina peptonada)

3.2. METODOS

A) Determinación de Coliformes Totales

a. Preparar las muestras de alimento según el procedimiento


recomendado.
b. Pipetear 1 ml de cada dilución decimal de la muestra, a cada uno de tres
tubos de Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2%.
c. Incubar los tubos a 35-37ºC por 24 y 48 horas.
d. Después de 24 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas.
Para la prueba de Coliformes Fecales, seleccionar los tubos gas positivo
y seguir el procedimiento del Método Europeo sobre deter- minación de
bacterias coliformes termotolerantes. Reincubar los tubos que no
muestren gas en 24 horas adicionales.
e. Después de 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas.
f. Seleccionar los tubos para la prueba confirmativa y determinación del
NMP como se describe en el Método Americano, ítem (f).
g. Confirmar los tubos de CLVBB seleccionados en el ítem (f) inmediato
anterior, por aislamiento en superficie de Agar Violeta Rojo Bilis o
Agar ENDO. Incubar las placas a 35 - 37ºC. Examinar las placas de
Agar VRBA después de 24 horas y las placas de Agar Endo después de
48 horas. La formación de colonias rojo oscuro con un diámetro mayor
de 5 mm en Agar VRBA o de colonias rojas rodeadas de halo rojo en
Agar Endo, confirman la presencia de Bacterias Coliformes.
h. Anotar el número de tubos de cada dilución confirmada como bacterias
coliformes positivo.
i. Determinar el NMP de Coliformes como se describe en el Método
Americano, puntos (f) y (i). (Figura 3-1, Cuadro 3-1 y 3-2).

B) Bacterias Coliformes Termotolerantes

Método, ampliamente utilizado en Europa (Buttiaux y colaboradores, 1956;


Guinee y Mossel, 1963). Este es el método conocido como de Mackenzie
Gilbert y Taylor (1948).
a. Seleccionar tubos de CLVBB que son gas (+) según Método Europeo
de Numeración de Coliformes.
b. Inocular una asada de cada uno de los tubos gas positivo a un tubo que
contiene CLVBB y a otro con Caldo Triptonado.
c. Incubar los tubos a 44 -+ 0.1ºC.
d. Leer producción de gas en tubos con CLVBB después de 24 y 48 horas
de incubación.

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e. Luego de 24 horas de incubación, efectuar la prueba del Indol en los


tubos de Caldo Triptonado. Los cultivos que muestren producción de
gas en CLVBB y formación de indol en Caldo Triptonado son positivos
para Coliformes Fecales

IV. RESULTADO Y DISCUSIONES

4.1. RESULTADOS

a. Coliformes totales

3 - 3 - 2 por tabla de número más probable (NMP) de 3 x 1,3 x 0.1 y 3 x 0,01


g/ml. Nos indica de límite de confianza 95 % inferior de 150 y superior de
4800 podermos concluir que es > 1100 ufc/ml.

b. Coliformes Termotolerantes

3 - 3 - 2 por tabla de número más probable (NMP) de 3 x 1,3 x 0.1 y 3 x 0,01


g/ml. Nos indica de límite de confianza 95 % inferior de 150 y superior de
4800 podermos concluir que es > 1100 ufc/ml.

4.2. DISCUSIONES

 Según Salinas C. (2008), existen diversas formas de realizar este método,


en la práctica se realizaron diluciones consecutivas (10-1, 10-2, 10-3)de las
1 ml de muestras en 9 ml de agua pectonada (1%) en tres tubos, de los
cuales se tomó para cada caso1 ml de dilución y se le agregó a otros tres con
caldo BRILA a concentración normal. Otra forma es transferirse de la
muestra original 10 ml a los tres primeros tubos conteniendo 10 ml de caldo
BRILA doble concentrado, 1ml a los tres siguientes y 0.1 ml a los tres
restantes; ambos a concentración normal.
La muestra puede ser diluida ser seriada mente transfiriendo 1 ml a un tubo
con9 ml de caldo. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10.
Se puede dividir la placa petrix en cinco zonas de igual tamaño. Use una
placa porcada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser
inoculado.
Transferir 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta
operación cinco veces por cada dilución. Permitir que el inoculó seque sobre
el medio de crecimiento. Selle la placa. Invierta la placa e incube a 25°C por
7días.
Las muestras a analizar no solo son liquidas, muchas veces son sólidas, en
estos casos suele agregarse 10 g de muestra en 90 g de agua, se agita y al

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sedimentarse se trabaja con el sobrenadante, a partir de este se podrá


realizarlas diluciones o trabajar directamente como el procedimiento antes
mencionado.
En algunas ocasiones realizar tres diluciones consecutivas no es suficiente,
por lo que es conveniente realizar las diluciones necesarias hasta obtener
resultados más precisos.
 En la práctica, DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES:
Desinfectar a mesa de trabajo con alcohol yodado. Identificar la muestra.
Agitar el frasco que contiene la muestra.4. Pipetear 10 ml de caldo
BRILA doble concentrado, 1 ml a los tres siguientes tubos conteniendo
BRILA a concentración normal y 0.1 ml a los tres tubos restantes con
BRILA a concentración normal. Homogeneizar la siembra
adecuadamente e incubar los tubos a 35-37 ºC durante 24 a 48 horas.
Anotar como positivos los tubos que muestren producción de gas en las
campanas de Durham. Obtener el Número Más Probable (NMP) de la
siguiente manera Para valores de 3, 3 y 2 respectivamente, la tabla indica
un NMP de > 1100 ufc/ml. (Según tabla del NMP). La
determinación COLIFORMES FECALES y E. Coli. primero de cada
tubo positivo (presencia de gas) del paso anterior, se siembra una
alícuota en caldo Brila (Concentración simple) y otra alícuota en caldo
triptonado. Luego Incubar a 44 + 0.1 ºC durante 24-48 horas. Luego del
tiempo de incubación, efectuar la prueba del indol en los tubos con caldo
triptonado, los cultivos (tubos) que muestren producción de gas en caldo
BRILA Y la formación de indol en caldo triptonado son positivos aE,
Coli fecal. Los cultivos que sólo muestren producción de gas más no
producción de indol se consideran coliformes fecales. Determinación del
NMP de coliformes fecales y E. Coli en la tabla delNMP

V. CONCLUSIONES

 Se adiestro los métodos y procedimientos de preparación, lectura e


interpretación de los análisis microbiológicos.

 Se conoció el procedimiento de determinación de Coliformes Totales,


Coliformes Termotolerantes y E. coli a través del método del Numero Mas
Probable, a partir de muestras de alimentos sospechosos.

 Se determinó si la muestra de alimento usado para este fin es apto o no para el


consumo humano y está dentro de los parámetros permisibles.

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VI. BIBLIOGRAFIA

 Según Salinas C. (2008), Introducción, Discusiones. Recuperado de:


https://es.scribd.com/doc/8536988/microbiologia-de-alimentos-Laboratorios

 Fuente: Acebedo B. (2016). Cuestionario N° 1. Recuperado de:


http://www.eumed.net/libros-gratis/ciencia/2013/22/coliformes-totales.html

 Fuente: Barrios H. (2017). Cuestionario N° 2. Recuperado de:


https://es.scribd.com/doc/257537404/Practica-4-Metodos-de-Siembra

 Fuente: Mark G. (2012). Cuestionario N° 3. Recuperado de:


http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf

 Fuente: Donna C. (2002). Cuestionario N° 4. Recuperado de:


https://www.ugr.es/~pomif/pom-ali/ma-i/ma-i-3-nmp_tabla.htm

 Fuente: Duarte M. (2013). Cuestionario N° 5. Recuperado de:


http://riul.unanleon.edu.ni:8080/jspui/bitstream/123456789/6263/1/224735.pdf

VII. CUESTIONARIO

1. ¿Describa al menos cuatro diferencias entre los métodos de NMP y recuento


estándar?
Número más probable (NMP)
 Es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos
discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa.
 Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se
emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es
factible.
 Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y
producir un cultivo turbio.
 Se requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de
cultivo.
 se incuban las muestras de esos tubos.
Recuento estándar
 corresponden a bacterias Gram negativas de morfología cocobacilar.
 Son utilizadas como indicadores de contaminación, por ser habitantes
normales del intestino del hombre y animales de sangre caliente.
 Es un medio de cultivo tipo ENDO.
 Para la recolección de muestras se utilizan frascos de vidrio o plástico, tapa
rosca o esmerilada
 Las colonias típicas de coliformes tienen un color rosa a rojo con un brillo
metálico característico. Fuente: Acebedo B. (2016).

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2. ¿Qué diferencias tienen los métodos de siembra por diseminación y


difusión?

Siembra por diseminación


Para la diseminacion de los microorganismos es necesaria una amplia
superficie de medio nutritivo, ésta se logra en las placas de Petri " en menor medida en el
agar inclinado. La técnica de la siembra en sí, consiste
en pasar sobre toda la superficie del medio, el instrumentó
portador del inoculo; en esta modalidad es recomendada evitar dañar la superficie
del medio.
Siembra por difusión
 Para sembrar por difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal
estéril para esparcir la muestra.
 Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la
superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras.
Fuente: Barrios H. (2017).

3. ¿Por qué para Coliformes termotolerantes debe incubarse a 44 +_ 0.1ºC y no


a 37ºC.?

Por qué resisten a temperaturas altas como el grupo de coliformes fecales, está
constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con
producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye
una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli. La
demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante
el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y
diferenciales.
Fuente: Mark G. (2012).

4. ¿En el método del NMP se tiene como resultado los siguientes tubos positivos
3 – 4 – 2 de una serie de 5 x 1, 5 x 0,1 y 5 x 0,01 g).¿Cómo expresaría los
resultados?¿Qué características y deficiencias tendría los resultados?.

El resultado obtenido este caso sería de 3 – 4 – 2 lo cual nos indica que el NMP
es de 28 ufc/ml. Siguiendo la tabla NMP, la diferencia seria que noy hay límites
de confianza.
Fuente: Donna C. (2002).

5. Para la determinación de Coliformes ¿Qué diferencias existen entre los


métodos americano y europeo? Explique.

Existen dos métodos para la determinación de coliformes fecales. El primero


utiliza caldo E.C. Broth con incubación a 45°±0.2°C y las siembras se hacen a
partir de los tubos de caldo lauril sulfato triptosa gas positivo. El segundo
método, ampliamente extendido en Europa (Buttiaux y col., 1956; Guinée y
Mossel, 1963), utiliza caldo lactosa bilis (2%) verde brillante con incubación a
44° ± 0.1°C, haciéndose la siembra a partir de los tubos caldo MacConkey gas
positivo.
Fuente: Duarte M. (2013).

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