Anda di halaman 1dari 43

LAPORAN PRAKTIKUM

BPS3202
LABORATORIUM TEKNOLOGI BIOPROSES

Modul Praktikum:
Konversi Enzimatis (ENZ)
Dosen : Roga Florida Kembaren, M.Sc
Adrianto Prihartantyo. S.Si, M.T
Asisten : Putry Yosefa Siboro

Kelompok : LABTEK/1819/02
Dandi P. Sinaga (31S16012)
Kusuma Pertiwi Sitorus (31S16004)
Nuri Christy Purba (31S16018)

Tanggal Praktikum:
18-19 Februari 2019

PROGRAM STUDI TEKNIK BIOPROSES


FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
INSTITUT TEKNOLOGI DEL
FEBRUARI 2019
ABSTRAK
Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam suatu
reaksi biokimia. Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat dan
menurunkan energi aktivasi. Energi aktivasi merupakan energi yang dibutuhkan untuk
mengubah molekul substrat menjadi produk. Dengan kehadiran enzim, waktu yang
dibutuhkan untuk bereaksi lebih singkat. Enzim bekerja hanya pada satu macam substrat
atau satu jenis reaksi karena enzim bekerja dengan spesifik. Sebagai contoh, enzim
selulase yang menghidrolisis ikatan -1,4-glikosidik pada molekul selulosa sehingga
membentuk gula yang lebih sederhana yaitu glukosa. Praktikum ini dilakukan bertujuan
untuk membuat kurva baku glukosa, menentukan nilai FPU (Filter Paper Unit) dari enzim
selulase, membuat reaksi enzimatis selulase dengan substrat selulosa (kertas Whatman),
menentukan nilai initial rate (Vo), membuat grafik Michaelis-Menten, serta menentukan
nilai Km dan Vmax enzim selulase tanpa inhibitor dan dengan menggunakan inhibitor
(EDTA). Pembuatan kurva baku standar glukosa dilakukan untuk mendapatkan persamaan
regresi linear yang akan digunakan untuk menghitung nilai FPU yang bertujuan untuk
mengetahui jumlah aktivitas enzim yang memproduksi 2.0 mg glukosa. Kemudian
dilakukan pengukuran absorbansi dari variasi sampel larutan stock enzim terhadap
variasi waktu sampel yang ditentukan dari 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 menit. Kemudian
masing-masing absorbansi yang diperoleh disubstitusi terhadap persamaan kurva baku
standar glukosa sehingga diperoleh konsentrasi masing-masing sampel. Untuk
menentukan nilai Km dan Vmax, maka terlebih dahulu dicari nilai V0 dengan metode DNS
(Dinitrosalicylic acid) untuk mendapatkan nilai absorbansi setiap sampel. Setelah
diperoleh nilai absorbansi, disubstitusi ke persamaan yang telah diperoleh maka didapat
nilai V0. Maka nilai Km dan Vmax dapat diperoleh dengan menggunakan modifikasi dari
persamaan Michaelis-Menten yaitu persamaan Lineweaver-Burk. Berdasarkan data yang
didapat, diperoleh nilai FPU sebesar 74 unit/ml. Berdasarkan perhitungan yang
dilakukan, diperoleh nilai Km dan Vmax tanpa inhibitor dan dengan inhibitor. Tanpa
inhibitor nilai Maka berdasarkan nilai yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa inhibitor
EDTA tergolong kepada inhibitor jenis non kompetitif.
Kata kunci : Enzim selulase, selulosa, FPU, Michaelis-Menten, Km, dan Vmax, Lineweaver-
Burk

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Tujuan Umum Percobaan


Percobaan ini bertujuan untuk meningkatkan keterampilan praktikan dalam melaksanakan
proses konversi enzimatis menggunakan enzim bebas atau enzim terimobilisasi.

1.2 Tujuan Khusus Percobaan


Percobaan ini memiliki tujuan khusus, yaitu :
1. Membuat kurva baku standar glukosa
2. Menentukan nilai FPU (Filter Paper Unit) enzim selulase
3. Membuat reaksi enzimatis selulase dengan substrat selulosa (kertas Whatman)
4. Membuat kurva Michaelis-Menten
5. Menentukan nilai Km dan Vmax enzim selulase tanpa inhibitor
6. Menentukan nilai Km dan Vmax enzim selulase dengan adanya inhibitor (EDTA).
BAB II
TEORI DASAR

II.1 Enzim Selulase


Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis yaitu
senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi dalam suatu reaksi
biokimia. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi
molekul lain yang disebut produk. Hal ini terjadi akibat pengaruh adanya enzim yang
bekerja dengan menurunkan energi aktivasi sehingga waktu reaksi lebih singkat.
Enzim yang digunakan pada praktikum ini adalah enzim bebas yaitu enzim yang
tidak terikat ke matriks. Enzim selulase termasuk kedalam enzim ekstraseluler yaitu enzim
yang dihasilkan di dalam sel, tetapi selanjutnya dikeluarkan ke media fermentasi di luar sel
untuk mendegradasi senyawa polimer sehingga mudah larut dan dapat diserap melalui
dinding sel (Stanburi dan Whitaker, 1984).
Enzim selulase merupakan enzim kompleks yang terdiri dari 3 tipe enzim yaitu
endoglukonase (endo-1,4-β-D-glukanase), eksoglukanase (ekso-β-1,4-glukanase), dan
selobiase (β-D- glukosidase) (Murashima dkk., 2002).
Seperti sifat enzim yang bekerja secara spesifik yaitu enzim hanya bekerja pada
satu jenis substrat saja maka enzim selulase hanya bekerja pada substrat selulosa.

II.2 Selulosa.
Selulosa adalah polimer glukosa yang berbentuk rantai linier dan dihubungkan oleh
ikatan β-1,4- glikosidik. Struktur yang linier menyebabkan selulosa bersifat kristalin dan
tidak mudah larut. Selulosa tidak mudah didegradasi secara kimia maupun mekanis. Di
alam, biasanya selulosa berasosiasi dengan polisakarida lain seperti hemiselulosa atau
lignin membentuk kerangka utama dinding sel tumbuhan (Holtzapple et.al 2003).
Unit penyusun (building block) selulosa adalah selobiosa karena unit keterulangan
dalam molekul selulosa adalah dua unit gula (D-glukosa). Selulosa adalah senyawa yang
tidak larut di dalam air dan ditemukan pada dinding sel tumbuhan terutama pada tangkai,
batang, dahan, dan semua bagian berkayu dari jaringan tumbuhan. Selulosa merupakan
polisakarida struktural yang berfungsi untuk memberikan perlindungan, bentuk,
penyangga terhadap sel, dan jaringan tumbuhan (Lehninger 1993).
Gambar II.2.1 Struktur Kimia Selulosa (Sumber : Lehninger 1993).

II. 3 Inhibitor
Inhibitor enzim merupakan molekul yang dapat mengganggu katalisis baik dengan
cara memperlambat maupun menghentikan reaksi enzimatis (Nelson dan Cox, 2005).
Terdapat dua tipe inhibisi enzim yaitu reversibel dan irreversibel. Inhibisi reversibel dapat
dibagi menjadi tiga yaitu inhibitor kompetitif, non kompetitif, dan unkompetitif. Inhibitor
kompetitif memiliki struktur yang menyerupai substrat dan akan bersaing dengan substrat
untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Inhibitor nonkompetitif bekerja dengan cara
berikatan pada bagian enzim sehingga mengubah konfirmasi tiga dimensi protein penyusun
enzim sehingga terbentuk kompleks enzim-inhibitor-substrat yang tidak aktif. Inhibitor
unkompetitif yatu inhibitor berikatan bukan pada sisi aktif enzim, tapi berikatan pada
kompleks enzim-substrat (ES) menghasilkan kompleks enzim-inhibitor-substrat yang tidak
aktif. Inhibisi irreversible terjadi akibat adanya ikatan kovalen yang kuat antara inhibitor
dan residu asam amino pada enzim, akibatnya inhibitor secara efektif merusak gugus
fungsional pada enzim yang esensial bagi aktivitas enzim.
Beberapa senyawa logam dan senyawa lainnya yang dapat menghambat aktivitas selulase
ialah Hg2+, Ag2+, Cu2+, surfaktan, senyawa pengkelat khususnya Sodium Dodecyl Sulphate
(SDS), dan Ethylene Diamine Tetraacetyc Acid (EDTA). Senyawa penghambat tersebut
dapat menekan seluruh kecepatan hidrolisis dengan menghambat adsorbsi eksoglukanase
dan endoglukanase pada selulosa dan juga menghambat aksi sinergis eksoglukanase dan
endoglukanase yang bekerja pada permukaan selulosa.

Pada praktikum ini, inhibitor yang digunakan adalah EDTA. EDTA adalah asam
kompleks berupa asam karboksilat poliamino yang biasa digunakan sebagai agensi
pengkelat atau ligan beberapa ion atau unsur logam terutama Fe3+ dan Ca2+. Mekanisme
kerja EDTA yaitu dengan mengkelat ion logam yang ada pada kofaktor sehingga kofaktor
tidak bisa berikatan kompleks dengan apoenzim yang disebut sebagai holoenzim, maka
enzim menjadi tidak aktif. Kofaktor merupakan bagian sisi aktif enzim berupa senyawa
organik yang dihasilkan oleh sel sedangkan apoenzim merupakan struktur enzim yang
memiliki sifat enzimatis rendah.

II. 4 Initial Rate (Vo), Km, dan Vmax

Initial rate dapat ditentukan dengan mengukur produk per satuan waktu. Produknya
diukur dengan metode DNS menggunakan spektofotometer UV-Vis berdasarkan
persamaan regresi konsentrasi substrat. Enzim selulase mengkatalisis reaksi hidrolisis
selulosa menjadi gula pereduksi, sehingga konsentrasi gula pereduksi dalam campuran
menjadi indikator yang diamati dalam menentukan laju awal reaksi enzimatis. Akan tetapi,
gula pereduksi tidak dapat diamati menggunakan spektrofotometer UV-Vis secara
langsung karena tidak berwarna dan tidak menyebabkan kekeruhan/turbiditas, maka perlu
ditambahkan suatu reagen yang dapat menghentikan aktivitas enzimatis, sekaligus
memberi warna pada glukosa.
Reaksi dengan DNS yang terjadi merupakan reaksi redoks pada gugus aldehid gula
dan teroksidasi menjadi gugus karboksil. Sementara itu, DNS sebagai oksidator akan
tereduksi membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang merupakan suatu senyawa yang
mampu menyerap dengan kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada 540 nm. Semakin
banyak komponen pereduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin banyak pula
molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang terbentuk dan mengakibatkan serapan semakin
tinggi (Sazciet.al. 1986).
Laju awal (V0) dari reaksi yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya
konsentrasi substrat hingga dicapai keadaan dimana penambahan substrat tidak lagi
meningkatkan laju awal reaksi dan bila semua enzim dalam keadaan ES (jenuh oleh
substrat) maka laju akan mencapai nilai maksimum (Vmax). Laj reaksi bergantung pada
kondisi larutan dan konsentrasi substrat. Kondisi yang menyebabkan denaturasi protein
seperti temperatur tinggi, konsentrasi garam yang tinggi, dan nilai pH yang terlalu tinggi
atau terlalu rendah akan menghilangkan aktivitas enzim. Peningkatan konsentrasi substrat
cenderung meningkatkan aktivitas enzim. Untuk menentukan laju maksimum suatu reaksi
enzimatik, konsentrasi substrat ditingkatkan sampai laju pembentukan produk yang
terpantau menjadi konstan (Radzicka dan Wolfenden, 1995).

Pada laju maksimum (Vmax), semua sisi aktif enzim akan berikatan dengan substrat
dan jumlah kompleks ES adalah sama dengan jumlah total enzim yang ada. Jumlah
substrat yang diperlukan untuk mencapai nilai laju reaksi tertentu sangatlah penting. Hal
ini diekspresikan oleh konstanta Michaelis-Menten (Km) yang merupakan konsentrasi
substrat yang diperlukan oleh suatu enzim untuk mencapai setengah kelajuan
maksimumnya. Setiap enzim memiliki nilai Km yang berbeda-beda untuk satu subtrat dan
ini dapat menunjukkan seberapa kuatnya pengikatan substrat ke enzim (Radzicka dan
Wolfenden, 1995).

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi enzim yang tetap, maka
pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi. Akan tetapi pada batas
konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat
diperbesar. Hal ini berdasarkan pada hukum Michaelis-Menten yang menyatakan bahwa
kecepatan reaksi akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat.
Kecepatan reaksi akan terus meningkat dengan nilai yang semakin kecil hingga mencapai
titik batas dimana enzim jenuh dengan substrat.

Gambar II.2 Pengaruh Konsentrasi Substrat Pada Laju Aktivitas Enzim

Menurut Leonor Michaelis dan Maud Menten, penggabungan enzim (E) dengan
substrat (S) merupakan reaksi yang dapat balik dan berlangsung relatif cepat membentuk
kompleks enzim-substrat (ES) yang kemudian terurai dan membentuk produk reaksi (P)
dan enzim bebas (E).

Persamaan Michaelis-Menten yaitu hubungan kuantitatif antara laju reaksi enzim


dan konsentrasi substrat, bila V max dan Km diketahui. Dikarenakan sangat sulit untuk
mencari harga Vmakx dan Km secara langsung, maka persamaan tersebut harus
ditransformasikan dengan metode Lineweaver-Burk yang merupakan bentuk
penyederhanaan terhadap rumus Michaelis Menten.

dP Vmax [S]
V= =( )
dT K M + [S]

1 K M + [ S]
=( )
V Vmax [S]

1 KM [S]
= +
V Vmax [S] Vmax [S]

1 Km 1 1
= +
V Vm [S] Vm

Gambar II.3 Lineweaver-Burk

Data untuk menghitung harga Vmax dan K m adalah dengan membuat grafik
hubungan antara V1 VS [S]
1
sehingga diperoleh persamaan linear

y = ax + b

1 1 1
dimana y = V
dan x = . Intersep garis (b) yang didapat dari persamaan linear adalah
[S] Vmax

dan slope (a) merupakan VKmax


m
.
Beberapa plot linear lain untuk data kinetik telah dikembangkan yaitu plot Woolf
dan Eadie Hofstee. Plot Eadi Hofstee menghasilkan Vmax dan K m dengan cara yang
langsung dan memaparkan awal dari linearitas.

𝑉
𝑉 = 𝑉𝑚 − 𝐾𝑚
[𝑆]

Gambar II.4 Plot Eadie Hofstee

Pada percobaan ini hal pertama yang harus dilakukan adalah pembuatan buffer
sitrat yang bertujuan untuk mempertahankan pH. Hal ini berkaitan dengan kondisi
lingkungan kerja yang cocok bagi enzim selulase yaitu 4.8 maka buffer sitrat dibuat
dengan menambahkan NaOH untuk menaikkan pH hingga 4.8. Kemudian dibuat reagen
DNS yang berfungsi untuk menghentikan reaksi dan menguji sampel yang telah
mengandung glukosa akibat kerja enzim selulase. Prinsip kerja DNS yaitu dengan
mengoksidasi gugus aldehid pada glukosa menjadi gugus karboksil. Dengan adanya
perubahan warna dari kuning ke jingga maka reaksi DNS positif atau dengan kata lain
sampel telah mengandung glukosa. Pemanasan dilakukan pada suhu 50 oC untuk
mempercepat reaksi dimana suhu kerja optimum enzim selulase berada pada suhu 50 oC.
Pembuatan kurva baku standar glukosa dibuat dengan memplot sampel glukosa
yang konsentrasinya berbeda-beda terhadap nilai absorbansi masing-masing sampel, maka
diperoleh kurva standar dan persamaan regresi linearnya yang akan digunakan untuk
memperoleh nilai FPU. Nilai FPU diperoleh dengan memplot nilai masing-masing
konsentrasi sampel terhadap nilai konsentrasi sampel yang diperoleh dari hasil percobaan
sehingga diperoleh konsentrasi enzim yang melepaskan dua mg glukosa. Dengan
mensubstitusi nilai konsentrasi enzim yang diperoleh terhadap persamaan untuk mencari
nilai aktivitas enzim maka diperoleh nilai aktivitas enzim selulase dalam bentuk FPU
unit/ml.
Penentuan nilai V0 (kecepatan awal) reaksi sangat penting untuk bisa medapatkan
nilai Km dan nilai Vmax. V0 diperoleh dengan memplot nilai konsentrasi produk tehadap
variasi waktu, maka dari grafik dapat diketahui nilai kecepatan awal reaksi. Dengan
melinearisasikan persamaan Michaelis-Menten secara aljabar atau yang disebut dengan
persamaan Lineweaver-Burk maka diperoleh nilai Km dan nilai Vmax.
BAB III
LANGKAH-LANGKAH PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan


III.1.1 Alat
Alat Ukuran Jumlah
Gelas kimia 2000 mL 1
Gelas kimia 1000 mL 1
Gelas kimia 500 mL 4
Gelas kimia 100 mL 4
Gelas ukur 1000 mL 1
Gelas ukur 25 mL 2
Mikro pipet 100-1000 µL 2
Tip 1 mL 100
Mikro tube 1,5 mL 48
Kuvet Enzim - 8
Thermometer - 2
Hot plate - 2
Pipet volum 10 mL 1
Stopwatch - 2
Tabung reaksi - 24
Penjepit tabung - 2
Sentrifugal - 1
Spektrofotometer - 1
Pipet tetes - 2
Kaca arloji - 2
PH meter - 1
Magnetic stirrer - 2
Batang pengaduk - 2
Pinset - 2
Spatula - 2
III.1.2 Bahan

Bahan Jumlah
Aquades Secukupnya

3,5-Dinitrosalicylic acid 1.497 gram


NaOH 68 gram
Garam Roschelle 43.22 gram

Asam Sitrat Monohidrat 140 gram


Enzim Selulase 2 ml
Kertas Whatman 4 gram
Glukosa 0.5 gram
EDTA 10 ml
Air Keran Secukupnya

III.2 Tahapan-Tahapan Percobaan


III.2.1. Pembuatan Larutan Buffer Sitrat

Mulai

500 ml 140 gram asam Sitrat


akuades Monohidrat

Dimasukkan kedalam
gelas beker 1000 ml

Dihomogenkan

NaOH Ditambahkan hingga pH


4,8

Larutan Buffer
III.2.2. Pembuatan Reagan DNS

Mulai

DNS 1.4971 gram + NaOH 2.7966 gram


600 ml + 43.2203 garam Rochelle
akuades

Dimasukkan kedalam gelas


kimia 1000 ml

Dihomogenkan

Larutan DNS
III.2.3. Pembuatan Larutan Stok Glukosa

Mulai

50 ml 0.5 gram glukosa


akuades

Diamasukkan kedalam gelas


kimia 100 ml

Dihomogenkan

Larutan induk
glukosa
III.2.4. Pembuatan Kurva Baku Glukosa

Larutan Glukosa

(0,5:1,2,4,6
, 8) ml
Glukosa Glukosa Glukosa Glukosa Glukosa Glukosa
buffer sitrat 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
pada
masing-
masing
tabung

Diinkubasi pada penangas air


50 ̊C selama 10 menit

Ditambahkan
1 ml buffer sitrat +50 pada masing-
mg substrat kertas masing tabung
whatman

Diinkubasi pada penangas air


50 ̊C selama 1jam

3 ml DNS Ditambahkan

Dipindahkan campuran ke
penangas air 100 ̊C selama 5 menit

Didinginkan dengan air mengalir


sampai dingin

Disentrifuga pada kecepatan


15000 rpm selama 5 menit

Diambil 1 ml

Diukur Absorbansi

Selesai
III.2.5. Pengujian Aktivitas Enzim Selulosa

III.2.5.1 Pembuatan Larutan Stok Enzim

Mulai

1 ml enzimselulosa 19 ml buffer sitrat pH

Dimasukkan kedalam gelas kimia


50 ml

Dihomogenkan

Larutan stok enzim selulosa


III.2.5.2. Variasi Pengenceran Stok Enzim

Stok enzim

(0.16,1.7 ,1.8
,1.85, dan 1.65)
ml buffer sitrat 0.35 ml 0.3 ml 0.2 ml 0.15 ml 0.1 ml
pada masing- enzim enzim enzim enzim enzim
masing tabung

Diinkubasi pada penangas air


50 ̊c selama 10 menit

1 ml buffer sitrat + 50 Ditambahkan ke dalam masing-masing


mg substrat kertas tabung
whatman

Diinkubasi pada penangas air


50 ̊C selama 1 jam

3 ml DNS Ditambahkan

Dipindahkan campuran ke penangas


air 100 C
̊ selama 5 menit

Didinginkan dengan air mengalir

Disentrifuga pada kecepatan


15000 rpm selama 5 menit

Diambil 1 ml

Diukur Absorbansi

Selesai
III.2.6. Pengujian Aktivitas Enzim Selulosa tanpa inhibitor

Mulai

1 gram kertas Dicampurkan pada gelas


whatman + 90 kimia 250 ml
ml buffer sitrat

10 ml enzim Diinkubasi 50 0C sesuai waktu


yang ditentukan

Diambil 1 ml larutan

Dipindahkan dalam tabung reaksi


setiap 10 menit hingga diperoleh 6
data

3 ml DNS Dicampurkan pada 1 ml buffer


tabung reaksi sitrat

Diinkubasi 1000C
selama 5 menit

Disentrifuga pada kecepatan


15000 rpm selama 5 menit

Diambil 1 ml

Diukur Absorbansi

Selesai
III.2.7. Pengujian Aktivitas Enzim Selulosa Dengan Inhibitor

Mulai

1 gram kertas
whatman + 90 ml Dicampur pada gelas kimia
baffer sitrat + 10 ml 250 ml
EDTA 2 µM

10 ml enzim Diinkubasi500C selama 10 menit


selulosa

Diambil 1 ml larutan

Dipindahkan dalam tabung reaksi


setiap 10 menit hingga diperoleh 6
data

3 ml DNS Dicampur pada tabung 1 ml buffer


reaksi sitrat

Diinkubasi 1000 C
selama 5 menit

Disentrifuga pada kecepatan


15000 rpm selama 5 menit

Diambil 1 ml

Diukur Absorbansi

Selesai
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

IV. 1. Pembuatan Kurva Baku Glukosa


Kurva baku glukosa adalah kurva yang menghubungkan antara konsentrasi glukosa
terhadap absorbansi. Absorbansi dari masing-masing sampel yang konsentrasinya berbeda-
beda diukur dengan menggunakan spectrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540
nm. Pengukuran konsentrasi glukosa dilakukan dengan metode DNS, dimana prinsip DNS
adalah penentuan jumlah gula pereduksi yang kaitannya erat dengan aktivitas enzim
dimana semakin tinggi aktivitas enzim maka semakin tinggi pula gula pereduksi yang
dihasilkan.
DNS merupakan senyawa aromatik yang akan bereaksi dengan gula pereduksi
seperti glukosa, maltosa, dan sukrosa yang akan membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid
yaitu suatu senyawa yang mampu menyerap dengan kuat radiasi gelombang
elektromagnetik pada 540 nm. Semakin banyak komponen pereduksi yang terdapat dalam
sampel, maka akan semakin banyak pula molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang
terbentuk dan mengakibatkan serapan semakin tinggi.
DNS bereaksi dengan glukosa secara oksidasi yang akan memutus ikatan aldehid
pada glukosa menjadi gugus karboksil, sementara DNS yang berperan sebagai oksidator
akan tereduksi dan membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid. Dengan adanya glukosa
sebagai hasil konversi selulosa menjadi glukosa pada sampel akan menyebabkan DNS
yang awalnya berwarna kuning akan berubah menjadi warna jingga (batu bata). Pada
pembuatan reagen DNS, ditambahkan NaOH yang bertujuan untuk memberikan suasana
basa karena DNS akan bereaksi pada suasana basa, kemudian ditambahkan garam Rochelle
(Kalium Natrium Tartrat) yang bertujuan untuk mempertahankan warna pada saat reaksi.
Semakin tinggi konsentrasi glukosa maka semakin tinggi pula absorbansi yang dihasilkan
pada masing-masing sampel Warna jingga yang dihasilkan akan lebih pekat pada
konsentrasi yang glukosa yang lebih tinggi sehingga pada saat pengukuran absorbansi
sampel dengan warna yang lebih pekat akan lebih kuat menangkap radiasi gelombang
elektromagnetik pada 540 nm sehingga absorbansinya lebih tinggi. Hal ini sesuai dengan
data yang diperoleh pada praktikum yang telah dilaksanakan.
Tabel IV.1 Konsentrasi terhadap Absorbansi
Konsentrasi Glukosa
Absorbansi
(mg/0.5ml)
3.350 0.153
2.500 0.114
1.650 0.093
1.000 0.078
0.714 0.055

Untuk pembuatan kurva baku glukosa maka diplot konsentrasi glukosa terhadap absorbansi
dimana X sebagai konsentrasi dan Y sebagai absorbansi yaitu :

0,180
0,160 y = 0.035x + 0.031
0,140 R² = 0.974

0,120
Absorbansi

0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000
Konsentrasi Glukosa mg/0.5ml

Gambar IV.1.1 Kurva Baku Glukosa

Dari grafik kurva baku glukosa dapat dilihat bahwa semakin kecil konsentrasi maka
absorbansinya semakin kecil juga. Hal ini menunjukkan bahwa absorbansi yang semakin
kecil diakibatkan karena kandungan glukosa sampel semakin kecil. Nilai koefisien grafik
sebesar R2 = 0.974 dimana tergolong baik karena nilai koefisen korelasi (R2) lebih besar
dari 0.95 yang mana koefisien korelasi akan semakin baik jika mendekati 1. Koefisien
korelasi yang diperoleh sebesar 97,4% yang artinya konsentrasi sangat mempengaruhi
absorbansi. Diperoleh juga persamaan linear kurva baku yaitu y = 0.035x + 0.031 dimana
persamaan ini akan digunakan untuk menentukan konsentrasi glukosa pada larutan stock
enzim yang akan digunakan dalam penentuan nilai FPU pada aktivitas enzim.
Reaksi antara gula pereduksi dengan DNS merupakan reaksi redoks pada gugus
gula dan teroksidasi menjadi gugus karboksil. Sementara itu DNS sebagai oksidator akan
tereduksi membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat. Reaksi berlangsung dalam suasana
basa dan suhu tinggi sekitar 90-1000C. Bila terdapat gula pereduksi pada sampel maka
larutan DNS yang awalnya berwarna kuning akan berubah menjadi warna jingga
kemerahan (Kusmiati & Agustini, 2010). Semakin tinggi intensitas warna DNS maka
jumlah gula yang tereduksi semakin banyak (Rosyada, 2015).

Gambar IV.1.2 Reaksi Glukosa dengan DNS

IV. 2. Penentuan FPU (Filter Paper per Unit)


Penentuan nilai FPU bertujuan untuk mengetahui jumlah aktivitas enzim yang
memproduksi 2 mg glukosa. Penentuan FPU dapat diperoleh dengan menggunakan
persamaan kurva baku glukosa dengan mensubstitusi absorbansi pengenceran enzim ke
fungsi y sehingga diperoleh konsentrasi glukosa hasil pengenceran. Pengenceran yang
dilakukan dapat dilihat pada tabel di bawah ini :

Tabel IV. 1.1. Absorbansi terhadap Konsentrasi Pengenceran Enzim


Pengenceran Buffer sitrat 1:20 Enzim Konsentrasi Absorbansi 540 nm
(µL) (µL)
1 1650 350 0.009 0.128
2 1700 300 0.008 0.097
3 1800 200 0.005 0.088
4 1850 150 0.004 0.083
5 1900 100 0.003 0.072

Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi pengenceran maka
absorbansi semakin tinggi dan sebaliknya. Dapat disimpulkan bahwa konsentrasi
berbanding lurus dengan absorbansi.
Selanjutnya nilai absorbansi pengenceran enzim disubstitusi ke persamaan kurva
baku glukosa sehingga diperoleh konsentrasi masing-masing sampel hasil pengenceran.
Konsentrasi dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel IV.2.2. Absorbansi terhadap Konsentrasi Glukosa pada Pengenceran Enzim
Absorbansi [Glukosa] (mg/0.5ml)
0.128 2.771
0.096 1.871
0.087 1.614
0.083 1.486
0.071 1.163

Untuk mendapatkan nilai FPU diplot konsentrasi enzim terhadap konsentrasi


glukosa dimana X sebagai konsentrasi glukosa dan Y sebagai konsentrasi enzim. Grafik
dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

0,010
0,009 y = 0,0039x - 0,0015
0,008 R² = 0,8581
Pengenceran Enzim

0,007
0,006
0,005
0,004
0,003
0,002
0,001
0,000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000
Konsentrasi Glukosa (mg/0.5ml)

Gambar IV.2.1 Grafik Konsentrasi Glukosa terhadap Konsentrasi Enzim

Dari grafik di atas dapat ditentukan aktivitas enzim saat memproduksi 2.0 mg
glukosa. Persamaan linear yang diperoleh adalah y = 0.003x – 0.001. Persamaan ini akan
digunakan dalam penentuan aktivitas enzim saat menghasilkan 2.0 mg glukosa dengan
mensubstitusi nilai X dengan 2 sehingga diperoleh aktivitas enzim sebesar 0.005.
Selanjutnya disubstitusi ke persamaan umum FPU sehingga diperoleh nilai FPU sebesar
74 unit/mL.
IV.3. Penentuan Kecepatan Awal (Vo) Reaksi Enzimatik

Penentuan nilai Vo (initial rate) dilakukan untuk menentukan kurva Michaelis


Menten yang akan menjadi bahan acuan terhadap penentuan parameter kinetika reaksi (V m
dan Km) dimana diperoleh data absorbansi terhadap tujuh variasi waktu yaitu :

Tabel IV.3.1. Variasi Waktu terhadap Glukosa

Variasi Waktu Abs 540 nm


(menit) Gabungan
10 2.049
20 2.443
30 2.611
40 2.802
50 2.951
60 2.989
70 3.000

3,500

3,000

2,500 y = 0,0153x + 2,08


R² = 0,8812
Absorbansi

2,000

1,500

1,000

0,500

0,000
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Variasi Waktu

Gambar IV.3.1. Grafik Absorbansi terhadap Variasi Waktu

Dari grafik di atas diperoleh persamaan garis serta koefisien relasi R2 dimana, R2
bernilai 0.881. Dapat disimpulkan bahwa nilai absorbansi semakin meningkat seiring
berjalan waktu.
Nilai absorbansi pada tiap variasi waktu disubstitusikan ke persamaan kurva baku
glukosa sehingga diperoleh konsentrasi glukosa seperti pada tabel berikut :

y = 0.035x + 0.031

Tabel IV.3.2. Glukosa terhadap Variasi Waktu Tanpa Inhibitor dan dengan Inhibitor

Tanpa Inhibitor Dengan Inhibitor (EDTA)

Variasi Waktu [Glukosa] Variasi Waktu [Glukosa]


(menit) (970 mg/ml) (menit) (970 mg/ml)
10 57.657 10 46.457

20 68.914 20 56.014
30 73.714 30 62.343

40 79.157 40 70.829
50 83.429 50 75.414
60 84.500 60 81.771

70 84.829 70 83.900

Dari Tabel IV.3.2. diperoleh konsentrasi glukosa semakin lama semakin


meningkat. Hal ini terjadi akibat kerja enzim selulase mampu mendegradasi selulosa
melalui proses katalis yang bekerja untuk melepas gula atau glukosa. Proses pembentukan
glukosa dari selulosa dengan enzim selulase menggunakan 3 tipe enzim selulase yaitu:

1. Endo-1,4 β-D- glucanase (endoselulosa, carboxymethyl cellulose atau Ncase) yang


memutus ikatan internal α-1,4 glikosida untuk menghasilkan ologidekstrin dengan
panjang rantai bervariasi. Efek yang ditimbulkan adalah panjang rantai polisakarida
semakin berkurang dengan cepat dan diikuti peningkatan jumlah gula perduksi secara
bertahap

2. Exo-1,4 β-D- glucanase (selobiohidrolase) yang mengurangi selulosa dari ujung


pereduksi dan non-pereduksi untuk menghasilkan selobiosa atau glukosa. Efek yang
ditimbulkan adalah meningkatnya jumlah gula pereduksi secara cepat dan secara
keseluruhan hanya terjadi sedikit perubahan panjang rantai dalam waktu singkat

3. Β-glucosidase yang mengurangi selobiosa untuk menghasilkan glukosa.


Ketiga tipe enzim ini bekerja secara sinergis mendegradasi selulosa dan melepas
gula pereduksi atau glukosa sebagai produk akhir. Enzim selulase menghidrolisis ikatan β-
1,4-glikosidik pada molekul selulosa sehingga menghasilkan glukosa (Rosyada, 2015).

Selanjutnya diplot grafik dengan sumbu X sebagai konsentrasi glukosa dan sumbu
Y sebagai variasi waktu. Grafik dapat dilihat sebagai berikut :

90,000
y = -0,009x2 + 1,1574x + 47,739
80,000 R² = 0,9933
70,000
Tanpa Inhibitor
[Glukosa] (970 mg/ml)

60,000
y = -0,0053x2 + 1,0585x + 36,431
50,000 R² = 0,997 Dengan
Inhibitor
40,000
Poly. (Tanpa
30,000 Inhibitor)
20,000 Poly. (Dengan
Inhibitor)
10,000
0,000
0 20 40 60 80
Variasi Waktu (menit)

Gambar IV.3.1. Grafik Pengaruh Waktu Terhadap Reaksi Enzimatik Tanpa Inhibitor dan
dengan Inhibitor

Selanjutnya , diplot variasi waktu sebagai X dan konsentrasi glukosa sebagai Y


sehingga diperoleh persamaan polinomial orde 2 yaitu :

𝑦 = −0.009𝑥 2 + 0.977𝑥 + 58.41 (Tanpa Inhibitor)

𝑦 = −0.005𝑥 2 + 1.058𝑥 + 36.43 (Dengan Inhibitor)

Melalui persamaan Michaelis Menten :

dP
V=
dT

maka dengan memisalkan Y sebagai V0 dan X sebagai waktu, maka didapatkan hasil
penurunan yaitu :

𝑦 = −0.018𝑥 + 0.977 (Tanpa Inhibitor)

𝑦 = −0.010𝑥 + 1.058 (Dengan Inhibitor)


Selanjutnya disubstitusikan X sebagai variasi waktu dan Y sebagai V0 maka
diperoleh nilai pada tabel sebagai berikut :

Tabel IV.3.3 Kecepatan Reaksi Terhadap Variasi Waktu Tanpa Inhibitor dan dengan
Inhibitor (EDTA)

Tanpa Inhibitor Dengan Inhibitor (EDTA)

Variasi Waktu V0 (µM/s) Variasi Waktu V0 (µM/s)


(menit) (menit)
10 0.977 10 0.958

20 0.797 20 0.858
30 0.617 30 0.758

40 0.437 40 0.658
50 0.257 50 0.558

60 0.077 60 0.458
70 -0.103 70 0.358

Pada percobaan hidrolisis selulosa, praktikan tidak menyertakan waktu 0 menit


dikarenakan pada saat percobaan, subtrat telah diinkubasi sebelum sampel diambil. Hal ini
menyebabkan enzim telah aktif bekerja. Sehingga variasi waktunya dimulai dari waktu 10
menit sampai 70 menit. Nilai kecepatan awal reaksi enzimatis yang menurun dapat terjadi
karena penurunan aktivitas enzim diakibatkan enzim yang telah jenuh berikatan dengan
substrat, seluruh sisi aktif sudah berikatan dengan substrat. Sehingga saat substrat diambil,
kompleks enzim juga cenderung mengalami reaksi kearah pelepasan substrat tidak hanya
pembentukan produk. Dengan demikian, aktivitas enzim rendah disertai dengan sisi aktif
enzim yang sudah jenuh oleh substrat menyebabkan terjadinya reaksi reversible konversi
enzimatis, tetapi tidak sampai pada kondisi kesetimbangan. Dapat dilihat pada lampiran
data mentah, sebagian besar data menunjukkan korelasi yang diperoleh nilainya lebih besar
dari 0.90 (R2 < 0.9). Dalam statistik, nilai korelasi di atas 0.9 menunjukkan kecocokan
yang kuat antara model dan data nyata. Maka data yang diperoleh menunjukkan perilaku
reaktan dan produk konversi enzimatis yang diharapkan.
IV.4 Pembuatan Kurva Michaelis Menten Pada Konsentrasi Substrat Tanpa
Inhibitor

Pembuatan kurva Michaelis-Menten didasarkan untuk mengetahui kinetika enzim


dimana kurva Michaelis-Menten ini dapat menggambarkan laju reaksi enzimatik dengan
menghubungkan laju reaksi V0 terhadap [S] (Michaelis, Menten. 1913).

Selanjutnya diplot grafik Michaelis-Menten dengan sumbu X sebagai konsentrasi


substrat dan sumbu Y sebagai nilai Vo (initial rate). Dalam menentukan variasi subtrat
maka dipakai persamaan neraca massa black box.

Jumlah substrat awal = Jumlah substrat akhir + Jumlah produk

Sehingga diperoleh tabel variasi produk terhadap variasi waktu sebagai berikut :

Tanpa Inhibitor Dengan Inhibitor (EDTA)

Variasi Waktu [Subtrat] Variasi Waktu [Subtrat]


(menit) (970mg/ml) (menit) (970mg/ml)
10 970.000 10 970.000

20 739.371 20 784.172

30 463.714 30 560.116
40 168.857 40 310.744

50 -147.772 50 27.428
60 -481.486 60 -274.228

70 -819.486 70 -601.312

Selanjutnya diplot grafik Michaelis Menten dengan sumbu X sebagai konsentrasi


substrat dan sumbu Y sebagai nilai Vo (initial rate) sehingga diperoleh grafik seperti
Grafik IV.4.1. yaitu :
1,2

1 R² = 0,9958 Tanpa Inhibitor

0,8
V0 (µM/s) R² = 0,997 Dengan Inhibitor
0,6
Linear (Tanpa
0,4 Inhibitor)
Linear (Dengan
0,2 Inhibitor)
Linear (Dengan
0 Inhibitor)
0,000 500,000 1000,000 1500,000
[Subtrat] (970mg/ml)

Gambar IV.4.1 Kurva Michaelis Menten pada Substrat tanpa Inhibitor

Pada literatur, umumnya kurva Michaelis-Menten merupakan kurva sigmoid, di


mana pada saat konsentrasi substrat bernilai nol, kecepatan awal reaksi bernilai nol juga.
Seiring kenaikan konsentrasi substrat, terjadi kenaikan laju awal reaksi, hingga pada saat
seluruh sisi aktif enzim jenuh akan ikatan dengan substrat, kurva cenderung konstan dan
mendekati suatu garis kecepatan maksimum (Vm). Pada kurva yang diperoleh praktikan,
terbentuk kurva Michaelis-Menten. Hal ini menunjukkan, perubahan konsentrasi substrat
menjadi produk glukosa yang terkonversi semakin meningkat. Pada reaksi enzimatis,
terdapat dua tahapan reaksi, yaitu reaksi reversibel saat pembentukan komplek enzim-
substrat, serta reaksi irreversibel saat pembentukan produk. Reaksi kedua bersifat sangat
irreversibel, sehingga untuk terjadinya reaksi ke arah sebaliknya tidak mungkin terjadi.
Namun pada reaksi pembentukan kompleks enzim-substrat, hal ini mungkin terjadi karena
reaksi bersifat reversibel.

IV. 5. Penentuan Nilai V m dan Km pada Substrat tanpa Inhibitor dan dengan
Inhibitor

Penentuan nilai Vm dan Km dilakukan dengan menggunakan metode Lineweaver-


Burk. Dimana persamaan Michaelis-Menten dapat diturunkan secara aljabar dalam bentuk
lain menjadi persamaan Lineweaver-Burk karena dapat menghasilkan penentuan V max
secara lebih tepat yang hanya dapat diduga pada pemetaan V0 terhadap [S] (Lineweaver,
Burk. 1934).
Pada metode ini diplot nilai 1/[S] dan 1/V0 sehingga diperoleh data seperti Tabel
IV.5.1 berikut:
Tabel IV.5.1 1/Vo terhadap 1/[S] pada Konsentrasi Substrat Tanpa Inhibitor dan dengan
Inhibitor
Tanpa Inhibitor Ada Inhibitor
[S] V0 1/ [S] (10
V0 (10mg/ 1/V0 (10 1/ [S] (10 (mg/10 [S] (mg/10 1/V0 (10 mL/mg)
(10mg/ml) mL) mL/mg) mL/mg) mL) mL) mL/mg)
0.977 970.000 1.023541 0.001031 0.958 970.000 1.043841 0.001030928

0.797 739.371 1.254705 0.001353 0.858 784.172 1.165501 0.00127523

0.617 463.714 1.620746 0.002157 0.758 560.116 1.319261 0.001785344

0.437 168.857 2.28833 0.005922 0.658 310.744 1.519757 0.003218083

0.257 -147.772 3.891051 -0.00677 0.558 27.428 1.792115 0.036459093

0.077 -481.486 12.98701 -0.00208 0.458 -274.228 2.183406 -0.003646601

-0.103 -819.486 -9.70874 -0.00122 0.358 -601.312 2.793296 -0.00166303

Selanjutnya di plot data pada tabel IV.5.1 diatas sehingga memperoleh grafik
seperti gambar berikut :

3
y = 237,11x + 0,9267 2,5 Tanpa Inhibitor
R² = 0,9376
2
Dengan Inhibitor
1,5
1/V0 (s/µM)

1 Linear (Tanpa
y = 202,81x + 0,8915 Inhibitor)
0,5 R² = 0,9339 Linear (Tanpa
0 Inhibitor)
-0,01 -0,005 0 0,005 0,01 Linear (Dengan
-0,5
Inhibitor)
-1
Linear (Dengan
-1,5 Inhibitor)
1/[S] (ml/970mg)

Gambar IV.5.1 Kurva Lineweaver Burk Tanpa Inhibitor dan dengan Inhibitor
Dari grafik Lineweaver-Burk tanpa inhibitor diperoleh persamaan y = 237.1x +
0.926 dengan koefisien relasi (R2) sebesar 0.937. Nilai tersebut termasuk dalam kategori
baik. Nilai koefisien korelasi akan semakin baik jika nilainya mendekati 1.
Dari persamaan untuk konsentrasi subtrat tanpa inhibitor melalui kurva
Lineweaver-Burk dapat diperoleh nilai V m dan Km, dimana nilai intersept = 1/Vmax
sehingga diperoleh nilai Vmax sebesar 1.079 µM/s dan nilai slope = Km/Vmax sehingga
diperoleh nilai Km sebesar 255.830 (970mg/mL).
Untuk grafik Lineweaver-Burk dengan adanya inhibitor yaitu EDTA diperoleh
persamaan y = 202.8x + 0.891 dengan koefisien relasi (R2) sebesar 0.933. Nilai tersebut
termasuk dalam kategori baik. Nilai koefisien korelasi akan semakin baik jika nilainya
mendekati 1.
Melalui persamaan untuk konsentrasi substrat dengan adanya inhibitor yaitu EDTA
melalui kurva Lineweaver-Burk dapat diperoleh nilai Vm dan Km, dimana nilai intersept =
1/Vmax sehingga diperoleh nilai Vmax sebesar 1.122 µM/s dan nilai slope = Km/Vmax
sehingga diperoleh nilai Km sebesar 227.541 (970mg/mL).
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN

III.1 Kesimpulan
Dari hasil percobaan yang telah dilakukan maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
 Persamaan kurva baku glukosa yaitu y = 0.035x + 0.031
 Nilai FPU yang diperoleh adalah 74 FPU/mL.
 Pada substrat tanpa inhibitor, nilai Vmax = 1.079 µM/s dan nilai Km = 255.830
(970mg/mL).
 Pada substrat dengan inhibitor, Vmax = 1.122 µM/s dan nilai Km = 227.541
(970mg/mL).
 Inhibitor yang digunakan yaitu EDTA merupakan jenis inhibitor kompetitif

III.2 Saran
 Pada saat melakukan praktikum, pembuatan larutan disarankan lebih akurat agar
konsentrasi setiap larutan yang diinginkan sesuai dengan yang diharapkan
 Sebaiknya praktikan mempu memperkirakan jumlah larutan yang dibutuhkan agar
saat praktikum, bahan yang sudah dibuat mencukupi selama praktikum berlangsung
 Saat pembuatan DNS, disarankan mencari alternatif lain pengganti fenol dan
sodium metabisulfite dalam campuran reagen DNS untuk melarutkan DNS
tersebut.
DAFTAR PUSTAKA

Baker, J and B. Adney. 2008. Laboratory Analytical Procedure : Measurement of Celluase


Activities. Colorado. National Renewable Energy Laboratory.

Chalal, D.S 1983. Growth Characteristic Of Microorganism In Solid State Fermentation


For Uppgrading Of Protein Values Of Lignocelluloses And Cellulose Production.
American Chemical Society: 205 – 310

Holtzapple, M. T. (2003). Hemicelluloses. In Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition


(pp. 3060-3071). Academic Press.

Lehninger, A.L. 1997. Dasar-dasar Biokimia (edisi ke-Jilid 1, diterjemahkan oleh M.


Thenawidjaja). Jakarta: Erlangga.

Lineweaver, H. and D. Burk. 1934. J. Am. Chem. Sos. 56. 658

Michaelis, L. Menten, M.L. (1913). "Die Kinetik der Invertinwirkung". Biochem Z 49:
333–369, diterjemahkan oleh M. Thenawidjaja). Jakarta: Erlangga.

Miller, G.L. 1959. Use of Dinitrosalicilyc Acid Reagent for Determination of Reducing
Sugar. Anal Chem. 31. 426-428

Murashima, K., A. Kosughi and RH. Doy. 2002. Synergistic Effects on Crystalline
Cellulose Degradation Between Cellulosomal Cellulases From Clostridium cellulovorans.
J. Bacteriol184:5088-5095

Nelson, D.L dan Cox, M.M. 2005. Principles of Biochemistry. Ed ke-4. New York: Worth
Publisher.

Radzika A, Wolfenden R. 1995. A Proficient Enzyme. Science 6 (267):90-931

Rosyada, N. 2015. Isolasi Bakteri Asam Laktat dengan Aktivitas Selulolitik pada Saluran
Pencernaan Mentok (Cairina moschata). Skripsi. Surakarta. Program Studi Biologi.
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sebelas Maret.
LAMPIRAN A

DATA LITERATUR
A.1 Kondisi Optimum Enzim Selulase
1. Adapun kondisi optimum kerja enzim selulase adalah: (Ghose, 1987)
Suhu optimum : 50oC
pH optimum : 5,16
LAMPIRAN B
CONTOH PERHITUNGAN

B.1 Penentuan Konsentrasi Larutan Enzim


Penentuan konsentrasi larutan enzim dengan perbandingan antara buffer dan enzim dengan
perbandingan enzim 1:20 adalah
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑐𝑎𝑚𝑝𝑢𝑟𝑘𝑎𝑛
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 = 𝑥 0,05
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 + 𝑏𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟)

B.2 Penentuan Konsentrasi Glukosa Standar


Penentuan konsentrasi glukosa standar dengan perbandingan antara glukosa dan buffer
adalah:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 0,5 𝑔/50𝑚𝑙
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 + 𝑏𝑢𝑓𝑓𝑒𝑟)

Dimana 0,5g/50 ml merupakan larutan glukosa stock yang telah dibuat sebelumnya

B.3 Penentuan Konsentrasi Glukosa pada Sampel berdasarkan Kurva Standar


Penentuan konsentrasi glukosa pada sampel diperoleh dengan:
1. Plot grafik antara konsentrasi larutan glukosa terhadap absorbansinya
2. Diperoleh persamaan 𝑦 = 0.035𝑥 + 0.031
3. Subsitusi nilai absorbansi enzim sebagai nilai y dan konsentrasi glukosa pada sampel
sebagai nilai x (mg/0,2 ml) sesuai persamaan:
𝑦 − 0,031
𝑥=
0,0035

B.4 Penentuan FPU


Untuk menentukan FPU, diketahui persamaan:
0,37
𝐹𝑖𝑙𝑡𝑒𝑟 𝑃𝑎𝑝𝑒𝑟 𝑈𝑛𝑖𝑡 = 𝑢𝑛𝑖𝑡𝑠/𝑚𝑙
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑚𝑒𝑛𝑔ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙𝑘𝑎𝑛 2 𝑚𝑔 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎

Konsentrasi enzim dapat diketahui dengan memplot konsentrasi Glukosa dengan


konsentrasi Enzim, diperoleh persamaan 𝑦 = 0.003𝑥 − 0.001. Kemudian input nilai x
sebagai 2 mg glukosa, diperoleh 𝑦 = 0.005.
Maka, FPU yang diperoleh sesuai praktikum adalah:
0,37
𝐹𝑃𝑈 =
0,005
Maka dihasilkan nilai FPU
𝐹𝑃𝑈 = 74 𝐹𝑃𝑈/𝑚𝑙

B.5 Penurunan Rumus

Laju reaksi persamaan di atas dapat didefinisikan dalam persamaan:

dP
V=dT = k2 [ES] [ES]

biasanya merupakan besaran yang tidak dapat diukur. Besaran yang dapat diukur adalah
konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim total, yaitu jumlah enzim bebas dan enzim
dalam kompleks ES:

[E]t = [E] + [ES]

Pada keadaan steady state, laju pembentukan dan penguraian kompleks ES sama:

k1 [E][S] = k −1 [ES] + k 2 [ES]

k1
[ES] = ( ) [ES]
k − 1 + k2

Kemudian konstanta laju reaksi digabungkan menjadi satu konstanta, yaitu KM:

k1
KM = ( )
k − 1 + k2

Sehingga dapat ditulis :

K M [ES] = [E][S]

K M [ES] = [E]t [S] − [ES][S]

[ES](K M + [S] = [E]t [S]

[E]t [S]
[ES] = ( )
K M + [S]

Selanjutnya :
dP K 2 [E]t [S]
V= =( )
dT K M + [S]

Saat lajureaksi mencapai kecepatan maksimum (Vmax), nilai KM >> [S] Maka:

Vmax = K 2 [E]t

Akan didapat persamaanMichaelis-Menten:

dP Vmax [S]
V= =( )
dT K M + [S]

Persamaan Michaelis-Menten ditransformasikan dengan metode Lineweaver-Burk yang


merupakan bentuk penyederhanaanterhadap rumus Michaelis

dP Vmax [S]
V= =( )
dT K M + [S]

1 K M + [ S]
=( )
V Vmax [S]

1 KM [S]
= +
V Vmax [S] Vmax [S]

1 Km 1 1
= +
V Vm [S] Vm

B.6 Perhitungan jumlah vm dan Km


Kurva Michaelis Menten ditentukan dengan memplot nilai Vo terhadap konsentrasi
substrat. Dimana nilai Vo ditentukan dengan menggunakan persamaan yang diperoleh
dengan memplot nilai absorbansi terhadap waktu pada sampel. Persamaan yang diperoleh
adalah persamaan kuadratik. Dengan mensubstitusi nilai X sebagai konsentrasi substrat
maka diperoleh nilai Vo pada masing-masing kondisi substrat.
Selanjutnya di plot nilai 1/Vo dan 1/[S] untuk menentukan nilai Vm dan Km
menggunakan metode Lineweaver-Burk. Dari grafik yang diperoleh, didapat persamaan
garis y = -120.1x-0.08.Dimana:
 Pada substrat tanpa inhibitor
1
𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑝𝑡 =
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
−0.08 =
𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑉𝑚𝑎𝑥 = −12.5 µM/s

Selanjutnya,
𝐾𝑚
𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 =
𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚
−120.1 =
−12.5

𝐾𝑚 = 1501.25 mg/0,5mL
 Pada substrat dengan inhibitor
1
𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑝 =
𝑉𝑚𝑎𝑥

1
−0.08 =
𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑉𝑚𝑎𝑥 = −12.5 µM/s

Selanjutnya,
𝐾𝑚
𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 =
𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾𝑚
−85.98 =
−12.5

𝐾𝑚 = 1074.75 mg/0,5mL
LAMPIRAN C
KURVA KALIBRASI

C.1 Kurva Baku Glukosa


0,180
0,160 y = 0.035x + 0.031
0,140 R² = 0.974

0,120
Absorbansi

0,100
0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000
Konsentrasi Glukosa mg/0.5ml

C.2 Kurva Pengenceran Enzim terhadap Konsentrasi Glukosa

0,010
0,009 y = 0,0039x - 0,0015
0,008 R² = 0,8581
Pengenceran Enzim

0,007
0,006
0,005
0,004
0,003
0,002
0,001
0,000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000
Konsentrasi Glukosa (mg/0.5ml)
C.3 Kurva Michaelis Menten Tanpa Inhibitor dan dengan Inhibitor
1,2

1 R² = 0,9958 Tanpa Inhibitor

0,8
Dengan Inhibitor
V0 (µM/s)

R² = 0,997
0,6
Linear (Tanpa
0,4 Inhibitor)
Linear (Dengan
0,2 Inhibitor)
Linear (Dengan
0 Inhibitor)
0,000 500,000 1000,000 1500,000
[Subtrat] (970mg/ml)

C.4 Kurva Lineweaver-Burk Tanpa Inhibitor dan dengan Inhibitor


3
y = 237,11x + 0,9267 2,5 Tanpa Inhibitor
R² = 0,9376
2
Dengan Inhibitor
1,5
1/V0 (s/µM)

1 Linear (Tanpa
y = 202,81x + 0,8915 Inhibitor)
0,5 R² = 0,9339 Linear (Tanpa
0 Inhibitor)
-0,01 -0,005 0 0,005 0,01 Linear (Dengan
-0,5
Inhibitor)
-1
Linear (Dengan
-1,5 Inhibitor)
1/[S] (ml/970mg)
LAMPIRAN D
DATA MENTAH

D.1 Tekanan dan Temperatur Laboratorium


Tabel D.1. Tekanan dan Temperatur Laboratorium
Tanggal P (mmHg) T (oC)
Pagi Sore Pagi Sore
18 Februari 2019 72 ± 0,05 72 ± 24 ± 26 ±
0,05 0,5 0,5
19Februari 2019 72 ± 0,05 72 ± 24 ± 26 ±
0,05 0,5 0,5

D.2 Absorbansi Larutan Glukosa Standar


Tabel D. 2. Absorbansi Larutan Glukosa Standar
Konsentrasi (mg/0,2mL) Abs 540nm (I) Abs 540nm (II) Average
Abs
3,35 0,142 0,163 0.1525
2,50 0,098 0.130 0,114
1,65 0,086 0.1 0.093
1 0,065 0.09 0,0775
0.7140 0,045 0.065 0,055

D.3 Absorbansi Pengenceran Enzim


Tabel D. 3. Absorbansi Pengenceran Enzim
Konsentrasi Abs 540nm (I) Abs 540nm (II) Average
Abs
0,00875 0,420 0,1140 0,267
0,00750 0,0990 0.0940 0,0965
0,005 0,0850 0.0900 0,0875
0,00375 0,0805 0.0855 0,083
0,0025 0,0777 0.0657 0,0717
D.4 1/Vo terhadap 1/[S] pada Konsentrasi Substrat Tanpa Inhibitor dan dengan
Inhibitor
Tanpa Inhibitor Ada Inhibitor
[S] V0 1/ [S] (10
V0 (10mg/ 1/V0 (10 1/ [S] (10 (mg/10 [S] (mg/10 1/V0 (10 mL/mg)
(10mg/ml) mL) mL/mg) mL/mg) mL) mL) mL/mg)
0.977 970.000 1.023541 0.001031 0.958 970.000 1.043841 0.001030928

0.797 739.371 1.254705 0.001353 0.858 784.172 1.165501 0.00127523

0.617 463.714 1.620746 0.002157 0.758 560.116 1.319261 0.001785344

0.437 168.857 2.28833 0.005922 0.658 310.744 1.519757 0.003218083

0.257 -147.772 3.891051 -0.00677 0.558 27.428 1.792115 0.036459093

0.077 -481.486 12.98701 -0.00208 0.458 -274.228 2.183406 -0.003646601

-0.103 -819.486 -9.70874 -0.00122 0.358 -601.312 2.793296 -0.00166303

D.5 Absorbansi Sampel (50 mg) Tanpa Inhibitor Terhadap Variasi Waktu

Tabel D. 4. Absorbansi Sampel Tanpa Inhibitor TerhadapVariasiWaktu


Variasi Waktu (Menit) Abs 540nm (I) Abs 540nm (II) Average
Abs
10 2,010 2,088 2,049
20 2,455 2,431 2,443
30 2,663 2,559 2,611
30 2,908 2,698 2,803
50 2,947 2,955 2,951
60 2,987 2,990 2,988
70 3 3 3
D.6 Absorbansi Sampel (50 mg) Dengan Inhibitor Terhadap Variasi Waktu

Tabel D. 4. Absorbansi Sampel Tanpa Inhibitor TerhadapVariasiWaktu


Variasi Waktu (Menit) Abs 540nm (I) Abs 540nm (II) Average
Abs
10 1,625 1,689 1,657
20 1,915 2,068 1,991
30 2,153 2,273 2,213
40 2,519 2,501 2,51
50 2,588 2,753 2,670
60 2,891 2,895 2,893
70 2,962 2,973 2,967