BAHAN DAN METODE

Gambar 1.
Lokasi dan distribusi perangkap cahaya HP di seluruh wilayah perkotaan Formiga, negara bagian
Minas Gerais, Brasil.

1. Area Studi.
Studi ini dilakukan di Kotamadya Formiga yang terletak di wilayah barat-tengah
negara bagian Minas Gerais (20120 km dari negara bagian ibukota) dan memiliki 65.128 jiwa di
area seluas 1502 km2. Gambar lokasi dan distribusi dari PH dapat dilihat di gambar 1.
2. Lalat Pasir
- Koleksi Sistematik, Identifikasi Spesies, dan Kondisi Cuaca.
Penangkapan dilakukan antara Mei 2012 dan April 2013 selama empat hari berturut-
turut per bulan. Perangkap HP digunakan di daerah peridomisiliar di 24 rumah dari jam 5
sore sampai jam 7 pagi. Distribusi perangkap diikuti informasi yang diberikan oleh
otoritas kesehatan sesuai dengan terjadinya kasus leishmaniasis pada manusia dan anjing
menghasilkan 22 wilayah preferensial untuk pengumpulan. Dalam wilayah ini, 24 rumah
dipilih sesuai dengan fitur lingkungan domisili (terdiri atas halaman belakang, pohon,
hewan peliharaan, kedekatan dengan tanah kosong, dan bintik-bintik hijau) (Gambar 2).
Serangga yang ditangkap dipasang sebelum identifikasi taksonomi. Data suhu,
kelembaban relatif, dan curah hujan diperoleh dari Stasiun Meteorologi Formiga (A524)
selama pengumpulan periode.

3. Infeksi Canine
- Koleksi Sampel, Evaluasi Klinis, dan Tes Serologi
Sampel anjing dihitung dengan mempertimbangkan Parameter World Health
Organization (WHO). Karena tidak ada informasi sebelumnya tentang prevalensi
yang tersedia, WHO merekomendasikan untuk mempertimbangkannya sebesar 50%.
Estimasi jumlah anjing di kota (mengikuti kampanye antirabies) sebanyak 9.000.
Berdasarkan informasi tersebut, perhitungan sampel yang dihasilkan yakni sampel
minimum sebanyak 517 anjing (tingkat kepercayaan 90% dan kesalahan sampel
3,5%). Jumlah yang lebih tinggi sebanyak 570 anjing domestik betina dan jantan
dievaluasi.
Sampel darah periferal (3-5 mL) dan evaluasi klinis dilakukan di Pusat Pertahanan
Kehidupan Hewan dan di lima klinik hewan. Sampel darah disimpan dalam es dan
dikirim ke Laboratorium Epidemiologi Penyakit Parasit di Universitas Federal Ouro
Preto untuk deteksi antibodi menggunakan tes serologi.
Dual Path Plataform (DPP), tes imunokromatografi cepat, dan Enzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) digunakan untuk mendiagnosis leishmaniasis
anjing yang direkomendasikan oleh Kementerian Kesehatan Brasil. Hanya anjing
yang positif leishmaniasis di kedua tes serologis yang dianggap terinfeksi.
 Fitur klinis anjing dievaluasi oleh dokter hewan, yang menentukan
karakteristik fisik dan gejala penyakit.
- Identifikasi Molekuler Leishmania.
Untuk mengidentifikasi Spesies Leishmania, DNA diekstraksi dari sampel
darah perifer dengan dengan amplifikasi selanjutnya dari Gen SSUrRNA oleh Nested
PCR (LnPCR). SSUrRNA adalah gen yang mengkode subunit kecil ribosom dan
terpelihara dengan baik di antara spesies genus Leishmania. Untuk teknik LnPCR,
primer spesifik untuk pesanan Kinetoplastida (R221 dan R332) digunakan untuk
menghasilkan 603 bp fragmen. Kemudian, reaksi kedua dilakukan dengan primer
khusus Leishmania (R223 dan R333) untuk diperoleh sebuah fragmen 353 bp. Reaksi
LnPCR dan profil termal seperti yang dijelaskan di tempat lain dengan modifikasi .
Produk PCR yang diamplifikasi divisualisasikan pada gel agarosa (1,5%) diwarnai
dengan etidium bromida.
Rantai polimerase polimorfisme panjang fragmen reaksi-restriksi (PCR-
RFLP) juga digunakan untuk mengkonfirmasi spesies Leishmania dengan mencerna
fragmen 120-bp wilayah kinetoplast minicircle yang dilestarikan dengan HaeIII.
Profil pembatasan divisualisasikan pada gel agarosa (4%). Strain referensi
Leishmania (Leishmania) infantum (MHOM / BR / 74 / PP75), Leishmania (Viannia)
braziliensis (MHOM / BR / 75 / M2903), dan Leishmania (Leishmania) amazonensis
(IFLA / BR / 67 / PH8) digunakan sebagai kontrol.
Untuk sequencing, fragmen LnPCR diekstraksi dari gel agarose menggunakan
QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN). Sequencing dilakukan menggunakan
BigDye Terminator v3.1 CycleSequencing kit sesuai dengan spesifikasi pabrikan.
Urutan ditentukan oleh sequencer DNA ABI3730 (Life Technologies) dan dianalisis
menggunakan program BioEdit untuk mengedit dan menyelaraskan. Urutan
dibandingkan dengan yang ada dalam database GenBank untuk mengidentifikasi
spesies Leishmania.

4. Proses geoproses
- Elaborasi Peta.
 Peta kepadatan lalat pasir diuraikan berdasarkan pada titik pengumpulan dan jumlah
serangga yang ditangkap. Data di-georeferensi menggunakan koordinat UTM SAD69 Fuso 23
ditentukan oleh GPS (N3Elgin). Anjing seropositif digeoreferensi menggunakan alamat rumah
mengikuti metodologi yang sama. Peta kepadatan kernel diuraikan menggunakan alat Spatial
Analyst dari perangkat lunak ArcGis 10.
Metode ini menghitung rasio antara jumlah lalat pasir / anjing dan area satuan yang
diberikan. Ini menghitung rata-rata kejadian anjing / lalat pasir secara terpisah per unit area.
Untuk studi ini, satuan luas didefinisikan dalam m2. Mempengaruhi area radius 1 km untuk lalat
pasir dan radius 200 m untuk anjing domestik didirikan di sekitar setiap rumah di peta.
Pendekatan semacam itu memungkinkan visualisasi pengaruh lalat pasir berdasarkan
jarak rata-rata penerbangan serangga tersebut. Di samping itu, anjing-anjing yang termasuk
dalam penelitian ini adalah hewan peliharaan, dan karena alasan ini mereka tidak akan
bersirkulasi di luar rumah. Hasil kepadatan disimpan dalam jenis file raster dalam formatKISI.
Pixel sepuluh meter ditetapkan sebagai resolusi spasial menggunakan skala 1: 100.000.
2. Signature Analysis
Metode ini digunakan untuk mengidentifikasi korelasi antara fitur lingkungan, vektor,
dan anjing yang terinfeksi menggunakan perangkat lunak Arcview. Metode ini terdiri dari
definisi variabel ketertarikan (kepadatan anjing yang terinfeksi dan lalat pasir) dan persilangan
selanjutnya dengan variabel-variabel lain yang dianalisis dalam penelitian ini (fitur lingkungan).
Variabel lingkungan dikumpulkan dari basis kartografi resmi (sungai, daerah perkotaan) dan
subproduk klasifikasi gambar (area hijau).
Peta tersebut diperoleh dari gambar satelit yang tidak membedakan tipe vegetasi yang
mungkin termasuk hutan Atlantik, sabana, dan Cerrado atau area hijau (mis., Taman). Air
wilayahnya meliputi sungai, anak sungai, danau, bendungan, dan kolam. Kemudian, data
dikonversi dalam format raster diikuti dengan penjabaran peta jarak antara variabel lingkungan
yang terjadi dan sisa wilayah yang dianalisis. Tujuannya adalah untuk mengetahui seberapa
dekat daerah dengan tingkat infeksi anjing yang lebih tinggi dalam kaitannya dengan perangkap,
sungai, hijau, dan daerah perkotaan. Semua informasi untuk prosedur dimodelkan dalam format
raster, dengan ukuran ekstensi dan piksel yang kompatibel satu sama lain (10 m2). Variabel yang
dilintasi adalah kepadatan lalat pasir total, kepadatan L. longipalpis, kepadatan L. whitmani,
kepadatan anjing yang terinfeksi, hidrografi, dan vegetasi (tumbuhan).
 5. Analisis statistik.
Data pengumpulan lalat pasir dianalisis menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism
5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). Uji normalitas d'Agostino-Pearson dilakukan untuk
menguji hipotesis nol bahwa data diambil dari distribusi Gaussian. Ketika data menyimpang dari
distribusi Gaussian, Spearman's
koefisien korelasi digunakan (signifikansi diambil untuk 𝑝 <0,05 untuk uji dua sisi).