Anda di halaman 1dari 10

RESUME REKAYASA PROTEIN

KELOMPOK 4

1. Concept of recovery, isolation, purification, and polishing for proteins


Tujuan dari protein recovery adalah mengembalikan sifat fisika kimia yang
telah berganti karena terpapar oleh pemisahan atau proses separasi. Hal ini untuk
mengembalikan sifat-sifat protein untuk mengembalikan sifat bioaktif maupun nutrisi
tubuhnya. Produk samping dari suatu proses diberikan beberapa perlakuan sebelum
kemudian dipisahkan kembali untuk mendapatkan hasil protein dengan konsentrasi
yang diinginkan.
Tujuan dari isolasi adalah memisahkan protein dari makromolekul yang lain
atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dari protein lain yang tidak diinginkan.
Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat
fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga aktivitasnya
tidak berubah.
Purifikasi bertujuan untuk memurnikan protein dari kontaminan yang tidak
diinginkan. Produk protein yang digunakan sebagai preparat injeksi harus bebas dari
pirogen dan harus steril. Proses pemurnian protein harus mampu mengeleminasi dan
menghilangkan virus kontaminan. Demikian pula berbagai kontaminan minor
termasuk DNA asing harus dapat dihilangkan.
2. Methods for recovery of protein
Menurut Sanmartin et al., (2011) terdapat beberapa metode yang bisa digunakan untuk
recovery protein. Untuk protein ikan yang akan diperoleh kembali, berikut akan
dirangkum dalam tabel yang menjelaskan perolehan kembali protein ikan dari by
product hasil produksi ikan:
Metode Mekanisme Kelebihan Kekurangan
Utama
Hidrolisis Kimia Pemecahan protein Yield yang Proses kontrol yang
(Asam dan Basa) menjadi peptida dihasilkan tinggi, rumit, fungsi
dengan proses cepat, protein yang dapat
penambahan asam proses yang tidak menurun, pahit,
atau basa mahal hidrolisat yang
heterogen
Hidrolisis Pemecahan protein Yield yang Pahit, harga enzim
Enzimatis menjadi peptida dihasilkan tinggi, mahal, proses yang
dengan selektivitas tinggi, panjang, fungsi
penambahan enzim produk akhir protein yang dapat
memiliki turun
kandungan garam
yang rendah,
kontaminasi
rendah
pH Shifting Pelarutan protein Yield yang Fungsionalitas
pada pH yang dihasilkan tinggi, protein yang dapat
tinggi atau rendah tidak ada pre turun, korosi pada
dengan mengubah treatment pada besi yang
muatan protein, ikan disebabkan oleh
diikuti dengan asam
presipitasi
isoelektrik
Ultrafiltrasi Separasi membran Permeat Waktunya lama,
dengan perbedaan kualitasnya bagus, membran yang
tekanan atau proses recovery harganya mahal
konsentrasi yang simultan,
efisiensi energi
Hidrolisis Air Hidrolisis dan Yield yang Dapat terjadi
Subkritikal pelarutan protein dihasilkan tinggi, degradasi termal
dengan bantuan air mudah asam amino,
subkritikal sebagai dimasukkan pada peralatannya
solven sistem makanan, kompleks
tidak perlu ada
katalis, hemat
energi dan biaya
Ekstraksi Fluida Pelarutan protein Dampak Peralatan yang
Superkritis dengan dengan bantuan lingkungan kompleks, perlu
CO2 rendah, mudah tekanan tinggi,
karbondioksida dimasukkan pada perlu modifier yang
superkritis sistem makanan, normal (Etanol)
kondisi operasi
yang tidak
ekstrem, solven
yang ada di produk
rendah, teknik
yang inert dan
murah
Perlakuan Ohmik Koagulasi pada Proses cepat, Biaya instalasi
protein dengan pemanasan yang yang tinggi, dapat
mengalirkan arus relatif seragam terjadi efek
listrik kepada elektrolit
larutan
Sumber: Sanmartin et al., (2011)

Sedangkan, M.E. Matthews (1984) menjelaskan beberapa tahapan untuk perolehan


kembali protein dari whey.
a. Presipitasi dengan Panas
Protein gandum dipresipitasi dengan panas dengan kondisi lingkungan yang
mendekati pH netral. Gandum yang kondisinya asam dipanaskan ke suhu 900C dan
dikondisikan selama 10 menit untuk mencapai yield yang maksimal. Untuk gandum
yang manis, maka dilakukan pemanasan dengan pH antara 6.0-6.5. setelah
dipanaskan, protein selain laktalbumin dihilangkan dengan settling, kemudian
diuapkan lalu dicuci, dipisahkan kembali dan dikeringkan.
b. Perbedaan Ukuran Molekuler
Ultrafiltrasi dapat dilkukan untuk mendapatkan kembali protein gandum terlarut
dengan konsentrasi yang tinggi. Sebelum diultrafiltrasi, gandum perlu
disentrifugasi maupun disating untuk menghilangkan padatan tersuspensi atau
partikel kasein. Pada proses continuous, maka teknik pre-treatment dapat dilakukan
dengan demineralisasi, pemanasan dengan kalsium, atau klarifikasi serta filtrasi.
Setelah itu, proses Ultrafiltrasi dirancang untuk memfraksionasi gandum menjadi
dua aliran yakni retentat yang kaya protein dan permeat yang rendah protein.
Setelah itu dapat dievaporasi sebelum dikeringkan. Selain ultrafiltrasi ada juga
metode gel filtrasi yang menggunakan hydrated gel.
c. Presipitasi dengan Agen Pengompleks
Agen pengompleks dapat dipakai untuk memperoleh kembali protein dari whey
dengan agen pengopleks polifosfat pada pH yang rendah.
d. Penghilangan Laktosa dan Mineral
Komposisi whey dapat dimodifikasi dengan penghilangan laktosa dan mineral.
Produk akhir dari metode ini rata-rata adalah delactosed whey powder yang
mengandung 25% protein. Dalam proses demineralisasi dan delaktosa dapat
dilakukan dengan elektrodialisis dan ion exchange.
e. Sifat Adsorpsi
Adsorpsi dapat dilakukan dengan media regenerated cellulose, campuran titania
dan alumina, serta silika. Gandum di dekatonisasi, kemudian dicampurkan dengan
resin di stirred tank reactor lalu dipisahkan. Setelah dipisahkan maka protein
didesorbsi lagi pada pH 9. Demineralisasi dan peningkatan konsentrasi larutan
protein dapat dilakukan dengan ultrafiltrasi.
f. Inkorporasi dengan Produk Lain
Contohnya adalah keju. Presipitasi protein dengan panas terkadang ditambahkan
pada cheese milk untuk peningkatan yield keju. Hal ini juga dapat meningkatkan
90% protein gandum yang diperoleh kembli. Tetapi penambahan protein gandum
kedalam keju dapat menyebabkan tekstur abnormal dan rasa yang berbeda.

Sedangkan, untuk skala industri metode perolehan kembali dapat dilakukan dengan
metode-metode berikut:

Operasi Sifat Fisiko-Kimia


Sentrifugasi Kecepatan sedimentasi
Filtrasi/Mikrofiltrasi Ukuran partikel
Homogenisasi Gradien tekanan
Penggilingan bead Liquid/solid shear
Ultrafiltrasi Ukuran molekul
Ekstraksi Dua Fasa Koefisien partisi
Presipitasi Solubilitas
Sumber: Leser, et al. (1994)
3. Methods for isolation of protein

a. Pemanasan Protein
Protein-protein dalam suatu organisme memiliki tingkat kestabilan terhadap
suhu dan pH yang berbeda-beda. Perbedaan tingkat kestabilan suatu protein
ditentukan oleh urutan asam amino-asam amino penyusun protein dan interaksi-
interaksi intramolekulnya. Jika suatu protein yang tidak tahan panas berada dalam
lingkungan yang suhunya tinggi, maka lipatan protein yang hidrofobik akan
membuka (terdenaturasi). Protein-protein yang telah mengalami pembukaan lipatan
akan saling berinteraksi satu sama lain membentuk suatu agregat dan akhirnya akan
mengendap.
b. Sonikasi
Sonikasi frekuensi tinggi adalah metode yang banyak digunakan untuk
menghancurkan sel dan organel. Aplikasi gelombang suara frekuensi tinggi adalah
metode yang efektif untuk merusak sel yang bisa diaplikasikan ke mikroorganisme.
Mekanismenya melibatkan microcavitation yang menghasilkan perbedaan tekanan
yang akan merusak dinding sel. Efisiensi perusakan sel dipengaruhi oleh kekuatan
yang dipakai pada instrumen, durasi pemaparan dan volume material proses.

c. Fraksinasi Ammonium Sulfat


Fraksinasi dilakukan atas dasar perbedaan kelarutan protein-protein di dalam
campuran. Garam netral, seperti (NH4)2SO4, ditambahkan ke dalam larutan protein
dalam jumlah tertentu. Pengaruh garam netral terhadap kelarutan protein
merupakan fungsi dari kekuatan ioniknya, suatu ukuran konsentrasi dan jumlah
muatan listrik sumbangan kation dan anion garam.
d. Dialisis
Proses dialisis dikendalikan oleh perbedaan konsentrasi terlarut dalam kedua
sisi yang dipisahkan membran. Setelah kesetimbangan konsentrasi tercapai, proses
difusi zat terlarut menembus membran menjadi setimbang. Penggantian molekul
garam dengan air atau bufer berkekuatan ion rendah dari luar membran
menyebabkan konsentrasi molekul terlarut kecil di dalam larutan protein berkurang.
e. Gel filtrasi
Gel filtrasi dilakukan menggunakan butiran berpori. Kolom yang dibangun
dengan butiran tersebut akan mempunyai dua pengukuran volume cairan, volume
eksternal, yaitu cairan diantara pori, dan volume internal, yaitu cairan yang berada
diantara pori-pori butiran. Molekul besar hanya melewati volume eksternal ketika
molekul kecil melewati volume internal dan eksternal.
f. Ultrafiltasi
Ultrafiltrasi adalah variasi dari membran filtrasi dimana tekanan hidrostatis
mendorong cairan melewati membran semipermeabel. Endapan padat dan
campuran dengan berat molekul besar tertahan, sedangkan air dan campuran dengan
berat molekul kecil melewati membran.
g. Ektraksi pelarut
Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia
dalam pelarut yang sesuai selama beberapa hari pada temperatur kamar terlindung
dari cahaya, pelarut akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut
karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel.
Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan
pencari dengan konsentrasi rendah (proses difusi).
h. Ekstraksi gelombang mikro
Ekstraksi dengan Bantuan Gelombang Mikro Ekstraksi dengan bantuan
gelombang mikro yang merupakan proses ekstraksi yang memanfaatkan energi
yang ditimbulkan oleh gelombang mikro dalam bentuk radiasi non-ionisasi
elektromagnetik. Energi ini dapat menyebabkan pergerakan molekul dengan
migrasi ion dan rotasi dari dua kutub, tetapi tidak mengubah struktur molekulnya.

4. Methods for purification step in protein purifiation concept

1. Filtrasi
Produk-produk hasil rekayasa genetika harus dimurnikan dengan cara
memisahkan produk tersebut dengan kultur sel yang mengandung senyawa lain,
meliputi zat yang tersuspensi dalam media, sel yang digunakan sebagai sistem
ekspresi, materi yang berasal dari pecahan sel, dan fragmen sel ketika dilisiskan.
Salah satu cara yang efektif untuk memisahkan produk hasil rekayasa genetika
dengan senyawa kontaminan tersebut adalah dengan cara filtrasi. Filtrasi dapat juga
digunakan untuk memekatkan biomassa sebelum dilakukan purifikasi selanjutnya.
2. Sentirfugasi
Partikel subseluler dan organel sel umumnya tersuspensi dalam larutan yang
kental, sehingga seringkali sulit dipisahkan melalui penyaringan. Namun, dapat
dipisahkan secara efisien dengan cara sentrifugasi pada kecepatan yang berbeda-
beda.Teknik sentrifugasi, sering digunakan untuk memisahkan DNA plasmid dan
DNA kromosomal
3. Presipitasi

Kelarutan protein tergantung pada suasana larutan antara lain, pH, dan
kekuatan ionik. Dengan cara menaikan kekuatan ionik perlahan-lahan pada
larutan, secara selektif dapat mengendapkan protein. Fenomena ini disebut dengan
salting out . Amonium sulfat sering digunakan pada purifikasi sistem salting out
tersebut. Presipitasi banyak digunakan untuk mengisolasi protein dari dalam larutan
supernatan kultur sel. Namun, metode prespitasi biasanya dilakukan pada produksi
skala kecil, dan kurang digunakan untuk purifikasi protein rekombinan skala
industri.
4. Kromatografi
Pemisahan molekul dari materi biologis seringkali melibatkan isolasi jenis
molekul tertentu dari campuran molekul lain yang memiliki sifat yang hampir
sama. Metode kromatografi merupakan metode purifikasi yang efektif untuk
memisahkan molekul-molekul tersebut. Dalam sistem kromatgrafi, komponen
sampel dipisahkan berdasarkan perbedaan distribusi molekul diantara dua fase
yaitu fase diam dan fase bergerak. Fase diam biasanya terdiri dari zat padat,
sedangkan fase gerak terdiri dari cairan atau gas.
a. Kromatografi fase tetap
Kromatogafi fase tetap menggunakan material konvensional atau adsorben yang
memiliki pori-pori yang dapat dilewati oleh senyawa yang akan dipisahkan.
Material adsorben yang digunakan umumnya merupakan senyawa anorganik
antara lain, silika gel, hidroksiapatit, beberapa jenis oksida logam. Pemisahan
senyawa terjadi karena perbedaan interaksi antara komponen sampel dengan
media kromatografi.
b. Kromatografi adsorpsi
Dalam sistem kromatografi adsorpsi atau disebut juga kromatografi fase normal,
digunakan fase diam yang lebih polar dibandingkan dengan fase gerak. Protein yang
akan dipisahkan secara selektif terikat pada kondisi berbeda.
c. Kromatografi penukar ion
Kromatografi pertukaran ion, dapat digunakan dalam suatu kondisi tertentu,
dimana kontaminan produk yang dialirkan melalui kolom, dapat terikat dan
diadsorpsi oleh matrik, sedangkan protein yang dikehendaki dapat terikat.
d. Kromatografi affinitas
Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan molekul yang diteliti secara
kovalen pada matriks immobile seperti kolom agarose. Tujuan penggunaan
kromatografi afinitas adalah untuk memisahkan komponen dari suatu campuran
komponen kompleks. Teknik ini didasarkan pada sifat beberapa asam amino
misalnya histidin, triptofan, tirosin, dan fenilalanin, yang dapat berikatan secara
spesifik dan reversibel dengan suatu ion logam yang biasa disebut dengan ligan.
5. Polishing methods for protein
Setelah melalui tahap purifikasi dan diperoleh purified protein, selanjutnya dilakukan
proses purifikasi lanjutan yang dikenal dengan polishing step pada protein tersebut.
Polishing dimaksudkan untuk membersihkan protein dari debris yang masih
terkandung di dalam purified protein sehingga protein target dapat diperoleh secara
murni. Polishing merupakan tahap penting pada downstream process karena debris
yang masih terkandung dalam purified protein dapat menimbulkan efek yang tidak
diinginkan ketika proses preparasi ini ditujukan untuk penelitian.
Initially purify protein using
affinity column chromatography

Load partially purrified target protein


into cation exchange column

Introduce a pH gradient

Elute target protein

Is additional
purification needed Done

Pass target protein through an


anion exchanger

Collect target protein Done

Adapun metode pada proses polishing yang dapat digunakan adalah column chromatography
based dan atau membrane filtration based polishing steps. Metode kromatografi pada proses
polishing ini dapat berupa affinity chromatography, cation dan anion (ion exchane)
chromatography, hydrophobic interaction chromatography, atau ceramic hydroxyapatite
chromatography.

A. Affinity Chromatography
Jenis kromatografi ini memisahkan protein berdasarkan interaksi reversible antara
protein dan spesifik ligand yang secara kovalen terikat pada matrix chromatography
B. Ion Exchange Chromatography
Teknik kromatografi jenis ini selektif dan resin yang digunakan relatif tidak mahal
sehingga cocok untuk digunakan pada tahap purifikasi awal maupun pada proses
polishing. Ion Exchange Chromatography ideal digunakan untuk mengurangi agregat
dengan berat molekul tinggi, residu DNA dan protein sel inang.
C. Hydrophobic Interaction Chromatography
Metode ini cocok digunakan utnuk memisahkan protein berdasarkan sifat
hydrophobicity dan bekerja secara komplemen dengan metode lain yang memisahkan
protein berdasarkan muatan, ukuran, atau afinitas nya.
D. Ceramic Hydroxyapatite Chromatography
Ceramic hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH)2 adalah bentuk kalsium fosfat yang dpat
digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein, enyme, asam nukleat, virus,
dan makromolekul lainnya. Hydroxyapatite dapat memisahkan protein yang terlihat
homogen pada metode kromatografi dan elektroforesis