0

MODUL PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI PERAIRAN

Oleh:

Dr. Ir. Hilal Anshary, M.Sc

Dr. Ir. Sriwulan, MP
Dr. Ir. Gunarto Latama, M.Sc

JURUSAN PERIKANAN
FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
2016
 1

HALAMAN PENGESAHAN
MODUL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PERAIRAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN 2016

Judul : MODUL PRAKTIUM MIKROBIOLOGI PERAIRAN

Nama Lengkap : Dr.Ir. Hilal Anshary, M.Sc.

NIP : 196710121992021001

Pangkat/Golongan : Lektor Kepala/IVA

Jurusan : Perikanan

Fakultas/Universitas : Ilmu Kelautan dan Perikanan/Universitas Hasanuddin

000. Tiga Juta Rupiah)

Dibiayai oleh Dana DIPA Universitas Hasanuddin
Makassar, Juni 2016

Mengetahui :
Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Koordinator Praktikum
Universitas Hasanuddin
Wakil Dekan Bidang Akademik

Prof Dr. Ir. Aisjah Farhum, M.Si Dr.Ir. Hilal Anshary, M.Sc.
NIP 196906051993032002 NIP 196710121992021001
 2

KATA PENGANTAR

Modul praktikum mikrobiologi perairan adalah buku penuntuk praktium

mikrobiologi perairan yang ditujukan bagi mahasiswa perikanan yang baru saja

mempelajari mikrobiologi. Modul praktium ini berisi serangkaian praktikum yang

akan mengantar mahasiswa dalam memahami prinsip dasar mikrobiologi dalam

laboratorium. Diharapkan setelah melaksanakan praktikum akan sangat membantu

mahasiswa dalam melakukan studi atau kajian dalam bidang mikrobiologi, mulai dari

pemahaman mahasiswa tentang morfologi bakteri, pewarnaan bakteri, cara bekerja

secara aseptic, menghitung bakteri dan mengetahui cara melakukan uji-uji biokimia

dan mampu mengidentifikasi bakteri dengan benar.

Seiring dengan meningkatnya minat mahasiswa untuk melakukan penelitian

bidang mikrobiologi terapan terutama dalam bidang perikanan maka kehadiran modul

praktikum akan sangat bermanfaat. Disadari bahwa modul ini masih jauh dari

kesempurnaan, sehingga kritik dan saran kepada penulisasangat diharapkan, dan

kedepannya akan selalu dilakukan perbaikan sesuai kebutuhan.

Makassar, Juni 2016

Penulis
 3

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

TATA TERTIB LABORATORIUM

MODUL KEGIATAN LABORATORIUM

1. Pengenalan dan Penggunaan Mikroskop

2. Mikroorganisme yang Umum Dijumpai di Perairan

3. Teknik Sterilisasi Bahan dan Peralatan

4. Teknik Pemidahan Biakan Secara Aseptic

5. Penyiapan Preparat Mikroorganisme Hidup

6. Penyiapan Medium

7. Teknik Kultur Murni Bakteri

8. Kuantitas Mikroba: Hitungan Langsung Dengan Metode Cawan

a. Cawan tuang

b. Cawan tebar

9. Pewarnaan Sederhana

10. Pewarnaan Gram dan Tahan Asam

11. Ciri-ciri Fisiologis Bakteri

 4

TATA TERTIB LABORATORIUM

1. Simpan semua peralatan anda pada tempat yang telah ditentukan dan jangan

meletakkannya di atas meja laboratorium

2. Kenakan jas praktikum selama anda bekerja di laboratorium. Jas praktikum

dapat melindungi anda dari bakteri kontaminan yang tidak disengaja dan juga

melindungi pakaian anda dari bahan-bahan atau zat warna yang digunakan di

laboratorium

3. Tidak diperkenankan makan atau minum di dalam laboratorium. Jaga agar

tangan, pensil dan barang-barang lainnya tidak menyentuh mulut anda

4. Baca petunjuk prosedur laboratorium sebelum anda masuk laboratorium

5. Cucilah tangan anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah

kegiatan laboratorium

6. Disinfeksi meja kerja anda sebelum dan sesudah kegiatan laboratorium dengan

disinfektan

7. Perlakukan setiap mikroorganisma yang digunakan dalam laboratorium

sebagai bakteri pathogen

8. Semua bahan yang terkontaminasi dengan kultur mikroba harus ditempatkan

pada wadah yang sesuai untuk disterilisasi

9. Jangan membawa keluar biakan mikroorganisma keluar dari laboratorium

10. Jika terjadi kecelakaan dalam laboratorium atau anda menumpahkan bahan,

segera laporkan pada asisten.

11. Sebelum meninggalkan laboratorium, periksalah semua peralatan dan bahan

yang telah anda gunakan, atur kembali letaknya, periksa mikroskop dan

peralatan lainnya.
 5

12. Cucilah kembali tangan anda dengan air dan sabun sebelum meninggalkan

laboratorium

13. Cucilah jas laboratorium anda sehingga selalu bersih setiap kali anda

memasuki laboratorium pada periode berikutnya.

14. Tutup pintu dan jendela untuk mengurangi terjadinya kontaminasi melalui

udara

15. Gunakan sarung tangan jika terdapat luka di tangan atau pada saat bekerja

dengan bahan kimia berbahaya

16. Ketahui dengan baik cara menggunakan alat sebelum menggunakannya

sendiri, dan simpan kembali semua peralatan laboratorium pada tempatnya

setelah digunakan

17. Buang sampah pada tempat sampah yang telah disiapkan dan jangan

membuangnya pada wastafel

18. Buang biakan pathogen setelah diatoklaf dan letakkan pipet yang telah

digunakan pada disinfektan

19. Selalu memijarkan lup inokasi sebelum dan sesudah digunakan

20. Jangan melakukan perkerjaan dilaboratorium sebelum mendapat instruksi dari

asisten atau teknisi

21. jika anda terluka saat bekerja, segera melaporkan pada asisten

22. Jika anda memecahkan glassware segera laporkan pada asisten dan buang

pecahan kaca pada tempat khusus, jangan ,mencapurnya dengan sampah

lainnya

23. jangan memindahkan peralatan atau bahan apapun keluar laboratorium tanpa

sepengetahuan pengelola laboratorium

 6

KOMPETENSI YANG DIHARAPKAN SETELAH MELAKUKAN

PRAKTIKUM

Skill Laboratorium,

Mahasiswa mampu

1. Menggunakan mikroskop medan terang dengan baik untuk melihat dan

membaca slide, termasuk mensetting dan mengatur focus mikroskop, dapat

memindahkan, membersihkan dan menyimpan mikroskop, menggunakan

lensa secara benar, melaporkan pengamatan mikroskopik

2. Menyiapkan slide dengan benar untuk pengujian mikrobiologi, yaitu

membersihkan dan membuang slide, penyiapan preparat apus dari biakan

padat dan cair, membuat preparat basah dan teknik tetes gantung, melakukan

pewarnaan Gram.

3. Menerapkan teknik aseptik dalam pemidahan dan penanganan

mikroorganisma dan peralatan, termasuk, sterilisasi peralatan, pemidahan

biakan secara aseptik.

4. Menggunakan media mikrobiologi secara tepat, termasuk mengisolasi koloni,

membuat kultur murni, menggunakan media uji biokimia.

5. Menghitung jumlah mikroba dalam sampel dengan metode pengenceran,

termasuk pemilihan dan penggunaan pipet secara benar, cara penyebaran

sampel untuk kuantitas mikroba.

6. Menggunakan peralatan laboratirium seperti inkubator, dan laminary flow

 7

Kemampuan berpikir laboratorium

Mahasiswa mampu:

Kognitif

1. Memformulasi pertanyaan secara jelas dan bisa dijawab

2. Mengembangkan hipotesis yang dapat diuji

3. Memprediksi hasil yang diharapkan

4. Mengikuti protokol praktikum

Analisa

1. Mengumpulkan dan mengorganisasi data secara sistematis

2. Menampilkan data secara tepat (grafik, table, gambar, atau deskriptif)

3. Menilai validitas data (termasuk integritas dan signifikansi)

4. Menarik kesimpulan dari hasil

Komunikasi

1. Mendiskusikan dan menampilkan hasil atau temuan di laboratorium

Interpersonal skill

1. Dapat bekerja dalam tim atau kelompok secara efektif, sehingga tuga, hasil,

atau analisis dilakukan secara bersama-sama

2. Dapat mengatur waktu dan tugas secara efektif sehingga memungkinkan

melaksanakan semua kegiatan secara simultan

 8

MODUL I. PENGENALAN DAN PENGGUNAAN MIKROSKOP

Tujuan:

1. Memperkenalkan pada mahasiswa komponen dan cara kerja mikroskop

dengan benar, serta dapat memanfaatkan seluruh fasilitas yang dimiliki

mikroskop medan terang dengan optimal.

2. Memperkenalkan cara merawat mikroskop

Pengantar Teori

Salah satu ketrampilan dasar yang mahasiswa peserta matakuliah mikrobiologi

perlukan adalah mereka harus memiliki kemampuan menggunakan mikroskop

majemuk cahaya secara akurat dan benar. Pada praktikum ini mahasiswa akan

mempelajari cara melakukan focus pada lensa objektif. Mahasiswa akan mempelajari

focus pada preparat slide yang telah disiapkan dengan melakukan latihan pada setiap

perbesaran secara berturut-turut dari perbesaran rendah sampai perbesaran tertinggi.

Berbagai macam mikroskop dapat digunakan untuk dapat mempelajari

mikroorganisme, diantaranya adalah mikroskop medan terang (bright field

microscope), medan gelap (dark field), fase kontras (Phase contrast) dan floresense

(Fluerescence). Mikroskop adalah alat yang digunakan untuk memperbesar objek atau

benda yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Mikroskop digunakan sebagai

alat untuk dapat melihat bentuk bakteri, karakteristik pewarnaan bakteri, pergerakan

bakteri, dll. Oleh karena itu penggunaan mikroskop perlu dipahami secara benar.

Mikroskop majemuk adalah mikroskop yang memiliki dua atau lebih lensa. Untuk

mendapatkan perbesaran suatu benda dengan mikroskop majemuk, kalikan perbesaran

 9

pada lensa objektif dengan perbesaran pada lensa ocular (eyepiece). Perhatikan dan

pelajari setiap komponen mikroskop.

Merawat Mikroskop

1. Gunakan kedua tangan untuk memindahkan atau mengambil mikroskop dari

tempatnya dan jaga agar mikroskop dalam keadaan berdiri

2. Gunakan kertas lensa untuk membersihkan lensa sebelum dan sesudah

digunakan. Bersihkan sisa-sisa minyak immersion

3. Jangan melepas bagian-bagian tertentu dari mikroskop tanpa sepengetahuan

instruktur.

4. Jangan menggunakan pengatur kasar untuk menggerakkan lensa objektif

mendekati specimen sambil melihat specimen pada lensa okuler karena

kemungkinan besar akan menyebabkan lensa objektif menyentuh permukaan

kasar spesiemen yang dapat menyebabkan lensa rusak, tetapi dekatkanlah

dengan cara melihat dari sisi mikroskop sambil memutar pengatur kasar

selanjutnya focus dapat dilakukan dengan menggunakan pengatur halus.

5. Jika sudah selesai menggunakan mikroskop, singkirkan specimen yang telah

digunakan, putar pengatur kasar agar lensa objektif menjauh dari tempat

preparat, bersihkan semua permukaan mikroskop bersihkan lensa dengan

kertas lensa (bersihkan lensa dari minyak imersi), atur agar lensa objektif

adalah perbesaran terendah, geser pengatur spesiemen ketengah, tutup

mikroskop dan kembalikan pada tempatnya.

 10

Alat dan Bahan

1. Mikroskop majemuk medan terang

2. Kertas Lensa

3. Minyak imersi

4. Aquades

Gambar 1. Bentuk mikroskop cahaya secara umum

Gambar 2. Cara memindahkan mikroskop

 11

MODUL II. MIKROORGANISME YANG UMUM DIJUMPAI DI PERAIRAN

Tujuan: 1. Menunjukkan bahwa mikroorganisme dapat dijumpai di lingkungan

2. Menunjukkan bahwa beragam mikroorganisme terdapat dilingkungan

sekitar

Pengantar Teori:

Mikroorganisme adalah mahluk yang berukuran sangat kecil dan terdapat

dimana-mana di alam semesta, termasuk dalam perairan. Mikroba ini merupakan

bagian dari hidup manusia, ada yang bersifat pathogen dan ada juga yang bermanfaat

bagi kehidupan manusia. Banyak jenis mikroorganisme bahkan merupakan

merupakan mikroflora pada tubuh manusia. Di lingkungan perairan, mikroba dapat

tumbuh dengan baik tergantung pada lingkungannya. Distribusi dan komposisi

mikroba dalam lingkungan perairan tertentu sangat tergantung pada kondisi perairan

tersebut, yaitu kondisi lingkungannya, dan juga ketersediaan nutrient. Untuk

membuktikan keberadaan mikroba diperlukan media umum yang diperlukan untuk

pertumbuhan mikroba, misalnya nutriet agar (NA), atau Tripticase Soy Agar (TSA),

bakteri atau mikroba lainnya yang ada diperairan atau di udara dapat tumbuh dalam

medium umum tersebut membetuk koloni yang tampak dengan mata. Koloni tersebut

berasal dari satu sel mikroorganisme yang berkembangbiak membetuk koloni.

Bahan dan Alat

Nutrien Agar

TSA

Cawan petri
 12

Prosedur Kerja

1. Ambil medium NA atau TSA dan pipit air dari yang diambil dari beberapa

tempat, seperti danau, sungai, kolam, atau dari air bak mandi.

2. Pipet air sampel sebanyak 1 mL lalu sebarkan pada medium TSA/NA

3. Biarkan beberapa saat sampai air meresap dalam agar

4. Inkubasi cawan pada incubator pada suhu 30 oC selama 24 – 48 jam

5. Amati jenis-jenis mikroba yang tumbuh

6. Gambar jenis-jenis mikroba yang tumbuh dari tempat yang berbeda-beda pada

lembar kerja, dan deskripsikan hasilnya

 13

MODUL III. TEKNIK STERILISASI BAHAN DAN PERALATAN

Tujuan: Menggunakan Autoclave secara benar dan aman

Pengantar Teori

Sterilisasi adalah suatu proses yang dilakukan agar media atau peralatan

terbebas dari segala bentuk kehidupan (steril). Ada 3 cara yang umunya dilakukan

untuk sterilisasi yaitu dengan cara fisik yaitu dengan panas uap (autoclave), panas

kering, dengan radiasi menggunakan ultra violet (UV), dan secara kimiawi dengan

ethylene oxide. Cara yang paling sering dilakukan dengan menggunakan panas uap

yaitu dengan autoclave menggunakan pemanasan uap mencapai 121 oC pada tekanan

15 lbs selama 15 menit. Dengan cara ini mikroorganisme termasuk spora akan mati.

Semua media atau peralatan yang tahan suhu 121 oC dapat disterilisasi dengan cara

ini. Autoclave modern sudah dirancang sehingga udara yang ada di dalam autoclave

akan keluar dan yang tinggal adalah uap. Untuk autoclave yang masih manual,

sebelum digunakan perlu dikeluarkan udara yang ada dalam autoclave dengan

pemanasan sampai seluruh udara keluar. Kadang-kadang peralatan pecah belah seperti

pipet, dan cawan petri juga perlu disterilkan. Dengan sterilisasi uap dapat merusak

peralatan glass dan juga akan basah setelah sterilisasi, sehingga untuk peralatan

seperti ini digunakan pemanasan kering. Pemanasan kering dilakukan dengan

memasukkan peralatan glass ke dalam oven dengan suhu 160 – 170 oC selama

minimal 2 jam, pemanasan jangan mencapai 180 oC karena akan menyebabkan kapas

atau kertas terbakar.

Kadang-kadang ada campuran bahan yang akan digunakan tidak dapat

disterilkan dengan pemanasan 121 oC, sehingga dapat dilakukan dengan melakukan
 14

penyaringan dengan saringan membrane 0.22 um. Radiasi UV dengan panjang

gelombang 260 nm dapat mematikan mikroorganisme tetapi tidak dapat menembus

kaca, lapisan kotor, air dan substansi lainnya secara efektif, sehingga UV hanya

digunakan dalam beberapa kasus khusus saja, seperti pada lampu UV pada langit-

langit laminary flow, atau ruangan, untuk sterilisasi udara dan permukaan yang

terekspose. Peralatan lainnya yang tidak bias disterilkan dengan pemanasan seperti

cawan petri plastic, jarum suntik plastic, dll disterilkan dengan gas ethylene oxide.

Gas ethylene oxide bersifat mikrobicidal dan sporicidal dan mematikan dengan cara

menempel pada protein sel.

Bahan dan alat

Autoclave

Kompor gas

Prosedur Kerja

1. Siapkan peralatan autoclave

2. Catat semua komponen/bagian-bagian peralatan autoclave

3. Asisten akan memperagakan cara penggunaan autoclave

4. Periksa bagian dasar autoclave apakah terisi air dengan cukup atau tidak

5. Pasang penutup autoclave secara benar

6. Nyalakan api kompor untuk memanaskan autoclave

7. Letakkan autoclave di atas nyala api kompor

8. Biarkan lubang angin dalam keadaan terbuka

9. Tutup lubang angin autoclave setelah terdengan bunyi mendesis

 15

10. Perhatikan penunjuk pembacaan suhu pada autoclave dan biarkan suhu naik

sampai mencapai angka 121 oC

11. Turunkan nyala api kompor agar suhu 121 oC dapat dipertahankan selama 15

menit

12. Setelah pemanasan pada 121 oC selama 15 menit selesai, matikan kompor

13. Biarkan autoclave menjadi dingin sebelum bahan-bahan yang disterilkan

dikeluarkan
 16

Gambar 3. Autoclave untuk sterilisasi basah

 17

MODUL VI. TEKNIK PEMIDAHAN BIAKAN SECARA ASEPTIK

Tujuan: - Mampu menerapkan teknik pada pemindahan biakan

- Dapat menggunakan jarum ose dan lup secara benar dalam teknik aseptik

- Mampu memindahkan medium cair dan medium padat secara aseptik

Pengantar Teori

Dalam praktek mikrobiologi, pemidahan biakan baik medium padat maupun

biakan cairan dari satu wadah ke wadah lainnya, memerlukan teknik aseptic untuk

mencegah terjadinya kontaminasi selama proses pemidahan biakan. Pemidahan

biakan dikatakan berhasil hanya jika tidak terjadi kontaminasi. Teknik ini merupakan

teknik yang sangat penting dalam mikrobiologi karena menentukan keberhasilan

suatu percobaan yang dilakukan. Beberapa teknik aseptic yang perlu diperhatikan

adalah disinfeksi tempak kerja untuk mematikan mikroorganisme yang mungkin ada

pada meja, pada tahap ini sel vegetative dan virus akan mati, namun endospora tidak

akan mati dengan tahap ini. Pemidahan biakan menggunakan jarum ose atau lup

sehingga alat ini perlu disterilkan dengan cara memijarkan di atas api Bunsen.

Sebelum memasukkan jarum ose pada tabung reaksi yang mengandung biakan, tutup

tabung dibuka lalu mulut tabung reaksi dipanaskan di atas nyala api Bunsen dan

selanjutnya setelah biakan diambil, mulut tabung dipanaskan kembali sebelum ditutup

dengan penutup tabung. Jika tabung mengandung biakan cairan, maka yang

digunakan adalah lup, sedangkan bila tabung berisi biakan padat maka yang

digunakan adalah jarum ose. Setelah proses inokulasi biakan selesai, maka jarum ose

atau lup dikeluarkan dari tabung, dipijarkan di atas api Bunsen, lalu dikembalikan
 18

pada tempatnya. Mulut tabung yang telah diinokulasi juga dipanaskan lalu ditutup

kembali. Untuk menginokulasi cawan petri, pengerjaan dilakukan dekat api Bunsen

tapi tidak perlu dipanaskan cawannya. Setelah seluruh pekerjaan selesai, maka meja

kerja didisinfeksi kembali.

Bahan dan alat

Biakan bakteri

Tabung reaksi berisi nutrient broth steril

Loop Inokulasi

Lampu spiritus

Disinfektan

Prosedur Kerja

Pemidahan biakan dari medium cair ke medium cair

1. Persiapkan meja kerja dengan menyeka menggunakan disinfektan

2. Beri label pada tabung

3. Dengan menggunakan lup, sterilkan lup dengan memanakan di atas api Bunsen

sampai berpijar, panaskan juga bagian kawat lainnya.

4. Goyang-goyang tabung berisi biakan agar tersebar merata

5. Buka tutup tabung dengan menggunakan jari kelingking dari tangan yang

memegang lup, lalu panaskan mulut tabung reaksi

6. Masukkan lup inokulasi ke dalam tabung biakan

 19

7. Keluarkan lup inokulasi yang telah berisi biakan, panaskan kembali mulut tabung

reaksi lalu tutup. Kembalikan tabung biakan pada rak tabung reaksi.

8. Ambil tabung reaksi berisi agar nutrient steril dengan tangan yang tidak memegang

lup, buka tutupnya dengan menggunakan jari kelingking, panaskan mulut tabung

9. Tanpa memanaskan lup, masukkan lup ke dalam tabung berisi medium cair steril,

inokulasi dan sebarkan di dalam medium dengan membolak balik lup.

10. Keluarkan lup dari tabung, dan panaskan mulut tabung

11. Tutup kembali tabung

12. Sterilkan lup dengan memijarkannya pada api Bunsen, kembalikan lup pada

wadahnya.

13. Inkubasi biakan yang baru saja diinokulasi pada inkubator dengan 37 oC selama

24 – 48 jam.

Pemindahan biakan dari agar miring ke agar miring

1. Persiapkan bahan-bahan dan alat yang diperlukan

2. Seka meja kerja dengan disinfektan

3. Sterilkan lup inokulasi dengan memijarkannya di atas nyala api Bunsen, seluruh

kawat dipanaskan dan biarkan dingin

4. Dengan menggunakan tangan anda yang bebas, ambil agar miring berisi biakan,

bukan tutupnya dengan menggunakan jari kelingking dari tangan yang memegang lup

inokulasi.

5. Panaskan mulut tabung dan masukkan lup inokulasi yang telah dingin, sentuhkan

lup pada biakan, dan keluarkan lup dari tabung.

 20

6. Panaskan kembali mulut tabung berisi biakan, lalu tutup dengan penutup yang ada

pada jari kelingking, hati-hati jangan membakar jarinya, kembalikan tabung pada rak

7. Ambil tabung agar miring steril dengan tangan anda yang kosong, lepaskan

tutupnya dengan menggunakan jari kelingking seperti cara sebelumnya, lalu panaskan

mulut tabung

8. Masukkan lup inokulasi ke dalam tabung (jangan memanaskan lup inokulasi), dan

inokulasi biakan dengan melakukan goresan pada medium agar secara zig-zag

9. Keluarkan lup inokulasi, panaskan mulut tabung lalu menutupnya dengan penutup

yang ada pada jari kelingking, lalu simpan kembali pada rak

10. Panaskan lup inokulasi sampai berpijar, panaskan seluruh kawatnya, biarkan

dingin lalu simpan pada tempatnya

11. Inkubasi agar miring yang telah diinokulasi pada incubator pada suhu 37 oC

selama 24 – 48 jam.

Inokulasi biakan dari cawan petri ke agar miring

Beberapa hal yang perlu diperhatikan pada saat bekerja dengan cawan petri

(memindahkan biakan dari cawan petri ke agar miring)

Memindahkan biakan dari koloni bakteri pada cawan petri ke agar miring atau

medium cair sangat mirip dengan prosedur yang telah dilaksanakan di atas. Beberapa

hal yang perlu diperhatikan tentang penggunaan lup atau jarum inokulasi. Lup

biasanya digunakan bila inokulum yang diperlukan lebih banyak. Jarum inokulasi

digunakan pada saat memindahkan isolate kultur murni dan tusukan dalam media,

misalnya pada uji motility pada medium semi solid. Dalam mengisolasi kultur murni,

jarum disentuhkan pada bagian tengah koloni bakteri. Teknik ini terutama digunakan
 21

bila bekerja dengan biakan campuran. Pada saat akan memindahkan biakan dari

cawan petri, cawan petri harus sedapat mungkin tidak terkontaminasi mikroba dari

udara, artinya cawan petri harus selalu dalam keadaan tertutup. Jika akan

memindahkan biakan, hanya sebagian dari cawan petri yang terbuka dan tidak

dilakukan pemanasan terhadap cawan petri sebagaimana yang dilakukan pada tabung.

Harus selalu diberi label pada cawan yang berisi media pada bagian dasar cawan dan

goresan dilakukan dari arah atas ke bawah.

Prosedur Kerja

1. Beri label pada agar miring dengan menulis nama anda dan nama bakteri yang

akan dipindahkan

2. Ambil lup inokulasi dan panaskan sampai berpijar dan juga panaskan seluruh

kawatnya, dan biarkan sampai dingin

3. Ambil cawan petri berisi biakan yang akan dipindahkan, angkat tutup dari cawan

sehingga memungkinkan untuk mengambil koloni dari cawan dengan lup yang sudah

disterilkan. Jangan melukai agar pada saat mengambil koloni bakteri, dan jangan pula

membuka seluruh cawan sampai terpapar dengan udara. Tutup cawan setelah koloni

diambil dari cawan.

4. Dengan menggunakan tangan anda yang kosong, ambil agar miring dan buka

tutupnya dengan menggunakan jari kelingking yang sedang memegang lup inokulasi.

5. Panaskan mulut tabung dan masukkan lup inokulasi, selanjutnya sentuhkan lup

pada permukaan agar miring dengan gerakan zig-zag. Jangan melukai permukaan

agar miring pada saat melakukan goresan

 22

6. Keluarkan lup inokulasi dan panaskan kembali mulut tabung, lalu tutup kembali

tabung.

7. Panaskan lup inokulasi sampai berpijar dan panaskan seluruh kawat, lalu simpan

pada wadahnya

8. Inkubasi agar miring pada incubator suhu 37 oC selama 24 – 48 jam.

 23

Gambar 4. Prosedur penyiapan kultur murni dari cawan petri ke agar miring.
 24

MODUL V. PENYIAPAN PREPARAT MIKROORGANISME HIDUP

Tujuan: Mempelajari cara pembuatan preparat bakteri dari medium cair dan medium

padat

Pengantar Teori

Bakteri berukuran sangat kecil dan transparan, sehingga sangat sulit terlihat

dengan bantuan mikroskop sekalipun tanpa prosedur pewarnaan terhadap bakteri.

Sebelum bakteri diwarnai perlu dilakukan penyiapan preparat dengan baik agar

bakteri yang akan diwarnai tidak terlalu tebal, tidak hilang pada saat pencucian dan

tidak mengkerut. Ada dua cara penyiapan preparat bakteri yaitu penyiapan preparat

yang berasal dari medium cair dan dari medium padat. Jika preparat dibuat dari

medium cair, maka ambil 1 – 2 lup cairan dan letakkan secara langsung pada slide

glass yang telah dibersihkan dan tidak mengandung minyak/lemak, sebarkan secara

merata pada permukaan slide, dan selanjutnya biarkan kering angin. Setelah kering

angin, slide difiksasi dengan melewatkan di atas nyala api Bunsen beberapa kali.

Dengan cara ini bakteri terfiksasi pada slide glass dan tidak merubah struktur dari

bakteri. Jika bakteri dari medium padat, dengan menggunakan jarum inokulasi ambil

bakteri dari medium padat dengan menyentuhkan ujung jarum inokulasi pada biakan

padat, selanjutnya disebarkan diatas slide glass yang telah diberi 1 atau 2 tetes air dan

disebar secara merata. Dikeringka anginkan dan difiksasi dengan panas sebagaimana

halnya pada pemindahan bakteri dari medium cair.

 25

Bahan dan Alat

Slide glass

Lampu spiritus

Jarum ose

Pemindahan biakan dari medium cair

Prosedur Kerja

1. Bersihkan slide glass dengan sabun dan alcohol 70% sebelum digunakan agar tidak

mengndung minyak/lemak

2. pegang slide glass pada bagian pinggirnya saja

3. beri label pada slide glass, yaitu sumber inokulum dan nama inokulum

4. aduk biakan yang akan dibuat preparat agar merata, lalu ambil 1 atau 2 lup biakan

secara aseptic dan sebarkan secara merata pada bagian tengan slide glass

5. biarkan kering angin, sampai kering sempurna

6. Fiksasi bakteri dengan melewatkan slide di atas nyala api Bunsen beberapa kali.

(jangan melakukan fiksasi pada slide yang masih basah, karena akan menyebabkan air

mendidih dan menghancurkan sel bakteri).

Pemindahan bakteri dari medium padat

Prosedur Kerja

1. Bersihkan slide glass dengan sabun dan alcohol 70% sebelum digunakan agar tidak

mengndung minyak/lemak
 26

2. pegang slide glass pada bagian pinggirnya saja

3. beri label pada slide glass, yaitu sumber inokulum dan nama inokulum

4. siapkan bakteri yang akan dibuat preparatnya

5. panaskan ujung jarum inokulasi sampai berpijar, biarkan dingin

6. secara aseptic, sentuhkan ujung jarum untuk mengambil sedikit biakan dari

medium padat.

7. sebarkan secara merata di atas slide glass yang telah ditetesi 1 atau 2 tetes air

8. biarkan kering udara sampai kering sempurna

9. Fiksasi bakteri dengan melewatkan slide di atas nyala api Bunsen beberapa kali.

(jangan melakukan fiksasi pada slide yang masih basah, karena akan menyebabkan air

mendidih dan menghancurkan sel bakteri).

 27

Gambar 5a. Prosedur cara pemindahan biakan dari medium cair ke preparat.
 28

Gambar 5b. Prosedur penyiapan preparat dari medium cair dan medium padat
 29

MODUL VI: PENYIAPAN MEDIUM

Tujuan: Memberikan ketrampilan kepada mahasiswa cara mempersiapkan media

dengan benar, dan mengetahui komposisi setiap media yang digunakan untuk

menumbuhkan bakteri

Pengantar Teori

Medium atau media (jamak) adalah makanan bagi mikroorganisme yang

digunakan untuk menumbuhkan mikroba secara in vitro dalam cawan petri atau

tabung. Medium umunya dapat tersedia dalam 3 bentuk yaitu medium padat, cair dan

semisolid. Medium cair antara lain adalah Nutrient Broth (NB), Citrate Broth,

Glukosa Broth, dll. Medium ini biasanya disiapkan untuk menumbuhkan bakteri

dalam jumlah besar, uji fermentasi, dan uji-uji biokimia lainnya. Media padat adalah

media cair yang ditambahkan dengan agen pemadat seperti agar, gelatin atau slica gel.

Bahan yang baik digunakan sebagai pemadat adalah bahan yang tidak dimanfaatkan

oleh mikroorganisme, tidak menghambat pertumbuhan mikroba dan tidak mencair

pada suhu ruang. Agar memenuhi criteria yang baik sebagai pemadat. Nutrien agar

(NA), Tripticase Soy Agar (TSA) dan agar darah merupakan contoh media padat yang

banyak digunakan untuk menumbuhkan koloni bakteri, isolasi kultur murni,

penyimpanan biakan dan pengamatan biokimia tertentu. Medium semisolid adalah

medium yang konsistensinya berada antara medium padat dan medium cair. Medium

ini mengandung agen pemadat dengan konsentrasi rendah sehingga bentuknya seperti

jelly, dan biasanya medium semisolid digunakan untuk menguji pergerakan bakteri.

Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri harus memenuhi

kebutuhan nutrisi dari mikroba yang akan ditumbuhkan. Kebutuhan dasar mikroba
 30

setidaknya meliputi 7 unsur yaitu: air, karbon, energy, nitrogen, mineral, factor

pertumbuhan dan pH. Komposisi media ada yang diketahui secara pasti dan juga yang

tidak. Media yang komposisi kandungannya diketahui secara pasti disebut media

sintetik sedangkan media yang komposisinya tidak diketahui secara pasti disebut

media nonsintetik. Media sintetik dibuat dari senyawa kimia yang sangat murni dan

diketahui dengan pasti. Media nonsintetik seperti Nutrient Broth, Triptic Soy Broth

komposisinya tidak diketahui secara pasti karena dibuat dari bahan yang

komposisinya tidak diketahui seperti dari beef extract, yeast extract dan peptone.

Bahan-bahan ini kaya akan nutrient dan vitamin.

Media khusus bakteri terdiri atas media selektif dan media differensial.

Bahan dan alat yang digunakan

Nutrient Agar

Timbangan

Aquades

Spatula

Erlenmeyer

Prosedur Kerja

1. Ambil medium, seperti Nutrien Agar (NA), Triptic Soy Broth (TSB) dari ruang

penyimpanan media, baca petunjuk pembuatannya. Pada label tertulis jumlah yang

harus ditimbang dalam 1 liter air.

2. Timbang bahan, untuk membuat sebanyak 200 mL media

 31

3. Tambahkan akuades sebanyak 200 mL aduk secara merata

4. Panaskan di atas hotplate sampai larutan tampak jernih

5. Tutup mulut Erlenmeyer dengan aluminium foil

6. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 oC, selama 15 menit.
 32

MODUL VII. TEKNIK KULTUR MURNI BAKTERI

Tujuan: 1). Mempelajari cara memperoleh koloni murni dari biakan campuran atau

dari sampel (air, tanah atau ikan sakit). 2). Mempelajari macam-macam teknik untuk

mendapatkan koloni murni

Pengantar Teori

Habitat tertentu seperti perairan, sedimen, atau tubuh ikan umunya dihuni oleh

lebih dari satu jenis bakteri. Sangat jarang suatu habitat dihuni oleh satu jenis bakteri

saja. Untuk dapat mempelajari morfologi, karakteristik, sifat-sifat fisiologis dan

biokimia suatu individu bakteri, sangat penting dilakukan pemisahan individu bakteri

dari individu lainnya. Ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk dapat

memisahkan bakteri, yang paling umum digunakan adalah metode cawan gores dan

metode cawan tuang. Metode cawan gores memiliki keuntungan yaitu menghemat

bahan dan waktu, namun memerlukan ketrampilan yang lumayan. Metode cawan

gores yang dilakukan dengan baik akan memperoleh koloni bakteri yang terpisah.

Kelebihan lain dari metode cawan gores adalah bahwa bakteri akan tumbuh sepanjang

goresan, bakteri yang tumbuh di luar goresan merupakan kontaminan.

Metode Cawan Gores

Bahan dan alat

Lup inokulasi

Cawan petri

Erlenmeyer berisi Nutrien Agar

 33

Lampu spiritus

Sampel/baiakan yang akan dimurnikan

Prosedur Kerja

1. Persiapkan meja kerja yang akan digunakan dengan memberikan disinfektan

alcohol 70% atau dengan betadine

2. Berikan label pada cawan yang akan digunakan untuk menggores biakan

3. Cairkan Nutrien agar dalam Erlenmeyer dengan memanaskan dalam microwave

atau hotplate, biarkan dingin sampai mencapai suhu sekitar 50 oC. (menuang nutrient

agar dalam cawan petri dalam keadaan panas akan menyebabkan terbentuknya

butiran-butiran air pada penutup cawan, dan akan menetesi dan merusak koloni

bakteri yang tumbuh).

4. Tuang nutrient agar secara aseptic ke dalam cawan petri, dan biarkan mengeras

5. Dengan menggunakan lup inokulasi secara aseptic lakukan penggoresan pada

cawan petri berisi agar dengan beberapa metode, yaitu metode Quadran A, Quadran

B, metode radian dan metode continues streak.

6. Inkubasi biakan dengan posisi cawan terbalik pada incubator dengan suhu 30 oC

selama 24 – 48 jam

7. Lakukan pemgamatan terhadap koloni bakteri yang tumbuh pada setiap metode

penggoresan yang dilakukan.

 34

Gambar 6. Prosedur metode cawan tuang untuk mendapatkan kultur murni

 35

Gambar 7. Metode cawan gores untuk mendapatkan kultur murni.

 36

Gambar 8. Beberapa teknik dalam metode cawan gores.

 37

MODUL VIII. KUANTITAS MIKROBA: HITUNGAN LANGSUNG DENGAN

METODE CAWAN

Tujuan: Mahasiswa dapat menghitung jumlah bakteri dalam sampel dengan metode

pengenceran cawan tuang

Pengantar Teori

Banyak studi menyangkut keberadaan mikroba pada suatu organism atau

habitat/lingkungan memerlukan pengetahuan tentang berapa jumlah mikroba pada

organism atau limgkungannya. Ada dua metode yang umum digunakan untuk

menentukan kuantitatif mikroba yaitu dengan metode perhitungan cawan tuang dan

metode turbidimetri. Perhitungan dengan metode hitungan cawan tuang adalah

metode pengukuran secara tidak langsung terhadap densitas sel dan hanya

menghitung bakteri yang hidup, sedangkan metode perhitungan dengan turbidimetri

berdasarkan kekeruhan dan merupakan perhitungan secara tidak langsung terhadap

bakteri baik sel yang hidup maupun mati. Metode perhitungan cawan melibatkan

beberapa pengenceran dengan menggunakan larutan fisiologis steril atau phosfat

buffer sampai bakteri cukup encer shingga dapat dihitung secara tepat. Jumlah koloni

bakteri dalam cawing seharusnya berkisar antara 25 sampai 250 koloni. Kurang dari

25 koloni tidak memenuhi sarat untuk dianalisis secara statistic atau lebih dari 250

koloni akan menyebabkan koloni akan berdempet satu sama lain sehingga sulit

menentukan dalam bentuk Colony Forming Unit (CFU). Setiap sel bakteri akan

terpisah dalam cawan dan akan tumbuh membentuk koloni yang terpisah satu sama

lain. Jadi jumlah koloni bakteri menggambarkan jumlah sel bakteri hidup yang dapat

tumbuh pada kondisi inkubasi yang digunakan. Umumnya pengenceran dilakukan

secara bertingkat mencapai 10-4 sampai 10-10 karena jumlah bakteri dalam sampel
 38

tidak diketahui, dan hasil pengencera dituang dalam cawan petri berisi Nutrien Agar

atau media lainnya, dengan dua atau tiga ulangan.

Bahan dan Alat

Prosedur Kerja

1. Bersihkan meja kerja yang akan digunakan dengan disinfektan

2. Beri label pada tabung dan cawing yang digunakan dengan menulis nama dan

tingkat pengencerannya

3. Secara aseptic pindahkan 1 mL sampel ke dalam blanko pengenceran 99 mL, ini

adalah pengenceran 10-2. Tutup kembali larutan pengencer tersebut.

4. Aduk secara merata, dan setelah itu buka kembali tutup botolnya lalu pindahkan, 1

mL dari botol tersebut ke dalam 99 mL botol blanko pengencer. Ini adalah

pengenceran 10-4.

5. Aduk secara merata, dan lakukan pengenceran sampai mencapai 10 -8.

6. Aduk kembali botol pengenceran 10-4, lalu pindahkan 1 mL pada cawan petri

pertama dan 0.1 mL pada cawan petri kedua. Lakukan hal yang sama pada

pengenceran 10-6 dan 10-8. Tuangkan kedalam masing-masing cawan petri tersebut

agar nutrient. Biarkan agar menyebar secara merata dengan sedikti menggoyang-

goyang cawan di atas meja kerja.

7. Setelah cawan dingin dan agar mengeras, inkubasi cawan pada posisi terbalik dan

inkubasi pada suhu 37 oC selama 24 – 48 jam.

8. Setelah inkubasi, hanya cawan petri yang ditumbuhi koloni bakteri antara 25 dan

250 koloni yang dihitung.

 39

9. Hitung konsentrasi bakteri. Sebagai contoh jika terdapat sebanyak 150 koloni

bakteri pada cawan dengan pengenceran 10-6, berarti jumlah bakteri per mL sampel

adalah: 150 dibagi 10-6, atau sama dengan 1.5 x 108 CFU/mL

Gambar 9. Prosedur kuantitas bakteri dengan metode pengenceran.

 40

MODUL IX. PEWARNAAN SEDERHANA

Tujuan: mempelajari cara melakukan pewarnaan sederhana dan melihat bentuk serta

susunan dari bakteri.

Pengantar Teori

Penggunaan satu jenis pewarna untuk mewarnai bakteri disebut juga dengan

pewarnaan sederhana. Beberapa pewarna yang umum digunakan dalam pewarnaan

sederhana adalah biru metilen (methylene blue), carbolfuchsin dan ungu Kristal

(crystal violet). Semua bahan pewarna tersebut dapat bekerja dengan baik dalam

mewarnai bakteri karena memiliki ion yang mengikat warna (chromopores) yang

bermuatan positif (cationic). Bakteri cenderung bermuatan negative sehingga akan

bereaksi dengan pewarna yang bermuatan positif. Pewarna yang bermuatan positif

disebut pewarna dasar (basic dye), sedangkan pewarna yang bermuatan negative atau

anionic chromopores, disebut pewarna asam (acidic dye), pewarna ini tidak akan

bereaksi dengan bakteri. Waktu yang diperlukan untuk melakukan pewarnaan

sederhana biasanya singkat berkisar antara 30 detik sampai 2 menit. Setelah preparat

yang dibuat telah diwarnai dengan waktu tertentu, selanjutnya dibilas dan

dikeringkan. Preparat dimati secara langsung dengan menggunakan mikroskop.

Pewarnaan sedehana berguna untuk dapat melihat bentuk bakteri, ukuran dan

orientasi/pengaturan bakteri apakah berpasangan, membentuk rantai, dll., dan untuk

melihat ada tidaknya granul.

Bahan dan alat

Ungu crystal
 41

Biru methylene

Slide glass

Biakan bakteri

Rak pewarna

Botol aquades

Prosedur Kerja

1. Buat preparat ulas bakteri, sebagaimana pada praktikum sebelumnya.

2. Letakkan preparast ulas bakteri pada rak pewarnaan

3. Lakukan pewarnaan dengan menggunakan pewarna methylene blue selamat 1

sampai 11/2 menit.

4. Bilas dengan menggunakan aquades selama beberapa detik

5. Keringkan slide dengan menggunakan kertas pengering

6. Lakukan pengamatan pada mikroskop dengan menggunakan minyak imersi

 42

MODUL X. PEWARNAAN GRAM DAN TAHAN ASAM

Tujuan: Memahami cara melakukan pewarnaan Gram, memahami proses biokimia

yang mendasari pewarnaan Gram, memahami prinsip-prinsip pada setiap proses

pewarnaan Gram.

Pengantar Teori

Pewarnaan Gram ditemukan oleh ahli mikrobiologi berkebangsaan Denmark,

bernama Christian Gram. Christian Gram mengembangkan teknik pewarnaan ini dan

mengelompokkan bakteri menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram positif dan

Gram negative. Prosedur ini didasarkan pada kemampuan mikroorganisme menahan

pewarna ungu dari crystal violet selama pemucatan dengan alcohol. Bakteri Gram

negative mengalami pemucatan dengan alcohol sehingga kehilangan warna ungu dari

crystal violet. Bakteri Gram positif tidak mengalami pemucatan dengan alcohol

sehingga tetap berwarna ungu. Setelah pemucatan, safranin, adalah pewarna

tandingan yang berwarna merah digunakan untuk memberi warna pada bakteri Gram

negative.

Beberapa jenis bakteri terutama genus Mycobacterium dan Nocardia tidak

mudah terwarnai dengan pewarna sederhana. Bakteri ini memiliki sejumlah besar

zat/bahan lipoid yang berlemak pada dinding selnya sehingga mempengaruhi sifat-

sifatnya terhadap zat pewarna. Tidak seperti pada kebanyakan bakteri, ketika

kelompok bakteri ini terwarnai dengan pewarna carbolfuchsin, mereka tidak akan

mudah terpucatkan oleh pemucat asam alcohol. Karena kelompok bakteri ini tidak

mudah terpucatkan dengan bahan pemucat sehingga disebut bakteri tahan asam.
 43

Setelah pemucatan, methylene blue ditambahkan pada mikroorganisme yang tidak

tahan asam sebagai pewarna tandingan.

Bahan dan alat

Crystal violet

Gram Iodine

Safranin

Ethanol 95%

Rak pewarna

Prosedur Kerja untuk pewarnaan Gram

1. Buat preparat ulas bakteri

2. Letakkan preparat di atas rak pewarna

3. Rendam preparat dengan pewarna ungu Kristal selama 30 detik

4. Bilas dengan air selama 5 detik

5. Warnai dengan Gram iodine mordan selama 1 menit

6. Bilas dengan air selama 5 detik

7. Lakukan pemucatan denga alcohol 95% selama 15 sampai 30 detik. Jangan

melakukan pemucatan terlalu lama. Tambahkan bahan pemucat tetes demi tetes

sampai warna ungu tidak lagi tercuci dari slide

8. Bilas dengan air selama 5 detik

9. Lakukan pewarnaan tandingan dengan safranin selama 60 – 80 detik.

10. Bilas dengan air selama 5 detik

11. Keringkan dengan menggunakan kertas pengering

 44

12. Lakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan minyak imersi. Bakteri

Gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram negative akan berwarna

merah muda.

Gambar 10. Prosedur pewarnaan Gram

 45

Gambar 11. Proses yang terjadi selama pewarnaan Gram

Gambar 12. Sel bakteri setelah pewarnaan Gram a). Gram positif, b) Gram negative.
 46

Prosedur Kerja Pewarnaan Tahan Asam

Bahan dan alat

Kit pewarnaan tahan asam (karbol fuchsin, biru metilen, alcohol asam)

Biakan bakteri

Hot plate

Rak pewarnaan

1. Siapakan preparat ulas

2. Rendam preparat dengan pewarna karbol fuchsin dan panaskan dengan uap diatas

air mendidih selama 5 menit. Jangan biarkan kering dan tambahkan pewarna

karbolfuchsin jika pewarnanya berkurang.

3. Setelah slide dingin, lakukan pemucatan dengan alcohol asam selama 15 – 20 detik

4. Hentikan pemucatan denga membilas dengan sebentar

5. Lakukan pewarnaan dengan pewarna tandingan methylene blue selama 30 detik

6. Bilas sebentar dengan air untuk menghilangkan kelebihan warna biru metilen

7. Keringkan dengan kertas pengering

8. Lakukakan pengamatan dengan mikroskop menggunakan minyak imersi. Bakteri

tahan asam akan berwarna merah, sedangkan bakteri tidak tahan asam berwarna biru.
 47

Gambar 13. Prosedur pewarnaan tahan asam (acid fast) pada bakteri.

Gambar 14. Sel bakteri setelah pewarnaan tahan asam.

 48

MODUL XI. CIRI-CIRI FISIOLOGIS BAKTERI

Tujuan: Mahasiswa mampu melakukakan pengujian biokimia mengidentifikasi

bakteri

Pengantar Teori

Untuk melakukan identifikasi bakteri tidak hanya memerlukan informasi

tentang pewarnaan dan bentuk serta ukuran bakteri, melainkan juga diperlukan

informasi tentang reaksi bakteri terhadap uji-uji biokimia yang dilakukan. Beberapa

uji-uji biokimia penting yang dilakukakn setelah melakukan pengamatan morfologi,

warna dan bentuk koloni, serta pewarnaan Gram adalah antara lain uji katalase,

oksidase, produksi indol, pemanfaatan laktat, oksidatif-fermentatif (O/F).

Sebagian besar bakteri aerob dan fakultatif yang memanfaatkan oksigen

menghasilkan hydrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap system enzim dari

bakteri tersebut. Bakteri ini bisa tahan terhadap antimetabolit beracun ini karena

bakteri menghasilkan enzyme catalase yang merubah hydrogen peroksida menjadi air

dan oksigen.
 49

DAFTAR PUSTAKA

Benson, H.J. 2001. Microbiological Applications: Laboratory Manual in General

Microbiology8th edition. McGraw-Hill comp. 478 p.

Cappucino, J.G & N. Sherman. 2014. Microbiology: a laboratory manual 10 th edition.

Pearson Education Inc.

Harley, J.P & L.M. Prescott. 2001. Laboratory Exercises In Microbiology, 5th edition.
McGraw-Hill College. 466 p.