Produksi Protease Ekstraseluler dari Bacillus

lichenisformis

1. Jenis dan sifat Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis merupakan kelompok bakteri yang termasuk dalam
kelas Bacili, ordo Bacillales, family Bacillaceae dan genus Bacillus (Itis.gov,
2018). Bacillus licheniformis merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang
dengan panjang antara 1.5 urn sampai 3 um dan lebar antara 0.6 um sampai 0.8
um. Spora dari bakteri ini berbentuk silindris atau elips dan terdapat pada sentral
atau parasentral dari sel penghasil spora. Bacillus licheniformis bersifat motil
dan memberikan hasil positif pada uji katalase dan uji Voyeus-Proskauer.
Bakteri ini masih dapat tumbuh pada suhu 50OC serta dalam larutan NaCl 7%.
Bacillus licheniformis tumbuh pada suhu minimum 15OC dan suhu maksimum
50-55OC. Bakteri ini dapat menyebabkan dekomposisi kasein, dapat
menggunakan asam sitrat dan propionat, dapat mereduksi NO3 menjadi NO2 dan
menghidrolisis pati. Bacillus licheniforlmis menghasilkan beberapa enzim
ekstraseluler yaitu α-amilase, amino peptidase, protease metal, protease serin,
protease serin-metal, penicilinase (B-laktamase), Endo-N-asetil glukoaminidase,
dan lipase serta antibiotik bacitracin (Sian, 1992).

2. Jenis, sifat dan lokasi Protease Bacillus licheniformis

Protease merupakan enzim proteolitik yang dapat mengkatalisis
pemecahan ikatan peptida dalam protein lainnya. Menurut Nomenclature
Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(NC-IUBMB), protease merupakan enzim yang tergolong dalam kelas-3 yaitu
hidrolase dan subkelas-4 yaitu bertindak pada ikatan peptida (Sbcs.qmul.ac.uk,
2018). Berdasarkan sisi aktif reaksinya, protease dibagi menjadi 2 kelompok
besar, yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase berperan dalam
memecah ikatan peptida pada bagian ujung amino atau terminal dari karboksi
substratnya sedangkan endopeptidase dapat memecah ikatan peptide yang jauh
dari terminal substrat. Berdasarkan kelompok fungsional dari bagian sisi
aktifnya, protease diklasifikasikan dalam 4 kelompok yaitu serin, aspartat, sistein,
dan metalloprotease. Protease merupakan enzim degradasi yang berperan dalam
mengkatalisis proses hidrolisis protein total (Ilmiah, 2018).

3. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan Bacillus

lichenisformis dan produksi Protease Bacillus lichenisformis
Fermentasi untuk memproduksi protease dilakukan dengan cara
menyiapkan starter yaitu mengambil satu ose biakan bakteri Bacillus
licheniformis dari stock kultur yang ada dan dilakukan kultivasi ke dalam
erlenmeyer 250 mL yang berisi 50 mL medium Luria Bertani (LB) cair. Adapun
komposisi media LB terdiri dari pepton 1%, ekstrak khamir 0.5%, NaCl 0.5%
dan pH ditetapkan pada 7,3. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada mesin
penggoyang dengan agitasi 180 rpm dan suhu 55OC. Enzim ekstrak kasar
diperoleh melalui proses fermentasi sistem batch dengan inkubasi selama 16 jam
untuk diamati aktivitas enzimatiknya (Ilmiah, 2018).
Pengukuran pH optimum enzim protease dilakukan dengan mengambil
enzim ekstrak kasar hasil pemekatan. Pengukuran pH yang bervariasi dari 7, 8, 9,
10, dan 11 dilakukan menggunakan bufer K-fosfat (pH 7), bufer Tris-HCl (pH 8
dan 9), dan bufer Glisin NaOH (pH 10 dan 11). Perlakuan untuk sampel enzim
yaitu dengan menambahkan kasein hidrolisat dengan volume 625 μL serta enzim
ekstrak kasar sebanyak 125 μL ke dalam tabung mikro. Inkubasi dilakukan pada
suhu 55OC, selama 10 menit. Larutan TCA bervolume 625 μL ditambahkan dan
kembali dilakukan inkubasi selama 15 menit, suhu 55OC dan pada kecepatan
agitasi 300 rpm. Supernatan didapatkan kembali melalui sentrifugasi dengan
kecepatan 11.000 g, selama 5 menit. Sebanyak 300 μL supernatan direaksikan
dengan Na2CO3 sebanyak 750 μL serta 150 μL folin. Inkubasi dilakukan kembali
pada suhu 55OC, selama 15 menit dan kecepatan agitasi yang sama. Aktivitas
enzim diukur menggunakan spektrofotometer λ= 660 nm (Ilmiah, 2018).
Hasil pengujian aktivitas protease dari Bacillus licheniformis
menggunakan pH alkalin menunjukkan aktivitas tertinggi terdapat pada pH 8.
Protease alkalin memiliki aktivitas tertinggi pada kisaran pH basa. Produksi
protease oleh berbagai species Bacillus bervariasi dari 7-9. Enzim yang
diinkubasi pada pH yang sesuai memiliki kestabilan tinggi sehingga dapat
dihasilkan aktivitas paling besar. Pada pH tersebut enzim berada dalam keadaan
yang kondusif dalam mengikat substrat sehingga aktivitas yang dihasilkan lebih
tinggi. pH 8 dapat mengontrol reaksi enzimatis dengan menjaga konformasi sisi
aktif dalam berikatan dengan substrat. Enzim yang memiliki aktivitas tertinggi
pada pH basa tersebut dapat digunakan untuk menghidrolisis protein. Kondisi
basa membuat asam amino penyusun rantai polipeptida suatu protein mengalami
kerusakan sehingga protease alkalin tersebut efektif untuk dijadikan kandidat
biodeterjen (Ilmiah, 2018).
Bacillus licheniformis merupakan jenis bakteri yang tergolong dalam
bakteri termofilik. Oleh karena itu penentuan suhu optimum dilakukan dengan
perlakuan inkubasi pada kisaran suhu 40OC, 50OC, 60OC, 70OC, 80OC, dan 90OC.
Substrat kasein hidrolisat sebanyak 625μL (pH 8) ditambahkan enzim sebanyak
125 μL dan dilakukan inkubasi selama 10 menit dengan suhu yang bervariasi.
Larutan TCA dengan volume 625 μL direaksikan dengan campuran tersebut dan
selanjutnya dilakukan inkubasi kembali selama 15 menit menggunakan suhu
yang beragam dari 40-90OC. Supernatan didapatkan dengan cara sentrifugasi
selama 5 menit dengan kecepatan 11.000 g. Hasil supernatan diambil sebanyak
300 μL dan direaksikan dengan Na2CO3 sebanyak 750 μL. Reagen folin dengan
volume 150 μL ditambahkan dan diinkubasi pada suhu yang bervariasi dengan
waktu 15 menit. Pengukuran aktivitas proteolitik dilakukan menggunakan
spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm (Ilmiah, 2018).
Setiap enzim memerlukan jumlah panas untuk dapat aktif. Suhu yang
rendah menyebabkan aktivitas enzim turun karena energi yang diperlukan untuk
mengkatalis suatu reaksi sangat sedikit. Peningkatan suhu inkubasi dapat
menaikkan aktivitas enzim pada titik optimum yang disebut sebagai suhu
optimum. Kenaikkan di atas suhu optimum dapat menurunkan aktivitas enzim
karena struktur enzim mengalami kerusakan sehingga kemampuan katalisisnya
berkurang. Aktivitas tertinggi Bacillus licheniformis diperoleh pada suhu 50OC.
Secara umum sebagian besar alkalin protease yang tersedia secara komersial
menunjukkan aktivitas optimum pada kisaran suhu 50OC-70OC. Berdasarkan
hasil tersebut menunjukkan bahwa protease yang dihasilkan oleh B.
licheniformis dapat dimanfaatkan untuk enzim komersial. Penurunan aktivitas
dapat terjadi karena enzim mengalami kerusakan struktur tiga dimensinya oleh
suhu yang terlalu tinggi sehingga kemampuan dalam berikatan dengan substrat
akan semakin rendah. Kenaikan suhu akan meningkatkan energi molekul
substrat sehingga dapat meningkatkan laju reaksi enzim. Peningkatan suhu juga
berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat sehingga mengalami
hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan turunnya aktivitas
enzim (Tekin et al. 2012).
Pengaruh ion logam dilakukan untuk pengujian aktivitas enzim terhadap
ion logam Ca2+, Mn2+, K+, dan Na+ dalam bentuk garam, masing-masing yaitu
CaCl2, MnCl2, KCl, dan NaCl. Perlakuan yang lain ialah membandingkan
dengan tanpa adanya penambahan ion logam (kontrol). Pengujian ion tersebut
sebagai aktivator atau inhibitor terhadap aktivitas protease dilakukan dengan
cara mereaksikan larutan enzim dengan ion logam konsentrasi 2 mM dan 5 mM,
kemudian direaksikan kembali dengan substrat kasein hidrolisat 0.6% (Ilmiah,
2018).
Ada beberapa enzim juga memerlukan ion logam dalam konsentrasi
tertentu untuk meningkatkan stabilitasnya pada suhu tinggi. Ion yang
ditambahkan dalam enzim dapat berperan sebagai aktivator atau inhibitor.
Pengaruh adanya activator yang berikatan pada enzim menyebabkan kenaikan
kecepatan reaksi enzimatis sedangkan kecepatan reaksi akan turun jika inhibitor
berikatan dengan enzim. Aktivitas protease Bacillus licheniformis menurun
dengan konsentrasi ion logam Ca2+, Mg2+, Mn2+, dan Na+ 5 mM karena pada
konsentrasi tersebut enzim kehilangan fungsinya dalam berikatan dengan
substrat. Tingkat konsentrasi ion yang diberikan akan mempengaruhi kekuatan
ion pada enzim sehingga dapat merusak struktur enzim. Konsentrasi ion 2 mM
menaikkan aktivitas enzim karena pada konsentrasi tersebut kecepatan reaksi
enzimatis berjalan dengan cepat dan mampu menjaga struktur enzim dengan
baik. Pemberian ion logam pada enzim tidak menunjukkan hasil yang signifikan
terhadap aktivitas protease. Hal ini diketahui dari aktivitas enzim yang
mengalami penurunan dengan penambahan ion logam konsentrasi 5 mM
sedangkan konsentrasi yang rendah menyebabkan enzim tersebut lebih aktif.
Enzim yang tidak dipengaruhi oleh penambahan ion logam lebih
menguntungkan karena aktivitasnya tidak dihambat oleh penambahan EDTA,
yaitu salah satu komponen dari deterjen (Ilmiah, 2018).
Aktivitas protease dari Bacillus sp. dapat dirangsang oleh penambahan
ion Mn2+ dan Ca2+. Hasil tersebut telah menunjukkan bahwa ion logam tersebut
dapat melindungi enzim protease terhadap denaturasi suhu dan memerankan
peran penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim pada suhu yang lebih
tinggi. Kation berupa Ca2+, Mg2+, Mn2+, dan Cu2+ umumnya meningkatkan
aktivitas protease sedangkan Hg2+, dan Zn2+ dapat menghambat aktivitas enzim.
Namun, Na+, K+, Al3+, dan Cd2+ sering ditemukan sesuai untuk enzim yang
ditambahkan dalam deterjen. Enzim protease dari Bacillus licheniformis
ditingkatkan aktivitasnya dengan penambahan 2 mM ion Ca2+ (Ilmiah, 2018).
Pengujian pengaruh berbagai komponen deterjen terhadap aktivitas
protease dilakukan dengan menggunakan pH 9 pada suhu 60OC. Pengujian
dilakukan pada suhu tersebut karena alkalin protease yang sesuai untuk bahan
aditif dalam deterjen, yaitu suhu 60OC. Komponen deterjen yang ditambahkan
ke dalam enzim meliputi surfaktan anionik yaitu SDS, surfaktan nonionik yaitu
Triton X-100, pengkelat logam berupa EDTA, dan agen pengoksidasi atau
pemutih yaitu H2O2. Surfaktan anionic dan nonionik berperan dalam memotong
ikatan antar kotoran dan mencegah noda kembali berikatan. Pengotor berupa ion
logam pada kain dapat dicegah dengan penambahan EDTA.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) yang ditambahkan dalam formula
deterjen juga berperan sebagai builder dalam proses pencucian. Komponen
deterjen juga mengandung bahan pemutih sehingga diperlukan penambahan
H2O2 dalam pengujian aktivitas protease B. licheniformis (Ilmiah, 2018).
Penambahan SDS 0.1-0.5% menyebabkan penurunan aktivitas protease B.
licheniformis. Enzim akan sangat terhambat aktivitasnya ketika ditambahkan
SDS karena bagian kepala hidrofilik SDS yang bersifat anionik dapat mengubah
muatan residu asam amino enzim protease dan memutuskan ikatan hidrogen
pada protein enzim sehingga konformasi sisi aktif protease berubah. Triton X-
100 dengan konsentrasi sebesar 1% dan 2% menyebabkan peningkatan aktivitas
protease. Peningkatan ini terjadi pada menit ke-0, 15, dan 30. Pada menit ke-0
melalui penambahan Triton X-100 dengan konsentrasi 3% juga menyebabkan
naiknya aktivitas protease. Penurunan aktivitas terjadi pada menit ke-15 dan 30.
Penurunan aktivitas tersebut tidak drastis karena tidak mencapai 50%, sehingga
melalui pemberian Triton X-100 dengan konsentrasi 3% tidak mempengaruhi
aktivitas enzim. Konsentrasi Triton X-100 sebesar 5% dapat menurunkan
aktivitas protease. Alkalin protease yang ditambahkan dengan Triton X-100 dan
surfaktan nonionik Tween 20 dan Tween 80 tidak terdeteksi adanya kehilangan
aktivitas enzim. Triton X-100 dan Tween 80 mampu mengaktifkan enzim
tersebut. Peningkatan aktivitas relatif dari masing-masing penambahan surfaktan
nonionik tersebut adalah 16% dan 8%. Peningkatan aktivitas ini disebabkan oleh
pengaruh surfaktan dalam pembukaan bagian substrat (Ilmiah, 2018).
Logam pengkelat seperti EDTA berperan dalam mengikat logam. Dalam
komponen deterjen, EDTA berperan dalam meningkatkan efisiensi pencuci dari
surfaktan dengan cara menonaktifkan mineral penyebab kesadahan air. EDTA
yang ditambahkan dalam protease B. licheniformis dengan konsentrasi tinggi
dapat menurunkan aktivitas enzim. Pada konsentrasi 10 mM menyebabkan
penurunan drastis pada aktivitas relatif enzim, yaitu lebih dari 50%. Pada
konsentrasi EDTA yang tinggi dapat mempengaruhi aktivitas protease.
Penambahan EDTA dapat menyebabkan terhambatnya aktivitas protease, yaitu
protease serin yang telah dihasilkan oleh Bacillus licheniformis. Penghambatan
enzim oleh EDTA akan meningkat seiring dengan tingkat konsentrasinya
(Ilmiah, 2018).
Bahan pemutih berupa hidrogen peroksida yang dicampurkan ke dalam
enzim dapat diamati pengaruhnya terhadap aktivitas protease. Pada konsentrasi
H2O2 sebesar 2.5% tidak menyebabkan penghambatan aktifitas protease yang
terlalu tinggi, justru menyebabkan naiknya aktivitas protease pada menit ke-0
dengan akivitas relatif sebesar 115% namun mengalami penurunan pada
inkubasi menit ke-15 dan ke-30 dengan nilai aktivitas relatif masing-masing 90%
dan 57%. Enzim protease dari Bacillus licheniformis tersebut memiliki
ketahanan pada agen pengoksidasi dengan konsentrasi 2.5%. Penambahan H2O2
dapat dihasilkan aktivitas relatif sebesar 93.54% yang menunjukkan bahwa
protease dari B. licheniformis NCIM-2042 merupakan enzim pengikat dan
pemutih yang stabil meskipun hidrogen peroksida tersebut merupakan zat
pengoksidasi kuat dan biasanya dapat menonaktifkan protein secara oksidatif.
Penghambatan aktivitas protease secara drastis terjadi dengan penambahan H2O2
sebesar 5%. Aktivitas relatif yang dihasilkan pada konsentrasi tersebut kurang
dari 50% pada inkubasi menit ke-0 hingga menit ke- 30. Enzim deterjen stabil
dengan adanya zat pengoksidasi dan pemutih. Enzim protease memiliki
ketahanan terhadap agen pemutih dan pengoksidasi seperti H2O2 selama
pencucian. Aktivitas protease sebesar 95% dan 86% diamati untuk konsentrasi
H2O2 masing-masing 2.5 dan 5% pada suhu 60OC selama 15 menit. Peningkatan
konsentrasi H2O2 sebesar 1% dan 5% dapat menyebabkan penurunan aktivitas
36% dan 38% untuk protease Bacillus licheniformis KBDL4 (Ilmiah, 2018).

DAFTAR PUSTAKA
Ilmiah, S.N., Mubarik, N.R., Wahyuntari, B. 2018. Characterization of Protease
from Bacillus licheniformis F11.1 as a Bio-Detergent Agent. Makara
Journal of Science. Vol 2 (3) : 105-112.

ITIS. 2018. Bacillus licheniformis. http://www.itis.gov/. [Diakses pada 27

Oktober 2018].

Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and

Molecular Biology. 2018. Hidrolase Nomenclature.
http://www.sbcs.qmul.ac.uk/ [Diakses pada 27 Oktober 2018].

Sian, L.W. 1992. Mempelajari Aktivitas Protease Bacillus licheniformis Galur

Gibson Nctc 10341 pada Fermentasi Terkontrol Menggunakan Limbah
Cair Tahu. Skripsi. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Tekin, N,. Cihan A.C., Takac Z.S., Tuzun C.Y., Tunc K., Cokmus C. 2012.
Alkaline protease production of Bacillus cohnii APT5. Turk J Biol.
36:430-440.