LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA MOLEKULER

ISOLASI DNA PLASMID DAN TRANSFORMASI

PLASMID KE VEKTOR
(Escherichia coli DH5α)

Oleh:
MUHAMAD AZWAR SYAH
P051160241

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA IPB
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2016
 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Bakteri memiliki informasi genetik berupa kromosom sirkuler dan plasmid
yang terletak di sitoplasma (Yuwono 2005). Seluruh metabolisme bakteri
dikendalikan oleh ekspresi gen yang terdapat kromosom sirkuler dan plasmid.
Plasmid merupakan materi genetik ekstrakromosal yang berbentuk sirkuler, dan
biasanya banyak mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik.
Secara alami, bakteri dapat mentransfer materi genetiknya berupa plasmid
melalui proses konjugasi. Penambahan plasmid pada bakteri dapat menyebabkan
munculnya sifat-sifat baru pada bakteri tersebut. Hal ini disebabkan karena plasmid
mengandung beberapa gen yang berperan dalam proses metabolisme. Salah satu
ekspresi gen yang berperan dalam plasmid adalah metabolisme laktosa yang
dikendalikan operon lac.
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas
ganda, berbentuk sirkuler, ukurannya lebih kecil dari DNA kromosomal (berat
molekul sekitar 2x106 sampai dengan 20x106 dalton dengan jumlah 3000-30.000
pasangbasa). Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
menggunakan Escherichia coli sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu
yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Plasmid ini tidak mengandung gen yang
diperlukan untuk pertumbuhan normal, tetapi sebaliknya memiliki gen untuk
fungsi-fungsi khusus seperti resistensi antibiotik. (Boyer, 2001).
Plasmid digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang
tidak bisa diperoleh secara alami karena plasmid dapat digunakan untuk membawa
molekul DNA asing masuk dalam sel inang. Astuti dkk. (2004) menggunakan
DNA Plasmid agraobacterium sp. sebagai vektor dalam transformasi gen Coat
Protein virus. Selain itu, plasmid E. coli dapat digunakan sebagai vektor dalam
transformasi DNA kromosom pada jahe (Manguwardoyo 2002).
Isolasi plasmid dapat dilakukan dengan cara alkali lisis bakteri yang telah
ditumbuhkan semalam pada media LB. Beberapa larutan yang dapat digunakan
dalam isolasi plasmid, yaitu SDS yang berperan dalam mengikat kation pada
membran sel sehingga mempengaruhi permeabilitas dari membran sel bakteri
(Manguwardoyo 2002). Salah satu teknik isolasi plasmid bakteri dikenal dengan
istilah metode SOL. Kecermatan dan ketelitian dalam setiap penambahan larutan
sangat diperlukan dalam menunjang keberhasilan isolasi plasmid. Transformasi
plasmid ke dalam bakteri dapat dilakukan dengan pemberian kejutan panas pada sel
kompeten yang diakhiri dengan pemberian suhu dingin. Teknik transformasi
mengikuti prinsip perbedaan tekanan sel. Pemberian kejutan panas pada sel
kompeten menyebabkan volume sel meningkat sehingga menyebabkan plasmid
masuk ke dalam sel kompeten, sedangkan pemberian suhu dingin mengembalikan
tekanan dalam sel menurun. Hal inilah yang mendasari praktikum isolasi plasmid
dan transformasi plasmi ke dalam bakteri E. coli.
Rumusan masalah
Rumusan masalah yang hendak dicapai pada praktikum ini adalah sebagai
berikut:
1. Bagaimana tahapan isolasi DNA plasmid bakteri ?
2. Bagaimana hasil isolasi DNA plasmid bakteri ?

Tujuan Praktikum
Tujuan praktikum ini adalah sebagai berikut :
1. Untuk mengetahui tahapan isolasi DNA plasmid bakteri
2. Untuk mengetahui hasil isolasi DNA plasmid bakteri
Manfaat praktikum
Manfaat yang dapat diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Dapat mengetahui tahapan isolasi DNA plasmid bakteri
2. Dapat mengetahui hasil isolasi DNA plasmid bakteri
 Hasil dan Pembahasan

Isolasi Plasmid Bakteri

Metode isolasi plasmid bakteri yang digunakan pada praktikum yaitu metode
SOL. Tahapan pertama pada isolasi plasmid dilakukan dengan pemberian larutan
SOL I yang terdiri dari larutan EDTA dan HCl. Hal ini bertujuan untuk untuk
menstabilkan pH pada sel bakteri. Selanjutnya pemberian larutan SOL 2 yang
mengandung larutan SDS dan NaOH. Pemberian larutan SDS ini berperan dalam
menginstabilisasi dinding sel bakteri melalui pengikatan kation-kation bakteri.
Pemberian SOL 2 menyebabkan dinding sel bakteri menjadi tidak permeabilitas
sehingga menyebabkan komponen sel keluar sel. Tahap selanjutnya dengan
pemberian larutan SOL 3 yang mengandung natrium asetat yang berperan dalam
mempresipitasi protein sehingga DNA berpisah dengan protein.
Pemberian ketiga larutan SOL tersebut menyebabkan permeabilitas dinding
sel bakteri menjadi rendah, dan pemberian suhu dingin mengembalikan
permeabilitas dinding sel bakteri. Hal ini menyebabkan komponen isi sel bakteri
tetap berada di luar sel. Komponen sel yang keluar termasuk salah satunya adalah
berbagai protein, senyawa organik, dan materi genetik (DNA plasmid, DNA
kromosal, dan DNA superkoil).
Senyawa organik dan protein dihilang dengan pemberian larutan PCI. Larutan
mengandung fenol yang mendenaturasi protein, dan kloroform melarutkan senyawa
organik. Selanjutnya, larutan tersebut disentrifugasi untuk memisahkan pelet dan
supernatan. Pelet akan mengendap didasar tabung karena mengandung senyawa
organik dan protein, sedangkan supernatan berada di lapisan atas karena
mengandung DNA.
Tahap selanjutnya, yaitu supernatan diberikan larutan etanol absolut dan
etanol 70%. Etanol absolut berfungsi untuk mengendapkan DNA plasmid bakteri,
sedangkan etanol 70% memurnikan DNA dari senyawa-senyawa kontaminan.
Keberhasilan isolasi plasmid dapat dilihat dengan terbentuknya endapan putih pada
dasar tabung. Penghilangan sisa etanol dapat dilakukan dengan pemberian
perlakuan vacuum dryer. Tahap terakhir adalah pemberian larutan RNase yang
diinkubasi pada suhu 37°C untuk mendegradasi RNA bakteri.

Hasil Elektroforesis DNA Plasmid Escherichia coli DH5α

Hasil visualisasi elektroforesis terlihat bahwa sumur 1, 2, dan 8 terbentuk tiga
pita tegas. Hal ini menunjukkan bahwa isolasi DNA plasmid bakteri telah berhasil
diisolasi. Pita pertama merupakan DNA kromosomal karena DNA kromosomal
memiliki ukuran yang lebih besar dibandingkan materi genetik yang lain. Pita
kedua merupakan DNA plasmid, dan pita ketiga merupakan DNA superkoil.
Beberapa sampel bakteri lainnya tidak terbentuk adanya pita. Hal ini dapat
mengindikasikan bahwa DNA plasmid bakteri tidak terisolasi. Beberapa
kemungkinan faktor yang menyebabkan hal tersebut diantaranya karena pelisisan
bakteri dengan pemberian larutan SOL tidak optimal, adanya aktivitas enzim
nuklease yang mendegradasi DNA, terjadinya kontaminasi oleh polisakarida, dan
metabolit sekunder ikut terisolasi serta kemungkinan besar DNA path-patah selama
proses isolasi (Fatchiyah dkk. 2011).

M1 M2 1 2 3 4 5 6 7 8

Smear

DNA kromosomal

DNA Plasmid

DNA Superkoil

Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA plasmid pada gel agarose 1%, M1-M2:
Marker , 1-8: Isolat Escherichia coli DH5α

Transformasi Vektor Plasmid Ke Bakteri Eschericia coli

Transformasi bakteri diawali dengan pembuatan sel kompeten yang tidak
memiliki DNA plasmid. Sel kompeten yang digunakan pada praktikum ini adalah
Eschericia coli DH5α. Kultur bakteri harus diinkubasi semalamam untuk
mendapatkan bakteri dalam fase log. Kultur bakteri diberikan larutan yang
mengandung CaCl2 untuk mengurangi permeabilitas dinding sel bakteri.

Sel kompeten dimasukkan ke dalam eppendorf yang mengandung plasmid

hasil isolasi sebelumnya. Selanjutnya, larutan tersebut di beri suhu dingin (es batu)
selama 20 menit untuk mengecilkan volume sel karena pada suhu dingin tekanan
dalam sel lebih rendah. Tahap selanjutnya, diberikan kejutan panas selama 45 detik
sehingga dinding sel bakteri membesar dan plasmid masuk ke dalam sel kompeten
tersebut. Pemberian suhu dingin (es batu) dilakukan kembali untuk mengencilkan
kembali membran sel bakteri sehingga plasmid terperangkap dalam sel kompeten.
Tahap terakhir, suspensi tersebut ditumbuhkan pada media LB, dan tumbuhnya
koloni putih dapat mengindikasikan bahwa plasmid telah tertransformasi ke dalam
bakteri E. coli.
 Gambar 2. Bakteri hasil transformasi plasmid
Gambar 2 terlihat adanya koloni bakteri berwarna putih. Hal ini
menunjukkan bahwa sel kompeten yang digunakan dalam proses transformasi
mengalami pembelahan. Namun, tumbuhnya bakteri tersebut dapat
mengindikasikan keberhasilan transformasi plasmid ke dalam bakteri kompeten,
dan dapat pula mengindikasikan plasmid tersebut tidak tertransformasi. .

Gambar 3. Hasil elektroforesis PCR koloni bakteri transformasi bakteri

PCR koloni dilakukan dengan menggunakan primer gen α. Penggunaan
primer dapat membuktikan bahwa bakteri sel kompeten telah tersisipi plasmid atau
tidak. Hal ini disebabkan karena hanya plasmid yang mengandung gen α. Hasil
elektroforesis terlihat semua sampel bakteri memiliki pita tegas (Gambar 3). Hal ini
menunjukkan bahwa semua sampel bakteri berhasil tertransformasi oleh plasmid.
 PENUTUP

Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan pada praktikum ini maka
dapat disimpulkan bahwa :
1. Tahapan isolasi DNA bakteri yaitu stabilisasi pH, pelisisan dinding sel,
presipitasi protein, ekstraksi DNA (PCI), Presipitasi DNA plasmid, dan
pencucian DNA.
2. DNA plasmid Eschericia coli sampel 1,2, 5 dan 8 berhasil terisolasi,
sedangkan sampel 3, 4, 6, dan 7 tidak berhasil terisolasi.
3. Transformasi plasmid dilakukan dengan dua tahap, yaitu pembuatan sel
kompeten (diberi larutan CaCl2) dan transfer plasmid dengan memanfaatkan
kejutan panas.
4. Semua plasmid telah berhasil ditransformasi yang ditandai dengan
tumbuhnya koloni pada media ZYT.

Saran

Saran yang dapat diajukan pada praktikum ini adalah sebaiknya praktikum
dilakukan setiap mahasiswa.

DAFTAR PUSTAKA
Astuti A., Handayani E., Rineksane I. A., Fitriyah N. A. 2004. Multiplikasi, Induksi
Planlet dan Seleksi Tembakau Hasil Transformasi Gen Coat Protein SMV
Secara Kultur In Vitro. Jurnal Bioteknologi. 1(2):31-32
Boyer, Rodney. 2001. Concepts In Biochemistry 2nd Edition. Brooks/Cole. USA

Mangunwardoyo W. 2002. Transformasi Fragmen DNA Kromosom Xanthomonas

campestris ke Dalam Eschericia coli. Jurnal Makara Sains. 6(1):22-23
Yuwono. 2005. Biologi Molekular. Jakarta. Erlangga.
 METODOLOGI
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah kultur E. coli E.coli DH5α, TFB, es, DMSO,
plasmid E.coli DH5α, media 2YT/LB, agar bakteri, LA, ampicilin, ddH2O, larutan
Sol, PCI (fenol kloroform-isoamilalkohol) sebanyak 1 x volume supernatan, EtOH
100% sebanyak 2 x volume supernatan, 1 ml EtOH 70%, 20-50 µl ddH2O, RNAse
sebanyak 0,2 x volume larutan, gel agarosa, buffer Tris Acid EDTA (TAE), EtBr
1%, loading dye,
Alat yang digunakan, yaitu tabung ependrof, laminar air flow, mikro pipet,
mikro tip, cawan petri, batang drigalski, bunsen, rak tabung ependrof, ice box,
inkubator, gel doc, dan sisir (tray).

Prosedur Kerja
Isolasi Plasmid Metode Sol
Koloni bakteri Escherichia coli sebanyak 1,5 mL dimasukkan kedalam
tabung eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 4.000 rpm selama 5 menit
temperatur ruang. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang dan hanya tersisa
pellet. Pellet yang mengandung endapan bakteri selanjutnya ditambahkan dengan
100µL sol 1 (resuspention selution) kemudian tambahkan 200 µL sol 2 (bolak balik
± 10 kali) dan simpan di es selama 10 menit, kemudian disentrifugasi 10.000 rpm
selama 10 menit pada suhu 4oC, setelah di sentrifugasi mengambil supernatan
sebanyak 500 µL + PCI (Phenol Choloform Isoamilalkohol) 1 kali volume
kemudian divorteks, kemudian di sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4oC. Kemudian mengambil supernatan + EtOH 100% sebanyak 2 kali volume
sambil dibolak balik. Kemudian di simpan pada es /frezer selama 3 menit.
Kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC,
memindahkan pellet ke tube yang baru sebanyak 500 µL + 1 ml EtOH 70%
kemudian disentrifugasi kembali 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC,
kemudian supernatan dibuang dan dikeringkan dengan menggunakan vacum drayer
selama 30 menit. Kemudian ditambahkan 15 µL, kemudian ditambahkan RNAse
dan inkubasi selama 37oC selama 10 menit, simpan di frezer agar isolat tidak rusak.
Lanjut uji elektroforesis.
Metode Analisis Plasmid dengan Elektroforesis
Pembuatan gel agarosa dengan konsentrasi 1% dalam 30 ml, Suspensi isolat
sebanyak 5µL dicampur dengan peyangga muatan berwarna (loading dye)
sebanyak 1µL. Campuran tersebut selanjutnya digunakan untuk mendeteksi
plasmid yang akan divisualisasikan pada sinar UV dengan cara memasukkan
terlebih dahulu campuran tersebut kedalam sumur-sumur agarosa 1%. Migrasi
plasmid pada gel agarosa akan berjalan dari kutub negatif menuju kutub positif
sehingga dibutuhkan arus listrik untuk memigrasikan plasmid. Elektroforesis
dijalankan dengan voltase yaitu 100 volt selama 30 menit. Gel yang sudah
dielektroforesis selanjutnya dimasukkan kedalam larutan EtBr (Editium bromide)
selama + 30 menit dan dicelupkan kedalam air selama + 5 menit. Untuk mengamati
pita plasmid maka gel tersebut diletakkan di atas UV transluminator dan hasil yang
pita tersebut difoto menggunakan kamera.
Seleksi Sel Kompeten
Kultur E.coli DH5α diambil sebanyak 1,5 ml disimpan di es selama 10
menit, kemudian di sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm di
suhu 4oC. Dari hasil sentrifuge diambil endapannya (pellet) dan ditambahkan
dengan 495 µl TFB diresuspensi perlahan, diletakkan di es kembali selama 10
menit. Setelah 10 menit campuran pellet dan TFB di sentrifuge pada suhu 4oC
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Hasil sentrifuge tersebut diambil
pelletnya dan ditambahkan 125µl TFB diresuspensi perlahan. Di tahap akhir
pembuatan sel kompeten campuran tersebut ditambahkan DMSO sebanyak 8,8 µl
dan disimpan di es selama 10 menit.
Transformasi
Sel kompeten yang telah didapatkan sebelumnya diambil sebanyak 50 µl
dan ditambahkan 10 µl plasmid E.coli DH5α diletakkan pada es selama 10 menit.
Kemudian dipanaskan menggunakan penangas pada suhu 42oC selama 45 detik.
Setelah 45 detik simpan kembali di es selama 5 menit. Setelah proses heat shock
campuran tersebut ditambahkan media 2YT/LB, inkubasi pada suhu 37oC selama
20 menit dengan kecepatan 200 rpm. Kemudian di sebar dengan batang drigalski
pada media plate agar yang mengandung LA dan ampicilin, inkubasi pada suhu
37oC selama 24 jam. Setelah 24 jam diamati pertumbuhan pada plate agar tersebut.
PCR koloni
Untuk melakukan perbanyakan sel yang telah ditransformasikan
dilakukan PCR. Hasil dari transformasi yang telah diinkubasi selama 24 jam,
diambil bakteri yang hidup menggunakan tusuk gigi steril kemudian goreskan pada
cawan petri berisi agar plate steril, lalu tusuk gigi steril tersebut dimasukkan
kedalam dH2O 7 µl pada PCR tube. Kemudian disimpan di heat block pada suhu
95 oC selama 10 menit. Setelah 10 menit ditambahkan mix solution sebanyak 55µl,
dilakukan PCR dengan 30 siklus dengan kondisi pra-denaturasi (95oC, 5 menit),
denaturasi (94oC, 30 detik), annealing (52oC, 1 menit), ekstensi (72oC, 2 menit),
dan ekstensi akhir (72oC, 5 menit). Produk PCR selanjutnya di elektroforesis
(menggunakan gel agarose 1%) pada voltase 100 volt selama 30 menit.
Elektroforesis gel agarose
Gel agarose (1%) dibuat dengan mecairkan agarose 0,3 gr dalam 30 mL buffer
TAE dengan pemanasan. Setelah hangat dicetak dalam plastik tray. Sesudah
membeku matrik gel digunakan untuk elektroforesis dengan meletakannya pada
wadah elektroforesis yang berisi buffer TAE. Sampel dicampur dengan buffer
loading dye dan dimasukan dalam sumuran (well) dalam matrik gel. Elektroforesis
dilakukan dengan menghubungkan arus listrik positif dan negatif sebesar 100 volt
selama 30 menit. Sesudah elektroforesis, visualisasi pita DNA dilakukan dengan
penyinaran gel menggunakan UV iluminator dan pita yang tampak diabadikan
dengan kamera.