Anda di halaman 1dari 21

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“Materi Isolasi DNA“

Nama : Zulfa Ridho Arrizqi


NIM : 135040218113016
Kelompok :1
Asisten : Fahma Sariahta Berutu

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 LatarBelakang

Didalam sel terdapat asam nukleat ,yaitu DNA


dan RNA. DNA merupakan materi genatik yang yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk
proses metabolisme dalam setiap organisme.
Molekul DNA yang terdapat diluar inti sel ini terikat
membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus,
mitokondria dan kloroplas.
DNA yang menyusun kromosom ini merupakan
nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda
(double helix) DNA akan terurai menjadi untai
tunggal (single helix), dimana basa nitrogen dan
kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan
dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen
dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida
yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat.
Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang
digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu
tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan.
Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik harus
dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik
dan enzimatis. Hal ini disebabkan membran sel dari
membran inti sebagian besar tersusun atas lipida.

1.2 Tujuan

a. Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA


b. Untuk mengetahui macam metode isolasi DNA
c. Untuk mengetahui tahap isolasi DNA
d. Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA
(Khususnya bidang pertanian)
Manfaat
.
a. Mahasiswa dapat mengetahui pengertian isolasi
DNA
b. Mahasiswa dapat mengetahui macam metode
isolasi DNA
c. Mahasiswa dapat mengetahui tahap isolasi DNA
d. Mahasiswa dapat mengetahui manfaat isolasi
DNA (Khususnya bidang pertanian)
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian isolasi DNA

 DNA isolation is the most important step in


molecular biology analysis. Several DNA isolation
techniques which are developed were expensive.
Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting
dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik
isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat
mahal dan memerplukan waktu yang lama
(Listanto,1996).
 DNA issolation is the use of DNA for analysis or
manipulation usually requires that it is isolated and
purified to a certain extent. Arti : Isolasi DNA
merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau
dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu
dan murni kandungannya (Wilson, Keith and John,
2010).
 Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan
sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya.molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung (Mader, 1993).
 Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari
tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya
dilakukan dengan homogenasi dan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah
DNA rusak (Yuwono, 2006).
2.2 Macam metode Isolasi DNA

Macam metode isolasi DNA sebagai berikut :


a. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD)
Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan
pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak
yang menggunakan primer tunggal yang sekuen
nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer
tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR
dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang
memungkinkan primer menempel pada beberapa
lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer
adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan
persentase G+C 50-60% (Subandiyah,2006).
b. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan
dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena
adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh
fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan
diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh
berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA
tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo,
2008).
c. Phenol:chloroform
Menggunakan senyawa Phenol-choloroform-
isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi
DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik
phenol.
d. SaltingOut
Menggunakan garam konsentrasi tinggii (NaCl 6
M), untuk medenaturisasi protein menggunakan
Proteinase K untuk denaturasi protein.
e. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat
dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate
bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan
chloroform untuk denaturasi protein.
f. Silica Gel Silica gel dapat mengikat DNA dengan
perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat,
tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005).
g. PCR (Polymerase Chain Reaction) Merupakan
suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang
dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah
yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang
urutannya komplemen dengan DNA templatnya.
Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA
secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri,
2004)

2.3 Tahapan Isolasi DNA

a. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi
jaringan yang ingin digunakan.
b. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan
membran sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan
lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan
larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel
harus dilisiskan, karena substansi gen yang
diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan
pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang
tidak mengandung DNA agar sel yang
mengandung inti sel dapat diisolasi atau
dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya
yang tidak berfungsi.
c. Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang
dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat
ekstrak.
d. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil
ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut
kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama
10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat
dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse
berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA
sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
e. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-
untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan
berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap
presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan
larutan presipitasi protein dan kemudian divortex
yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan.
Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium
asetat yang jika berikatan dengan protein
mengakibatkan terbentuknya senyawa baru
dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan
tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5
menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip
utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
\yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas
(Fauziah, 2010).

2.4 Manfaat Isolasi DNA

 Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.


 Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan
secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi
Southern.
 Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan
pustaka genomik.
 Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur
rutin peminakan DNA.
 Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan
(template) dalam prosedur perbanyakan DNA
secara in vitro melalui teknik PCR (Anggie, 2011)
BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan bahan
Alat
 Pisau : untuk memotong daun
 Timbangan : menimbang bahan
 Mortar dan pestle : menghaluskan mangga
 Beaker glass : mencampur bahan
 Spatula :Untuk mengaduk dan
mengambil bahan praktikum
 Pipet : mengambil bahan/ekstrak
 Tabung reaksi : tempat ekstrak diamati
 Kertas label : memberi tanda
 Rak tabung reaksi : menyangga tabung reaksi
 Mikro pipet : alat perantara untuk
mengambil larutan yang ada di tube
 Oven cortex : mengaduk larutan
 Centrifuge : Memisahkan
 Autoclave : Menghomogenkan
 Tube : Untuk meletakkan bahan
yang sudah di haluskan dan untuk mereaksikan
bahan.

Bahan
 Daun jagung dan kedelai : bahan untuk praktikum
 (PVP) polivinil pirolidon : mencegah terjadinya
browning dan kontaminasi fenol
 Aquades : sebagai pelarut
 Chisam : menghilangkan etanol dan
flafanoid (Chloroform 96 ml dan isoamil alkohol 4
ml)
 Buffer ekstraksi : melindungi DNA ketika terjadi
reaksi kimia
 Nitrogen cair : untuk merusak dinding sel
 mercaptoethanol: mencegah terjadinya browning
dan kontaminasi polisakarida

3.2 Cara kerja


Siapkan alat dan bahan

Campur buffer ektraksi dengan dengan karbon (0.5%


w/v) dan mercaptoethanol 4 μL (Kocok sebelum
digunakan)

Masukkan 1 mL ke dalam tube ukuran 1.5 mL dan tutup


kembali tube (jangan lupa label di tube)

Tube berisi buffer ekstraksi*

Segera vortex sampai rata

Inkubasi dalam oven pada suhu 65 oC selama 30’


(bolak-balik tube setiap 15’)

Keluarkan tube dari oven dan dinginkan sebentar

Setelah dingin, sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm


selama 10'

Ambil supernatant dan pindahkan ke tube baru


(gunakan tube 2 ml atau 1,5 ml)

Tambahkan 500 μl chisam pada supernatant, vortex


Sentrifuge pada kecepatan 10000 rpm selama 10’

Pindahkan supernatant ke tube 1,5 ml, tambahkan


chisam 500 μl, vortex

Sentrifuge pada kecepatan 10000 rpm selama 10’

Pindahkan supernatant ke tube baru (1,5 ml) dan


tambahkan 300 μl isopropanol dingin secara perlahan

Bolak-balik tube secara perlahan (jangan sampai


terguncang keras) dan inkubasi dalam frezer selama 30’

Keluarkan tube dan biarkan hingga tidak terlalu dingin,

Sentrifuse pada kecepatan 8000 rpm selama 10’

Buang supernatant dan tambahkan buffer pencuci 500 μl


pada pellet dalam tube, vortex

Sentrifuse pada kecepatan 9000 rpm selama 10’

Buang supernatant dan kering anginkan pellet selama ±


20’

Tambahkan buffer TE sebanyak 50-100 μl dan larutkan


pellet DNA dengan cara mengetuk-ketuk tube secara
perlahan
Tambahkan 1 μl RNAse, inkubasi dalam oven suhu 37oC
selama 30’

Isolat DNA

Simpan Dalam Freezer

Dokumentasi Keterangan
Daun jagung dan kedelai
yang akan ditumbuk
bersamaan dengan
nitrogen cair
Nitrogen cair
dimasukkan ke dalam
mortar dan siap
ditumbuk besama
dengan daun jagung dan
kedelai
Hasil tumbukan dari
mortar daun jagung dan
kedelai dipindahkan ke
dalam tube

Prose penghomogenkan
bahan dengan vortex
sampai rata
Pengingkubasian dalam
oven pada suhu 65°C
selama 30’

Tube yang berisi


supernatan dan residu di
sentrifuge dengan
kecepatan 1000rpm
selama 10’

Mengambil supernatan
dan dipindahakan ke
tube yang baru

Hasil Isolasi DNA


kedelai

Hasil Isolasi DNA jagung


3.3 Analisis Perlakuan
Langkah pertama yaitu sipakan alat dan bahan
sebelum melakukan praktikum kemudian campur buffer
ektraksi dengan dengan karbon (0.5% w/v) dan
mercaptoethanol 4 μL (Kocok terlebih sebelum
digunakan). Setelah itu, masukkan 1 mL dengan mikro
pipet ke dalam tube ukuran 1.5 mL dan tutup kembali
tube (jangan lupa label di tube). Tube berisi buffer
ekstraksi; ekstraksi ini dibuat dengan adalah menimbang
0.1 g sampel daun, kemudian masukkan dalam mortar,
kemudian tambahkan sedikit PVP dan tambahkan N2
cair, segera di gerus sampai halus (jangan sampai
mencair ketika N2 saat menggerus). kemudian vortex
sampai rata dengan durasi secukupnya, kemudian
inkubasi dalam oven pada suhu 65 oC selama 30’
(bolak-balik tube setiap 15’). Lalu keluarkan tube dari
oven dan dinginkan sebentar. setelah dingin, sentrifuge
dengan kecepatan 10000 rpm selama 10'. Ambil
supernatant dengana menggunakan mikro pipet dan
pindahkan ke tube baru (gunakan tube 2 ml atau 1,5 ml).
Tambahkan 500 μl chisam pada supernatant, vortex.
Sentrifuge pada kecepatan 10000 rpm selama 10’.
Pindahkan supernatant ke tube 1,5 ml, tambahkan
chisam 500 μl, vortex. Sentrifuge pada kecepatan 10000
rpm selama 10’. Pindahkan supernatant ke tube baru
(1,5 ml) dan tambahkan 300 μl isopropanol dingin
secara perlahan. Bolak-balik tube secara perlahan
secara manual (jangan sampai terguncang keras) dan
inkubasi dalam frezer selama 30’. Keluarkan tube dan
biarkan hingga tidak terlalu dingin, sentrifuge pada
kecepatan 8000 rpm selama 10’. Buang supernatant dan
tambahkan buffer pencuci 500 μl pada pellet dalam tube,
vortex kembali, sentrifuge pada kecepatan 9000 rpm
selama 10’, Buang supernatant dan kering anginkan
pellet selama ± 20’, tambahkan buffer TE sebanyak 50-
100 μl dan larutkan pellet DNA dengan cara mengetuk-
ketuk tube secara perlahan, tambahkan 1 μl RNAse,
inkubasi dalam oven suhu 37oC selama 30’, isolat DNA,
simpan Dalam Freezer. Perlakuan sentrifuge yang
beulang-ulang di atas agar mengendap.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)


DNA Keterangan

Hasil Isolasi DNA


kedelai terlihat

Hasil Isolasi DNA


jagung terlihat

4.2 Pembahasan
Pada praktikum yang telah dilakukan, pada
beberapa isolasi bahan yang dipakai dengan daun
tanaman kedelai dan daun tanaman jagung.
Dari isolasi DNA daun tanaman kedelai
menunjukkan bahwa terdapat bintik-bintik putih seperti
jentik yang menyebar dilarutan ternyata hasil benang-
benang DNA terlihat tipis-tipis dan sedikit tidak
menggumpal (terpisah dari benang yang lain) mungkin
hal tersebut dapat disebabkan daun terlalu muda
sehingga terlihat tipis dan masih sedikit DNAnya
sedangkan daun tanaman jagung menunjukkan bahwa
Pada larutan tersebut terdapat bintik memanjang
berwarna putih kebiru-biruan ternyata hasil benang-
benang DNA terlihat jelas menggumpal agak tebal
dibandingkan dengan daun tanaman kedelai.
Karena hal ini pemilihan daun harus tepat dan
sehat (ujung daun tidak menguning) jika daun terlalu
muda DNA masih terlihat sedikit dan jika daun terlalu tua
maka DNA sudah rusak. Selain itu juga bisa dipengaruhi
oleh dalam pemrosesan langkah kerja kemungkinan
yang bisa terjadi yaitu bisa disebabkan permberian
perlakuan atau pemberian larutan yang berlebihan
maupun kurang yang dapat memicu tidak timbulnya
DNA atau dapat tiimbul namun sedikit dan terputus-
putus benang-benangnya.
Metode isolasi DNA dengan menggunakan
metode Lengkong et al. (1998) dalam Masniawati (2000)
berdasarkan penelitian Pratama (2009) memperlihatkan
hasil ekstraksi DNA yang kurang optimal baik kualitas
maupun kuantitas DNA yang dihasilkan sehingga
mempengaruhi intensitas pita DNA hasil amplifikasi yang
tidak jelas.
Pada prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan
melindungi DNA genom dari degradasi akibat senyawa
sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan atau
kerusakan akibat penanganan fisik (Milligan 1992).
Berdasarkan metode dari Doyle dan Doyle (1987)
dalam Ardiana (2009) yang dimodifikasi. Sebanyak 200
mg sampel tanpa tulang daun ditambah PVP 0,02 g
digerus dengan nitrogen cair hingga halus (tepung).
Penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dalam proses isolasi DNA dapat
mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan
oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins &
Smart 1996).
Buffer CTAB dengan kandungan garam yang
tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel,
sedangkan PVP dapat mengurangi browning akibat
kandungan fenol pada daun muda (Porebski et al.
1997;Surzycki 2000).
BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan
memperoleh hasil dari isolasi daun tanaman jagung dan
daun tanaman kedelai nampak terlihat DNAnya.
Sedemikian rupa bahwa DNA yang terlihat lebih jelas
dan menggumpal tebal terdapat pada tanaman jagung
sedangkan pada tanaman kedelai terlihat tipis dan tidak
menggumpal. Hal tersebut dapat dipengaruhi oleh
pemilihan daun kurang tepat sehingga dapat
menyebabkan perbedaan dan selain itu juga dapat
dipengaruhi oleh perlakuan pemberian cairan terhadap
bahan yang diuji.

5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan

Untuk kedepannya, praktikum alangkah baiknya


dilakukan dengan bergantian dengan 2 orang atau 3
orang supaya praktikum dapat dilakukan secara
maksimal apabila praktikum dilakukan secara bersama-
sama dan banyak orang maka alhasil kurang maksimal.

5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten


Untuk asisten jangan terlalu banyak post test
maupun pre test dan durasi praktikumnya agak
ditambahi sedikit.
DAFTAR PUSTAKA

Aditia. 2010. Isolasi DNA. (online)


http://sharkestaditia.blogspot.com/2010/03/isolasi
DNA.html Diakses 25 Desember 2014
Anggie,2011.Manfaat Isolasi DNA. (online)
http://anggiemyblog.blogspot.com/2011/04/lapora
n-isolasi-dna.html diakses tanggal 25 Desember
2014
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction,
2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole.
Doyle, J.J & Doyle, J.L. 1990. Isolation of plant DNA
from fresh tissue. Focus 12: 13-15.
Fauza, Hamda dkk. 2007. Jurnal: Variabilitas Genetik
Tanaman Gambir Berdasarkan Marka Rapd
(Genetic Variability Of Gambier Using Rapd
Marker.
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. (online)
http://miss-purplepharmacy.blogspot.com
/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 25
Desember 2014.
Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada
Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi
Bandung.
Lengkong, E.F., Hartana, A & Suharsono. 1998.
Keragamangenetika beberapa kultivar kelapa
berdasarkan penanda RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA).Prosiding Seminar Sehari
Hasil-hasil Penelitian Bidang IlmuHayat. Bogor, 3
September 1998
Masniawati, A. 2000. Keragaman genetik kelapa dalam
mapanget-32 (dmt-32) hasil penyerbukan sendiri
berdasarkan penandamolekuler random amplified
polymorphic DNA (RAPD). Tesis
Pascasarjana. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman
jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas
Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.
Restu, Muh.2012. Jurnal : Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan
Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.)
untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkan
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD),
Fakultas Kehutanan, Universitas Hasanuddin.
Makassar
Saiki, R. K., D. H.Gelfand, s. Stoffels, J. Scharf, R.
Higuchi, G. T. Horn, k. b. Mullis, & H. A. Erlich.
1998. Primetr-directed enzymatic amplification of
DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science 239 : 487-491
Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk
Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan.
Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan
Aplikasi PCR
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular
Biology. Berlin,
Heidelberg, New York: Springer-Verlag.
Wilkins, T.A & Smart, L.B. 1996. Isolation of RNA from
Plant
Tissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory
Guide to RNA.Isolation, Analysis and Synthesis.
New York: Wiley–Liss.
Yuwono. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase chain
Reaction. PenerbitAndi. Yogyakarta. UnitasVol 9
No 1. Surabaya.