LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

I. JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Kadar Protein Dengan

Metode Biuret
II. TANGGAL PERCOBAAN :
➢ Mulai : Senin, 02 Oktober 2017, pukul 07.00 WIB
➢ Selesai : Senin, 02 Oktober 2017, pukul 09.40 WIB

III. TUJUAN PERCOBAAN :

Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan cara
Biuret.
IV. DASAR TEORI :
Protein berasal dari kata protos atau proteos yang berarti pertama atau
utama.Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan
atau manusia. Oleh karea itu, sel merupakan pembentuk tubuh, maka protein
yan terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan
dan pertumbuhan tubuh (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Protein merupakan molekul besar dengan bobot molekul bervariasi
antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim,
protein akan menghasilkan asam-asam amino. Ada 20 jenias asam amino
yang terdapat dalam molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu sama
lain dengan ikatan peptida. Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat
dalam molekul protein ialah sebagai berikut : karbon 50%, hidrogen 7%,
oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0-3%, dan fosfor 0-3%. Dengan
berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat dilakukan penentuan
kandungan protein dalam suatu bahan makanan. Unsur nitrogen ditentukan
secara kuatitatif, misalnya dengan cara Kjedahl, yaitu dengan cara destruksi
dengan asam pekat.berat protein yang ditetukan adalah 6,25 kali berat unsur
nitrogen (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Ikatan yang terjadi antara dua dua asam amino tersebu dinamakan ikata
peptida. Jadi, pada satu molekul dipeptida terdapat satu ikatan peptida. Suatu
senyawa yang terdiri atas tiga buah asam amino yang berikatan disebut
tripeptida. Pada satu molekul tripeptida ini terdapat dua buah ikatan peptida.
Ikatan peptida yaitu :

1
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Melalui suatu proses tertetu, sejumlah besar molekul asam amino dapat
membentuk suatu senyawa yang memiliki banyak ikatan peptida. Molekul
senyawa ini merupakan suatu molekul besar atau makromolekul yang terdiri
atas banyak molekul asam amino dan karenanya disebut polipeptida. Protein
adalah salah satu makromolekul yang terdiri atas sejumlah besar asam amin
(Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Suatu peptida yang mempunyai dua ikatan peptida ata lebih dapat
bereaksi dengan ion Cu++ dalam suasana basa dan membentuk suatu
senyawa kompleks yang berwarna biru ungu. Reaksi ini dikenal dengan nama
reaksi biuret (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi
oleh manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara
umum, sumber dari protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein
sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi
untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang
dibutuhkan tubuh. Maka, penting bagi kita untuk mengetahui tentang protein
dan hal-hal yang berkaitan dengannya.
Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu
keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel
maupun ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH,
panas, pelarut, kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Protein ada yang reaktif
karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif,
seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Kelarutan protein di dalam suatu
cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain,
pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya. Protein seperti
asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-beda. Titik
Isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai
selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga
tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada pH isoelektrik

2
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

(pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada saat itu muatan
listriknya nol.
Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan
bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu yaitu protein globular dan protein serabut.
Protein serabut bersifat tidal larut didalam air, merupakan molekul serabut
panjang, dengan rantai polipeptida yang menunjang pada satu sumbu dan
tidak berlipat. Sedangkan protein yang lain adalah Protein Globular,
mempunyai rantai-rantai popipeptida berlipat rapat-rapat menjadi bentuk
globular atau bulat padat. Protein ini biasanya larut dalam airyang segera
berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik. Hampir
semua enzim merupakan protein globular.
Kebanyakan protein mengabsorbsi sinar ultraviolet maksimumpada 280
nm. Penentuan protein berdasarkan absorbansi sinar UV adalah cepat,
mudah, dan tidak merusak bahan. Untuk keperluan perhitungan juga
diperlukan kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi
protein dengan optical density. Keuntungan dari spekrofotometer UV-tampak
ini adalah dilengkapi dengan alat perekam yang menyediakan plot absorban
vs panjang gelombang. Agar plot ini akurat, penempatan radiasi suatu
sampel, harus sedekat mungkin dengan monokromatik. Selain itu,
spektrofotometer menggunakan prisma yang memiliki pita absorbansi efektif
dari satu nanometer atau kurang (Dangeubun dan Putnarubun, 2009).
Dalam percobaan ini kita menguji protein secara biuret yaitu yang
berdasarkan serapan cahaya oleh senyawa kompleks yang berwarna ungu. Di
mana kompleks ini terbentuk dari Cu2+ dan gugus –CO dan –NH pada
protein. Untuk penentuan kadar protein dengan uji biuret ini, digunakan
spektrofotometer UV. Adapun penggunaannya yaitu dengan mengukur
absorban senyawa pada panjang gelombang yang rangenya sama dengan
panjang gelombang UV, sedangkan range yang digunakan pada percobaan ini
adalah 540 nm.
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau
gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi
rendah. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron

3
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

bebas. Kromofor-kromofor organik seperto karbonil, alkena, azo, nitrat, dan

karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang
gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang
digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron
bebas nseperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor
akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang
yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas
Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua
kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan
kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Bila energi dari cahaya
(foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari
molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi
dalam spektrofotometer.
Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya
monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet
(tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang
diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan
ke layar pembaca. Larutan yang akan diamati melalui spektrofotometer harus
memiliki warna tertentu. Hal ini dilakukan supaya zat di dalam larutan lebih
mudah menyerap energi cahaya yang diberikan. Secara kuantitatif, besarnya
energi yang diserap oleh zat akan identik dengan jumlah zat di dalam larutan
tersebut. Secara kualitatif, panjang gelombang dimana energi dapat diserap
akan menunjukkan jenis zatnya (Cahyanto 2008).
Pada percobaan ini digunakan kacang tunggak sebagai sampel untuk
dihitung kadar protein yang ada didalamnya. Kacang tunggak (Vigna
unguiculata) merupakan tanaman yang banyak dibudidayakan oleh
masyarakat. Tanaman kacang tunggak biasanya tumbuh di dataran rendah.
Tanaman ini tahan terhadap kekeringan, sehingga cocok dikembangkan pada
lahan kering dibandingkan dengan jenis kacang-kacangan lainnya (Rukmana
dan Oesman, 2000). Di Indonesia produksi kacang tunggak cukup tinggi
yaitu mencapai 1,5-2 ton/ha tergantung varietas, lokasi, musim tanam dan
budidaya yang diterapkan (Sayekti et al., 2012). Kacang tunggak

4
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

mengandung protein 22,9%, karbohidrat 61,6%, namun kandungan lemaknya

rendah 1,4%, dengan kadar air 11%. (Anonim, 2012a).
Analisis protein umumnya bertujuan untuk mengukur kadar protein
dalam bahan makanan. Analisis protein dapat dilakukan antara lain dengan
metode Kjeldahl, Lowry, Biuret, Bradford, turbidimetri dan titrasi formol
(Sudarmadji dkk, 2007).
Metode Kjeldahl
Metode Kjeldahl dilakukan untuk menganalisis kadar protein kasar
dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan
cara ini adalah kadar nitrogennya (Winarno, 1986). Prinsip analisis
Kjeldahl adalah sebagai berikut: bahan organik di didihkan dengan asam
sulfat pekat sehingga unsur-unsur dapat terurai. Atom karbon menjadi
CO2 dan nitrogen menjadi amonium sulfat. Larutan tersebut kemudian
dibuat alkalis dengan menambahkan NaOH berle bihan sehingga ion
amonium bebas menjadi amonia bebas. Amonia yang dipisahkan dengan
cara distilasi kemudian dijerat dengan larutan asam borat. Garam borat
yang terbentukdititrasi dengan HCl (Sudarmadji, 1996).
Dari hasil titrasi dapat dihitung % N. Hasil % N tersebut dapat
digunakan untuk memperkirakan kadar protein kasarnya. Umumnya
campuran protein murni terdiri dari 16% nitrogen. Apabila jumlah N
dalam bahan telah diketahui, maka jumlah protein dihitung dengan
mengalikan jumlah N dengan faktor konversi 6,25 (100/16). Besarnya
faktor konversi (tabel 2.3) tergantung pada persentase nitrogen yang
menyusun protein dalam bahan pangan. Pada protein tertentu yang telah
diketahui komposisinya dengan tepat, maka faktor konversi yang lebih tepat
lah yang dipakai.

5
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Kekurangan metode Kjeldahl ialah bahwa purin, purimidin, vitamin-

vitamin,asam amino besar, kreatin, dan kreatinin ikut teranalisis dan terukur
sebagai nitrogen protein (Winarno, 1986).

Metode Bradford
Metode Bradford digunakan untuk menentukan konsentrasi protein
dalam larutan. Prinsip metode ini berdasarkan pembentukan komplek
antara Coomassie Brillant Blue (CBB) dengan larutan protein yang diukur
pada pa njang gelombang 595 nm (gambar 2.4). Pembentukan komplek
disebabkan adanya ikatan antara pewarna CBB dengan protein melalui
interaksi ionik antara gugus asam sulfonat dengan muatan positif protein
yaitu pada gugus amina.
Asam amino bebas, peptida dan protein dengan berat molekul
kecil tidak menghasilkan warna biru dengan reagen ini. Umumnya berat
molekul peptida atau protein harus lebih besar dari 3000 Da untuk
menghasilkan warna biru dengan reagen ini. Banyaknya ligan yang
berikatan dengan molekul protein sebanding dengan muatan positif
protein, sehingga jumlah absorbansi sebanding dengan kadar protein dalam
larutan (Pierce, 2005).

Metode Dumas Termodifikasi

Akhir-akhir ini, teknik instrumen otomastis telah berkembang dengan
kemampuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan cepat. Teknik ini
berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Dumas lebih dari 1,5 abad yang
lalu, dan mulai berkompetisi dengan metode Kjeldahl sebagai metode
standart penentuan kadar protein karena lebih cepat.

6
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Prinsip Umun
Sampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu
tinggi (sekitar 900oC) dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan
CO2, H2O dan N2. Gas CO2 dan H2O dipisahkan dengan melewatkan gas
pada kolom khusus untuk menyerapnya. Kandungan nitrogen kemudian
dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom dengan detektor
konduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu memisahkan
nitrogen dari sisa CO2 dan H2O. Alat dikalibrasi dengan senyawa analis yang
murni dan telah diketahui jumlah nitrogennya, seperti EDTA (= 9,59 %N).
Dengan demikian sinyal dari detektor dapat dikonversi menjadi kadar
nitrogen. Dengan metode Kjeldahl diperlukan konversi nitrogen dalam
sampel menjadi kadar protein, tergantung susunan asam amino protein.
Keuntungan dan Kerugian
a. Keuntungan :
• Jauh lebih cepat dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per
pengukuran, dibandingkan dengan 1-2 jam pada Kjeldahl).
• Metode ini tidak menggunakan senyawa kimia atau katalis toksik.
• Banyak sampel dapat diukur secara otomatis.
• Mudah digunakan.
b. Kerugian :
• Mahal.
• Tidak memberikan ukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua
nitrogen dalam makanan berasal dari protein.
• Protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang berbeda karena
susunan asam amino yang berbeda.
• Ukuran sampel yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang
representatif.

Metode Lowry
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam
metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan

7
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II)

akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen
Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat,
menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus
aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna
biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru
terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya.
Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode
Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas
deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry
lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Lowry, dkk, 1951).
Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan
metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat,
deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril,
disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium, dan kalsium.
Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan
interferensi tersebut. Oleh karena itu dianjurkan untuk menggunakan blanko
untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen,
sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau
melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Lowry dkk 1951).
Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek
dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang. Prinsip kerja metode
Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin,
triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan
fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru,
sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry dkk 1951).
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Reaksi
yang terlibat adalah kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana
metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi
Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks
phosphomolibdat - phosphotungstat (phosphomolybdotungstate),
menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus

8
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna
biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru
terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya.
Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.
Metode Biuret
Untuk menentukan adanya protein atau ikatan peptida termasuk hasil
hidrolisis protein seperti metaprotein, proteosa, polipeptida kecuali asam
amino dilakukan uji biuret. Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida
yang terbentuk pada pemanasan dua mulekul urea. Dalam suasana basa,
CuSO4 bereaksi dengan senyawa yang mengandung dua atau lebih ikatan
peptida membentuk kompleks berwarna ungu. Reaksi positif tersebut terjadi
dengan adanya perubahan warna menjadi ungu atau merah muda akibat
terjadinya persenyawaan antara cadangan N dari peptida dan O dari air.
Warna yang terjadi dari panjangnya ikatan peptida panjang berwarna ungu,
sebaliknya jika pendek warnanya merah muda. Berikut ini adalah komplek
yang akan terbentuk dari reaksi tersebut.

Metode Turbidimetri
Kekeruhan akan terbentuk dalam larutan yang mengandung protein
apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic
(TCA), Kalium Ferri Cianida [K4Fe(CN)6] atau asam sulfosalisilat. Tingkat
kekeruhan diukur dengan alat Turbudimeter. Cara ini hanya dipakai untuk
bahan protein yang berupa larutan atau hasilnya, tetapi biasanya hasilnya
kurang tepat (Sudarmadji, 1989).

9
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan

penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat.
Pengendapan protein menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga
konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur derajat kekeruhan
(turbiditas).

Keuntungan :
Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta
sensitif terhap protein dengan konsentrasi rendah.
Kerugian :
Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan
jernih, serta tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat
mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang gelombang di mana
protein akan dianalisis. Karena diperlukan larutan jernih, maka makanan
harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum dianalisis, seperti
homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat menyita
waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif
mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan
tersebut telah mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat
secara kovalen dengan senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan
tergantung pada jenis protein (karena protein yang berbeda mempunyai
sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula).
V. Alat dan Bahan
Alat :
• Tabung reaksi 10 buah
• Spektronik-20 1 buah
• Gelas kimia 2 buah
• Gelas ukur 1 buah
• Labu ukur 10 mL 1 buah
• Pipet tetes 5 buah
• Sentrifuge 2 buah

10
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Bahan :
• Kacang kedelai
• Larutan standar protein
• Reagen biuret
• Aquades

VI. Alur Kerja

1. Persiapan Sampel

1 g sampel

➔ Dihancurkan dengan mortar

➔ Ditambah air
➔ Dimasukkan labu ukur
➔ Ditambah air sampai tanda batas
➔ Disaring

Residu Filtrat

➔ Dilakukan pengenceran
Sampel

➔ Disentrifuge selama 10 menit 3500 rpm

Sampel filtrat

Sampel filtrat

➔ Dibagi dalam tiga tabung masing-masing sebanyak 1 ml

➔ Ditambah 5 ml reagen Biuret ke dalam 3 tabung
➔ Dikocok
➔ Diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit
➔ Diukur absorbansi pada λ 520 nm dengan alat spektrofotometri
UV-Vis
Absorbansi
11
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

2. Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

1 mL aquades

➔ Dimasukkan tabung reaksi

➔ Ditambah 5 mL reagen biuret
➔ Dikocok
➔ Diinkubasi pada suhu 37oC, ±10 menit
➔ Diukur absorbansi pada λ 540nm dengan
alat spektronik 20
Absorbansi

3. Penetapan Absorbansi Larutan Standar

Tb. reaksi 1: Tb. reaksi 2: Tb. reaksi 3: Tb. reaksi 4: Tb. reaksi 5:
1mL larutan 1mL larutan 1mL larutan 1mL larutan 1mL larutan
1mg/mL 2mg/mL 3mg/mL 4mg/mL 5mg/mL

➔ Ditambah 5mL reagen biuret

➔ Diinkubasi (tabung) pada suhu
37oC, selama 10 menit/ suhu kamar
selama 30 menit

Hasil pengamatan

➔ Diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 540nm
dengan alat spektronik 20

12
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

absorbansi

13
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

VII. Hasil Pengamatan

No. Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan / Reaksi Kesimpulan
Perc Sebelum Sesudah

1. Persiapan Sampel − Sampel: kacang − Sampel Sampel kacang ose

1 g sampel ose disentrifuge: yang dihasilkan
− Aquades: dihasilkan larutan berwarna
− Dihancurkan dengan mortar
larutan tidak larutan keruh putih keruh
− Ditambah air
berwarna dan terdapat
− Dimasukkan labu ukur
− Sampel endapan putih
− Ditambah air sampai tanda batas
dihancurkan:
− Disaring
serbuk putih
Residu Filtrat

− Dilakukan
pengenceran
Sampel

− Disentrifuge selama
10 menit 3500 rpm
Sampel filtrat

14
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

− Sampel filtrat: − Tabung I + Kandungan protein kacang Protein (kacang ose)

Sampel filtrat
putih keruh reagen Biuret: ose / kacang tunggak positif terhadap uji
− Dibagi dalam tiga tabung masing- − Reagen Biuret: larutan dalam per 100 g adalah biuret dengan
masing sebanyak 1 ml warna biru berwarna biru 22,9 gram membentuk senyawa
− Ditambah 5 ml reagen Biuret ke muda muda (Sumber: Departemen kompleks berwarna
dalam 3 tabung − Tabung II + Kesehatan RI, 1979) biru-ungu.
− Dikocok reagen Biuret: Rata-rata kadar
− Diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 larutan protein adalah
menit berwarna biru 0,02126%
− Diukur absorbansi pada λ 520 nm muda
dengan alat spektrofotometri UV-Vis − Tabung III +
Absorbasi reagen Biuret:
larutan
berwarna biru
muda
Hasil absorbansi
Sampel 1 : 0,143
Sampel 2 : 0,140
Sampel 3 : 0,138

15
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

2. Penetapan absorbansi larutan blanko − Aquades: cairan − Aquades + Larutan basa Cu2+ akan Nilai absorbansi
1 ml aquades tidak berwarna reagen Biuret: menghasilkan kompleks blanko adalah nol
− Reagen Biuret: larutan ikatan peptida sehingga
− Ditambah 5 ml reagen Biuret
larutan berwarna biru menghasilkan warna ungu.
− Dikocok
berwarna biru muda Hasil absorbansi larutan
− Diinkubasi pada suhu 37°C selama
muda blanko :
10 menit
− Diukur absorbansi pada λ 520 nm
dengan alat spektrofotometri UV-Vis

Absorbasi

16
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

3. − Larutan standar − Kadar 1 mg/ml Absorbansi berbanding lurus Absorbansi

1 ml larutan standar dengan
kadar 1, 2, 3, 4, 5 mg/ml protein dengan + reagen dengan konsentrasi berbanding lurus
kadar 1, 2, 3, 4, Biuret: larutan dengan konsentrasi
− Dimasukkan dalam 5 tabung reaksi 5 mg/ml: larutan berwarna biru CuSO4.5H2O + 2NaOH → sehingga semakin
− Ditambah 5 ml reagen Biuret pada tidak berwarna muda Cu(OH)2 + Na2SO4 + 5H2O tinggi konsnetrasi
masing-masing tabung − Reagen Biuret: − Kadar 2 mg/ml Cu(OH)2 Cu2+ + 2OH- maka semakin pekat
− Diinkubasi pada suhu 37°C selama warnanya
larutan + reagen
10 menit sampai terbentuk warna berwarna biru Biuret: larutan Regresi linier larutan
yang stabil muda berwarna biru standar
− Diukur absorbansinya pada λ 520 y= 4,15 x + 0,052
muda
nm dengan spektrofotometri UV- R2 = 0,975
− Kadar 3 mg/ml
Vis
+ reagen
Absorbansi
Biuret: larutan
berwarna ungu
(-)
− Kadar 4 mg/ml
+ reagen
Biuret: larutan
berwarna ungu
(+)
− Kadar 5 mg/ml

17
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

+ reagen
Biuret: larutan
berwarna ungu
(+)
− Hasil
absorbansi :
Std 1 : 0,104
Std 2 : 0,130
Std 3 : 0,162
Std 4 : 0,227
Std 5 : 0,263

18
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

VIII. Analisis Pembahasan

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein pada suatu sampel.
Disini sampel yang digunakan adalah kacang ose atau kacang tungga. Penentuan
kadar dari protein dilakukan dengan analisis kualitatif menggunakan metode
spektrofotometer UV-VIS single beam dengan menggunakan larutan biuret.
Penyerapan sinar UV-VIS dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus
kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi yang rendah.
Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, dapat terjadi dua kemungkinan.
Kemungkinan pertama yaitu cahaya ditangkap, serta kemungkinan yang kedua adalah
cahaya discattering. Apabila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan
perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang
akan menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer. Spektrofotometer
sendiri merupakan suatu teknik analisis yang bertujuan untuk mengetahui jumah
(konsentrasi) zat dalam suatu bahan berdasarkan spektroskopi khusus untuk panjang
gelombang UV-Visible. Pengertian spektroskopi sendiri adaah istiah atau nama yang
digunakan untuk ilmu yang mempelajari tentang hubungan antara radiasi (sinar) dan
energi ( yang memiliki fungsi panajang gelombang yang biasa disebut adalah dengan
frekuensi) dengan benda.
Prinsip dari spektrofotometri adalah suatu metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu larutan berwarna pada panjang
gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi
dengan detektor fototube. Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang berupa
larutan berwarna atau tidak berwarna, karena pada umumnya suatu alat
spektrofotometri yang dilengkapi sumber cahaya untuk mengukur spektrum dan
panjang gelombang pada larutan tertentu. Jumah sinar yang diserap atau diteruskan
oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponensial dari konsentrasi larutan dan
pada panjang larutan yang dilalui sinar.
Prinsip dari metode biuret adalah untuk mengetahui adanya ikatan peptida pada
sampel. Ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan
penambahan garam kupri dalam suasana basa. Reaksi biuret merupakan reaksi warna
yang umum untuk gugus peptida (-CO-NH-N) dan protein. Senyawa dengan dipeptida
memberikan warna ungu, biru dan merah. Warna biru-ungu yang dihasilkan
bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Sehingga fungsi dari

19
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

warna biru-ungu yaitu untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa sampel
dapat dihitung absorbansinya. Dari warna biru-ungu tersebut diketahui panjang
gelombang yang akan digunakan untuk menghitung absorbansi yaitu 540 nm.
Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret yaitu menganalisa
adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret ke dalam sampel yang
kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer,
Hal yang pertama dilakukan yaitu mempersiapkan sampel yang digunakan pada
percobaan ini. Sampel yang digunakan adalah kacang ose atau kacang tunggak.
Kacang ose ditimbang sebanyak 1 gram kemudian ditumbuk sampai halus,. Setelah
itu, sampel yang sudah halus dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah
aquades sampai tanda batas. Sampel dilarutkan dalam aquades berfungsi untuk
melarutkan kandungan protein yang terdapat dalam sampel, serta pada metode ini
yang digunakan untuk mengukur absorbansi yaitu larutan sehingga perlu untuk
dilarutkan. Selanjutnya, campuran dipindahkan ke tabung sentrifuge. Setelah
campuran terpisah, diambil filtratnya yang berwarna keruh. Pengambilan filtrat
dikarenakan pada filtrat merupakan larutan yang mengandung protein. Filtrat dibagi
dalam 3 tabung reaksi yang akan digunakan sebagai sampel 1, sampel 2, dan sampel
3. Masing-masing tabung reaksi berisi 1 mL filtrate. Ketiga sampel ini yang akan
digunakan dalam pengukuran absorbansi.
Pada percobaan ini digunakan larutan protein standart. Pertama yang perlu
dilakukan yaitu mempersiapkan larutan standart sebagai pembanding kadar protein
pada sampel. Disiapkan larutan standart dengan kadar protein 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3
mg/mL, 4 mg/mL, dan 5 mg/mL. Kemudian ditambahkan dengan reagen biuret
sehingga ikatan peptida pada protein membentuk senyawa kompleks dengan Cu2+ ,

reaksinya:

20
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Hasil warna yang pada larutan sampel dengan berbagai kadar + reagen biuret.
• Kadar 1mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna biru muda
• Kadar 2mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna biru muda
• Kadar 3mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna ungu (-)
• Kadar 4mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna ungu (+)
• Kadar 5mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna ungu (+)

Kemudian dilakukan uji spektrofotometer UV-vis pada larutan srandart, sehingga

didapat nilai absorbansi:

Larutan Standart Absorbansi

1 mg/mL 0,104
2 mg/mL 0,130
3 mg/mL 0,162
4 mg/mL 0,227
5 mg/mL 0,263

Dari nilai absorbansi yang didapat dapat dibuat grafik antar konsentrasi vs absorbansi:

Grafik Larutan Standart

0.3
y = 4.15x + 0.0527
0.25 R² = 0.9753

0.2
Absorbansi

0.15

0.1

0.05

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Konsentrasi

Berdasarkan grafik tersebut didapat sebuah persamaan garis lurus:

y = 4.15x + 0.0527

Dengan nilai regresi sebesar 0,9753. Dari persamaan tersebut nantinya dapat digunakan
untuk menghitung kadar protein dari sampel kacang ose atau kacang tunggak.

21
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Larutan blanko digunakan sebagai pembanding dengan larutan satandart dan larutan
sampel pada proses pengukuran absorbansi yang menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS.
Larutan blanko dibuat dengan, 1 ml aquades dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian
ditambah 5 ml reagen biuret. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit dan
didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit, lalu diukur absorbansinya . Ketika aquades
ditambahkan dengan reagen biuret larutan berwarna biru muda. Kemudian diinkubasi larutan
tetap biru muda.Nilai absorbansi larutan blanko adalah 0,000.
Langkah awal dalam penentuan absorbansi sampel yaitu dengan menambahkan 1 mL
sampel yang terdapat dalam 3 tabung reaksi dengan 5 ml reagen biuret. Pada saat penambahan
reagen biuret terjadi perubahan dari larutan tidak berwarna sedikit keruh menjadi biru muda
(sampel 1), biru muda (sampel 2), biru muda dan (sampel 3). Larutan dikocok, lalu diinkubasi
pada suhu 37oC selama 10 menit dan didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit. Diukur
absorbansi sampel, diperoleh nilai absorbansinya :
• Sampel 1 : 0.143
• Sampel 2 : 0.140
• Sampel 3 : 0.138

Nilai absorbansi tersebut dimasukkan pada persamaan y = 4,15x + 0,0527 sebagai

nilai y. Sehingga didapat nilai x atau konsentrasi protein sebesar: x1= 0,0219 ; x2=
0,0212 ; x3= 0,0207 ; dengan x rata-rata = 0,02126. Kemudian berdasarkan
perhitungan, diperoleh kadar protein sebesar 0,02126%. Kadar protein secara teori
pada sampel berupa kacang ose atau kacang tunggak sebesar 22,9 g/100 g. Kadar
protein yang diperoleh telah mendekati dengan kadar protein pada teori. Kadar yang
tidak tepat dengan teori ini dapat disebabkan oleh kurang halusnya sampel sehingga
kadar protein tidak sepenuhnya larut dalam filtrat.
IX. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, tentang penentuan kadar protein
dengan metode biuret diperoleh nilai absorbansi larutan standar dengan berbagai
konsentrasi sehingga didapat persamaan kurva y = 4.15x – 0.0527, dengan nilai regresi
linear 0,9753. Pada sampel diperoleh nilai absorbansi rata-rata sebesar 0,02126 mg/mL.
Kadar protein pada kacang ose atau kacang tunggak dalam 1 g/mL sebesar 0,02126%.

22
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

X. Daftar Pustaka
Anonim. 2012a. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Depkes RI. Jakarta: Bhratara Karya
Aksara.
Dangeubun, J.L., dan Putnarubun. C, 2009. Isolasi dan Penentuan Aktivitas Enzim
Proteolitik Dari Pancreas Ikan Lele. Percikan, Vol. 104, Edisi September 2009,
Hal. 111.
Fessenden, JR & Fessenden, JS. 1986. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Jakarta:
Erlangga.
Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Lowry , Rosenbrough , Farr, Randall. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol
Reagent. New York: Kluwer Academic Publishers
Poedjiadi, Anna dan F.M. Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia, Edisi Kedua.
Jakarta : UI Press, Hal. 81-82, 91-92.
Rukmana, R dan Oesman, Y. 2000. Kacang Tunggak, Budidaya dan Prospek Usaha
Tani. Yogyakarta: Kanisius
Sudarmadji, Slamet . 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Yogyakarta: Liberty
Yogyakarta.
Tim Dosen.2016. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya: UNESA Press.
Underwood /R.A. Day, Jr. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta;
Erlangga.

23
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

LAMPIRAN
A. Tugas
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standart
tersebut tentukan kadar protein sampel!
Jawab :
Larutan Konsentrasi Absorbansi
Standar 1 0,010 0,104
Standar 2 0,020 0,130
Standar 3 0,030 0,162
Standar 4 0,040 0,227
Standar 5 0,050 0,263

Grafik Larutan Standart

0.3
y = 4.15x + 0.0527
0.25 R² = 0.9753

0.2
Absorbansi

0.15

0.1

0.05

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Konsentrasi

24
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Kadar protein dalam sampel kacang tunggak (x)

1. Sampel 1
y = 4,15x + 0,052

0,143 = 4,15x + 0,052

0,143 − 0,052
𝑥1 =
4,15

𝑥1 = 0,0219 𝑚𝑔/𝑚𝐿

2. Sampel 2
y = 4,15x + 0,052
0,140 = 4,15x + 0,052
0,140 − 0,052
𝑥1 =
4,15
𝑥1 = 0,0212 𝑚𝑔/𝑚𝐿

3. Sampel 3
y = 4,15x + 0,052
0,138 = 4,15x + 0,052
0,138 − 0,052
𝑥1 =
4,15
𝑥1 = 0,0207 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Rata-rata kadar protein kacang tunggak

𝑥1 + 𝑥2 + 𝑥3 0,0219 + 0,0212 + 0,0207

= = 0,02126 𝑚𝑔/𝑚𝐿
3 3
Kadar protein (mg / 100 gram)

0,02126
x100% = 0,02126 %
1000
10
2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret? Jika benar
demikian, bagaimana menemukan kadar protein yang tercampur dengan peptida ?
Jawab :
Ya, peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret karena dengan
metode Biuret merupakan salah satu cara yang baik untuk menentukan kadar protein
suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu2+ akan membentuk kompleks dengan ikatan
peptida suatu protein, sehingga menghasilkan warna ungu yang dapat diidentifikasi
25
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Absorbansi ini berbanding
langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung jenis protein karena seluruh
protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat.

26
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

B. Dokumentasi
No. Dokumentasi Keterangan
1. 1 gram sampel padatan yaitu
kacang ose atau kacang lento
dihancurkan dengan mortar.

2. Diencerkan dengan aquades

menggunakan labu ukur 10 mL.

3. Sampel yang telah diencerkan

dimasukkan dalam tabung
sentrifuge.

27
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

4. Tabung yang berisi larutan

sampel dimasukkan dalam alat
sentrifuge dengan kecepatan
3700 rpm selama 10 menit.

5. Sampel protein yang akan

digunakan sebagai larutan
standar.

6. Setelah diambil 5 mL sampel

protein diencerkan secara
berurutan (5, 4, 3, 2, 1 mg/mL).

28
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

7. Hasil pengenceran sampel

protein (5, 4, 3, 2, 1) mg/mL
larutan tidak berwarna.

8. Larutan pengenceran standar

protein ditambah dengan 5 mL
reagen biuret. Terjadi perubahan
warna, pengenceran :
5 mg/mL :
4 mg/mL :
3 mg/ mL :
2 mg/ mL :
1 mg/mL :
9. Hasil sentrifuge, larutan keruh
diambil dan dimasukkan dalam 3
tabung reaksi masing-masing 1
mL sebagai larutan sampel 1, 2,
dan 3. 1 tabung reaksi sebagai
blanko berisi 1 mL aquades.

29
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

10. Larutan sampel 1, 2, dan 3 serta

blanko ditambah dengan 5 mL
reagen biuret. Terjadi perubahan
warna menjadi biru muda pada
larutan blanko dan larutan
sampel 1, 2, 3.

11. Tabung reaksi pengenceran,

blanko, dan sampel diinkubasi
dalam waterbath pada suhu 37oC
selama 10 menit.

12. Pada tabung pengenceran sampel

protein terjadi perubahan warna
pada tabung 3, 4, dan 5 :
Tabung 3 : ungu
Tabung 4 : ungu (+)
Tabung 5 : ungu (+)

30
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

13. Setelah diinkubasi pada larutan

blanko dan sampel tidak terjadi
perubahan warna.

14. Semua larutan pada tabung

reaksi di ukur absorbansinya
dengan UV-VIS. Data yang
diperoleh :
- Blanko : 0.000
- Sampel 1 : 0.143
- Sampel 2 : 0.140
- Sampel 3 : 0.138
Larutan standar :
- Tabung 1 : 0.104
- Tabung 2 : 0.130
- Tabung 3 : 0.162
- Tabung 4 : 0.227
- Tabung 5 : 0.263

31
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

C. Lampiran Perhitungan
• Pengenceran Larutan Standar

Diketahui: Konsentrasi protein 10 mg/mL

Ditanya: penambahan volume?

Penyelesaian:

1. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 10 = 10 . 5

V1 = 5 ml

2. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 5 = 10 . 4

V1 = 8 ml

3. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 4 = 10 . 3

V1 = 7,5 ml

4. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 3 = 10 . 2

V1 = 6,7 ml

5. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 2 = 10 . 1

V1 = 5 ml

32
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

• Kadar protein dalam sampel kacang (x)

Diketahui : 𝑦 = 4,15𝑥 + 0,052
𝑦1 = 0,143
𝑦2 = 0,140
𝑦3 = 0,138
𝑚 = 1 𝑔 = 1000 𝑚𝑔
𝑉 = 10 𝑚𝐿
Ditanya : Kadar protein pada kacang kedelai mentah?
Jawab :
Sampel 1

y = 4,15x + 0,052

0,143 = 4,15x + 0,052

0,143 − 0,052
𝑥1 =
4,15

𝑥1 = 0,0219 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Sampel 2
y = 4,15x + 0,052
0,140 = 4,15x + 0,052
0,140 − 0,052
𝑥1 =
4,15

𝑥1 = 0,0212 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Sampel 3
y = 4,15x + 0,052
0,138 = 4,15x + 0,052
0,138 − 0,052
𝑥1 =
4,15
𝑥1 = 0,0207 𝑚𝑔/𝑚𝐿

Rata-rata kadar protein kacang tunggak

𝑥1 + 𝑥2 + 𝑥3 0,0219 + 0,0212 + 0,0207

= = 0,02126 𝑚𝑔/𝑚𝐿
3 3
Kadar protein (mg / 100 gram)

0,02126
x100% = 0,02126 %
1000
10

33