PROTOCOLO DE LABORATORIO

CURSO BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

Código 151009

JULIETH NATALY LESMES CORREA

Docente

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
Bogotá

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 ÍNDICE

Unidad 1: Naturaleza de las ciencias

 Práctica No. 1: Bioseguridad

Unidad 2: Célula:
 Práctica No. 2: Microscopía
 Práctica No.3: Célula: Crenación, Hemólisis, Plasmólisis y
Turgencia.
 Práctica No. 4: Permeabilidad selectiva del eritrocito.
 Práctica No. 5: Tejidos vegetales y Aislamiento de cloroplastos.

Unidad 3: Genética
 Práctica No. 6: Acción de lisosomas.
 Práctica No. 7: Mitosis y Meiosis.

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 OBJETIVOS

La guía de prácticas del curso de Biología Celular y Molecular tiene como objetivo
dar herramientas al estudiante para comprender las interacciones bioquímicas,
genéticas que se llevan a cabo en la célula y desarrollar su pensamiento científico
y crítico respecto a las relaciones que se dan en la Biología celular y Molecular.

3
 INTRODUCCIÓN

Para la realización de la presente guía han participado los docentes Carmen

Eugenia Piña López, Yurby Salazar, Bibiana Ávila y Alberto García y la coordinadora
de laboratorios Angélica Yara durante el proceso de construcción se han realizado
mejoramientos académico-pedagógicos y didácticos con la incorporación de
Objetos Virtuales de Aprendizaje.

El estudio de las ciencias biológicas siempre ha estado acompañado del uso del
microscopio; su uso contribuyó en la formulación de la teoría celular. Hooke estudió
las células de la superficie de una hoja, y las paredes celulares del corcho,
consideradas por primera vez como unidad del organismo. Durtrochet escribió que
todos los tejidos orgánicos estaban formados por células globulosas pequeñísimas
de adhesión simple. Schleiden dijo: “Todos los organismos están compuestos de
células”; Virchow dijo: “Donde haya una célula, debió haber antes una célula
precursora”. Los detalles microscópicos de la célula se hicieron evidentes al mejorar
el diseño del microscopio, de tal manera que para el siglo XIX se lograron identificar
casi todas las estructuras o componentes de la célula, las cuales actualmente
pueden describirse con el uso de diferentes tipos de microscopios; sin embargo, el
microscopio de luz es el más utilizado, permitiendo observar la estructura básica de
la célula. Con el microscopio compuesto, se pudieron apreciar organismos vivos
cuya existencia era desconocida para los primeros investigadores. Los
microscopios están formados por tres sistemas fundamentales: 1) el sistema
mecánico, que es el sostén de los sistemas complementarios y que permite el ajuste
del punto focal y las dioptrías; 2) el sistema óptico, que permite magnificar a
diferentes grados la muestra observada y 3) el sistema de iluminación, que permite
iluminar y concentrar los haces luminosos en el punto de interés, así como regular
la intensidad de la iluminación. Esta guía de laboratorio de “Biología Celular” se
incluye experimentos y actividades básicos que por principio debe conocer el
estudiante. La información contenida permite vincular los aspectos teóricos con las
actividades prácticas propuestas. Aunque esta práctica cumple con las actividades
propuestas, es importante que el estudiante profundice sobre algunos temas
sugeridos. La biología celular y molecular es una disciplina básica apoyada en
ciencias básicas y dan coherencias al entendimiento desde la biología, bioquímica
y genética a los distintos fenómenos celulares. El estudio de las propiedades de la
célula permite comprender el funcionamiento y la constitución de las estructuras y
las interacciones celulares, las aplicaciones de este conocimiento a desarrollo de
biotecnológicos.

4
 DESCRIPCIÓN DE LA
ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 1
“BIOSEGURIDAD”

Introducción

El significado de la palabra bioseguridad se entiende por sus componentes:

“bio” de bios (griego) que significa vida, y seguridad que se refiere a la
calidad de ser seguro, libre de daño, riesgo o peligro. Bioseguridad en el
Laboratorio de Microbiología es el conjunto de normas y procedimientos
que debe seguirse, para conservar la salud y seguridad del personal que
labora en el laboratorio y de la comunidad frente a los riesgos de infección
para evitar contaminarse y contaminar a los demás con agentes
potencialmente patógenos. Los microorganismos pueden entrar al
huésped por diferentes mecanismos: contacto directo con la sustancia
infectada (saliva, sangre, pus, lesión); salpicaduras de sangre o saliva,
secreciones nasofaríngeas sobre la piel o mucosa sana o erosionada,
contacto directo con objetos contaminados y, por aerosoles contaminados.

Objetivo
Conocer las normas de bioseguridad en el laboratorio.

Material que debe llevar al laboratorio

Elementos de protección personal (Bata, gorro, guantes, tapabocas y
gafas de bioseguridad), Toallas desechables, jabón antiséptico.

Material que le será proporcionado en el Laboratorio

Hipoclorito de sodio.

Procedimiento:
1. Normas de Bioseguridad

 Utilizar la "bata de Laboratorio" debidamente abotonada y

limpia y retirarla antes de salir del laboratorio.

5
 Usar guantes para manipular muestras y cultivos de
microorganismos, evitar contaminar el área de trabajo y los
implementos personales (esfero, libros, apuntes);
descartarlos cuidadosamente en la caneca roja.

 Dar uso adecuado a los guantes, ya que son un “arma de

doble filo”
 Utilizar mascarillas de respiración, la cual debe encajar
cómoda y adecuadamente sobre el puente de la nariz para
evitar el empañamiento de las gafas protectoras. Esta protege
sobre todo la mucosa nasal que es más susceptible a
infecciones que la bucal, debido a que esta última tiene mayor
cantidad de flora normal que la protege contra infecciones.
 Utilizar anteojos de protección para evitar lesiones oculares
causadas por partículas proyectadas hacia el rostro del
operador, a la vez que protege contra infecciones
considerando que muchos gérmenes de la flora oral normal
son patógenos oportunistas.
 No entrar al Laboratorio implementos que no tengan que ver
con la práctica.

 No comer, beber, fumar ni colocar otros objetos en la boca,

mientras esté en el Laboratorio.
 Jamás llevarse el lapicero, bolígrafo o cualquier otro
implemento a la boca.
 No almacenar alimentos en la nevera ni en los estantes del
Laboratorio.
 Hablar lo mínimo mientras está trabajando en el Laboratorio.
 No pipetear con la boca.
 No usar jeringas o agujas para manipular líquidos o
especímenes clínicos.

 Utilizar únicamente mecheros comerciales, NUNCA

improvisados.
 Mantener el Laboratorio limpio y aseado.

6
  Descontaminar las áreas de trabajo antes de iniciar la práctica
de laboratorio, cada vez que se derrame una sustancia y, una
vez terminada la práctica.
 Descartar todo el material contaminado en los recipientes
destinados para ello.
 Lavarse las manos luego de manipular cultivos, muestras,
animales y, antes de abandonar el Laboratorio.
 Conocer las reglas del uso y cuidado de todos los equipos.
 Leer y entender los pasos de cada procedimiento antes de
proceder a realizarlo.
 Preguntar al docente cualquier duda sobre los procedimientos
a seguir.
 No permitir el ingreso de personas ajenas a las áreas de
trabajo.
 Notificar de inmediato al docente cualquier accidente.

2. Desinfección del área de Trabajo.

 Prepare una dilución de hipoclorito de sodio al 0.5%.
 Impregnar el área de trabajo y dejar actuar durante 5
minutos.
 Pasado este tiempo limpiar con toallas de papel, del centro
hacia la periferia y descartar el papel en la caneca
correspondiente.

Nota: este procedimiento se debe realizar antes y después de las

prácticas

3. Manejo de elementos de protección personal.

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 El docente le indicará la manera adecuada de colocar, usar y retirar todos
y cada uno de los elementos de protección (bata, anteojos, mascarilla
respiratoria o tapabocas, guantes, etc.) a utilizar en el laboratorio.

Tabla 1. Elementos de Bioseguridad y sus características

EQUIPO CARACTERÍSTICAS DE
PELIGRO EVITADO
SEGURIDAD
Abertura trasera
Bata Contaminación de ropa
Cubren la ropa de calle
Lentes resistentes a los
Gafas de
Impactos impactos
seguridad
Protección Lateral
De látex, vinilo o nitrilo,
Contacto directo con
aprobados para uso
Guantes fluidos y/o
microbiológico, desechables
microorganismos
Protección de las manos
Varios diseños disponibles
Tapabocas/Masc
Inhalación de aerosoles Desechables
arillas
De cara entera o media cara

Fuente: Elaboración propia, 2017

4. Lavado de manos.

 Abrir la llave del agua con una toalla desechable o un trozo

de papel y descartar ese papel en la caneca.
 Humedecer las manos con agua de chorro.
 Aplicar jabón antiséptico en la palma de la mano
 Frotar las palmas de las manos entre sí.
 Frotar la palma de la mano derecha contra el dorso de la mano
izquierda entrelazando los dedos y viceversa.
 Frotar las palmas de la mano entre sí, con los dedos
entrelazados.
 Frotar el dorso de los dedos de una mano con la palma de la
mano opuesta, agarrándose los dedos.
 Frotar con un movimiento de rotación el pulgar izquierdo,
atrapándolo con la palma de mano derecha y viceversa.

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  Frotar la punta de los dedos de la mano derecha contra la
palma de la mano izquierda, haciendo un movimiento de
rotación y viceversa.
 Colocar las manos debajo del chorro y dejar que corra el agua,
hasta eliminar completamente el jabón.
 Secar perfectamente las manos con toallas desechables y con
la misma cerrar la llave.
 Ahora sus manos son seguras.

Importante: Siempre lavar sus manos al ingresar y antes de salir del

laboratorio

Fuente:
http://www.who.int/gpsc/information_centre/gpsc_lavarse_manos_post
er_es.pdf?ua=1

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2. Manejo de residuos

 Residuos infecciosos o de riesgo biológico

Muchas enfermedades infecciosas se propagan a través de la sangre y

otros fluidos corporales, de manera que es importante tomar las
precauciones necesarias para no exponerse a ellas innecesariamente. Los
fluidos corporales incluyen la orina, heces, sangre, saliva, leche materna,
secreciones nasales y oculares, y secreciones segregadas por heridas o
tejidos. La segregación en la fuente es la base fundamental de la
adecuada gestión de residuos y consiste en la clasificación y disposición
de los residuos en las canecas y contenedores adecuados, de acuerdo con
el código de color adoptado por la legislación vigente. Los residuos se
deben depositar en los recipientes adecuados, los cuales deben ser del
color correspondiente a la clase de residuos que se va a depositar en ellos
y deben estar marcados e identificados de acuerdo con la siguiente tabla:

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3. Uso de Reactivos.

Todos los reactivos que se utilizan en las operaciones y reacciones en el

laboratorio son potencialmente peligrosos por los que, para evitar
accidentes, deberán trabajarse con cautela. Numerosas sustancias
orgánicas e inorgánicas son corrosivas o se absorben fácilmente por la
piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de evitar
su contacto directo; si este ocurriera, deberá informar inmediatamente al
docente

Para la manipulación de los reactivos se debe tener en cuenta:

 Los reactivos del laboratorio deben permanecer en su lugar

respectivo.
 Si necesita de un reactivo tome la cantidad que necesite del envase
sin introducir sustancias o utilizar las espátulas, que no hayan sido
previamente limpiadas, dentro del mismo.
 Al finalizar coloque el envase en su sitio respectivo.
 No devuelva material que ha sido sacado del envase al mismo, si
no está seguro de que no se encuentra contaminado o mezclado
con otras sustancias

4. Uso Equipos.

Para la manipulación de los equipos se debe tener en cuenta:

 Los equipos deben ser mantenidos completamente limpios después

de haber sido utilizados.
 Si no sabe cómo opera un equipo, solicite el catálogo de
funcionamiento o que se le enseñe a operarlo.

Microscopio:

Cuando hay necesidad de movilizar el microscopio de un sitio a otro, éste

debe sostenerse en posición vertical, y tomarlo por el brazo y por la base,
que son las partes más sólidas del equipo.

11
Balanza:

 Verificar siempre la nivelación de la balanza.

 Limpie la balanza de derrames y salpicaduras, estando apagada.
 Al encender la balanza déjela estabilizar por 10 minutos como
mínimo.
 Utilice siempre un recipiente para pesar, no ubique las sustancias o
especímenes directamente en el platillo.
 Al pesar mantener las puertas cerradas para mejorar la estabilidad.
 No pese sustancias corrosivas, calientes o que puedan degradar el
interior de la balanza.
 No mover bajo ninguna circunstancia las balanzas de su posición.
 Revise la capacidad máxima del equipo.

Espectrofotómetro:

 Estos equipos son muy delicados por lo cual es conveniente leer las
instrucciones de uso antes de ser utilizados.

 Permitir que el instrumento se caliente antes de hacer algún

procedimiento.

 Verificar el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando

varíe la longitud de onda.

 Asegurarse de que las cubetas estén limpias y libres de ralladuras y

huellas digitales. Esto debe hacerse cada vez que va a usarse.

 Mantener cerrada la tapa del portamuestras durante el proceso de

medición, para asegurar una lectura adecuada.

Uso Material de Vidrio.

 El material de vidrio se debe dejar limpio.

 Cualquiera que sea el sistema que se utilice se debe enjuagar muy
bien el material de vidrio con agua corriente varias veces y
finalmente con agua destilada.
 El material de vidrio graduado, como probeta, bureta, pipetas,
matraz aforado, nunca debe ser sometido a calentamiento.

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  Se pude calentar el material de contención, como: vaso de
precipitado, balón, tubos de ensayo, erlenmeyer.
 Descartar el material de vidrio roto en el contenedor dispuesto para
tal fin.

Presentación de resultados

 Teniendo en cuenta la fórmula V1xC1=V2xC2; en una tabla

presente diluciones al 0.5%, 1%, 1.5% y 5% de hipoclorito de sodio
que tiene una concentración inicial de 10% indicando la
concentración inicial, concentración final, volumen inicial de
hipoclorito, volumen de agua y volumen final para cada dilución.

 En una tabla identifique el nombre, uso y elabore el gráfico del

siguiente material de vidrio empleado en el laboratorio: Erlenmeyer,
matraz aforado, embudo, tubo de ensayo, pinzas, gradilla, capsula,
mortero, vaso de precipitado y probeta.

Cuestionario:

 Defina que es Bioseguridad

 ¿Cómo puede usted evitar en el laboratorio daños a su salud?
 Defina el concepto de Limpieza, contaminación, desinfección,
descontaminación y esterilización

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 DESCRIPCIÓN DE LA
ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 2
“MICROSCOPÍA”

Introducción

El microscopio es un instrumento que permite aumentar el tamaño de un

objeto un número determinado de veces. Existen dos grandes tipos de
microscopio: el microscopio óptico (que usa luz) y el microscopio
electrónico (que usa electrones). El microscopio óptico fue el instrumento
que llevó al descubrimiento de la célula, mientras que el microscopio
electrónico, dado su enorme poder de resolución, permitió establecer una
descripción detallada de las estructuras subcelulares (como por ejemplo
los organelas celulares).
El microscopio óptico funciona en base a lentes de vidrio convergentes,
que como su nombre lo indica, provocan que los rayos de luz converjan
en un punto, al cual se le llama foco. Al lograr que un número de rayos
de luz que normalmente veríamos separados, enfoquen en nuestra retina,
podemos interpretar esa imagen (que es una imagen virtual) como una
ampliación de la imagen real.

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Su sistema óptico posee un lente condensador (que concentra la luz
proveniente de la fuente), una serie de lentes objetivos (que recogen los
rayos difractados por la muestra), con diferentes poderes de aumentos
(usualmente 4x, 10x, 40x y 100x) y uno o dos lentes oculares (cerca de
los ojos) que generalmente proporcionan un aumento de 10x. Los
términos de aumento se expresan en x, de tal forma que un aumento de
10x (“diez por”) significa que una imagen está aumentada 10 veces el
tamaño original. El aumento total del microscopio es el producto de los
aumentos del lente objetivo más el lente ocular.

Objetivo

Comprender el funcionamiento del microscopio y reconocer los diferentes

poderes del microscopio mediante diferentes montajes.

Material que debe llevar al laboratorio

Agua estancada, Papel milimetrado (media hoja), Hilos de colores (2 cm

cada uno), Tela de cuadros (2 cm), Recorte de periódico con la letra
asimétrica, laminas portaobjetos, laminillas, elementos de protección
personal (Bata, gorro, guantes, tapabocas, gafas de bioseguridad).

Material que le será proporcionado en el Laboratorio

Microscopio óptico. Lamina con extendido coloreada, Microscopio, Aceite

de inmersión, Papel de Arroz o de óptica, Alcohol isopropílico.

Procedimiento:

1. Identificación de las partes del microscopio

 Tome el microscopio asignado e identifique las partes,

escribiéndolas en el recuadro correspondiente.

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 1. Funciones del Microscopio

Partes del Función

microscopio
Fuente de Luz
Condensador
Diafragma
Platina y pinza
Objetivos
Oculares
Tornillo
Macrométrico
Tornillo
Micrométrico
Revolver

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 2. Realización de Montaje húmedo

 Tome con un gotero una muestra de agua estancada.

 Coloque la gota de agua estancada sobre una lámina porta-objeto.
 Tome una laminilla cubreobjetos, en posición oblicua, (45 grados) y
apoyando una arista sobre la lámina al lado de la gota, déjela caer
suavemente.
 Retire el exceso de agua por los bordes usando papel absorbente

3. Manejo del Microscopio

Antes de iniciar verifique que el microscopio y sus partes se encuentren

limpias.

 Encienda el microscopio.
 Coloque el objetivo de menor aumento 4X.
 Baje la platina completamente girando el tornillo
macrométrico.
 Tome la lámina con la preparación.
 Coloque la lámina con la preparación sobre la platina
sujetándola con las pinzas.
 Procure que la preparación quede centrada, girando el tornillo
para desplazamiento del carro móvil.
 Gire el tornillo Macrométrico en sentido contrario a las agujas
del reloj para subir la platina hasta el tope.
 Debe hacerlo mirando directamente y no a través del ocular,
ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparación.
 Cierre o abra el diafragma hasta una posición intermedia,
accionando su perilla en sentido contrario a las agujas del
reloj para que la luz no sea ni muy brillante ni demasiado
tenue.
 Inicie la observación con el objetivo de 4X.

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  Mirando a través de los oculares, separe lentamente el
objetivo de la preparación con el tornillo macro métrico en
sentido de las agujas del reloj hasta ver la imagen.
 Cuando se observe algo nítido la muestra, gire el tornillo
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
 Gire el revólver.
 Coloque el objetivo de 10X
 Visualice con el objetivo de 10X y detalle las estructuras
 Gire el revólver y visualice con el objetivo de 40X enfoque con
el tornillo micrométrico y detalle las estructuras.
 Al finalizar las observaciones, apaga la luz del microscopio y
deje el microscopio en posición de reposo; es decir con el
objetivo de menor aumento y la platina en su posición más
baja.

4. Observación con el objetivo de inmersión 100X

Este objetivo se utiliza para la observación de muestras fijadas, no

para muestras frescas.
 Coloque el objetivo de inmersión de manera que el orificio de la
platina quede entre el objetivo de 100X y el de 40X.
 Suba totalmente el condensador para ver claramente el círculo de
luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá
que aplicar el aceite.
 Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la preparación en
el círculo de luz.
 Coloque una lámina coloreada sobre la platina.
 Ubique el objetivo de 100x.
 Suba la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de
aceite.
 Observe la imagen con aumento de 100X.

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  En esta preparación se muestran los glóbulos blancos, glóbulos
rojos y plaquetas coloreados con colorante de Wright.
 Cuando termine limpie el objetivo de inmersión con un papel
especial para óptica y alcohol isopropílico.
 Deje el microscopio en objetivo de menor aumento.

5. Comprobación de los poderes o capacidades del microscopio

 Realice un montaje húmedo con la letra asimétrica y obsérvela al

microscopio siguiendo los pasos anteriores.
 Realice un montaje húmedo con una hebra de hilo y obsérvela al
microscopio siguiendo los pasos anteriores.

6. Cálculo del diámetro del campo de visión

 Realice un montaje húmedo con un centímetro cuadrado de papel

milimetrado y obsérvelo al microscopio.

 Calcule el diámetro del campo de visión para aumentos de 4X,

10X, 40X del mismo cuadrado de 1 cm de lado de papel
milimetrado.

Presentación de resultados

 Elaborar los esquemas correspondientes para cada una de las

preparaciones.

 Cada esquema debe incluir: título, aumento y además señalar las

distintas estructuras celulares que se observen.

19
Cuestionario

1. ¿Qué organismos pueden observarse en la gota de agua estancada?

2. ¿Son todos de igual tamaño y forma?
3. ¿Se observan organismos móviles o estáticos?
4. Para las muestras de la letra, la hebra de hilo observadas determine:
 ¿Cómo se manifiesta el poder de resolución?
 ¿Cómo se manifiesta el poder de aumento?
 ¿Cómo se manifiesta el poder de definición?
 ¿Cómo se manifiesta el poder de penetración o profundidad?
5. ¿Cuál es la utilidad del microscopio?

20
 DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD
PRÁCTICA No. 3
CÉLULA: CRENACIÓN, HEMÓLISIS, PLASMÓLISIS Y TURGENCIA

Introducción

La membrana plasmática de las células vegetales y animales es muy

permeable al agua, siendo pocas las sustancias que la atraviesan con igual
facilidad, esto ocasiona que cuando exista entrada y salida de ella, la
célula también se altere en su forma, ya que ésta, en parte está
determinada por el estado de hidratación de los coloides celulares.

Objetivo

Observar los fenómenos de hipotonía, isotonía e hipertonía en células

animales y vegetales.

Material

• Microscopio compuesto.
• 6 portaobjetos y 6 cubreobjetos.
• Vasija con agua destilada.
• Pipeta Pasteur.
• Solución de NaCl al 0.6%
• Solución de NaCl al 0.9%
• Solución de NaCl al 1.2%
• Solución de NaCl al 10%

No realice las preparaciones al mismo tiempo, para obtener resultados

satisfactorios es muy importante que concluya con la observación de una
muestra antes de preparar la siguiente.

21
Células sanguíneas

1. Empleando una lanceta estéril obtenga una gota de sangre,

colóquela en un portaobjetos limpio y seco, ponga el cubreobjetos y
realice la observación correspondiente al microscopio 4x, 10x y 40x.
Nota 1. Evite cualquier tipo de contaminación de su muestra, por
ejemplo, con alcohol, agua, etc.

2. Repita el paso 1 pero ahora agregando a su muestra de sangre 2

gotas de agua destilada.
3. Repita el paso 1, y adicione a la muestra 2 gotas de las siguientes
soluciones: NaCl al 0.6% NaCl al 0.9% NaCl al 1.2% NaCl al 10%

Células vegetales

4. Seleccione una hoja de Elodea en buen estado y colóquela sobre un

portaobjetos limpio y seco, y con el envés de la hoja hacia arriba.
Adicione gotas de agua de su medio, suficientes para cubrir la hoja
totalmente y ponga con cuidado el cubreobjetos. Realice las
observaciones correspondientes al microscopio en objetivo 4x, 10x y
40x.
5. Repita el paso 1, pero ahora agregando gotas de agua destilada.
6. Repita el paso 1 y adicione a la muestra en lugar de agua, gotas de
las siguientes soluciones: NaCl al 0.6% NaCl al 0.9% NaCl al 1.2% NaCl
al 10%.

Presentación de resultados

Elaborar los esquemas correspondientes para cada una de las

preparaciones.
Cada esquema debe incluir: título, aumento y además señalar las distintas
estructuras celulares que se observen.
En un cuadro presente los resultados de las soluciones hipotónicas,
isotónicas e hipertónicas para los dos tipos de células.

22
Cuestionario

1. Mencione las diferencias observadas entre el comportamiento de la

célula vegetal y animal. Explique.
2. Describe lo que sucede en una célula cuando se coloca en un medio:
a) hipotónico, b) isotónico, c) hipertónico.
3. Explique en qué consisten los fenómenos de ósmosis y de difusión.
4. ¿Por qué los sueros fisiológicos que se aplican a pacientes
intravenosamente deben ser isotónicos?

23
 DESCRIPCIÓN DE LA

ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 4

“PERMEABILIDAD SELECTIVA DE LA MEMBRANA DEL

ERITROCITO”

Introducción

Cuando un eritrocito es colocado en una solución isotónica, que contiene

moléculas que pueden atravesar la membrana, la molécula penetrante
entra en la célula ocasionando que ésta estalle. Este estallamiento de los
eritrocitos es llamado hemólisis y puede ser detectado por medio de un
espectrofotómetro, que mide el cambio en la absorción de la luz, debido
al paso de la hemoglobina hacia el exterior.

Objetivo

Visualizar y determinar el porcentaje de hemólisis en eritrocitos causada

por diferentes moléculas.

Material

• 4 vasos de precipitados de 100 ml.

• 6 vasos de precipitado de 250 ml.
• Una pipeta de 1 ml.
• 6 pipetas de 10 ml.
• Un agitador de vidrio.
• Una pizeta con agua destilada.
• Espectrofotómetros.
• Celdas para espectrofotómetro.

24
Reactivos

• Solución de NaCl 0.17 M Solución de Glicerol 0.32 M

• Solución de Metanol 0.32 M
• Solución de Butanol 0.32 M
• Solución de Oxalato de amonio 0.12 M
• Solución de Fructuosa 0.25 M
• Solución de Ácido cítrico 0.26 M
• Material biológico Sangre desfibrinada (10 ml) por grupo de trabajo.
• Sangre humana con anticoagulante EDTA

Procedimiento

Preparar una solución “STOCK” de la siguiente manera: Coloque con una

pipeta 5 ml de sangre desfibrinada en un vaso de precipitados, adicione
45 ml de solución isotónica de NaCl 0.17 M. Se agita levemente para
homogenizar. Para preparar la solución al 100% de
HEMOLISIS, coloque en un vaso de precipitados 0.5 ml de solución
“STOCK” y agregue 3 ml de agua destilada; y luego adicione 26.5 ml de
solución de NaCl 0.17 M. Agite.
Para preparar la solución de 0% de HEMOLISIS, coloque en un vaso de
precipitados 0.5 ml de solución “STOCK” y 29.5 ml de solución de NaCl
0.17 M. Se agita ligeramente.
Para calibrar el espectrofotómetro primero ajuste a 0% de Transmitancia
a una longitud de onda de 525 nm, y luego llene una celda con la solución
de 100% de HEMOLISIS y calibre a 100% de Transmitancia a la misma
longitud de onda. Una vez calibrado el espectrofotómetro, se obtiene la
lectura de Transmitancia para la solución de 0% de HEMOLISIS.

Nota
- Los datos obtenidos servirán para realizar la curva estándar para
Hemólisis de la sangre, graficando % de Transmitancia contra % de
Hemólisis.
*Posteriormente en un vaso de precipitados coloque 29.5 ml de una de
las soluciones

25
(Oxalato de amonio, Metanol, Fructosa, Butanol, Glicerol o Ácido cítrico),
en seguida adicione 0.5 ml de solución “STOCK”, agitando suavemente y
llenando una celda con la mezcla. Ponga la celda en el espectrofotómetro
calibrando de antemano y tome las lecturas cada 60 segundos hasta los
5 minutos o bien hasta obtener una lectura de 100% de Transmitancia.

Cuando haya terminado con la primera solución problema repita el último

paso (*) utilizando las soluciones problemas restantes.

Presentación de resultados

Utilizando su curva estándar para Hemólisis, obtenga los valores

equivalentes de hemólisis de cada una de las lecturas de Transmitancia
de las soluciones problema. Para cada solución problema realice dos
gráficas: a) % de Transmitancia contra % de Hemólisis. b) % de
Hemólisis contra Tiempo, presentando los valores en forma de barras.
De acuerdo a tus resultados presenta el ordenamiento de las diferentes
moléculas según su velocidad de penetración al interior de los eritrocitos.

Cuestionario

1.- Describa en detalle la estructura de la membrana plasmática según el

modelo actual. Esquematícelo.
2.- Explique las características que debe presentar una molécula para que
pueda atravesar fácilmente la membrana plasmática.
3.- Con qué finalidad se usa sangre desfibrinada en los experimentos.
4.- Si hubiéramos utilizado sangre de otro animal mamífero,
¿esperaríamos los mismos resultados?, explíquelo en función de la
permeabilidad de la membrana.

26
 DESCRIPCIÓN DE LA

ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 5

“Acción de lisosomas”

Introducción

Las sustancias que penetran en la célula por fagocitosis o pinocitosis van

a experimentar la acción de las enzimas digestivas intracelulares,
contenidas en orgánulos llamados lisosomas. Estos orgánulos son
corpúsculos esféricos que miden aproximadamente 0.5 micrómetros,
están delimitados por una unidad de membrana y contienen enzimas
hidrolíticas. Se han encontrado lisosomas en todas las células animales y
vegetales.
Los lisosomas promueven la digestión intracelular, tanto del material
exógeno que penetra en la célula por pinocitosis, como también el
material endógeno. Este último puede estar constituido por orgánulos
degenerados o por productos de desasimilación del metabolismo celular.

Objetivo

Que el alumno observe la función de los lisosomas de manera análoga en

ciliados.

Material
• Microscopio compuesto Porta y cubreobjetos.
• Pipeta de un ml.
• Mechero de Bunsen
• 6 tubos de ensaye 15 x 150 mm.
• Gradilla.
• Pinzas
• Tela de asbesto.
• Tripie Recipiente para baño María.
• Pipeta Pasteur con goma.
• Termómetro.
• Hoja de papel aluminio.
27
Reactivos
• Solución de Rojo Congo al 0.4%
• Material biológico
• Cultivo de levaduras de pan. (30 ml.)
• Cultivo de ciliados (Paramecium spp.) por cada equipo.

Procedimiento

1.- En tres tubos de ensayo, coloque en cada uno de ellos un mililitro del
cultivo de levaduras. Un tubo se pone en el refrigerador durante 10
minutos. Otro se coloca en el baño María a 30ºC, y el último se tapa con
papel aluminio y se pone en un baño María hirviendo durante 10 minutos.

2.- Al término de la exposición de cada temperatura, se coloca de

inmediato en cada tubo 0.5 ml de rojo de Congo al 0.4%. Agite cada tubo
y deje en reposo durante 5 minutos. Realice las observaciones al
microscopio de cada uno de los tubos, poniendo atención al grado de
tinción que se presenta.

3.- En base en sus observaciones seleccione el cultivo de levaduras para

cumplir mejor el objetivo de su práctica. Coloque sobre un portaobjetos
unas gotas del cultivo de levaduras con gotas del cultivo de ciliados.
Observe al microscopio y realice un esquema inicial. Siga observando
cuidadosamente hasta visualizar de manera análoga la función de los
lisosomas en ciliados (cambio de color).

Presentación de resultados Presentar los siguientes

esquemas:

 Cultivo de levaduras a 0-4°C

 Cultivo de levaduras a 30°C
 Cultivo de levaduras a 100°C
 Esquema inicial del cultivo de ciliados con levaduras.
 Esquema final del cultivo de ciliados con levaduras.

28
Cuestionario
1.- Tomando en cuenta tus observaciones experimentales, ¿Qué ocurre
con las células de levadura dentro de los ciliados y por qué?
2.- Discuta el mecanismo que ocurre al calentar las levaduras y al agregar
el colorante.
3.- Realice en esquemas, el origen y las funciones de los diversos tipos de
lisosomas.

29
 DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA No 6
“Tejidos vegetales: Aislamiento de cloroplastos intactos”

Introducción

La célula es la unidad básica de la vida que contiene una amplia variedad

de distintos tipos de orgánulos. Si se requiere estudiar la función
particular de los cloroplastos u otro orgánulo resulta de gran valor poder
aislar en estado puro el orgánulo que interesa. La separación de un
orgánulo, por lo general se hace mediante la técnica de centrifugación
diferencial, la cual depende del principio de que las partículas de tamaño
diverso se desplazan hacia el fondo del tubo de centrifuga a diferentes
velocidades cuando se les coloca en un campo centrífugo.

Una suspensión de material de células rotas se somete al principio de la

fuerza centrífuga muy baja durante un corto período de tiempo, de modo
que solo los núcleos y las células íntegras se sedimentan formando un
precipitado. Con fuerzas centrífugas cada vez mayores se pueden separar
los cloroplastos y las mitocondrias en suspensión, luego los microsomas
y para finalizar los ribosomas. Este último paso requiere de una
ultracentrífuga, la cual genera velocidades que producen hasta 100 000
veces la fuerza de la velocidad.

Los cloroplastos cuando son aislados cuidadosamente son capaces de

reducir el colorante 2,6-Diclorofenol-Indo fenol (DCPIP), lo cual debe ser
medido espectrofotométricamente comparado con una muestra control.
La reducción se debe a que capta los electrones en lugar del NADPox en
la parte no cíclica de la fotosíntesis.

Ensayar un método de aislamiento de cloroplastos y observar su

funcionamiento en condiciones óptimas y con “SHOCK” osmótico.

Materiales y Reactivos
• Lámpara con foco. Mortero y pistilo
• Pipeta de 10 ml.
• Pipeta de un ml.Vaso de precipitados de 100 ml. Tijeras.
30
 • 6 tubos de ensaye 15mm X 150 mm.
• Gradilla.
• Embudo.
• Bolsa de hielo.
• Sobre de gasas.
• Papel milimétrico.
• Charola metálica.
• Pipeta Pasteur con goma.
• Cubeta con agua destilada.
• 3 espectrofotómetros.
• 6 celdas para espectrofotómetro.
• Una centrífuga clínica.
• 6 tubos para centrífuga.
• Solución de NaCl 0.35 M en Buffer de fosfatos 0.02 M, pH 8. (buffer
salino)
• Solución de DCPIP 0.3 M.

Material biológico
Hojas de espinacas o de acelgas (3 o 4 por equipo)

Procedimiento

 Enfrié con anticipación el mortero con hielo, agregué 20 ml de buffer

salino frío y las partes verdes de sus hojas de espinacas.
 Tritúrelas durante 5 minutos como máximo y en seguida filtre el
homogenizado a través de gasa doble previamente humedecida con
10 ml de buffer salino.
 El filtrado se distribuye de manera equitativa en dos tubos de
ensayo y se centrifuga a 1000 rpm. Durante tres minutos (recuerde
que los tubos deben tener la misma cantidad de líquido al
centrifugar por lo que hay que agregarle solución buffer si es
necesario para igualarlos), se obtienen dos fases:
 El sobrenadante: que contiene los cloroplastos en suspensión. El
precipitado: que tiene células intactas y núcleos.

31
  El sobrenadante obtenido se coloca en tubos de ensaye fríos. Se
desecha el precipitado. Se coloca de nuevo el sobrenadante en
tubos de centrífuga y se centrifuga a 3000rpm durante 5 minutos.
 Al final de este tiempo se descarta el sobrenadante y el precipitado
se suspende en buffer salino frío utilizando en total 2 ml por cada
tubo.
 De esta manera se tiene preparada la suspensión de cloroplastos
intactos.

Para preparar la suspensión de cloroplastos con “SHOCK” osmótico:

1. Se coloca en un tubo 1 ml de la suspensión de cloroplastos intactos

y 4 ml de agua destilada.
2. Envuelva 4 tubos de ensaye con papel aluminio, y después se
preparan los tubos de la siguiente manera:

3
(este tubo
4
Tubo 1 2 no se
(Blanco)
expone a la
luz)
Solución de
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
DCPIP 0.3 M.
Buffer Salino 9.5 ml 9.5 ml 9.5 ml 9.5 ml
Suspensión
cloroplastos con 0.2 ml __ __ __
SHOCK osmótico
Suspensión de
Cloroplastos __ 0.2 ml 0.2 ml __
intactos

3. Antes de proceder a tomar las lecturas correspondientes debe agitar

perfectamente bien todos los tubos.
4. Para calibrar el espectrofotómetro primero ajuste a 0% de
absorbancia a una longitud de onda de 450 nm, luego llene una
celda con el contenido del tubo No. 4 (TUBO BLANCO) y calibre a
0% de absorbancia a la misma longitud de onda. Una vez calibrado

32
 el espectrofotómetro obtenga las lecturas de absorbancia a 450 nm
de los tubos 1, 2 y 3 al tiempo de 0 minutos de exposición a la luz.
5. Enseguida exponga los tubos 1, 2 y 4 a la luz, colocándolos a una
distancia aproximada de 15 cm del foco durante un minuto. Al
término de este tiempo tápelos nuevamente con papel aluminio y
proceda a realizar las lecturas de absorbancia a 450 nm de los tubos
1, 2 y 3 en el espectrofotómetro ya calibrado como en el paso 4.
6. Repita el paso 5, cuatro veces más, es decir, los tubos son
expuestos a la luz por un tiempo total de 5 minutos, en intervalos
de un minuto de exposición.

Presentación de resultados

1.- Presente en la siguiente tabla los datos experimentales obtenidos.

Tubo/Tiempo de
0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min
exposición
Tubo 1.
Suspensión
cloroplastos con
SHOCK osmótico
Tubo 2.
Suspensión de
Cloroplastos
intactos
(expuesto a la
luz)
Tubo 3.
Suspensión de
Cloroplastos
intactos (no
expuesto a la
luz)
Tubo 4. Blanco

33
 2. Realice una gráfica de absorbancia (450 nm) contra tiempo de
exposición a la luz en papel milimetrado.

Cuestionario

1. Explique porque durante el aislamiento de cloroplastos se trabaja a

bajas temperaturas y además porque se utiliza una solución buffer
salina.
2. Analice en detalle los resultados obtenidos para cada tubo.
3. Describir brevemente otra técnica para determinar fotosíntesis.
4. Nombre la materia prima y los productos para cada fase de la
fotosíntesis.

34
 DESCRIPCIÓN DE LA

ACTIVIDAD PRÁCTICA No 7

“Meiosis y Mitosis”

Objetivo

Aprender a diferenciar los periodos del ciclo celular.

Material

• Microscopio.
• Aceite de inmersión.
• Acetocarmín
• Metanol,
• Bisturí
• Micropreparados que ilustran los procesos de mitosis y meiosis.

Procedimiento
1. Con ayuda de una pinza retire la capa externa marronacea o rosácea y
lave con abundante agua, esto se realiza para eliminar restos de
sustancias con las que frecuentemente han sido tratadas para inhibir o
retardar la germinación de las raicillas.
2. Llene un vaso de precipitados con agua y coloque un bulbo de cebolla
sujeto con dos o tres palillos de manera que la parte inferior quede
inmersa en el agua.
3. Póngalo a germinar a 25°C o a temperatura ambiente durante 3 días,
al cabo de estos aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de unos
3 o 4 cm. de longitud.
4. Revise diariamente y procure que la corona no se deseque para lo cual
es necesario rellenar con agua cada 24 horas.
5. Cuando las raíces tengan entre 0.5 y 1 cm de longitud, realice cortes
de raíz de aproximadamente 2 – 3 mm a partir del ápice.

35
6. Colóquelas en una lámina portaobjetos. Adiciona una gota del colorante
acetocarmín.
7. Coloque el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con ayuda
de la punta de una lanceta, de unos golpecitos sobre el cubre objetos
sin romperlo, de modo que la raíz quede extendida.
8. Use papel absorbente para retirar el exceso de colorante realice una
suave presión, evitando que él cubre objetos resbale. Si la preparación
está bien asentada no hay peligro de rotura por mucha presión que se
realice.
9. Selle todos los bordes del cubre objetos con esmalte transparente, para
evitar que se seque y de esta manera conservar la preparación durante
varios días.
10. Coloque la preparación al microscopio e inicie la observación con el
objetivo de 10x e identifique las células.
11. Cambie al objetivo de 40X para detallar las células. Observe los
núcleos y cromosomas en color rosáceo – morado.
12. Ubique el objetivo de 100 x y escriba sus observaciones anotando
las diferencias en cada uno de los aumentos mencionados.
13. Trate de observar detenidamente las preparaciones y distinga
células en interfase y células en división y dentro de estas, las
diferentes etapas de la mitosis.

Presentación de resultados

Realice dibujos de todas las fases observadas.

Cuestionario

 ¿Qué etapas de la meiosis y mitosis observo?

 ¿Qué proceso se está desarrollando en las etapas observadas?
 ¿Qué tipo de células se están observando?

36
 ¿Cuántos cromosomas poseen las células en mitosis?
 ¿Cuántos cromosomas poseen las células en meiosis?

37
 BIBLIOGRAFÍA

Pérez Avila, J., Valenciaga Rodríguez, J. L., Acosta, A., Nicolau Mena, O.,
Turcios Tristá, S. E. & Navaroli Fernández, F. (2012). Mecanismos
de acción hormonal a través de receptores ubicados en la
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Molecular De La Celula. Editorial Omega. 4 Edición Campbell, Neil
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Freeman, Scott. (2009). Biología. Pearson Ediciones. 3 ediciones Pierce

B.A. 2005. Genética: Un enfoque conceptual. México. Editorial
Médica Panamericana.

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La Célula. Pearson Educación. 6 edición

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