KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:
 Melakukan analisa sampel (zat warna) secara kromatografi lapis tipis

II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

a. Alat yang Digunakan
 Pelat TLC
 Chamber Chromatography
b. Bahan yang Digunakan
 Toluen
 Benzen
 Sikloheksan
 Zat warna

III. DASAR TEORI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses
migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih,
salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu
dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan
adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran
molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana kromatografi
biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.
Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan
prinsip ini.

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan

komponen menggunakan fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan
adsorben inert. KLT merupakan salah satu jenis kromatografi analitik. KLT
 sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak keuntungan
menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk
dalam kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas. Kromatografi
juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik
penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan
senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga
dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi
yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil (Fessenden,2003).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu teknik yang sederhana yang
banyak digunakan, metode ini menggunakan empeng kaca atau lembaran
plastik yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis dan kering. Untuk menotolkan
karutan cuplikan pada kempeng kaca, pada dasarnya menggunakan mikro pipet
atau pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan
pengelusi di dalam wadah yang tertutup (Soebagio,2002).
Prinsip KLT adalah adsorbsi dan partisi dimana adsorbsi adalah penyerapan
pada pemukaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu
zat yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan.
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada
(Sudarmadji et al. 2007):
a. Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, hal ini bergantung pada
bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
b. Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini
tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika.

Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan

adsorben seperti silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa.
Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam. Fasa gerak yang digunakan
dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan pada
polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang
berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT
 dipilih dengan cara trial and error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh
terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh (Gritter et al, 1991). Fasa diam
dalam kromatografi biasanya adalah padatan atau cairan, dan fasa geraknya
adalah cairan atau gas. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang
leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya,
kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari
campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-
atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang
terlibat ialah :
 Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan).
 Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus
(adsorpsi, penjerapan).
 Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap
(keatsirian).
Kromatografi lapis tipis merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawamurni dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan
kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat
sedikit, baik menyerap maupun merupakan cuplikan KLT dapat digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofilik seperti lipid-lipid dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat
digunakan untuk mencari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara
kromatografi dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapis tipis
seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi-pereaksi
yang lebih reaktif seperti asam sulfat.( Fessenden, 2003 )
Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai
faktor resensi. Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam
dikelompokkan (Gritter,1991) :
a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina).
b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel).
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina).
d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel).
 Pada fase gerak, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan
fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom
serapan. Sistem tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organik
dalam seri pelarut mikroskop diberikan dalam tabel 25, yang meliputi (sifat
hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform
(perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol) benzene,
sikloheksana, dan eter petroleum (Lipsy, 2010).
Identifikasi secara kulitatif pada kromatografi kertas khususnya
kromatografi lapis tipis dapat ditentukan dengan menghitung nilai Rf. Nilai Rf
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa. Harga Rf didefinisikan
sebagai perbandingan antara jarak senyawa titik awal dan jarak tepi muka pelarut
dari titik awal (ibnu gholib, 2007).
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu.
Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa
dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai
kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa
diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam,
sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara
0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi
kepolaran eluen, dan sebaliknya (Ewing Galen, 1985).
KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu (Julia, 1993) :
1. Waktu pemisahan lebih cepat.
2. Sensitif artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna

Dalam analisis kimia suatu bahan, maka akan sering dihadapkan pada
pekerjaan-pekerjaan seperti menghilangkan konstituen pengganggu atau
mengisolasikannya maupun memekatkan konstituen yang dikehendaki sebelum
dilakukuan identifikasi maupun pengukuran jumlahnya. Untuk melakukan
analisis kimia tersebut maka kita harus menggunakan suatu metode agar dapat
menentukan hasil yang tepat, kromatografi salah satunya, dan dapat pula
digunakan sebagai analisa secara kuantitatif. Kromatografi adalah suatu metoda
untuk separasi yang menyangkut komponen suatu contoh di mana komponen
dibagi-bagikan antara dua tahap, salah satu yang mana adalah keperluan selagi
gerak yang lain. Di dalam gas kromatografi adalah gas mengangsur suatu cairan
atau tahap keperluan padat. Di dalam cairan kromatografi adalah campuran cairan
pindah gerakkan melalui cairan yang lain, suatu padat, atau suatu ‘gel’ agar.
Mekanisme separasi komponen mungkin adalah adsorpsi, daya larut diferensial,
ion-exchange, penyebaran/perembesan, atau mekanisme lain (David, 2010).

Kromatografi lapis tipis dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai
selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif atau
preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga
yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi
(Gritter et al, 1991).

Kromatografi lapis tipis juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk
kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,
identifikasi senyawa secara kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan
senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa
yang tidak bereaksi dengan pereaksi–pereaksi yang lebih reaktif seperti asam
sulfat. Data yang diperoleh dari kromatografi lapis tipis adalah nilai Rf yang
berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat
dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan
sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang
ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil
dari 1,0.

Menurut Gandjar dan Rohman( 2007), fase yang digunakan pada KLT yaitu:

1. Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel
fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik
 kinerja kromatografi lapis tipis dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang
paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme
sorpsi yang utama pada kromatografi lapis tipis adalah adsorpsi dan partisi.

2. Fase Gerak

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan
mengoptimasi fase gerak :

 Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
 Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
 Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan.
 Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia
masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya
jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Sebagaimana dalam prosedur kromatografi lain, jika sampel yang digunakan
terlalu banyak akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual
terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 µl. Tepi bagian bawah
lempeng lapis tipis yang telah ditotolkan sampel dicelupkan kedalam fase gerak
kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak harus dibawah lempeng bertotol sampel.