Anda di halaman 1dari 12

1.

Pendahuluan
Mikroskopi adalah metode yang umum digunakan dalam mendeteksi
mikroorganisme langsung dari spesimen klinis maupun untuk mengamati lebih
lanjut tentang organisme yang tumbuh dari media kultur. Mikroskopi
didefinisikan sebagai penggunaan mikroskop untuk memperbesar objek yang
terlalu kecil untuk divisualisasikan oleh mata sehingga karakteristik objek dapat
diamati. Karena sebagian besar agen infeksius merupakan mikroorganisme yang
tidak terlihat oleh mata tanpa alat bantu, teknik mikroskopi memegang peranan
penting di laboratorium mikrobiologi.
Jenis mikroskop yang dapat digunakan bergantung pada jenis
mikroorganisme yang hendak dideteksi, diidentifikasi, dan dikarakterisasi.
Mikroskop medanterang (atau yang lazim disebut sebagai mikroskop cahaya) dan
mikroskop fluoresens merupakan jenis mikroskop yang paling luas penggunaan
dan aplikasinya di laboratorium mikrobiologi klinik. Secara garis besar mikroskop
dapat dibagi menjadi mikroskop cahaya dan mikroskop electron. Mikroskop
medan terang, mikroskop medan gelap, mikroskop fase-kontras, dan mikroskop
fluoresens adalah jenis-jenis mikroskop yang menggunakan cahaya/sinar
ultraviolet untuk menerangi specimen. Mikroskop elektron menggunakan partikel
elektron (dibandingkan dengan sinar) dan magnet (dibandingkan dengan lensa
pada mikroskop cahaya) untuk mengamati partikel submikroskopis. Dalam tugas
ini, penulis akan mencoba memaparkan prinsip penggunaan mikroskop, jenis-
jenis mikroskop, dan cara penggunaannya. Pemaparan akan difokuskan pada
mikroskop cahaya yang paling sering digunakan dalam kegiatan sehari-hari di
laboratorium mikrobiologi klinik.

2. Jenis-Jenis Mikroskop
2.1 Mikroskop Medan Terang
Mikroskop yang menggunakan sinar yang dipancarkan langsung ke mata
tanpa didefleksikan oleh plate condenser disebut sebagai mikroskop medan
terang (brightfield microscope). Mikroskop medan terang menggunakan
system dua lensa untuk memperbesar tampilan specimen yang hendak
diamati. Keterbatasan utama dari penggunaan mikroskop lapangan terang
yang sering disebut secara sederhana dengan sebutan mikroskop cahaya ini

Page | 1
adalah ketiadaan kontras antara specimen dan latar belakang sehingga sulit
dilakukan pengamatan terhadap sel yang hidup/viable. Mikroskop cahaya
terutama digunakan untuk mengamati preparat yang telah difiksasi dan
diwarnai dengan metode pewarnaan tertentu.

Gambar 1. Mikroskop Medan Terang

2.1 Mikroskop Medan Gelap


Prinsip kerja mikroskop medan gelap serupa dengan mikroskop medan terang,
perbedaan terletak pada system kondensor yang dimodifikasi sehingga sinar
tidak dipancarkan langsung ke specimen sehingga terdefleksi atau tersebar.
Sistem ini membuat specimen terlihat terang diatas latar belakang yang gelap.
Mikroskop ini sangat berguna untuk mengamati mikroorganisme hidup
golongan spiroketa (spirochetes), seperti Treponema pallidum.

Page | 2
Gambar 2. A, Prinsip Kerja Mikroskop Medan Gelap. B, Treponema
pallidum dalam specimen yang diperiksa dengan mikroskop medan gelap

2.2 Mikroskop Fase Kontras


Bila kita mencoba mengamati preparat tanpa diwarnai terlebih dahulu, sangat
sedikit kontras atau detail yang dapat diamati karena sel akan nampak
transparan. Proses pewarnaan akan meningkatkan kontras antara sel dan media
sekitar, sehingga pemeriksa dapat mengamati detail sel dari specimen. Namun
proses pewarnaan akan menimbulkan kematian sel sehingga aktivitas dari sel
hidup tidak dapat diamati. Mikroskop fase kontras memungkinkan
pengamatan terhadap specimen tanpa melalui proses pewarnaan. Mikroskop
fase kontras dilengkapi dengan lensa dan condenser yang dapat membuat sinar
ditransmisikan sedemikian rupa sehingga komponen seluler yang memiliki
perbedaan index refraktif akibat perbedaan kepadatan dan ketebalan dapat
terlihat sebagai objek yang berbeda. Gambaran objek akan terlihat gelap
dengan latar belakang yang terang.

Gambar 3. Mikroskop Fase Kontras

Page | 3
Gambar 4. Bakteri pembentuk endospore dengan pemeriksaan mikroskop fase

kontras

2.3 Mikroskop Fluoresens


Mikroskop fluoresens terutama digunakan untuk memvisualisasikan
specimen yang telah diwarnai dengan pewarna fluoresens. Sumber cahaya
yang digunakan adalah sinar UV. Radiasi ultraviolet dengan panjang
gelombang 230-350 nm akan diserap oleh bahan kimia fluoresens dan
kemudian akan dipantulkan lagi dalam bentuk sinar bewarna oranye, kuning,
atau hijau. Penggunaan mikroskop ini secara klinis adalah untuk mengamati
reaksi antigen-antibodi.

Gambar 5. Prinsip Kerja Mikroskop Fluoresens

Page | 4
Gambar 6. A, Pewarnaan BTA dengan Ziehl-Nelseen. B, BTA dengan
pewarnaan Auramin-Rhodamin

2.4 Mikroskop Elektron


Mikroskop elektron menggunakan partikel elektron (dibandingkan dengan
sinar) dan magnet (dibandingkan dengan lensa pada mikroskop cahaya) untuk
mengamati partikel submikroskopis. Mikroskop elektron merupakan
penemuan visioner dalam dunia mikroskopi, memungkinkan tercapainya
pembesaran specimen hingga 1.000.000x. Mikroskop elektron terbagi
menjadi dua jenis, transmission electron microscope (TEM) yang
memungkinkan visualisasi struktur internal objek dan scanning electron
microscope (SEM) yang memberikan gambaran struktur permukaan tiga
dimensi dari objek yang diamati.

Gambar 7. A, Tampilan mikroskop TEM: Escherichia coli di dalam sel mast.


B, Gambaran Escherichia coli dari mikroskop SEM

Page | 5
Gambar 8. Penggunaan mikroskop dalam pemeriksaan specimen
mikroorganisme

3. Bagian-Bagian Mikroskop Cahaya

1. Eyepiece / oculars (lensa okuler)

Page | 6
Untuk memperbesar bayangan yang
dibentuk lensa objektif

2. Revolving nosepiece (pemutar lensa


objektif)
Untuk memutar objektif sehingga
mengubah perbesaran

3. Observation tube (tabung pengamatan/


tabung okuler)
4. Stage (meja benda)
Spesimen diletakkan di sini

5. Condenser (condenser)
Untuk mengumpulkan cahaya supaya
tertuju ke lensa objektif

6. Objective lense (lensa objektif)


Memperbesar spesimen

7. Brightness adjustment knob (pengatur


kekuatan lampu)
Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu

8. Main switch (tombol on-of)


9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri

10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)


11.Specimen holder (penjepit spesimen)
12.Illuminator (sumber cahaya)
13.Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal)
Untuk menaikkan atau menurunkan object glass

14.Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal)


Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas

15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)


Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat

16.Fine focus knob (sekrup fokus halus)


Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat

17.Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)


18.Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser)
Untuk menaik-turunkan kondenser

Page | 7
4. Prinsip Penggunaan Mikroskop Cahaya
4.1 Magnifikasi
Mikroskop cahaya yang umum digunakan dilengkapi dengan empat lensa
objektif yang memiliki derajat pembesaran yang berbeda. Total pembesaran
specimen didapatkan dari pengalian pembesaran lensa okuler dan lensa
objektif. Lensa objektif pada mikroskop cahaya umumnya memiliki
pembesaran 4x, 10x, 40x, dan 100x. Dengan pembesaran lensa okuler 10x,
didapatkan total pembesaran 40x, 100x, 400x, dan 1000x. Dari pembesaran
1000x kita dapat mengamati sebagian besar bakteri dan jamur, namun
pembesaran tersebut tidak cukup untuk mengamati virus yang membutuhkan
pembesaran 100.000x atau lebih.

4.2 Resolusi
Selain pembesaran, kita perlu memperhatikan kemampuan resolusi dari lensa
mikroskop. Pengertian dari resolusi adalah kemampuan suatu lensa untuk
memberikan gambaran objek yang berbeda dari dua objek yang berdekatan.
Kekuatan resolusi dari lensa ditentukan oleh panjang gelombang dari sumber
sinar yang digunakan dan numerical aparatur yang merupakan karakteristik
dari lensa objektif yang digunakan. Kekuatan resolusi dari mikroskop cahaya
adalah sekitar 0,2 μm. Ini berarti dua objek yang berjarak kurang dari 0,2 μm
tidak akan terlihat sebagai dua objek yang berbeda. Karena diameter sel
bakteri rata-rata adalah sekitar 1 μm, maka sel bakteri akan tampak dari
pemeriksaan dengan mikroskop cahaya, namun tidak dengan struktur internal
maupun eksternal dari bakteri.
4.3 Pencahayaan
Pencahayaan yang efektif diperlukan untuk memaksimalkan fungsi dari
pembesaran dan kekuatan resolusi. Mikroskop modern dilengkapi dengan
sumber cahaya artifisial dari lampu tungsten yang biasanya terletak pada kaki
mikroskop. Cahaya dari sumber sinar akan melewati lensa kondensor yang

Page | 8
terletak dibawah meja specimen yang berfungsi sebagai pengatur focus
cahaya. Beberapa mikroskop dilengkapi dengan diafragma yang dapat diatur
pembukaannya melalui knob khusus yang memungkinkan pengaturan jumlah
sinar yang diperlukan untuk menerangi specimen.

5. Penggunaan Mikroskop Cahaya

Untuk mencapai resolusi yang diharapkan dari pembesaran 1000x, perlu


digunakan minyak imersi. Minyak imersi memiliki spesifikasi optic dan
karakteristik kekentalan yang dirancang khusus untuk penggunaan mikroskopi.
Minyak imersi digunakan untuk mengisi ruang antara lensa objektif dan specimen
yang sedang diperiksa. Pembesaran rendah (100x/400x) digunakan untuk mencari
lapang pandang tertentu dari specimen, sedangkan pembesaran yang tinggi dan
bantuan minyak imersi biasanya dibutuhkan untuk mendeteksi dan mengamati
karakteristik bakteri secara optimal.

.Pada umumnya digunakan tiga pilihan pembesaran saat melakukan


pemeriksaan dengan mikroskop: 1) kekuatan rendah dengan total pembesaran
100x, 2) pembesaran tinggi tanpa bantuan minyak imersi dengan total pembesaran
400x, dan 3) pembesaran tinggi total 1000x pembesaran dengan bantuan minyak

Page | 9
imersi. Pembesaran rendah lazim digunakan untuk mengeksplorasi seluruh lapang
pandang sehingga dapat dilakukan pencarian terhadap objek yang ditentukan dan
juga dapat mengetahui kondisi lapang pandang secara keseluruhan. Pemeriksaan
dilanjutkan dengan pembesaran tinggi untuk mengamati secara lebih detail.

5.1 Pemeriksaan Low-Power Field


1. Letakkan object glass pada meja specimen dengan bagian yang
mengandung spesimen menghadap keatas
2. Nyalakan sumber cahaya, arahkan cahaya agar terletak ditengah-tengah
dari slide
3. Pastikan condenser berada pada poin tertinggi yang paling dekat dengan
meja spesimen
4. Putar revolving nose-piece sehingga lensa objektif pembesaran rendah
yang hendak kita gunakan terletak ditengah-tengah (sampai terdengar
bunyi ‘klik’ untuk memastikan lensa terpasang dengan baik)
5. Putar coarse adjustment knob hingga meja spesimen berada dekat dengan
lensa objektif
6. Sambil melihat melalui lensa okular, atur focus objek dengan fine
adjustment knob hingga terlihat gambar yang jelas. Apabila
menggunakan mikroskop dengan lensa binocular, atur diopter adjustmet
ring dan interpupillar distance adjustment knob untuk mengatur jarak
antara kedua lensa agar sesuai dengan jarak mata pemeriksa dan
menyamakan focus antara mata kiri dan kanan
7. Atur condenser untuk mendapatkan pencahayaan yang optimal.
Pengaturan ini harus dilakukan setiap kali mengubah lensa objektif yang
akan digunakan.
8. Ketika gambaran jelas telah terlihat, geser slide untuk mengamati seluruh
lapang pandang menggunakan vertical feed knob dan horizontal feed
knob

Page | 10
9. Setelah menemukan struktur yang dicari dalam suatu area, pemeriksa
dapat meningkatkan pembesaran dengan mengubah lensa objektif yang
digunakan.

5.2 Pemeriksaan High-Power Field


Setelah memutar revolving nosepiece ke lensa objektif pembesaran tinggi,
terkadang perlu dilakukan penyesuaian focus dengan mengatur fine adjustment
knob. Mikroskop berkualitas memiliki kualifikasi parfokal dan parsentral, dengan
artian gambar akan tetap terlihat focus dan terletak ditengah setelah penggantian
lensa objektif yang digunakan. Ketika hendak meningkatkan pencahayaan,
pastikan untuk mengatur diafragma terlebih dahulu, jika masih dirasa kurang baru
tingkatkan pencahayaan dari sumber sinar untuk menjaga lampu mikroskop tetap
awet.

5.3 Pemeriksaan Oil-Immersion Field


Penggunaan minyak imersi mengurangi berkas sinar yang didefleksikan dan
memaksimalkan numerical aperture sehingga dapat meningkatkan resolusi.
Teteskan dulu minyak imersi sebelum mengubah lensa objektif. Ketika
menggunakan lensa objektif dengan minyak imersi diperlukan lebih banyak sinar
untuk menerangi spesimen, sehingga pembesaran diafragma/peningkatan sumber
cahaya perlu dilakukan. Atur kembali focus dengan fine adjustment knob bila
diperlukan. immersion lens. Beberapa mikroskop memiliki filter biru atau hijau
pada sumber penerangan untuk meningkatkan resolusi.
Pemeriksaan dengan oil immersion field digunakan secara luas dalam studi
bakteriologi sehingga sangat penting bagi praktisi untuk menguasai penggunaan
teknik ini. Penting untuk mengetahui tentang working distance yakni jarak antara
lensa dengan spesimen yang akan berkurang secara signifikan seiring peningkatan
pembesaran.

Page | 11
Page | 12