Anda di halaman 1dari 19

Immunosensor elektrokimia untuk penentuan sensitif dari faktor pertumbuhan

transformasi (TGF) - β1

abstrak
Urinimmunosensor amperometrik pertama untuk kuantifikasi TGF-​β​1, sitokin diusulkan sebagai biomarker untuk pasien yang
memiliki atau berisiko untuk penyakit ginjal, dijelaskan dalam karya ini. Desain immunosensor melibatkan perangkat sekali
pakai menggunakan karboksilat mikropartikel magnetik asam difungsikan didukung ke elektroda karbon layar-dicetak dan
kovalen imobilisasi antibodi spesifik untuk TGF-​β​ 1 menggunakan Mix & Go polimer. Sebuah sandwich-jenis immunoassay
dilakukan dengan menggunakan biotin-anti-TGF dan konjugasi dengan streptavidin peroksidase-berlabel (poli-HRP-Strept)
polimer. Amperometrikmeasurementsdilakukan pada -0,20 V dengan menambahkan larutan hidrogen peroksida ke permukaan
elektroda di hadapan hydroquinone sebagai mediator redoks. Kalibrasi Plot memungkinkan berbagai linearitas membentang
antara 15 dan 3000 pg / mL TGF-​β​1 yang memadai untuk penentuan sitokin dalam plasma dan urin. Batas deteksi, 10 pg / mL,
yang terutama ditingkatkan sehubungan dengan yang diperoleh dengan ELISA kit. Kegunaan dari immunosensor untuk
penentuan penerbangan TGF-​β​1 konsentrasi dalam sampel nyata dievaluasi dengan menganalisis urin berduri pada tingkat
konsentrasi pg / mL yang berbeda.

1. Pendahuluan
Sitokin adalah berat molekul protein bioaktif rendah yang diproduksi oleh banyak sel yang berbeda dan sangat terkait dengan
sistem kekebalan tubuh (Stenken dan Poschenrieder 2015) (Liu et al., 2016). Ada minat klinis yang sangat besar dalam sitokin
tekad sebagai konsentrasi tinggi dari protein ini berhubungan dengan peradangan atau perkembangan penyakit dan, karena itu,
berbagai jenis sitokin yang banyak digunakan sebagai biomarker untuk mengkarakterisasi fungsi kekebalan tubuh, memprediksi
penyakit dan memonitor evolusi dan perawatan mereka. Aplikasi ini memerlukan ketersediaan metode analisis yang sangat
sensitif karena sitokin muncul ke lingkungan ekstraseluler pada kisaran konsentrasi pM.
Pertumbuhan transformasi faktor-β (TGF-β) keluarga adalah kumpulan terkait secara struktural sitokin multi-fungsional yang
mengatur berbagai proses fisiologis dan patologis. Mereka terlibat dalam sel-pertumbuhan, tingkat proliferasi, diferensiasi dan
produksi protein matriks ekstraselular (Grainger et al., 2000). Tiga isoform (TGF-β1, -β2, dan -β3) yang hadir pada mamalia
dengan beberapa perbedaan dalam kegiatan biologis dan juga dalam potensi mereka. Khususnya,TGF-
perilakusebagai inhibitor pertumbuhan sel-sel induk hematopoeitic dari yang lain. Sitokin ini telah dianggap sebagai biomarker
yang baik fibrosis hati (Fallatah 2014) atau karsinoma kandung kemih (Eder et al., 1996). Meningkatkan bukti juga link TGF-β1
untuk perkembangan fibrosis ginjal dan jaringan parut yang terkait dengan nefropati diabetik atau nephrosclerosis hipertensi
(Tsapenko et al., 2013) dan glomer- ulonephritis (Grainger et al., 1995). TGF-

ß
1 tingkat konsentrasi antara 0,1 dan 25 ng / mL telah dilaporkan dalam plasma dari
individu yang sehat (Grainger et al., 2000). Variabilitas diamati tergantung sampai batas tertentu pada jenis uji yang digunakan
untuk kegigihan. Tingkat sirkulasi peningkatan TGF-β1 pada pasien yang menderita berbagai jenis kanker selain penyakit ginjal
tersebut, dan mengalami depresi berat di aterosklerosis maju (Matharu et al., 2014).
Meskipun penting, relatif sedikit metode yang tersedia untuk penentuan sitokin ini. Strategi immunoassay berdasarkan
konfigurasi sandwich-jenis dengan peroksidase-label atau bio tinylated anti-TGF-β1 sebagai antibodi pendeteksi dipekerjakan di
komersial ELISA kit kolorimetri. Metode ini berlaku untuk menentukan TGF-β1 dalam kisaran dari puluhan hingga ribuan
β
1 terlibat dalam respon flammatory kekebalan tubuh dan di- menunjukkan seratus kalilebih kuat
pg/ mL dengan konsentrasi minimum terdeteksi yang bisa drop ke beberapa unit pg / mL. Dalam kasus tertentu biosensor untuk
TGF-
ß
1 tekad, hanya dua konfigurasi telah ditemukan dalam
literatur. Sebuah aptasensor melibatkan aptamer-dimodifikasi Au elektro
n penulis Sesuai.
Des terintegrasi dengan mikrofluida dilaporkan. Thiolatedapta-:.
alamat E-mail Yseo@quim.ucm.es (P. Yáñez-Sedeno)
mer dilabeli dengan metilen biru rakitan pada emas
Silakan mengutip artikel ini sebagai: Sánchez-Tirado, E., et al. , biosensor dan Bioelectronics (2016),
http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2016.05.093i
biosensor dan Bioelectronics ∎ (∎∎∎∎) ∎∎∎-∎∎∎
E. 2 Sánchez-Tirado et al. / Biosensor dan Bioelectronics ∎ (∎∎∎∎) ∎∎∎-∎∎∎ permukaan. Rentang linear tertutup hingga 250 ng /
mL dengan deteksi
(Sigma), adiponektin (APN), interleukin 6 (IL-6) dan
interleukin 8 batas tion dari 1 ng / mL. Perangkat ini digunakan untuk memantau TGF-
ß
1
(IL-8) (Abcam), dan tumor necrosis factor alpha (TNF
α)
(
BD rilis dari sel-sel hati (Matharu, et al., 2014). Baru-baru ini, sebuah
PharMingen ) diuji sebagai interferents potensial.
Deionisasi wa immunosensor impedimetric dikembangkan untukdeterminasi
terdiperoleh dari Millipore Milli-Q sistem pemurnian
tion dari TGF-
ß
1 dalam serum manusia. Sebuah monolayer rakitan dari
(18,2 M
Ω
cm pada 25 ° C). polietilen glikol (PEG)
yang disiapkan ke elektroda interdigitated digunakan untuk imobilisasi kovalen dari antibodi. A
2.2. Aparatus dan elektroda linear impedansi vs log
[TGF-β1] berkisar antara 1 dan 1000 ng / mL ditemukan dengan batas deteksi 0,570 ng / mL (Yao et al.,
Pengukuran amperometri dilakukan menggunakan
INBEA 2016). Namun, biosensor menunjukkan sensitivitas yang lebih tingginee-
potensiostatdisediakan oleh software IbGraph.
Layar-dicetak ded untuk diterapkan sampel klinis mengandungsangat rendah TGF-β1
elektrodakarbon (SPCEs, 110 DRP, φ 4mm) dari
konsentrasi DropSens. Misalnya, dalam urin sitokin ini berkisar biasanya
(Oviedo, Spanyol) digunakan sebagai elektroda kerja.
Elektroda ini antara 10 dan 50 pg / mL dan telah diusulkan sebagai biomarker yang
disediakan dengan pseudo-referensi elektroda perak
dan mobil-pasien yang memiliki atau berisiko untuk penyakit ginjal (Tsapenko et al.,
Bon elektroda counter. Inkubasi langkah-langkah yang
dilakukan pada 25 ° C 2013) (Grainger et al., 1995) (Honkanen et al., 1997). Jelas, itu
menggunakan Optic Ivymen Sistem inkubator suhu
konstan juga sebagian besar penting sifat non-invasif mengumpulkanurine
pengocok(Comecta SA) dan pengukuran pH dilakukan
dengan menggunakan sampel dan karena kegunaannya untuk dipekerjakan dengan titik
pHmeter CRISON Dasar ke-20. Sebuah P-Selecta
ultrasonik mandi, perangkat perawatan magnetik.
Separator (DynaMagn®, Invitrogen Dynal), dan homo
Vortex Dalam karya ini, immunosensor amperometri pertama untuk
genizator dari Heidolph juga digunakan. Semua
percobaan yang kuantifikasi TGF-β1 dijelaskan, dengan tujuan de-
dilakukan pada suhu kamar. veloping alat analisis
sensitif, handal, dan kuat untuk penentuan sitokin ini dalam sampel klinis yang kompleks.
2,3.Prosedur immunosensor menyiratkan perangkat
sekali pakai menggunakan mikropartikel magnetik difungsikan asam- karboksilat didukung ke skrining
2.3.1. Penyusunan poli-HRP-Strept / Biotin-anti-TGF / TGF-β
1
/ elektroda karbon dicetak. Ini manik-manik magnetik memiliki
setan-anti-TGF-MB-konjugatdidemonstrasikan untuk
menjadi alat yang sangat berguna untuk persiapan elektrokimia
3
μ
L dari komersial suspensi HOOC-MB yang
immunosensors trans memungkinkan minimalisasi efek matriks dimenjadi
ferred 1,5 mL Eppendorf tabung dan dicuci dua kali
dengan analisis 50 uL sampel kompleks (Zacco et al., 2006), (Ruiz-Valdepeñas
MES larutan buffer pada 25 ° C. Setiap langkah
mencuci terdiri dari Montiel et al., 2015). Kovalen imobilisasi dari an-khusus
ulang suspensi dari MBs difungsikan dalam larutan
penyangga dan tibody untuk TGF-β1 (anti-TGF) dilakukan dengan menggunakan Mix & Go,
mengadukpada 600 rpm selama 10 menit (hingga
homogenisasi) diikuti oleh polimer mengandung beberapa kompleks logam karenamereka
pemisahan magnetikselama 4 menit dan penghapusan
dari solusi. Selanjutnya, efisiensi untuk mengikat protein (Ojeda et al., 2015). Sandwich-jenis
25 uL Mix & Go ditambahkan dan diinkubasi selama
60 menit pada 25 ° C immunoassay dirancang menggunakan biotin-anti-TGF, dan conjuga-
sambil diaduk di 600rpm. Setelah itu, dua langkah cuci
dengan tion dengan peroksidase-berlabel streptavidin (poly-HRP-Strept)poli-
WBSdilakukan dan, lebih lanjut, 25
μ
L dari 5
μ
g
/ mL anti-TGF mer digunakan untuk memperkuat elektrokimia yang deteksi. Am-
solusi disiapkan di 25 mM MES larutan buffer pH 5.0
yang pengukuran perometric dilakukan dengan menambahkan hidrogen
ditambahkan, memungkinkan inkubasi selama 60
menit pada 25 ° C sambil diaduk di solusi peroksida ke permukaan elektroda di hadapan
600 rpm. Kemudian, immunoconjugates dicuci
terlebih dahulu dengan hydroquinone sebagai mediator redoks. Kegunaan analisis dari
50 uL 25 mM MES larutan buffer pH 5.0 dan, kedua,
dengan immunosensor yang ditunjukkan oleh aplikasi untuk urine
50 uL 100 mM PBS pH 8,0. Selanjutnya, langkah
memblokir dengan sampel inkubasi yang mengandung konsentrasi TGF-β1 berbeda pada pg /
mLkonjugat anti-TGF-MB dengan 50 uL 2 M
etanolamin tingkat.
Solusi yang disiapkan di 0,1 M PBS pH 8,0 diterapkan untuk 1h. Setelah itu, kelebihan dari etanolamin telah dihapus dengan
mencuci berturut-turut dengan 50
μ
L buffer PBS yang sama dan dengan 50
μ
L
dari 2. Experimental
WBS. Bioconjugation sitokin sasaran dilakukan dengan menambahkan 25 uL larutan standar TGF-β1 atau sampel dan 2.1.
Reagen dan solusi
inkubasi selama 60 menit pada 25 ° C. Dua pencucian dengan 50
μ
L WBS dilakukan dan 25 uL dari 2 mg / mL Biotin-anti-TGF-β1 jadi- Manusia TGF-
ß
1, capture tikus antibodi (anti-TGF), dan
lution mengandung 1% BSA ditambahkan dan
diinkubasi selama 60 menit pada ayam terbiotinilasi antibodi (Biotin-anti-TGF) berasal dari R & D
25 ° C sambil diaduk pada 600 rpm. Kemudian, dua
langkah cuci dengan Sistem dan termasuk dalam DuoSet
®
ELISA Pengembangan Sistem
50 uL WBS yang diterapkan diikuti dengan
penambahan 25 uL 1 / (DY240-05). Horseradish peroksidase berlabel streptavidin (HRP-
500 diencerkan poli-HRP-Strept di PBS, dan inkubasi
selama 20 menit. Strept) (Roche), poli-HRP-Strept (85-R200) (Fitzgerald), karboksilat
Akhirnya, dua lagi mencuci langkah-langkah dengan
50 uL WBS yang diterapkan. Semua manik-manik magnetik asam difungsikan (HOOC-MB) (Dynabeads
®
M
larutan bufferyang digunakan adalah yang
direkomendasikan oleh pemasok dari 270 Asam Karboksilat, 2,8 m diameter, 30 mg / mL), dan Mix & GoTM
DuoSet
®
ELISA System Development (DY240- 05).
polimer dari Diagnostik Anteo, juga digunakan. Larutan buffer yang digunakan adalah: 0,1 M larutan buffer fosfat pH 8,0 dan
0,05 M
2.3.2. Penentuan TGF-β1 fosfat NaH2
solusipenyangga dari pH 6,0 dibuat dari Na
2
HPO
4
dan PO
4;
garam dapar fosfat pH 7,2 (PBS) yang mengandung
sebagaimana siap poli-HRP-Strept / Biotin-anti-TGF / TGF-β1 / anti TGF-MB itu kembali ditangguhkan di 45
μ
L dari 1 mM
hydroquinone dan 8,1 mM Na
2
HPO
4,
1,5 mM KH
2
PO
4,
137 mM NaCl, dan 2,7 mM KCl;
ditransfer ke permukaan SPCE tersebut. Hal ini
dilakukan dengan menjaga larutan pencuci penyangga (WBS) dibuat dari PBS terakhir
olehSPCE horizontal dan menempatkan magnet
neodymium pada melarutkan 0,05% Tween 20; 25mm MES larutan penyangga daripH
bawahbagian dari elektroda untuk menemukan cara
direproduksi 5,0 dibuat dari 2- (N-morfolina) asam ethanosulfonic (Gerbu).
MBs biofunctionalized ke daerah permukaan elektroda
kerja. Sebuah Hidrogen peroksida (Aldrich, 30% (b / b) danhydroquinone (Sigma)
potensideteksi A200 mV diterapkan dan latar belakang
juga digunakan. 2M etanolamin (Sigma) disiapkan di 0,1 M
saat ini tercatat sampai stabilisasi (100 kurang-lebih) .
buffer fosfat pH 8,0 digunakan sebagai memblokir solusi.
Selanjutnya, aliquot 5 uL 50 mM larutan hidrogen
peroksida adalah asam askorbat (AA) (Fluka), asam urat (UA) dan kreatinin (CR)
ditambahkan dan, setelah periode 200 s untuk reaksi enzimatik untuk
Perbesar mengutip artikel ini sebagai:. Sánchez-Tirado, E., et al, biosensor dan Bioelectronics (2016),
http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2016.05 .093i
E. Sánchez-Tirado et al. / biosensor dan Bioelectronics ∎ (∎∎∎∎) ∎∎∎-∎∎∎ 3
take tempat, arus pengurangan kuinon terbentuk diukur.
2.3.3. Analisis urin berduri
prosedur yang dijelaskan di atas diaplikasikan sampel urin yang dibubuhi TGF-β1 pada konsentrasi akhir 25, 45 atau 100 pg /
mL ada pretreatment diperlukan kecuali 1:. 3 pengenceran dengan 0,1 M PBS pH 7,2. Penentuan TGF-β1 dilakukan dengan
interpolasi dari tanggapan amperometri untuk sam-prinsip ke dalam plot kalibrasi dibangun dengan standar TGF-β1.
3. Hasil dan diskusi
Gambar. 1 menunjukkan skematis langkah-langkah yang berbeda yang terlibat dalam penyusunan dan fungsi poli-HRP-Strept
/ Biotin-anti TGF / TGF-
ß
1 / anti-TGF-MB / SPCE immunosensor. Mobilisasi kovalen im- antibodi capture ke asam-functio- karboksilat
mikropartikel magnetik nalized (langkah 1) dilakukan dengan menggunakan polimer Mix & Go. Polimer ini menggunakan ligan
untuk mengikat induk Fc lakukan-yang meniru domain-domain yang mengikat dari protein A dan G (Ooi et al., 2014), dan juga
dapat berinteraksi kuat dengan elektron menyumbangkan gugus seperti kelompok karboksil dipisahkan. Oleh karena itu,
kombinasi HOOC-MB dengan penggunaan Mix & Pergi untuk imobilisasi antibodi mengakibatkan metodologi nyaman untuk ap-
menghujani sebagai rute umum untuk persiapan immunosensors elektrokimia (Ojeda et al., 2015). Antibodi penangkapan
mobilisasi im- diikuti oleh langkah memblokir dengan etanolamin (langkah 2) dan pelaksanaan sandwich-jenis immunoassay
menggunakan antibodi sekunder biotinylated dan poli-HRP-Strept untuk penguatan sinyal (langkah 3). Penggunaan manfaat
poli-HRP-Strept in konjugat HRP-Strept konvensional telah menunjukkan untuk menjadi menguntungkan untuk desain sensitif
munosensors im- elektrokimia sebagai beberapa molekul HRP yang tersedia untuk biocata- lyze H
2
O
2
pengurangan(Ojeda et al ., 2014). Setelah MBs menyandang immuno-konjugat dipindahkan ke permukaan SPCE,
hidrokarbon Drogen peroksida ditambahkan (langkah 4) dan amperometri
Gambar. . 1. display Skema langkah yang terlibat dalam penyusunan immunosensor amperometri untuk TGF-β1
Silakan mengutip artikel ini sebagai: Sánchez-Tirado, E., et al, biosensor dan Bioelectronics (2016), http: //. Dx .doi.org /
10,1016 / j.bios.2016.05.093i
respon pada À200mV di hadapan hydroquinone diukur sesuai dengan reaksi yang ditampilkan pada Gambar. 1.
3.1. Optimasi variabel eksperimental yang terlibat dalam paration pra dari immunosensor
Pengaruh variabel yang terlibat dalam penyusunan immunosensor TGF-β1 pada sponses analitis yang sesuai dipelajari.
Jumlah Mix & Go digunakan adalah bahwa optimum kap pola sebelumnya dalam kelompok kami (Ojeda et al., 2015) dan, dalam
studi ini, konvensional HRP-Strep digunakan untuk label antibodi deteksi karena efek dari variabel lain yang tidak harus
bergantung pada jenis label yang digunakan.
The anti-TGF loading pada MBs asam-difungsikan karboksilat dioptimalkan dengan mengukur respon spesifik dan tidak
spesifik (tanpa antigen terjepit) dengan ging konsentrasi antibodi random antara 2,5 dan 20
μ
g / mL. Ara. 2 (a) menunjukkan sebagai yang terbesar rasio lancar tertentu-to-tidak spesifik
diperoleh untuk konsentrasi antibodi / mL 5 mg. Konsentrasi yang lebih tinggi menghasilkan penurunan nifikan sig- dari respon
tertentu kemungkinan besar karena Dering hin- dari reaksi elektrokimia di hadapan loading biomolekul besar. Dengan demikian,
konsentrasi seperti itu se- lected untuk membangun immunosensor tersebut. Optimalisasi waktu cubation in untuk langkah ini
(hasil tidak ditampilkan) mendorong kami untuk memilih 60 menit untuk kovalen mengikat antibodi.
Etanolamina terpilih sebagai agen blocking untuk meminimalkan adsorptions tidak spesifik ke HOOC-MB setelah anti-TGF
mengikat karena untuk efisiensi terbukti untuk tujuan ini (Ojeda et al., 2014). Dalam rangka mengoptimalkan langkah ini
memblokir, 1 dan 2 M etanolamin lutions begitu- dan kali inkubasi yang berbeda selama 30-90 kisaran min diuji. Ara. 2 (b) dan
(c) menunjukkan sebagai memblokir efektif dicapai dengan menggunakan larutan 2 M etanolamin selama 60 menit. Di bawah
Kondisi ini dapat, saat karena adsorpsi tidak spesifik adalah kurang dari 25% dibandingkan yang diukur untuk konsentrasi
TGF-β1 seperti serendah 125 pg / mL.
Konsentrasi Biotin-anti-TGF juga dioptimalkan dengan pengujian serah elektrokimia yang tanggapan diukur dengan berbeda
E. 4
Sánchez-Tirado et al. / Biosensor dan Bioelectronics ∎ (∎∎∎∎) ∎∎∎-∎∎∎ 400
6
1200
300
5
1000
4
800
200
3
600
100
ic jika c
3
A n, i
EPSN
io tar
2
2
u - ot - ci
tnerruc
A n, i
1
fice S
400
200
1p
cificepsnu - ot - cific
0
2,5 5,0 10 20
0
0
ep S
oitartnerruc
0
anti-TGF, ug / mL
1 Etanolamina, 2
M
250
250
4
200
A i,
4
3
ic jika cep
oi
0
0 30 45 60 90
1234
blokir langkah, min
Silakan mengutip artikel ini sebagai:. Sánchez-Tirado, E., et al, biosensor dan Bioelectronics (2016), http://dx.doi.org/10.1016
/j.bios.2016.05.093i
200
A
CIFI
n
150
t
150
c
0
sn
ar
n, i
3
2
u-
tn
100
2 100
ot - CIFI
erruc
cepsnu - ot -
1
ic jika ce
io tartnerru
50
1
cep S
50
pS0
Biotin-anti-TGF, ug / mL
Gambar. 2. Pengaruh anti-TGF memuat (a), konsentrasi agen blocking (b), waktu inkubasi dalam memblokir langkah (c) dan
konsentrasi Biotin-anti-TGF (d) pada respon amperometri diperoleh dengan TGF-β1immunosensor. 3 uL HOOC-MB; 25 uL Mix
& Go, 60 menit; (a) 2,5-20 ug / mL anti-TGF, 60 menit; 50 uL 1 M etanolamin, 90 menit; 25 uL 2 ug / mL Biotin-anti-TGF, 60
menit; 25 uL 1/2000 pengenceran HRP-Strept; 20 menit; (b) 5 mg / mL anti-TGF, 60 menit; 50 uL 1 atau 2 M etanolamin, 90
menit; (c) 50 μL1M etanolamin, 30-90 menit; 25 uL 2 ug / mL Biotin-anti-TGF, 60 menit; 25 uL 1/2000 pengenceran
HRP-Strept, 20 menit; (d) 5 mg / mL anti-TGF, 60 menit; 50 uL 1 M etanolamin, 60 menit; 25 uL 1-4 ug / mL Biotin-anti-TGF,
60 menit; 25 uL 1/2000 pengenceran HRP-Strept, 20 menit 25 uL 125 pg / mL TGF-β1 (abu-abu gelap) dan 0 pg / mL TGF-β1
(abu-abu terang), 60 menit; E
aplikasi
1
/4 A200 mV. Melihat teks untuk informasi lebih lanjut. Rangkap tiga pengukuran dengan kesalahan bar di 7 s nilai.
Immunosensors siap dengan beban conjugate lebih
konsentrasiantara 1 dan 2
μ
g / mL.
Konsentrasi yang lebih besar 1-4 ug berbagai / mL. Hasil yang diperoleh (Gbr. 2 (d)) menunjukkan peningkatan
menghasilkan respon yang lebih kecil dan agak mirip
menyarankan sa- di respon amperometri dengan meningkatkan Biotin-anti-TGF
turation antibodi situs mengikat. Dengan demikian, 2 mg / mL adalah
250
5
c
c
0
1/500 1/1000 1/2000 1/4000
HRP-Strept, pengenceran
0
jika 200
4
ICEP
oi A n, i
150
poli-HRP-Strept, pengenceran
s
tar
100
3
2
nu - ot - cific
mentega
50
S
RRU
1
ep
1250
8
0
1000
6 A n, i
750
Gambar. 3. tanggapan Perbandingan dari TGF-β1 immunosensor ketika beban yang berbeda HRP-Strept (a) dan poli-HRP-Strept
(b) digunakan untuk label terbiotinilasi anti-TGF deteksi antibodi: 25 uL 125 pg / mL TGF-β1 (abu-abu gelap) atau 0 pg / mL
TGF-β1 (abu-abu terang), 60 menit; 25 uL HRP-Strept, 20 menit (a); 25 uL 60 pg / mL TGF-β1 (abu-abu gelap) atau 0 pg / mL
TGF-β1 (abu-abu terang), 60 menit; 25 uL poli. HRP-Strept, 20 menit (b); 3 uL HOOC-MB; 25 uL Mix & Go, 60 menit; 25 uL 5
ug / mL anti-TGF, 60 menit; 50 uL 1 M etanolamin, 90 menit; 25 uL 2 ug / mL Biotin-anti-TGF, 60 min (c) arus amperometri
untuk 25 uL 125 pg / mL (abu-abu gelap) atau 0 (abu-abu terang) TGF-β1, 60 menit, diukur dengan immunosensors disiapkan
oleh kovalen imobilisasi anti-TGF ke HOOC-MB menggunakan Mix & Go (1) atau dengan aktivasi dengan EDC / NHSS (2). 3
uL HOOC-MB; 25 uL Mix & Go, 60 menit atau 25 mL 25 mg / mL EDC / NHSS, 60 menit; 50 uL 2 M etanolamin, 60 menit; 25
uL 2 ug / mL Biotin-anti-TGF-β1, 60 menit; 25 uL, 1/500 poli-HRP-Strept, 20 menit; E
aplikasi
cificepsnu - o
800
500
c
0
4
t - cific
oitartnerru
S
1/250 1/500 1/1000 1/2000
3
0
cifice
o
250
2
ep
A n,
600
i
400
2
1
psnu - ot - cific
itartnerruc
Mix & Go EDC / NHSS
0
200
ep S
1/
4 A200 mV. Melihat teks untuk informasi lebih lanjut. Hasil analisis rangkap tiga dengan kesalahan bar di 7 s nilai.
E. Sánchez-Tirado et al. / Biosensor dan Bioelectronics ∎ (∎∎∎∎) ∎∎∎-∎∎∎ 5
terpilih sebagai konsentrasi konjugat optimal. Mengenaiin.
kondisi Kesalahan bar dihitung dari pengukuran yang
dilakukan waktu cubation untuk langkah ini (hasil tidak ditunjukkan), jangka waktu 60 menit
dengan tiga immunosensors berbeda dalam setiap
kasus. Stabil ditunjukkan cukup untuk memungkinkan mengikat semuaanti terbiotinilasi
negarasaat vs logaritma konsentrasi TGF-β1 mengikuti
tubuh untuk antigen TGF-β1.
Disesuaikan persamaan I (nA) 1/4978 log C (pg / mL)
À734 (r21/40.991), dengan dalam rangka untuk mendapatkan mungkin sensitivitas tertinggi untuk mencapai tujuan
berbagai linearitas membentang antara 15 dan 3000 pg / mL TGF-
ß
1
. disebutkan dalam Pendahuluan untuk pekerjaan ini, elektrokimia
kisaran ini mencakup lebih dari dua lipat dan itu
adalah strategi penguatan sinyal dilaksanakan dengan label yangde-
memadaiuntuk penentuan sitokin dalam sampel nyata
proteksi antibodi dengan polimer peroksidase-streptavidin bukannya
memperhitungkan konsentrasi diharapkan, pada ng /
mL tingkat di konvensional HRP-Strept. Strategi ini telah menunjukkan untuk meningkatkan
plasma (Grainger et al., 1995), atau puluhan pg / mL
dalam urin (sensitivitas Tsapenko dalam penyusunan immunosensors elektrokimia
et al., 2013). Batas deteksi, 10 pg / mL, dihitung
dengan sejak beberapa molekul HRP yang tersedia untuk digunakan dalam bioca-
menerapkan di
b
kriteria3,mana s
b
diperkirakan
sebagai talysis standar substrat enzim (Ojeda et al ., 2014). diramalkan
Penyimpangandalam satuan konsentrasi (n1/410)
kosong efek amplifikasi skr diukur dipicu oleh penggunaan poli-HRP-Strept adalah
sewa (0 ng / mL TGF-β1). Karakteristik analitis
dicapai dikonfirmasi dengan membandingkan respons yang diperoleh dengan kedua con-
dengan immunosensor diusulkan meningkatkan
terutama yang jugates dilaporkan. Ara. 3 (a) menunjukkan hasil ketika HRP-Strept dipekerjakan
untuk ELISA kit komersial. Misalnya, RayBio®
Manusia TGF- dengan faktor pengenceran mulai dari 1/500 ke 1/4000. There- spesifik
beta1ELISA kit (ELH-TGFb1) klaim
(<www.raybiotech.com/files/ tanggapan untukTGF-
β
konsentrasi1 dari 125 pg / mL sedikit menurun
manual / ELISA / ELH-TGFb1.pdf>) untuk dosis
terdeteksi minimum ketika konsentrasi konjugasi lebih rendah sementara yang terbaik spesifisitas
(konsentrasi analit mengakibatkan absorbansi sama
dengan 2s ke-tidak spesifik rasio lancar diperoleh untuk 1/2000 HRP-Strept
lebih tinggi daripada kosong) dari 80 pg / mL, yang
delapan kali pengenceran. Ketika poli-HRP-Strept dipekerjakan, yang luar biasa besar
lebih tinggi dari yang dicapai dalam pekerjaan ini.
Immunosensor yang mantan saat diukur (Gbr. 3 (b)) untuk konsentrasi TGF-β1 dari
hibits juga sensitivitas sangat tinggi dari yang
dilaporkan untuk 60pg / ml, sehingga menunjukkan amplifikasi dicapai di
kedua aptasensor yang (LOD dari 1 ng / mL)
(Honkanen et al., 1997) dan respon elektrokimia. Dalam hal ini, yang terbesar spesifik-to-un
yang imunosensor impedimetric (LOD 1/40.570 ng /
mL) (Yao et al., Rasio lancar tertentu terjadi untuk faktor pengenceran 1/500 dan, karena
2016). bisa diharapkan, itu jauh lebih kecil dari yang
terjadi
Reprodusibilitas tanggapan amperometri diperoleh
dengan HRP-Strept. Dalam kedua kasus, waktu inkubasi 20 menit adalah
dengan immunosensors berbeda dievaluasi. Set
immuno- cukup untuk mengikat dengan antibodi sekunder terbiotinilasi.
Sensor disiapkan pada hari yang sama dan pada hari yang
berbeda menggunakan Sebagai berkomentar atas, strategi untuk menangkap mengikat anti-
anti-TGF-MB baru / SPCE dalam setiap kasus. Relatif
standar tubuh de- ke MBs asam-difungsikan karboksilat tersirat penggunaan
viation (RSD) (n1/45) nilai-nilai yang 2,9% dan 3,9%
untuk tes per- polimer Mix & Go. Ini diklaim sebagai strategi yang efisien untuk
membentuk pada hari yang sama dalam ketiadaan dan
di hadapan stabil dan berorientasi pengikatan antibodi (Ojeda et al., 2015)
250 pg / mL TGF-
ß
1, masing-masing, sedangkan RSD (
n1/45) nilai-nilai itu dan, dalam kasus ini, hal itu menunjukkan dengan membandingkan im-
3,7% dan 4,2%, masing-masing, untuk pengukuran
yang dilakukan pada respon munosensor berbeda ketika antibodi anti-TGF yang kovalen
hari. Hasil ini menunjukkan tingkat presisi yang baik
dicapai dalam bergerak menggunakan Mix & Go, dengan yang diperoleh saat konvensi
fabrikasi dan fungsi immunosensing nasional EDC /
NHSS kimia yang diusulkan dipekerjakan untuk antibodibind-.
platform yang Selain itu, kemampuan penyimpanan
anti-TGF-MB / SPCE con- ing. Sebagai Gambar. 3 (c) menunjukkan, sangat ditingkatkanspesifik-to-back-juga
jugates diuji. Berbeda anti-TGF-MB / SPCE yang
disiapkan tanah saat itu tampak ketika anti-TGF diamobilisasi
pada hari yang sama, disimpan dalam kondisi
kelembaban pada 4 ° C, dan menggunakan Mix & Go, mungkin sebagai konsekuensi dari yang cocok atau-
digunakan untuk mempersiapkan immunosensors
untuk mengukur 250 pg / mL TGF- ientation dari antibodi yang disediakan oleh ini polimer.
β1 pada hari yang berbeda. Hasil yang diperoleh (tidak ditampilkan) menunjukkan bahwa tanggapan immunosensor tetap dalam
kontrol 3.2. Karakteristik analitis dari
batas immunosensor,terletak di 73 s, yang s adalah standar deviasi dari pengukuran (n 1/410) dilakukan pada hari kerja pertama,
untuk di Gambar. 4 menunjukkan plot kalibrasi untuk TGF-
β
1 dibangun dengan
minimal 30 hari (tidak ada waktu penyimpanan lagi
diuji) menunjukkan immunosensor dikembangkan di bawahdioptimalkan bekerja
/ konjugat SPCEstabilitas yang baik dari anti-TGF-MB.
3.0

2.6
Silakan mengutip artikel ini sebagai:. Sánchez-Tirado, E., et al, biosensor dan Bioelectronics (2016),
http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2016.05.093i
1 μA


2,2
j
A μ, i
1,8
1,4
1,0
0,6
0,2
1 10 100 1000
10000
TGF β1, pg / mL
0 100 200 300 400
saya, s
Gambar. 4. Kalibrasi Plot construted untuk TGF-β1 oleh amperometry di poli-HRP-Strept / Biotin-anti-TGF / TGF-β1 /
anti-TGF-MB / SPCE immunosensor. Amperograms direkam untuk) 0; b) 2.5; c) 15; d) 30; e) 60; f) 125; g) 250; h) 500; i) 1000;
j) 3000 pg / mL TGF-β1. Garis putus-putus menunjukkan waktu pengukuran.
E. 6
Sánchez-Tirado et al. / Biosensor dan Bioelectronics ∎ (∎∎∎∎) ∎∎∎-∎∎∎ 800
pendekatan untuk menentukan konsentrasi TGF-β1 rendah dalam cairan biologis urin seperti kompleks. 600
A n, i
400
4. Kesimpulan
200
The immunosensor amperometrik pertama untuk kuantifikasi
0
tanpa interferent
AA UA APN CR TNF IL-6 IL-8
sitokin TGF
β
1, diusulkan sebagai biomarker untuk pasien yang memiliki atau berisiko untuk penyakit ginjal, dijelaskan
dalam karya ini . Desain rasional dari immunosensor melibatkan stabil dan berorientasi im-
Gambar. 5. tanggapan amperometri diukur denganpoli-HRP-Strept / Biotin-anti
mobilisasiantibodi spesifik pada asam
karboksilat-fungsi TGF / TGF-β1 / anti-TGF-MB / SPCE immunosensor untuk 0 (abu-abu terang) dan 25pg / mL
tionalized MB dengan menggunakan polimer Mix &
Go, dan elektro TGF-β1 (abu-abu gelap) di hadapan 370 ug / mL asam askorbat (AA), 50 mg / mL asam urat (AU), 200 pg / mL
adiponektin (APN), 10 pg / mL kreatinin (CR), 200 pg / mL faktor tu- mor nekrosis alfa (TNF), 500 pg / mL interleukin 6 (IL-6),
dan 10 ng / mL di- terleukin 8 (IL -8).
sinyal kimia strategi amplifikasi dengan label antibodi deteksi dengan polimer peroksidase-streptavidin, memungkinkan
karakteristik analisis ulang markably ditingkatkan diperoleh sehubungan dengan ELISA kit atau metode sebelumnya.
Menggabungkan ben
Tabel 1
ben-, plot kalibrasi cocok untuk penentuan Penentuan
cy- TGF-β1 dalam urin berduri dengan poli-HRP-Strept / Biotin-anti-TGF /
Tokine dalam plasma dan urin dicapai. Hal ini
memungkinkan de- TGF-β1 / anti-TGF-MB / SPCE immunosensor.
Pemutusan konsentrasi TGF-β1 dalam urin pada pg / mL con
TGF-β1, pg / mL TGF-β1found, pg / mL Recovery,%
tingkat centration tanpa pengobatan sampel kecuali 1: 3 pengenceran dengan larutan buffer. Hasil yang diperoleh menunjukkan
bahwa awal 25 25.970.5 10.378
tujuan mengembangkan analitis45 44.970.3 100 9671
10073 9775 sensitif, handal, dan kuat
alatuntuk penentuan sitokin ini dalam sampel klinis yang kompleks, dan, karena itu, cocok untuk mengembangkan
point-of-perawatan perangkat ini cukup dicapai. Antibodi yang digunakan juga dipamerkan selektivitas yang besar terhadap
protein lain. Ara. 5 menampilkan tanggapan immunosensor dalam ketiadaan dan di hadapan 25 pg / mL TGF-β1, dan dalampra
Ucapan Terima Kasihrasa asam askorbat (AA), asam
urat (UA), adiponektin (APN), kreatinin (CR) , tumor necrosis factor alpha (TNF), interleukin 6
dukungan keuangan dari Spanyol Ministerio de
Economia y Communication (IL-6) atau interleukin 8 (IL-8) pada konsentrasi yang diharapkan
petitividad, Proyek Penelitian CTQ2015-70023-R, dan
NANOA- pasien yang sehat. Seperti jelas terlihat, tidak ada perbedaan yang signifikan
Program VANSENS dari Comunidad de Madrid
(S2013 / MT-3029) yang jelas dalam hal apapun. Menariknya, karena po deteksi
sangat kami hargai. Nilai bangkan digunakan, tidak
ada gangguan dari zat electroactive seperti askorbat dan asam urat diamati.
3.3. Penentuan TGF-
ß
1 diurine berduri
Referensi
Kegunaan dari immunosensor untuk penentuan konsentrasi rendah TGF-β1 dalam sampel nyata dievaluasi oleh
Eder, IE, Stenzl, A., Hobisch, A., Cronauer, MV, Bartsch, G., Klöcker, H., 1996. J. Urol.
156, 953-957. Fallatah, HI, 2014. Kemajuan dalam. Hepatologi, 357287. menganalisis berduri urine mengikuti prosedur yang
diuraikan dalam detik- tion 2.3.3. Sampel yang digunakan adalah LiquichekTM Urine Kimia Control (BioRad) yang
mengandung asam urat, amilase, kalsium, klorida,
Grainger, DJ, Kemp, BR, Metcalfe, JC, Liu, AC, Lawn, RM, Williams, NR, Grace,
AA, Schofield , PM, Chauhan, A., 1995. Nat. Med. 1, 74-79. Grainger, DJ, Mosedale, DE, Metcalfe, JC, 2000. sitokin Growth
Factor Wahyu 11,
133-145. kortisol, kreatinin, fosfor, glukosa,
magnesium, albumin,
Honkanen, E., Teppo, A.-M., Törnroth, T., Groop,
P.-H., Grönhagen-Riska, G., 1997. kalium, natrium , dan urea, dan itu dibubuhi TGF-β1 pada tingkat konsentrasi 25, 45 atau 100
pg / mL.
Nephrol. Dial. Transpl. 12, 2562-2568. Liu, G., Qi, M., Hutchinson, MR, Yang, G., Goldys, EM, 2016. Biosens. Bioelectron.
79, 810-815. Kemungkinan efek matriks dievaluasi
dengan membangun
Matharu, Z., Patel, D., Gao, Y., Haque, A., Zhou, T.,
Revzin, A., 2014. Anal. Chem. 86, grafik kalibrasi dalam urin dengan spiking dengan TGF-β1 konsentrasi yang berkisar antara
25 dan 250 pg / mL dan menerapkan 0, 1: 2 dan 1: rasio 3 pengenceran dengan 0,1 M PBS pH 7,2. Hasil yang diperoleh
8865-8872. Ojeda, I., Moreno-Guzmán, M., González-Cortés, A., Yáñez-Sedeno, P., Pingarrón, J.
M., 2014. Anal. Bioanal. Chem. 406, 6363-6371. Ojeda, I., Barrejón, M., Arellano, LM, González-Cortés, A., Yáñez-Sedeño,
P., Langa, revealed that a 1:3 dilution was enough to avoid significant matrix effects since the slope of the calibration plot, 911
nA per decade of concentration, was not statistically different from that obtained with TGF-
β
1 standards. Accordingly, the determination of TGF-
β
1
F., Pingarrón, JM, 2015. Biosens. Bioelectron. 74, 24–29. Ooi, HW, Cooper, SJ, Huang, C.-Y., Jennins, D., Chung, E., Maeji,
NJ, Whittaker, A.
K., 2014. Anal. Biochem. 456, 6–13. Ruiz-Valdepeñas Montiel, V., Campuzano, S., Pellicanò, A., Torrente-Rodríguez, RM,
Reviejo, AJ, Cosio, MS, Pingarrón, JM, 2015.
Anal. Chim. Acta 880, 52–59. in urine could be accomplished by interpolation of the current measured with the immunosensor in
the 1:3 diluted samples into
Stenken, JA, Poschenrieder, AJ, 2015. Anal. Chim. Acta 853, 95–99. Tsapenko, MV, Nwoko, RE, Borland, TM, Voskoboev,
NV, Pflueger, A., Rule, AD,
Lieske, JC, 2013. Clin. Biochem. 46, 1430–1435.
calibration plot prepared with standards. No other sample pre-
Yao, Y., Bao, J., Lu, Y., Zhang, D., Luo, S., Cheng,
X., Zhang, Q., Li, S., Liu, Q., 2016. Sens. treatment was needed in any case. Table 1 summarizes the results obtained in the
analysis of spiked urine with recoveries near to
Actuators, B 222, 127–132. Zacco, E., Pividori, MI, Alegret, S., Galve, R., Marco, MP, 2006. Anal. Chem. 78,
1780–1788. 100% in all cases, thus demonstrating
the suitability of the
〈www.raybiotech.com/files/manual/ELISA/ELH-TGFb1.pdf〉.
Please cite this article as: Sánchez-Tirado, E., et al., Biosensors and Bioelectronics (2016),
http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2016.05.093i