26/04/2017

Metode Pengujian dan

Keamanan Kosmetik

Oleh:
Dr. Arief Nurrochmad, M.Si., M.Sc., Apt
PELATIHAN DASAR PENILAIAN KEAMANAN KOSMETIKA DAN
PENYUSUNAN DIP BAGI PELAKU USAHA KOSMETIKA

Surakarta, 26-28 April 2017

Definisi Kosmetika

Kosmetika adalah bahan atau sediaan yang

dimaksudkan untuk digunakan pada bagian
luar tubuh manusia (epidermis, rambut, kuku,
bibir dan organ genital bagian luar) atau gigi
dan mukosa mulut terutama untuk
membersihkan, mewangikan, mengubah
penampilan dan/atau memperbaiki bau badan
atau melindungi atau memelihara tubuh pada
kondisi baik .

1
 26/04/2017

Peraturan Kepala Badan POM Nomor

HK.03.1.23.12.10.11983 Tahun 2010 tentang Kriteria
dan Tata Cara Pengajuan Notifikasi Kosmetika

Mutu
Kemanan
Kriteria
Kosmetika Kemanfaatan

Penandaan

ASEAN Guidelines for safety evaluation

of cosmetic products
 Tidak ada pendekatan secara formal untuk
proses evaluasi keamanan.
 Proses yang sebenarnya akan bervariasi
dari produk ke produk sesuai dengan
kebaruan komposisi produk dan relevansi
dan kecukupan informasi yang ada.
 Namun, sebagai aturan umum, dasar
utama untuk evaluasi keamanan diberikan
dengan mempertimbangkan profil
toksikologi dan kandungan bahannya.

2
 26/04/2017

ASEAN Guidelines for safety evaluation

of cosmetic products....cont
 Dari sudut pandang ilmiah, hampir di
semua kasus pengujian produk jadi tidak
memerlukan penggunaan uji toksikologi
pada hewan.
 Secara umum, semua pertanyaan yang
diajukan pada tahap ini dapat dijawab
dengan memanfaatkan sumber informasi
lainnya, termasuk data manusia dari tes
kompatibilitas kulit yang dilakukan secara
etis pada kulit relawan manusia.

Keamanan Ingredients
 Pemilihan bahan yang hati-hati merupakan isu
utama untuk memastikan keamanan produk
jadi.
 Struktur kimia akan menentukan reaktivitas
kimia dan biologis.
 Kemungkinan interaksi antar bahan yang
berpotensi terhadap keamanan.
 Kondisi pemaparan (tipe formulasi, konsentrasi,
frekuensi dan durasi kon tak, area tubuh yang
terlibat efek sinar matahari, dll.)

3
 26/04/2017

Sumber Data Toksikologi

 Sumber utama data toksikologi bahan adalah dari

pemasok (supplier).
 Pembuat bahan baku harus mematuhi undang-
undang nasional tentang bahan kimia / zat
berbahaya (occupational safety, transportasi,
pengemasan dan pelabelan).
 Sebagian besar usaha harus dilakukan untuk
mengumpulkan data toksikologi dan informasi
relevan lainnya dari pemasok.
 Jika perlu mungkin perlu mendorong pemasok
untuk melakukan studi tambahan.

Sumber Data Toksikologi lain:

 Scientific literature, databases (e.g. Toxline, Medline),
reports issued by the US Cosmetic Ingredient Review
(CIR) program, the EU Scientific Committee on
Consumer Products (SCCP) or the ASEAN Cosmetic
Scientific Body (ACSB), the Research Institute for
Fragrance Materials (RIFM) monographs, reports by
ECETOC, NTP, BIBRA.
 Safety Data Sheets
 In-house experience dengan kandungan bahan
tertentu dan kosmetika yang dikandungnya
 Penilaian ahli berdasarkan kesamaan dengan zat kimia
yang terkait

4
 26/04/2017

Scientific Literature Database:

https://toxnet.nlm.nih.gov/newtoxnet/toxline.htm
https://www.nlm.nih.gov/bsd/pmresources.html
http://www.cir-safety.org/
https://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consum
er_safety_en
http://aseancosmetics.org/
http://www.ecetoc.org/
https://ntp.niehs.nih.gov/
https://www.bibra-information.co.uk/

Evaluasi Produk Jadi Kosmetika

 Penilaian keamanan berkaitan dengan cara
penggunaan.
 Sumber informasi utama adalah karakteristik
toksikologi bahan dan pengalaman manusia yang
tersedia dengan produk yang sama.
 Evaluasi berdasarkan sifat-sifat bahan. Namun,
pertimbangan pemaparan pada manusia yang
memadai sangat penting untuk interpretasi data
yang ada. Juga pemeriksaan potensi peran bahan
pembawa.
 Toleransi lokal, dengan membandingkannya dengan
formula lain yang telah dipasarkan.

5
 26/04/2017

Evaluasi Produk Jadi Kosmetika

cont.....
 Penggunaan bahan baku dengan penggunaan baru
atau bahan baku baru: tambahan data keamanan
atau informasi detail diperlukan.
 Bila data toleransi lokal dirasa kurang, maka uji
tambahan dapat dilakukan secara in vitro dan atau
pada sukarelawan manusia.
 Pengujian in vitro dapat dilakukan untuk melengkapi
informasi yang tersedia sesuai protokol
 Kompatibilitas atau toleransi kulit dapat diperiksa
dengan menggunakan konstruksi model kulit atau
percobaan yang dilakukan pada relawan manusia.
 Uji klinik sesuai GCP

Pedoman Uji Toksisitas Nonklinik

Peraturan Kepala BPOM RI. Nomor 7 tahun 2014

 Pedoman Uji Toksisitas Nonklinik secara in

vivo digunakan sebagai acuan dalam
pelaksanaan kegiatan uji keamanan
pengembangan obat baru, obat tradisional,
kosmetik, suplemen kesehatan, dan
pangan.

6
 26/04/2017

Uji Toksikologi kosmetika in vivo

Tak Khas Khas

Akut Uji sensitisasi kulit
Subkronis Uji iritasi mata;
Kronis Uji iritasi akut dermal;
Uji iritasi mukosa vagina;

Obyek, Subyek, Proses, Data, Hasil, Manfaat ???

Pedoman Uji Toksisitas Nonklinik secara in

vivo menurut Peraturan Ka BPOM meliputi:
a. Uji toksisitas akut oral;
b. Uji toksisitas subkronik oral;
c. Uji toksisitas kronik oral;
d. Uji teratogenisitas;
e. Uji sensitisasi kulit;
f. Uji iritasi mata;
g. Uji iritasi akut dermal;
h. Uji iritasi mukosa vagina;
i. Uji toksisitas akut dermal; dan
j. Uji toksisitas subkronik dermal

7
 26/04/2017

Persyaratan Umum Uji Toksikologi

untuk bahan Kosmetika
1. Acute toxicity*
2. Skin absorption;
3. Skin irritation;
4. Mucous membrane irritation;
5. Skin sensitisation;
6. Sub-chronic toxicity;
7. Mutagenicity;
8. Phototoxicity and Photomutagenicity (in case of UV-
light absorbing)
9. substances);
10. Human data (if available)
11. Toxicokinetics;
12. Teratogenicity, Reproduction toxicity, Carcinogenicity,
and additional Genotoxicity.
13. Metabolism studies

Keabsahan uji toksisitas

 Sediaan uji
 Penyiapan sediaan uji
 Hewan uji
 Dosis
 Teknik
 Prosedur pengujian,
 Kemampuan SDM

8
 26/04/2017

Uji Toksisitas

 Uji toksisitas adalah suatu uji untuk

mendeteksi efek toksik suatu zat pada
sistem biologi dan untuk memperoleh data
dosis-respon yang khas dari sediaan uji.
 Data yang diperoleh dapat digunakan untuk
memberi informasi mengenai derajat bahaya
sediaan uji tersebut bila terjadi pemaparan
pada manusia, sehingga dapat ditentukan
dosis penggunaannya demi keamanan
manusia.

Ketentuan Umum Uji Toksisitas

A. Sediaan Uji
1. Sediaan uji yang berupa zat kimia:
a. Identitas bahan
b. Sifat fisiko - kimia;
c. Kemurnian
d. Kadar cemaran
2. Sediaan uji yang berupa simplisia tanaman obat:
a. Nama latin dan nama daerah tanaman
b. Deskripsi daerah penanaman
c. Bagian tanaman yang digunakan
d. Pemerian simplisia
e. Cara pembuatan dan penanganan simplisia
f. Kandungan kimia simplisia

9
 26/04/2017

Ketentuan Umum Uji Toksisitas

B. Penyiapan Sediaan Uji
1. Formulasi dalam media cair
2. Campuran pada makanan
3. Sediaan uji simplisia tanaman obat
C. Dosis Uji
D. Kelompok kontrol
E. Cara Pemberian Sediaan Uji
F. Hewan uji
G. Kondisi ruangan dan pemeliharaan
hewan uji

Tabel 1. Kriteria hewan uji yang

digunakan dalam uji toksisitas
No Jenis hewan uji Bobot Rentang
minimal Umur
1 Mencit 20 g 6-8 minggu
2 Tikus 120 g 6-8 minggu
3 Marmut 250 g 4-5 minggu
4 Kelinci 1800 g 8-9 minggu

10
 26/04/2017

Uji Toksisitas Akut

Penelitian ini dirancang untuk menentukan efek
toksik dari sediaan/bahan uji bila diberikan dalam
dosis tunggal dan/atau dalam dosis dosis ganda
dalam waktu yang singkat, biasanya satu hari (24
Jam).

Suatu pengujian untuk mendeteksi efek toksik yang

muncul dalam waktu singkat setelah pemberian
sediaan uji yang diberikan secara oral dalam dosis
tunggal, atau dosis berulang yang diberikan dalam
waktu 24 jam.
(PerKa BPOM, 2014)

Uji Ketoksikan Akut

TUJUAN: untuk menentukan
(1) Potensi ketoksikan akutnya, yang dinyatakan
sebagai kisaran dosis letal tengah (LD50)
yang diklasifikasikan sesuai dengan Globally
Harmonised System (GHS);
(2) Mekanisme yang memerantarai terjadinya
kematian hewan uji (mode of death); dan
(3) Spektrum efek toksik yang khas senyawa uji
(targeted organ).

11
 26/04/2017

Uji Ketoksikan Akut

Data yang dikumpulkan berupa:
(1) Tolok ukur ketoksikan kuantitatif (klasifikasi
kisaran dosis letal/toksik) dan
(2) Tolok ukur ketoksikan kualitatif (gejala
klinis, wujud, dan mekanisme yang
memerantarai kematian hewan uji).

Uji Ketoksikan Akut

Suggested reading: ”OECD guidance document for acute
oral toxicity testing”, OECD 2001. Freely avaiable for
download at OECD website. www.oecd.org.

OECD Guidelines
ACUTE ORAL TOXICITY - Fixed Dose Procedure 420
ACUTE ORAL TOXICITY - Acute Toxic Class Method 423
ACUTE ORAL TOXICITY Up-and-Down Procedure 425
ACUTE TOXICITY (Oral) 401
ACUTE TOXICITY (Dermal) 402
ACUTE TOXICITY (Inhalation) 403

12
 26/04/2017

Definisi umum Toksisitas Akut

Efek samping yang terjadi dalam waktu tertentu,

setelah paparan tunggal untuk zat melalui per oral,
dermal atau inhalasi

Istilah ini biasanya tidak termasuk iritasi lokal atau

efek korosif yang timbul dari satu aplikasi dari zat
pada kulit atau mata

Dalam semua uji pada pedoman OECD untuk

toksisitas akut, periode observasi minimum setelah
paparan adalah 14 hari.

Definisi OECD

Toksisitas akut oral: efek samping yang terjadi

setelah pemberian oral dosis tunggal suatu zat, atau
beberapa dosis yang diberikan dalam waktu 24 jam.
Toksisitas akut dermal: efek samping yang
disebabkan oleh substansi setelah paparan tunggal
oleh aplikasi dermal selama periode waktu yang
singkat (24 jam atau kurang).
Toksisitas akut inhalasi: efek samping yang
disebabkan oleh substansi setelah paparan tunggal
jika terhirup dalam jangka waktu yang singkat
biasanya paling sedikitnya empat jam untuk zat yang
mampu dihirup.

13
 26/04/2017

Kriteria toksisitas akut bahan kimia

dan pestisida

Kriteria toksisitas akut obat, OT dan

bahan lainnya (GRAS)

14
 26/04/2017

OECD guidelines– Toksisitas Akut Oral

Uji toksisitas akut konvensional telah menjadi uji yang

paling banyak dikritik dalam hal kesejahteraan hewan
(Animal Ethics).

Pengembangan tiga tes alternatif untuk Uji Toksisitas

Akut Oral akut (Test Guideline 420, 423, 425).

Guideline 401 sudah dihapus tahun 2002

420 Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Method

423 Acute Oral toxicity - Acute Toxic Class Method
425 Acute Oral Toxicity - Up-and-Down Procedure

OECD guidelines – Akut Dermal

atau Toksisitas inhalasi

402 Acute Dermal Toxicity

403 Acute Inhalation Toxicity

Saat ini mengalami revisi agar sesuai dengan

prinsip untuk pengujian Toksisitas oral akut

Versi Draft tersedia secara online di www.oecd.org

15
 26/04/2017

Metodologi -Toksisitas akut oral

 Zat harus diberikan dalam volume konstan selama

dengan rentang dosis untuk diuji dengan variasi
konsentrasi dosis stok

 Air disarankan digunakan utk pembawa

 Tikus berpuasa semalam (air ad libitum)

 Hewan Pengerat: Volume <1mL/100g BB (sampai

2 mL/100 g BB untuk cairan)

420 Acute Oral Toxicity - Fixed

Dose Method
 Sighting studi untuk menentukan dosis awal atau mulai
dosis 300 mg/kg BB

 Kelompok hewan dari satu jenis kelamin (Betina, kecuali

jantan dianggap lebih sensitif) dengan prosedur bertahap
menggunakan dosis tetap 5, 50, 300 dan 2000 mg/kg
(5000)

 Kelompok selanjutnya dapat diberikan dosis lebih tinggi

atau lebih rendah

 Lanjutkan sampai menemukan dosis yang menyebabkan

jelas efek toksik atau tidak lebih dari satu kematian

16
 26/04/2017

Waktu Observation

 Setidaknya sekali selama 30 menit pertama;

 Berkala selama 24 jam pertama, dengan

perhatian khusus diberikan selama 4 jam
pertama; dan

 Setiap hari setelah itu, untuk total waktu

pengamatan sampai 14 hari

420 Acute Oral Toxicity - Fixed

Dose Method - Interpretation

Pada setiap tingkat dosis dievaluasi:

 Kematian hewan uji

 Gejala-gejala toksik yang nyata
 Tidak ada toksisitas

Gunakan flowchart disediakan dalam pedoman untuk

mengklasifikasikan

Anda mendapatkan perkiraan berbagai LD50 yang

tidak dihitung tetapi nilai cut-off peraturan

17
 26/04/2017

423 Acute Oral toxicity - Acute

Toxic Class Method

Mirip dengan OECD 420 kecuali:

 Tidak ada studi pendahuluan (sighting)

 Ukuran kelompok 3 (bukan 5) setiap

tahapan

 Dan kematian adalah end point (bukan

toksisitas yang nyata)

Kriteria penggolongan untuk penentuan

toksisitas bahan kimia dan pestisida

18
 26/04/2017

Kriteria penggolongan untuk penentuan

toksisitas obat, OT dan pangan

425 Acute Oral Toxicity: Up-and-Down

Procedure
 Juga prosedur bertahap, menggunakan hewan
tunggal. LEBIH KOMPLEKS. Bukan pedoman EU.
 Dosis permulaan: diyakini di bawah LD50 atau 175
mg/kg BB
 Meningkatkan-penurunan biasanya x 3.2, 48 jam
antara hewan
 Cari tingkat dosis di mana hasil kebalikan dari
langkah awal diperoleh (kematian atau tidak) -
lanjutkan naik dan turun dari tingkat ini - berhenti
ketika kriteria terpenuhi
 LD50 dihitung (software)

19
 26/04/2017

Acute dermal toxicity OECD

guideline 402
• Disukai tikus, kelinci, marmut

• Setidaknya 3 tingkat dosis, setidaknya 5

hewan dari jenis kelamin yang sama per
tingkat dosis (atau uji batas)

• Mencukur 10% dari permukaan tubuh

setidaknya 24 jam sebelum paparan.

• Sudiaan uji tanpa pengenceran dioleskankasa

berpori ganti seluruh periode paparan 24
jam

• Pedoman EU B3: tikus, kelinci.

Acute dermal toxicity

OECD guideline 402..continue
• Observasi setidaknya 14 hari
termasuk;
• Pengamatan gejala klinis terstruktur
• Berat badan mingguan
• Waktu kematian
• Nekropsi makroskopik.

Perhitungan LD50

20
 26/04/2017

Metode alternatif Non-animal

• In vitro methods and (quantitative) structure-activity

relationship (Q)SAR) models (The Interagency
Coordinating Committee on the Validation of Alternative
Methods, ICCVAM, 2001; ECVAM, 2002; Gribaldo, et al.,
2005).
• In vitro cytotoxicity method (European Centre for the
Validation of Alternative Methods, ECVAM, 2002)
• Some of the in vitro methods were reported to correlate
well enough with the in vivo data "to predict LD50 values
with a reasonable degree of precision" (ECVAM, 2002).
• A prediction model has been developed that can estimate
the equivalent concentrations of a chemical in serum
from the in vitro effective concentrations (Gülden, et al.,
2006).

Table 1. Non-animal test methods for acute systemic

toxicity testing.

Validation
Method Test Purpose OECD TG
Authority
In vitro basal cytotoxicity
Adjunct to in vivo acute
assay: Neutral red uptake
oral toxicity tests for
(NRU) test with rodent cells ICCVAM pending
determining starting
(mouse 3T3 fibroblasts) (3T3
doses
NRU assay)
In vitro basal cytotoxicity
assay: Neutral red uptake Adjunct to in vivo acute
(NRU) test with human cells oral toxicity tests for
ICCVAM pending
(normal human epidermal determining starting
keratinocytes (NHK)) (NHK doses
NRU assay)
Colony Forming Unit- ECVAM
Haematotoxicity test for
Granulocyte/Macrophage (INVITTOX pending
acute neutropenia
(CFU-GM) Assay Protocol)

21
 26/04/2017

Subchronic Toxicity Study

407 Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity study in Rodents

408 Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents

409 Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity in Non-Rodents

410 Repeated Dose Dermal Toxicity: 21/28-Day Study

411 Subchronic Dermal Toxicity: 90-Day Study

412 Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study

413 Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study

Uji Ketoksikan Subkronis

Definisi:
Uji toksisitas subkronis oral adalah suatu
pengujian untuk mendeteksi efek toksik yang
muncul setelah pemberian sediaan uji dengan dosis
berulang yang diberikan secara oral pada hewan uji
selama sebagian umur hewan, tetapi tidak lebih dari
10% seluruh umur hewan (selama kurang dari 3
bulan) (PerKa BPOM, 2014)
Tujuan uji:
Spektrum efek toksik
Kekerabatan antara dosis dan spektrum efek toksik
Evaluasi keterbalikan (reversibilitas) efek toksik

22
 26/04/2017

Toksisitas Dosis Berulang

Prinsip dasar:
 Untuk menentukan efek samping apa yang terjadi pada
paparan berulang (28 atau 90 hari)
 Cakupan yang luas terhadap parameter toksisitas
 Organ sasaran yang terkena efek toksik, kurva dosis-
efek, dan NOAEL / LOAEL
Data hewan uji:
 Spesies yang paling sensitif, uji dengan rute yang sesuai
 Frekuensi dan durasi pemberian (5-7 hari/minggu selama
28 atau 90 hari)
 Pilihan:
• Spesies yang proses biologis mirip dengan manusia
• Penentuan NOAEL: uji 90-hari memiliki tingkat yang
lebih baik daripada uji 28 hari.

Repeated Dose Toxicity 28 or 90-day test

Metode umum:
 5 sampai 10 hewan / jenis kelamin / dosis
 Rute pemberian relevan dg manusia (makanan, minum air,
inhalasi, per oral)
 Satu kelompok kontrol dan kelompok minimal 3 diobati
 Limit test dilakukan dengan dosis 1.000 mg/kg BB
Pengamatan:
 Bobot badan, konsumsi makanan dan minum
 Gejala-gejala klinis
 Hematologi
 Biokimia klinik
 Urinalisis
 Gross nekropsi + bobot organ
 Histopatologi

23
 26/04/2017

Cosmetic Used in Testing

 Lipstick
 Eye Shadow
 Eyeliner
 Mascara
 Foundation
 Hairspray

Personal care & hygiene products are also items

of the ‘cosmetic industry’

Why are these products tested on

animals?
Measure levels of:
 Eye tissue damage
 Skin irritancy
 Toxicity

Caused by numerous substances used in the

manufacture of cosmetics

24
 26/04/2017

Types of Tests
Development: Dr. John Draize and coworkers
at the U.S. FDA in the 1940’s. Standard in vivo
regulatory test for >60 years
 Draize eye irritancy test
 Draize skin irritancy test
 lethal dosage (LD) test

PROCEDURE
 DRAIZE EYE IRRITANCY TEST:
Animal is placed in restraining stocks that hold their heads in
place eyelids are clipped open
Solutions of products are applied
 DRAIZE SKIN IRRITANCY TEST:
Animal is shaved or abraded
Solutions of products are applied to raw skin
Covered with plastic sheeting
 THE LETHAL DOSAGE (LD) TEST:
Animal is restrained
Solutions of products are forced through stomach tubes,
vapor spray inhalers or injection

25
 26/04/2017

Conventional Method- eye

irritation
OECD TG 405 (2002)
OPPTS 870.2400 (EPA, August 1998)

 Test system- albino rabbit

 The substance to be tested is applied in
a single dose to one of the eyes of the
experimental animal; the untreated eye
serves as the control.
 The eyes of the test animals washed
after 24 h following instillation of the
test substance.

Conventional Method- eye

irritation...cont
Dose level:
 Liquids - 0.1 ml
 solids, pastes, and particulate substances - volume of 0.1 ml
or a weight not more than 100 mg.
 Aerosols- test substance administered to the eye in a
burst of about one second, from a distance of 10 cm.

Observations of eye reactions:

Examined at 1, 24, 48 and 72 h after application.
Cornea- Opacity
Iris- congestion, swelling, circumcorneal hyperaemia,
hemorrhages.
Conjunctiva- Redness and hyperaema.

26
 26/04/2017

Conventional Method- skin

irritation
OECD TG 404 (2002)
OPPTS 870.2500 (EPA, August 1998)
 Test system- albino rabbit
 The substance to be tested is applied in a single
dose to the skin of animal; untreated skin areas
of the test animal serve as the control.

 Dose level:
liquid- 0.5 ml
solid or paste- 0.5 g

 Exposure period – 4 h

Conventional Method- skin

irritation
 Application of the test substance
The test substance should be applied to a small area (6
cm2) of skin and covered with a gauze patch, which is
held in place with non-irritating tape.

 Observations of skin reactions

Scored at 60 minutes, and then at 24, 48 and 72 h after
patch removal.

Examined for signs of erythema and oedema

27
 26/04/2017

UN GHS Classification System

(2013)

McNamee P. – In vivo and in vitro evaluation of eye irritation...(2017)

EU CLP Classification System

(2008)
 Classification based on severity and reversibility of effect

McNamee P. – In vivo and in vitro evaluation of eye irritation...(2017)

28
 26/04/2017

Today’s REACH of Alternative

Testing
 Animal testing for REACH- how are we
doing?
 •EU/OECD developments in alternatives
relevant for 2018 (Annex VII and VIII)
 •Does industry need more guidance?

Validation Process on Alternative

Methods

29
 26/04/2017

EU/OECD developments in
alternatives relevant for 2018
1. Skin irritation – in vitro
2. Eye irritation – in vitro
3. Acute toxicity
–Waiving - dermal
–In vitro - oral
4. Skin sensitisation – in vitro

Skin irritation/Corrosion- Available

test methods
 Corrosion (UN GHS cat 1 or NC):
–RhE (OECD TG 431, updated 2014, further revision expected mid 2015)
–TER (OECD TG 430, updated 2013, further revision expected mid 2015)
–Corrositex (OECD TG 435, created 2006, revision expected mid 2015)
Improvement in ability to sub categorise Cat 1
Increase in available models: EpiSkin™ Standard Model (SM) and EpiDerm™
Skin Corrosivity Test, SkinEthic™ RHE1 and epiCS®

 Irritation (UN GHS cat 2 or NC):

–RhE (OECD 439, updated 2013, further revision expected mid 2015)

Increase in available models: EpiskinTM, EpidermTM, Skin EthicTM, LabCYTE EPI

model, epiCS®
Method for dealing with MTT reducers and coloured substances

30
 26/04/2017

Reconstituted Human Epidermis Models

(RHE)

 EpiSkinTM model (L’Oreal, France)

 EpiDermTM model (MatTek Corp., USA)

 SkinEthicTM model (Skinethic, Nice, France)

Predictive capacity of in vitro human

skin models
Assay Sensitivity Specificity
Episkin (MTT endpoint) 75% 81%
Episkin (MTT + IL-1α endpoints) 91% 79%
EpiDerm 57% 84%

(ECVAM, 2007)

Sensitivity - % in vivo irritants correctly identified by assay

Specificity - % in vivo non-irritants correctly identified by assay.

31
 26/04/2017

Skin irritation -performance of the

alternatives
56% concordance with human
patch test

Out of 16 irritants in
the rabbit, only 5 were
irritating to human skin

76% (EpiDerm) and 70% (EPISKIN)

concordance with human patch test
Contact Dermatitis 2010: 62: 109–116

OECD testing strategy

Taken from OECD Guidance Document No. 203

32
 26/04/2017

Skin irritation-Guidance/acceptance
 Appropriate testing strategy outlined in ECHA
Evaluation Report 2010
 ECHA OECD guidelines webpage :
http://echa.europa.eu/documents/10162/21650280/oecd_
test_guidelines_skin_irritation_en.pdf (24/04/2017)
 OECD Guidance Document – IATA . No. 203 (July 2014).
 ECHA R7 guidance update -expected July 2015

 Deletion of ‘in vivo’ requirement in Annex VIII agreed in

principle by CARACAL (Jan 2015)- revised REACH text
expected to be published early 2016- in the meantime
registrants must still use Annex XI adaptation to waive
study (weight of evidence)

Eye irritation- Available test methods

 Serious eye damage (Cat 1 and NC):
– ICE (OECD TG 438, updated 2013)
– BCOP (OECD TG 437, updated 2013)
– STE (OECD TG 490- expected mid 2015)
– Fluorescein Leakage Method (OECD TG 460, created 2012,
Cat 1 only)
Can be used for Cat 1 (top-down strategy) or NC (bottom-up
strategy)
 Not irritating (NC):
–HCE (OECD TG 491- expected mid 2015)
Available as EpiOcularTM Can be used for NC (bottom-up
strategy)

33
 26/04/2017

Eye irritation-performance of the

alternatives
 In-house BASF study of EpiOcular™ -85% accurate with 31 literature
substances and 86% accurate with 29 propriety substances. Altern Lab
Anim. 39 (2011) 365 – 87.
–“The results obtained in this study, based on 60 test substances,
indicate that the EpiOcular-EIT and the BCOP assay can be
combined in a testing strategy to identify strong/severe eye
irritants (Category 1), moderate and mild eye irritants
(Category 2), and non-irritants (No Category) in routine
testing. In particular, when the bottom-up strategy with the 60%
viability cut-off was employed, none of the severely irritating
substances (Category 1) were under-predicted to be non-
irritant. Sensitivity for Category 1/2 substances was 100% for
literature reference substances and 89% for BASF SE proprietary
substances.”
 SkinEthic™ HCE model (OECD TG coming) - 435 consumer product
substances, overall accuracy value > 82% (irritants/non-irritants).
Toxicology in Vitro 24 (2010) 523–537.

Eye irritation- Guidance/acceptance

 ECHA OECD guidelines webpage :
http://echa.europa.eu/documents/10162/2165028
0/oecd_test_guidelines_eye_irritation_en.pdf
(24/04/2017)
 ECHA R7 guidance - expected July 2015
 OECD guidance IATA document in preparation -
expected 2017.
 Deletion of ‘in vivo’ requirement in Annex VIII
agreed in principle by CARACAL (Jan 2015)-
revised REACH text expected to be published
early 2016- in the meantime registrants must still
use Annex XI adaptation to waive study (weight
of evidence)

34
 26/04/2017

Acute toxicity-oral
 In vitro assay (NRU3T3) can be used to
demonstrate lack of oral toxicity (Annex VII):
 NRU3T3 protocol is given by ECVAM as DB-ALM
Protocol n°139. http://ecvamdbalm.jrc.ec.europa.eu
 ECVAM recommends its use in a weight of evidence
assessment to demonstrate non-toxicity:
https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-
recommendations/files-
3t3/ReqNo_JRC79556_lbna25946enn.pdf (April
2017)
 NICEATM/ECVAM validation of the NRU3T3 has
shown it predicts non-toxic substances with 95%
sensitivity

Acute toxicity-dermal
 The dermal toxicity test dapat
diabaikan jika zat tersebut tidak
diklasifikasikan untuk aplikasi/
pemberian rute oral (Annex VIII)

35
 26/04/2017

Acute toxicity-dermal
 The dermal toxicity test can be waived
if the substance is not classified by the
oral route (Annex VIII)
 Removal of the requirement for the dermal
route for non-toxic (LD50>2,000 mg/kg
bw/d) substances was agreed in principle by
CARACAL (July 2014)- revised REACH text
expected to be published early 2016 - in the
meantime registrants must still use Annex XI
adaptation to waive study (weight of
evidence)
 ECHA R7 guidance already permits waiving

Skin sensitisation- Available test

methods
 Sensitiser (Cat 1 and NC)
– Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) (OECD
TG 442c, created 2015)
– ARE-Nrf2 Luciferase Test Method
(KeratinosensTM) (OECD TG 442d, created
2015)
– h-Clat (draft OECD guideline, expected 2016)
– QSARs are also well developed, for lists of
models see http://www.antares-life.eu/
Can be used in isolation to predict Cat 1 or in
combination to predict NC

36
 26/04/2017

GHS Classification Categories for Skin

Sensitiziers

ANIMAL TESTS FOR SKIN

SENSITIZATION

37
 26/04/2017

Skin sensitisation -performance of

the alternatives
LLNA/GPMT is 72% predictive
of human reactions (European
Commission 2000).

Several organisations have assessed the use of the in

vitro tests in combination with accuracies around 90%
(J. Appl. Toxicol. 2013; 33: 1337–1352, Toxicology and Pharmacology 69
(2014) 371–379, Regul Toxicol Pharmacol. 71 (2015):337-51.)

Skin sensitisation -performance of

the alternatives

E.g. BASF study showed that a combination of two out

of three tests gave a reported accuracy of 94%
compared to human data.
Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, (2012), 489 – 504.

38
 26/04/2017

Skin sensitisation-
Guidance/acceptance
 ECHA OECD guidelines webpage:
http://echa.europa.eu/documents/10162/21650280/oec
d_test_guidelines_skin_sensitisation_en.pdf
(24/04/2017)
 Draft OECD guidance document in progress -
expected end 2015
 ECHA R7 guidance update in progress – expected
early 2016
 An option to use the in vitro tests in place of the
LLNA has been agreed in principle by CARACAL (Jan
2015)-revised REACH text expected to be published
early 2016 -In the meantime registrants must use
Annex XI adaptation to waive study (weight of
evidence).

New or revised in vitro test methods

to address Skin corrosion/ irritation

39
 26/04/2017

New or revised in vitro test methods

to address Skin corrosion/ irritation

Sekian
Terima kasih

40