MAKALAH FITOKIMIA

“Pemisahan Secara Elektroforesis”

Disusun Oleh:

Achmad Haris Fattan . M 15330052

Meidinda Ayu Putri 15330127

Siti Nur Fatikhah 16330006

Mayang Willis Kinanthi 16330018

Siti Mutiah 16330037

Jovita Nilfia Arista Laoli 16330116

Rauzatul Ulfa 17330721

INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL

FAKULTAS FARMASI
2018/2019
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadiran Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat
dan karunia-Nya pada kita semua sehingga kami bisa menyelesaikan makalah ini dengan
baik dan lancar. Untuk melengkapi tugas dan menambahkan wawasan dan pengetahuan ilmu
khususnya pada bidang ilmu Fitokimia.

Tak lupa kami ucapkan terima kasih yang sebanyak – banyaknya kepada semua
pihak yang telah berpartisipasi dalam penyusunan makalah ini, kami ucapkan banyak terima
kasih. Semoga segala bantuan dan dukungan yang diberikan kepada kami, mendapat imbalan
yang berlipat dari Allah Subhanahu Wata’ala, amin.

Kami menyadari dalam penulisan makalah ini masih terdapat beberapa kekurangan,
sehingga saran dan kritik yang membangun sangat kami butuhkan dalam penyempurnaan
makalah ini. Atas saran, kritik maupun bantuannya kami ucapkan terima kasih.

Semoga apa yang di tulis di Makalah ini dapat bermanfaat bagi para pembaca.

Jakarta, Oktober 2018

Penyusun

DAFTAR ISI
COVER

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ........................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ...................................................................................... 1
1.3 Tujuan ........................................................................................................ 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori dan Prinsip Pemisahan secara Elektroforesis .................................... 4

2.2 Pemisahan Kerja Elektroforesis ................................................................. 4

2.3 Macam Elektroforesis .................................................................................. 6

2.4 Komponen Utama Alat .............................................................................. 10

2.5 Manfaat ...................................................................................................... 12

BAB III PEMBAHASAN

3.1 Definisi Elektroforesis .............................................................................. 13

3.2 Jenis-Jenis Elektroforesis ........................................................................... 19

3.3 Instrumentasi Elektroforesis ...................................................................... 30

3.4 Aplikasi Elektroforesis .............................................................................. 39

BAB IV PENUTUP

4.1 Kesimpulan ................................................................................................ 42

DAFTAR PUSTAKA

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena
kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi
murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik
pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran .
Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbang akan
selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang
teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler. Bidang
ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode
elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di
bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode
elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang
menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang
bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam
Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa Junani
yangmempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan Swedia Arne
Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan chanrge mereka dalam tabung
berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi
hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel
elektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada
1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang
berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda
elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di
sini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.

1.2 Tujuan
a. Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis
b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis
c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis
d.. Mengetahui kegunaan/ aplikasi elekroforesis

BAB II
 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori dan Prinsip Pemisahan Secata Elektroforesis

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit

menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk
pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam
amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.
keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari
pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al,
2010)

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel koloid
berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan
bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara teknis, elektroforesis
merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan
arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal- bakal elektroforesis
digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis
ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju
pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac 2007). Bufer
elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua
elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002).

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub
yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap
massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan
dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA.

Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel,tanda
dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepadakekuatan
molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahanmolekul dapat
terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

2.2 Prinsip kerja Elektrofoesis

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen

bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (
) pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik".
Hasil yang didapatkandari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan
informasi mengenaiseberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan
migrasi.Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positifakan bergerak
searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalamcampuran terdapat dua jenis
komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2)komponen netral (N), maka komponen
negatif akan bergerak menuju
kutub positif (+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alatelektroforesis
secara sederhana dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut dapat dilihat
komponen yang bermuatan positif akan mengalir kearah kutub negatif, sedangkan komponen
bermuatan negatif akan mengalir kearah kutub positif.

2.3 Macam elektroforesis

Elektroforesis kertas

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fasediam dan
partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ionkompleks.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zatterlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatanion, pH, viskositas,
dan adsorpsivitas zat terlarut.
Sesuai dengan perkembangan ilmu bahan, elektroforesis kertas menjadi fasa pertamadari
perkembangan elektroforesis zona. Dengan menggunakan medium kertas, pemisahan
dan analisis terhadap asam amino, peptida, nukleotida, dan ion-ion logamyang kecil dapat
dilakukan.

Kelemahan penggunaan kertas selulosa asetat adalah: adanya gangguan yangdisebabkan oleh
adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul
polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggudan menjadi lebih rendah (Harjadi
1993). Kelemahan ini dapat diatasi dengan caraasetilasi gugus hidroksil dengan
menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar.Hal ini menyebabkan migrasi molekul
polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses pemisahan berlangsung lebih cepat.

 Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah:

 proses migrasi lebih cepat
 pemisahan spot menjadi lebih kecil
 mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri
 mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit.Pada elektroforesis kertas
selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkandengan cara kering dalam
percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya danspotnya lebih kecil daripada cara
basah. Oleh karena itu, percobaan inimenggunakan medium selulosa asetat.

2. Elektroforesis gel

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diamuntuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan denganmedium gel kanji
(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besarseperti protein-protein.
Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikanagarosa dan poliakrilamida
sebagai gel media.

Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam danfase bergerak
(eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah,sementara fase bergerak
berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kaliditambahkan larutan penyangga
pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objekelektroforesis gel. Elektroda positif dan
negatif diletakkan pada masing-masing ujungaparat elektroforesis gel.
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisielektroda negatif.
Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objekakan bergerak dari
elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-
beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai
pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akanlebih lambat berpindah.

3. Elektroforesis kapiler

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam
amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada
pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940
untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis
farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan
semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan
dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini
dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta
konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros
listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.

Elektroforesis kapiler (CE), juga dikenal sebagai zona elektroforesis kapiler, dapat digunakan
untuk memisahkan spesies ion oleh muatan mereka dan gesekan kekuatan dan radius
hidrodinamika. Elektroforesis , bermuatan listrik bergerak analit dalam konduktif cairan
menengah bawah pengaruh suatu medan listrik . Diperkenalkan pada tahun 1960-an, teknik
elektroforesis kapiler (CE) dirancang untuk spesies terpisah berdasarkan ukuran mereka
untuk mengisi rasio dalam interior sebuah kapiler kecil penuh dengan elektrolit.

Medium pendukung

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid
dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan
asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di
medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu
campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relatif
stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron
(elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.

1. Cellulose asetat

2. Larutan Buffer

Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu : a.

a. Komposisi
Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi
kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat
membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.
b. Konsentrasi
Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan
bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya.
Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga
panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.
c. pH
Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah,
sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga
terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam
aminoyang memiliki sifat asam dan basa.

4. Medan elektrik

Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam
medium.

a. Voltase Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial
antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan
gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
b. Aliran listrik Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan
umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan
meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak
yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.
 c. Tahanan Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis
medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan
bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas
permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

2.4 Komponen utama alat

1. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH tertentu.

2. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas(selulosa asetat, selulosa
nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar.

3. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.

Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi dua:

1. Elektroforesis Planar

2. Elektroforesis Kolom Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena

elektrokinetik, juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa
diam. Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis. Efek
konveksi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti bentuk planar
menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang digunakan dibuat dari silika yang
bermuatan netral atau negatif. Bagian luar kapiler dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur.
Electro Osmotic Flow

(EOF)

Jika kapiler pada elektroforesis diberi tegangan, maka akan terjadi perpindahan muatan ke
arah kutub negatif (-). Perpindahan yang terjadi disebut "electroosmotic flow (EOF)" .
Pergerakan elektrolit yang tidak dipengaruhi oleh EOF disebut "elektroforetik" . Prinsip kerja
EOF dapat dilihat pada gambar berikut.

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa terjadi pemisahan anatara muatan positif dengan
muatan negatif akibat adanya lapis rangkap listrik. Lapis rangkap listrik terjadi akibat
pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler. Sebelum diberi tegangan,
permukaan kapiler akan bermuatan netral, setelah diberi tegangan, maka ion negatif akan
menempel pada permukaan sebagai lapis pertama. Ion positif akan mengikuti ion negatif
membentuk lapisan pada permukaan, dalam hal ini ion positif akan membentuk lapisan
kedua. Sistem ini disebut lapis rangkap listrik. Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi
oleh ukuran, bentuk, serta muatan dari masing-masing komponen.

Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi jika komponen memiliki muatan tinggi dan
ukuran rendah, dengan kata lain memiliki densitas muatan yang tinggi. Densitas muatan
sendiri adalah perbandingan anatara muatan dengan ukuran yang dimiliki oleh suatu
komponen.

2.4 Manfaat

Elektroforesis gel secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran fragmen DNA ,
misalnya dalam pemetaan pembatasan DNA kloning. Metode ini juga digunakan dalam
diagnosis genetika molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis PCR. Elektroforesis gel
agarosa juga digunakan untuk menyelesaikan DNA melingkar dengan perbedaan superkoil
topologi, dan untuk menyelesaikan fragmen yang berbeda karena sintesis DNA. Selain
menyediakan media yang tepat untuk analisis ukuran fragmen, gel memungkinkan
pemurnian fragmen DNA.
 BAB III
PEMBAHASAN

3.1 Definisi Elektroforesis

Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul dalam medium
konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya buffer
berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit dimasukkan ke
dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik diterapkan. Dalam
contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung molekul bermuatan
negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju
elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan mobilitas yang
berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda. sama, ion
bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik diterapkan.(Andreas Manz,
et.al, 2010)

Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010)

Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan
yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. gratis
pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit digunakan. pemisahan ion analit terjadi
karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit
hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran.
pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel
memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang lebih kecil.
ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya dua rasio ukuran yang
sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase
tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda sesuai
dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenen
atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukan mobilitas
elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat
spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara
spontan bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free
boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum
proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan
memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap vertikal
pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien perbedaan
kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu
medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan
temperatur. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap
kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-
butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga-rongga kapiler. Kertas
penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat
dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal
dan interferensi anomali paling kecil pada boundary. Pada umumnya istilah
elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transfor fisik zat
terlarut yang bermuatan didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar,
2008).
Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel
bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub
positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative
(katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan
pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006)
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub
yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya
serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya
Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan(Ricardson dkk. 1986):
 F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan
listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996 ektroforesis adalah suatu cara analisis
kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam
medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986
Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang
dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium
penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen protein tersebut
akan mulai bermigrasi (Ricardsondkk. 1986).
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya
muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika
kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi
mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh
oleh suatu partikel bermuatan sesuai dengan :
𝑈𝑡𝑒 𝑈,𝑉
d= = (persamaan 2.1)
𝑞𝑘 𝐿

dimana V= tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U = Mobilitas

ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang ditempuh (Kopkar, 2008).
Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama: mobilitas
elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas Manz,
et.al, 2010)

a. Mobilitas elektroforesis

Mobilitas elektroforesis μep merupakan parameter spesifik untuk senyawa yang

diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik diterapkan.
senyawa dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain.

Ketika pertukaran ion q diposisikan kedalam medan listrik E, pengalamannya sebuah

gaya listrik Fef:
Fef = q.E (persamaan 2.2)

Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode negative
(katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda negative (anoda).
Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul menengah. gaya ini berbanding
lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi elektroforesis, Vep serta viskositas
medium, ἠ. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Ffr = 6 . ἠ . π . r. Vep (persamaan 2.3)

Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan gaya listrik
(persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan konstan, Vep (persamaan 2.5).

Fef = Ffr (persamaan 2.4)

Vep = q.E (persamaan 2.5)
6. ἠ.π.r
Mobilitas elektroforesis μep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan migrasi Vep
atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). μep lebih sering digunakan daripada VEP
untuk menggambarkan migrasi ion.
μep = Vep / E = q.E (persamaan 2.6)
6. ἠ.π.r

Untuk media pemisahan diberikan viskositas adalah konstan. maka mobilitas

elektroforesis μep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti yang disebutkan
sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas dasar rasio q / r, ketika
mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam medan listrik. perubahan pH
penyangga mengubah muatan suatu analit dan dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas
Manz, et.al, 2010)

b. Aliran elektroosmosis (EOF)

Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti kaca, menyatu
silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan yang paling bioanalitik, pH
buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif yang dihasilkan. Kelompok Silanol (-
SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler
menjadi negatif . Ini menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi
massal. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Dalam penerapan medan listrik kation dilapisan difus bergerak menuju katoda dan
tarik solusi massa l dengan mereka. gerakan ini dari solusi massa l disebut aliran elektro
osmosis. Dalam elektroforesis gel phenomenonof EOF juga disebut sebagai electro
endoosmosis. Kecepatan dari EOF ,VEOF berbanding lurus dengan konstanta dielektrik dan
potensi zeta, dari buffer serta kekuatan medan listrik diterapkan, E.Veof berbanding terbalik
dengan viskositas buffer pemisahan.

𝜺 . ᶊ. 𝑬
VEOF = ( persamaan 2.7)
𝟒 .𝝅.ἠ

μEOF = VEOF /E (persamaan 2.8)

Seringkali arah mobilitas elektroosmosis dari solusi massal adalah melawan arah dari
ionanalit. Ini adalah karena bagi kebanyakan pemisahan biomelecularionanalit bermuatan
negatif dan akan diseret ke arah anoda sedangkan EOF diarahkan katoda.

Profil aliran EOFmemiliki bentuk plug. kecepatan aliran identikatas seluruh diameter
kapiler , kecuali untuk bergerak lebih lambat lapisan difus dekat dengan dinding kapiler.
Distribusi kecepatan homogeneus meminimalkan pelebaran pita dan dengan demikian
meningkatkan efisiensi pemisahan. Situasi yang sangat berbeda terjadi dengan tekanan aliran
didorong digunakan dalam Chromatografy cair. di sini profil aliran para bola kecepatan aliran
memiliki distribusi besaratas diameter kolom. Analit dalam arus tengah jauh lebih cepat dari
pada analit lebih dekat kedinding saluran.Hasil ini dalam pelebaran pita dan hilangnya
efisiensi pemisahan.

Kontrol EOF
Dalam kapiler, eof dapat dikontrol oleh: 1). beroperasi pada pH rendah, 2).
permukaan kimia modification, 3). pelapisan dinamis dinding kapiler misalnya dengan
lapisan polimer atau, 4). menggunakan aditif yang mengubah viskositas, dan potensial zeta.
1). Biaya permukaan dinetralkan dengan mengoperasikan ata pH cukup rendah untuk
protonate kelompok silanol. ini namun hanya terjadi pada pH, 4, pH di mana banyak
biomolekul tidak stabil.
2). Modifikasi kimia dari gugus silanol pada dinding kapiler dapat dilakukan untuk membuat
mereka sangat hydophilic atau sangat hidrofobik. permukaan hidrofilik, diperoleh dengan
pengobatan dengan asam sulfonat, mempertahankan konstan, EOF tinggi. kelompok
fungsional hidrofobik melekat memimpin permukaan penekanan EOF. masalah dengan
modifikasi kimia adalah bahwa stabilitas jangka panjangnya sering sangat redah.
3). Alternatif adalah lapisan dinamis dinding saluran dengan menambahkan polimer seperti
polietilena glikol (PEG) ke buffer run. lapisan polimer kental terbentuk pada dinding
kapiler,yang topeng biaya dan menekan EOF.
4). Aditif netral seperti hidroksil etil selulosa atau Polyvinil alkohol meningkatkan
viskositasbuffer menjalankan dan dengan demikian mengurangi kecepatannya. Selanjutnya,
mereka menekan interaksi permukaan analit. sama, pelarut organik seperti asetonitril
metahnol dan dapat digunakan untuk mengurangi atau meningkatkan viskositas masing-
masing. surfaktan kationik seperti dedocyl trimetilamonium bromidamenyerapke
dindingcapillarlydan dengan demikian mengubahmuatan permukaan. Ini membalikkan arah
EOF. Surfaktan harus digunakan pada konsentrasi rendah untuk menghindari pembentukan
misel, yang dapat mengganggu proses pemisahan.
c. Efisiensi Pemisahan dan Resolusi

Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh aliran

elektroforesis (EOF). Mobilitas nyata μapp dari suatu analit ditentukan oleh jumlah dari
mobilitas elektroforetiknya μep dan mobilitas elektroosmosis μEOF.(Andreas Manz, et.al,
2010)

μapp = μep + μEOF (persamaan 2.9)

Jika EOF mendominasi gerakan elektroforesis, maka semua komponen analit

bergerak menuju katoda. mereka dipisahkan dari satu sama lain karena perbedaan mereka
dalam mobilitas jelas. Kation memiliki μapp tertinggi karena mereka berada diarah yang sama
dengan μEOF. Spesies netral tidak memiliki μep. Karenanya mereka diseret pada kecepatan
dari solusi massal. Anion mencapai katoda terakhir, μepnya menentang arah μEOF.

Kecepatan perpindahan ,V pada analit didefinisikan sebagai produk dari mobilitas

nyatanya , μapp, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8). kekuatan medan, E,
adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L. Karena itu v, dapat dijelaskan
sebagai:

v = μapp . E = (μep + μEOF ) . V / L (persamaan 2.10)

Waktu perpindahan, t, dari analit didefinisikan sebagai panjang kapiler , L, kecepatan

perpindahan ,v. Substitusi v untuk persamaan 3.9 menjadi:

L2

t = L/v = (persamaan 2.11)

μapp . V

Oleh karena itu kekuatan medan listrik lebih besar , E, lebih cepat velocitynya dan lebih
cepat waktu perpindahannya. Pada elektroforesis , pelebaran pita utamanya disebabkan ileh
difusi longitudinal. Distribusi peak τ2 berbanding lurus dengan koefisien difusi, D dari analit
dan waktu perpindahannya.

2 . D. L2

τ2 = 2.D.t = (persamaan 2.12)

μapp. V

Jumlah plat teoritik N, pada elektroforesis dapat dijelaskan dengan:

μapp . V

N = L2 / τ2 = (persamaan 2.13)

2. D

Jumlah plat tidak tergantung pada panjang kapiler dan waktu perpindahan. Tegangan
yang besar mentebabkan peningkatan dalam jumlah yang meningkat. Dalam teori jutaan
pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan elektroforesis membuat teknik ini unggul
dari LC, di mana jumlah plate per kolom biasanya di urutan sepuluh ribu. Dalam prakteknya,
bagaimanapun, plat nomor yang lebih rendah diamati pada elektroforesis. pelebaran pita
disebabkan oleh injeksi sampel dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan yang mengarah
ke plat nomor di urutan ratusan ribu ketimbang jutaan .

Resolusi, Rs, antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas elektroforesis
antara dua spesies, ∆μep (yaitu selektivitas pemisahan), tegangan pemisahan,V, mobilitas
elektrofoersis nyata, μapp , dan koefeisien difusi, D.

1 1
Rs = ∆μep . √𝑉 .√ μ 𝑎𝑝𝑝 . (persamaan 2.14)
4 .√2𝐷

Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah untuk

meningkatkan selektivitas pemisahan∆μep. ini dapat dicapai misalnya dengan mengubah pH
buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis. meningkatkan tegangan pemisahan,
juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi untuk molekul besar seperti ini memiliki koefisien
difusi yang kecil

3.2 Jenis – Jenis Elektroforesis

Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan konvensional yang
telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih canggih atau modern sebagai
penyempurnaan dari metode koinvensional yang sebelumnya. Adapun jenis-jenis
elektroforesis yang dikenal 2 (dua) kelompok teknik elektroforesis, yaitu:
a. Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak / moving
boundary)
Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu
protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai
fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang.
b. Dengan pengemban padat atau matriks seperti:
- Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)
- Elektroforesis Kertas
- Elektroforesis selulosa asetat
- Elektroforesis gel

1. Elektroforesis Zone (Elektroforesis Wilayah)

Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju perpindahan
elektroforesis wilayah, faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion-ion adalah mobilitas
ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat terlarut,
temperatur, ada atau tidaknya fenomena elektroforesis atau elektroosmosis. Medium yang
umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida dan
bubuk gel (Kopkar, 2008).
Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan
komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas
atau konformasi.
2. Elektroforesis Kertas
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di
awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat
itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA
terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang
kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka
menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis
tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis
RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan
‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan
berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas
kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi
tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur
molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida
2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan
mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses
elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan
mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini
terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel
dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan
yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat
terlarut.
3. Elektroforesis Tirai (elektroforesis kontinu),
Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinu. Suatu
tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu larutan buffer. Suatu
aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari suatu
resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua ruang
elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan komponen
terpisahkan dalam berbagai permukaan seperti pada gambar dibawah ini.

Gambar 2.2 Elektroforesis Tirai ( Elektroforesis Kontinu), (Khopkar, 2008)

4. Elektroforesis Gel (GE)
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh
gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran
molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan
zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada
gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-
molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik
sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju
elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru
Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel
berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel
difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,
autoradiogram gel tersebut dibuat.
 Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah
proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita
yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul
yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang
biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda
(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan
untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka
tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut
dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur
gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose
atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.
Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium
bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan
listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan
kecepatannya tergantung dari :
a. Ukuran molekul DNA
b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga
muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-
sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut.
a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui
susunan sekuens berbagai genom
b. DNA Fingerprinting
c. Mendeteksi kelainan genetik.
 d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu
e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau percobaan perlakuan gen
f. Mempelajari evolusi tingkat molecular
g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam
h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein
tertentu.
i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA
plasmid
k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR
Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel elektrik non-
konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi, buffer elektrolit. pori-pori
fungsi gel molekuler saringan, yang menghambat molekul bermigrasi menurut ukuran
mereka. Selanjutnya, gel bertindak sebagai media pendukung anticonvective, yang dapat
meminimalkan difusi dari molekul sampel, dan dengan demikian mengurangi pelebaran pita.
karenanya, nomor plat tinggi dan resolusi tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat
molekul tinggi seperti DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya
dapat dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel, hanya
analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak bermigrasi melalui gel
bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis gel adalah agak lambat dan tenaga
kerja - metode intensif, yang tidak mudah otomatis.

Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam gel native elektroforesis

dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium
dedocylsulfate-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) analit diperlakukan sedemikian
rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk sixe rasio. maka mereka
hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.
 Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE)
Gel Media
Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang umum
digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu : mudah atau cepat
pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul biologic, biaya pemisahan
yang sangat besar.
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan
menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan
dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat
terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik
elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai
adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun
menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel
dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah
model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan
sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.
Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan
menganalisis pemanjangan primer.
 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).

Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa yang dapat
diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa dilarutkan dalam buffer
yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan dituangkan ke dalam tangki elektroforesis.
pada pendinginan gelasi terjadi. pori-pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm
konsentrasi 1% (10 mg mL-1) sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1).
pori-pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam
nukleat. untuk sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.

Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen cross-

linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat
pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang C%

Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagaberikut:

1. Ukuran molekul DNA.
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia
untuk melintasi gel lebih banyak.
2. Konsentrasi gel.
Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar
melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati
gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar
untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.

4. Densitas muatan
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul
dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume
molekul.
5. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,
sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.
 6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut
dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi
DNA akan lebih cepat.

5. Elektroforesis Kapiler (CE)

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi
yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan
pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis kapiler
adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion), baik
bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan
kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju
elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju
anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas atau
gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan berupa campuran
(misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah satu larutan
buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub negatif arus
searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon
dengan kutub positif arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen campuran bermuatan
listrik maka komponen-komponen campuran tersebut bermigrasi ketika arus listrik searah
dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak menuju katoda (kutub
negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif bergerak menuju anoda
(kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang netral tidak bergerak. Hasil pemisahan
elektroforesis konvensional ditunjukan oleh adanya noda-noda berwarna sepanjang media
pemisah(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan sederhana.
Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain
kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat dari noda-noda
tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak
dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk
melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan dengan
cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini
disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan
efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih banyak lagi
untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih
komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan konsentrasi
sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-kendala yang terdapat pada elektroforesis
konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah istilah
elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Aliran Elektroforentik.
Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan, kation akan
bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan bergerak menuju anoda
(kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak akan bergerak. Aliran ion-ion menuju
kutub listrik yang berlawanan ini disebut aliran elektroforetik yang diperlihatkan dalam
gambar 2. Aliran elektroforetik inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam elektroforesa
klasik (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroforetik) (sumber:
L. Thompson, et.al (1997))
Aliran elektroosmotik.
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan media kertas
atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan buffer dipakai sebagai
pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut berkontak dengan larutan dalam
air maka permukaan gelas akan dilapisi anion (SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika
dengan air sehingga permukaan pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-
kation yang berasal dari buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan
kedua pada permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan pipa kapiler
tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan kation yang cepat ke
katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran elektroosmotik diilustrasikan dalam
gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.5. Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroosmotik)

(sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan lebih
dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian secara keseluruhan
aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya semua molekul baik
yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda. Tentunnya ion positif (kation)
bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran
elektroosmotik. Molekul netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling
lambat karena aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen elektroforesis kapiler
diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami konsep gerakan ion-ion atau molekul
netral ke katoda dapat digunakan suatu analogi. Aliran elektroosrnotik dapat dianalogikan
sebagai aliran sungai yang deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan sebagai ikan yang
sedang berenang ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan sebagai ikan yang
sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai ikan mati. Bila air
sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam sungai akan menuju ke
hilir.
Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda dipengaruhi oleh
medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut
 V = 𝜇 ef E + 𝜇 eo E (persamaan 2.15)
V menyatakan kecepatan solut menuju katoda, 𝜇 ef adalah mobilitas elektroforetik, 𝜇 eo adalah
mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis kapiler

(sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Efisiensi Elektroforesis kapiler.
Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor penentu
keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler menyerupai
kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi, semakin tajam suatu
peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dinyatakan dengan formula berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
(𝜇𝑒𝑓 + 𝜇𝑒𝑜) 𝐸
N= (persamaan 2.16)
2𝐷

Seperti dalam persamaan, 𝜇 ef menyatakan mobilitas elektroforetik, 𝜇 ef menyatakan

mobilitas elektroforentik, 𝜇 eo adalah mobilitas elektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang
diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik dan koefisien
difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin efisien pemisahan. Oleh
karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam sistem elektroforesis sangat besar
(10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih cepat berdifusi lambat atau D besar, sebaliknya
molekul besar akan terdifusi lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N) dalam
elektroforesis kapiler berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil
koefisien difusi maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan
semakin baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik
tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai puncaknya
pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak menyebabkan kenaikan
harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi menghilangkan panas yang
ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya efisiensi dalam elektroforesis
konvensional diaktivkan oleh panas yang ditimbulkan oleh tegangan listrik yang
tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

3.3 Instrumentasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel
Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat pendingin dan
komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel. pemisahan dapat dilakukan secara
vertikal atau horizontal. catu daya memberikan tegangan typi xallally 200-500 V dengan arus
listrik cof 400 Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke dalam waduk penyangga di setiap
sisi gel. untuk sebagian pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif.
sehingga analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk
melindungi pengguna dari tegangan tinggi .
Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel
vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan
3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi panjang
tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi
pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam tangki vertikal.
ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang dan lebar sekitar
8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya digunakan.

Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi

kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper
reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan menggunakan
sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam
bentuk pita yang sempit dan lebar

Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue

memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk mengusir
panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan
waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada
divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.
Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk horizontal; c.
bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010)

Preparasi Sampel Dan Sistem Buffer

Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya mengandung gliserol
dan diterapkan pada sumur sampel. untuk menghindari pemblokiran untuk gel sampel pori-
pori harus tidak mengandung partikel padat. konsentrasi tinggi dan garam dan penyangga
dalam sampel dapat mengganggu pemisahan elektroforesis. maka harus dijaga agar tetap
minimum, biasanya, 50 nm. jumlah sampel yang diperlukan tergantung pada metode deteksi,
jumlah khas di ordee g. yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa
berkisar dari L ke Ml

Visualisasi Dan Deteksi

Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan

dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan
adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi
pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh
jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan
perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip dengan
protografhy

Metode Gel Elektroforesis

A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE)

Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran

protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen
anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan
protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing
seperti ᵝmercapto etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan
tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino

B. Isoelektrik Focussing (IEF)

Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti

protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan
pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose
dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.

C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)

Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian
yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan
terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau
asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat
dibandingkan dengan database elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk
mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil
dalam operasi.

2. Instrumen Elektroforesis Kapiler

Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri dari
beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan rekorder(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.8 Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler

(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Pipa Kapiler.
Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti dengan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 𝜇m dan
panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan panjang ternyata
mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler. Hal ini dapat diperhatikan pada
gambar 2.9 dan 2.10
 Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis
kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N (pada gambar
6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka pemisahan semakin tidak efisien.

Gambar 2.10 pengaruh panjang kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis

Kapiler((Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Buffer.
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut tercelup
dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan arus
listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul. Karena sutu molekul dapat bermuatan
positif, negatif atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat
menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan
elektroforesis. Hal ini dapat ditunjukan pada gambar 2.11

Gambar 2.11 Pengaruh pH buffer terhadap selektivitas pemisahan peptide dengan

elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Sumber arus.
Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt tapi dalam
elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi 10.000-30.000 Volt
seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju katoda berbanding dengan tegangan
listrik. Oleh karena itu tidaklah mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler dapat
dilakukan dalam beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional dilakukan
mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi efisiensi
pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4.
Sistem Pemasukan Cuplikan
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa kapiler
yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat
dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan elektrokinetika yang masing-
masing dapat diformasi dengan persamaan.
∆𝑝𝜋4𝑡𝐶
Q= (persamaan 2.17)
8𝜂𝐿
𝜇𝑒𝑓 + 𝜇𝑒𝑜)
Q=( (persamaan 2.18)
𝐿

Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua ujung pipa
kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran tegangan listrik, C adalah
konsentrasi cuplikan, 𝜂 adalah visikositas, 𝜇 ef dan , 𝜇 eo, kuata rus, dan L adalah panjangh pipa
kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan ke dalam cuplikan maka dengan gaya kapilaritas
cuplikan akan terisap dengan sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di antara kedua
ujung pipa kapiler. Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali ke dalam
larutan buffer. Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa saat ketika
salah satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah cuplikan
akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan mempengaruhi efisiensi
elektroforesis kapiler pada gambar 2.12 dan 2.13.

Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak dancyl

leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.13 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap efisiensi (N)

(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Detektor.
Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah yaitu kekatoda
maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian detektor dapat diletakan di salah
satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda. Berbagai detektor telah digunakan untuk
mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain spektrometri (seperti UV, dan
Fluoresen) dan detektor elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri). Detektor UV
diperlihatkan dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa kapiler yang terbuat dari
gelas silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini memungkinkan pendeteksian aliran
komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak perlu mengganggu aliran komponen
hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15 dapat digunakan dalam elektroforesis
kapiler dengan teknik penggunaan yang sama detector UV, detektor elektrokimia pada
gambar 2.16.

Gambar 2. 14 Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati sinar UV
maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya yang diserap oleh
solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.

Gambar 2. 15 Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

 Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

3.4 Aplikasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel (GE)
Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang ditunjukkan pada
gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan untuk visualisasi asam nukleat.
Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar pencampuran dijalankan secara paralel.
Standar pencampuran mengandung molekul dengan dasar berpasangan panjangnya.
Pemisahan pattern dikandung dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder.
Jumlah dasar berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan pita
ke pita dalam barisan DNA.
 Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari Genomic
DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida
2. Elekroforesis Kapiler (CE)
Analisis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar daripada
molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode CE dan HPLC
diperlihatkan pada gambar 2.17.

Gambar 2.17 Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode ( A) CE dan B

(HPLC) (sumber Anal, chem. 61, 1188, 1989)

Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE dilakukan pada

pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer dalam buffer citrate.
Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8 (220 x 2 mm) dengan fas gerak
0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan
jumlah peak yang lebih banyak daripada peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi
yang lebih baik daripada HPLC untuk pemisahan peptide.
Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :
1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang
memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam
mengungkap sebuah kasus.
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.
Kelebihan dan Kekurangan dalam Elektroforesis

Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana, digunakan untuk

memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. Akan tetapi memiliki
keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan
berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat arus
searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan tegangan
listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan noda hasil
pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan tegangan
listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi tidak
terlalu jelas memisah.
 BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit

menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk
pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam
amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.
keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari
pemisahan elektroforesis.
Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel
bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub
positif (anoda). Sebaliknya, partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative
(katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak Jadi medan listrik menyebabkan pemisahan
pada metode elektroforesis.
Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah), elektroforesis kertas,
elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah
gel agarosa dan Gel poliakrilamida elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam
berbagai bidang, misalnya :di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan
DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu
polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.Memudahkan identifikasi
protein yang terdapat pada sebuah DNA.
 DAFTAR PUSTAKA

Andreas Manz, et.al, 2010, “Bioanalytical Chemistry” published by Imperial College Press,
London

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi +
175 hlm.

Richardson, b. J, p. R. Baverstock and m. Adams 1986. Allozyme electro- phoresis. A

handbook for animal sys- tematics and population studies. Aca- demic press, inc. San diego :
410 pp. Sambrook, j. & d. W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual vol 2.
3rd ed. Cold spring harbour laboratory press, new york: xvii + 3.4--14.53 + 1.44

Rothe, g. M. 1995. Electrophoresis of enzymes. Springer - verlag. Berlin heidelberg: 278 pp.
Hlm.

S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.

Sumar Hendayana , PH.D. 2006, “ Kimia Pemisahan Metode kromatografi dan Elektroforesis
Modern “ PT. Remaja Rosdakarya.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing

Company, Belmont: xvii + 820 hlm.