VIII.

PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan penetapan kadar zat aktif dalam materi
biologis, yaitu teofilin dalam sampel urin manusia dengan metode Kromatografi
Lapis Tipis-Spektofotodensitometri. Penetapan kadar teofilin dalam urin
dilakukan karena teofilin memiliki indeks terapi yang sempit sehingga perlu
dilakukan therapeutic drug monitoring (TDM) terhadap penggunaan teofilin
secara klinis untuk memastikan kadar teofilin dalam tubuh berada pada kisaran
terapetik dan untuk menghindari efek toksik (Flanagan et al., 2005). Dalam
sediaan farmasi, teofilin merupakan suatu metabolit sekunder golongan alkaloid
yang memiliki efek farmakologi bronkodilator, yaitu perangsang SSP yang kuat
dan merelaksasi otot polos terutama bronkus (Ganiswarna, 1995).

Penetapan kadar teofilin dilakukan dengan menggunakan sampel urin.

Digunakan urin manusia karena pengambilan sampel urin juga tidak menyakitkan
dan pengambilan sampel urin tidak memerlukan peralatan khusus (misalnya
spuite) seperti pada pengambilan sampel darah, pengambilan cuplikan dari data
urin juga memberikan proses analisis pemisahan sampel yang mudah karena tidak
terdapat protein yang terlarut di urin seperti pada plasma (Shargel and Yu, 2005).
Dalam praktikum ini sampel urin yang digunakan merupakan sampel urin
simulasi dengan penambahan larutan teofilin sehingga tidak akan dijumpai
metabolit-metabolit teofilin dalam urin simulasi karena teofilin yang ditambahkan
tidak mengalami proses fisiologis (metabolisme) di dalam tubuh manusia.
Sebelum penetapan kadar, dilakukan preparasi sampel urin yaitu menggunakan
metode ekstraksi cair-cair yang bertujuan untuk memisahkan senyawa teofilin dari
matriksnya yaitu urin yang dikhawatirkan dapat mengganggu proses analisis.
Kemudian dilakukan pemisahan dari metabolit yang lebih spesifik dengan
menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis, dimana teofilin merupakan
senyawa yang dapat berpendar (fluoresensi) pada panjang gelombang tertentu
yang dapat dilihat dari struktur kimianya yang rigid (kaku) dan kromofor yang
diperpanjang (Gandjar dan Rohman, 2007). Selanjutnya kadar analit diukur
densitasnya dengan menggunakan metode spektrofotodensitometri (Moffat et al.,
2005).
 Penetapan kadar teofilin dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu,
pembuatan larutan stok teofilin sulfat 1 mg/mL, larutan baku teofilin, larutan seri
konsentrasi 100 ng/µL, 200 ng/µL, 300 ng/µL, 400 ng/µL dan 500 ng/µL, larutan
uji, larutan sampel, preparasi sampel dengan metode ekstraksi cair-cair,
pemisahan dengan KLT dan analisis dengan spektrofotodensitometer. Tahap
pertama adalah pembuatan larutan stok dan larutan seri. Pelarut yang digunakan
dalam pembuatan larutan adalah metanol. Metanol merupakan pelarut yang dapat
melarutkan alkaloid dalam bentuk garam dan basa, sehingga metanol dapat
melarutkan teofilin yang merupakan senyawa alkaloid. Larutan seri merupakan
larutan yang dibuat menggunakan senyawa baku yang murni, pembuatan larutan
seri bertujuan untuk membuat kurva kalibrasi sehingga dapat digunakan dalam
penentuan regresi linier pada penetapan kadar sampel. Hal yang menjadi
pertimbangan dalam pemilihan konsentrasi larutan seri adalah konsentrasi larutan
sampel yang diperkirakan berada dalam rentang seri yang dibuat, sehingga
validitas konsentrasi sampel yang dibuat dapat dipercaya melalui linieritas kurva
kalibrasi larutan seri. Selanjutnya dilakukan pembuatan larutan uji dan larutan
sampel, dimana dalam praktikum ini sampel urin yang digunakan merupakan
sampel urin simulasi dengan penambahan larutan teofilin dari larutan stok yang
telah dibuat.
Kemudian dilakukan preparasi sampel yang ditujukan untuk membuat
sampel berada dalam bentuk yang dapat diaplikasikan pada instrumen analisis
yang digunakan, terbebas dari matriks-matriks atau pengotor, dan berada dalam
kadar yang sesuai untuk deteksi dan pengukuran (Settle, 1997). Proses preparasi
sampel diawali dengan pemipetan masing-masing 2 mL larutan uji dan larutan
sampel ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan 1 tetes NH4OH
agar pH larutan mencapai 9-10 untuk menjadikan larutan dalam suasana basa agar
nantinya dapat dideteksi dengan spektrofotodensitometri pada panjang gelombang
absorbansi maksimum teofilin dalam larutan basa (275 nm) (Mohammad et al.,
2014).

Pada pemisahan dengan KLT maka tahap awal yang dilakukan adalah
pengkondisian plat. Plat KLT dicuci terlebih dahulu dengan menggunakan
metanol untuk menghilangkan pengotor yang mungkin menempel pada
permukaan silika ketika penyimpanan plat. Setelah pencucian dilakukan aktivas
plat dengan tujuan untuk menghilangkan sisa metanol yang masih menempel pada
plat dan mengaktifkan sisi aktif dari gugus silanol. Aktivasi dilakukan selama 10
menit pada suhu 110oC (Gandjar dan Rohman, 2007). Suhu ini dipilih untuk
mengurangi kandungan air pada plat KLT karena air memiliki titik didih 100 0C.
Apabila digunakan suhu lebih rendah, maka air akan susah menguap dan apabila
digunakan suhu yang lebih tinggi, dikhawatirkan akan merusak gugus silanol
yang terdapat pada plat. Sedangkan waktu 10 menit dipilih agar tidak merusak
plat sehingga plat menjadi kering, mudah retak, maupun bengkok. Setelah aktivasi
plat dilakukan penotolan larutan seri, sampel, dann uji dengan konsentrasi yang
telah ditentukan dengan menggunakan pipet 2 µL dengan tujuan untuk
mengoptimalkan totolan yang sekecil-kecilnya karena penotolan yang menyebar
atau terlalu banyak akan menghasilkan pemisahan yang kurang baik seperti
terbentuknya puncak ganda ketika dianalisis dengan densitometri.
Sebelum plat dielusi, dilakukan penjenuhan chamber terlebuh dahulu.
Tujuannya adalah untuk meratakan tekanan uap yang ada dalam chamber
sehingga proses elusi dapat berlangsung dengan baik. Pengelusian selanjutnya
dilaukan secara ascending hingga batas pengembangan. Pada saat pengelusian,
totolan tidak boleh terendam dalam fase geraknya, karena apabila totolan
terendam maka larutan yang ditotolkan dapat larut bersama fase geraknya.
Pemisahan akan terjadi sesuai dengan afinitas analit terhadap fase diam dan fase
gerak yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Setelah proses elusi selesai plat diangin-anginkan dan dianalisis
menggunakan metode Spektrofotodensitometri. Spektrofotodensitometer
merupakan suatu instrumen yang digunakan untuk analisis suatu senyawa dengan
intensitas radiasi yang direfleksikan pada permukaan lempeng ketika disinari
dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap
sinar akan dicatat sebagi puncak (peak) oleh pencatat (recorder). Plat KLT yang
berisi analit hasil pemisahan dianalisis menggunakan densitometri dimana proses
scanning dilakukan dengan metode absorpsi. Teofilin merupakan senyawa obat
yang mampu berfluoresensi kuat akibat dtrukturnya yang kuat dan kaku (rigid)
serta gugus kromofornya yang panjang. Scanning pada praktikum kali ini
dilakukan pada panjang gelombang eksitasinya yaitu 275 nm. Dari data absorpsi
pada panjang gelombang eksitasi akan diperoleh nilai Rf dan AUC dari spot seri,
sampel, dan uji.

Perhitungan kadar teofilin dapat diketahui melalui persamaan regresi linier

yang diperoleh dari kurva kalibrasi larutan seri teofilin. Senyawa teofilin
terdeteksi pada Scanning di gelombang 275 nm. Harga Rf memiliki nilai yang
mirip antar totolan tetapi nilai Rf tidak sesuai dengan pustaka.ketidaksesuaian ini
dapat disebabkan karena kondisi percobaan yang berbeda. Berdasarkan nilai AUC
diperoleh persamaan regresi linier y = 18,257 x + 3509,2 dengan nilai R 0,99994
Rendahnya nilai AUC sampel dan uji menunjukkan rendahnya efisiensi metode
ekstraksi yang digunakan. Rendahnya kadar teofilin yang terekstraksi disebabkan
karena karena proses ekstraksi cair-cair yang tidak sempurna dan juga akibat
tertinggalnya analit pada dinding-dinding wadah yang digunakan. Rendahnya
kadar teofilin yang didapat juga dipengaruhi oleh konsentrasi penotolan yang
sedikit yaitu 2 mikro sehingga teofilin hanya sedikit terdapat pada plat. Pengaruh
dari pergantian fase gerak akuabides menjadi akuades yang digunakan juga
mempengaruhi harga Rf dari teofilin yang sangan besar dan jauh dari harga Rf
teofilin standar sesuai pustaka.
Dalam praktikum kali ini juga dilakukan validasi metode. Parameter
validasi yang diguakan pada praktkum kali ini adalah akurasi, presisi, linieritas,
range, LOD, dan LOQ. Berdasarkan kadar sampel yang diperoleh, diketahui
bahwa larutan tersebut sudah memasuki rentang LOD dan LOQ sehingga larutan
tersebut dapat dideteksi dan dikuantifikasi tetapi hasil perolehan recovery nya
tidak memasuki rentang 98-102% sesuai dengan persyaratan yang telah
ditentukan, Apabila kadar teofilin dalam sampel berada dibawah nilai LOD maka
senyawa teofilin tidak dapat dideteksi dengan menggunakan metode yang
dilakukan pada praktikum ini.
 DAFTAR PUSTKA

Flanagan, Sean et. Al Biomechanics of heel raise exercise. Jurnal of aging and
physical activity 2005 ; Human Kinetics Publishers Inc.

Gandjar, I. G. dan A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.

Ganiswarna, S., 1995, Farmakologi dan Terapi, edisi IV, 271-288 dan 800-810,
Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.

Moffat, C.A., M. D. Osselton, and B. Widdop. 2011. Clarke’s Analysis of Drugs

and Poisons, In Pharmaceuticals, Body Fluids, and Postmortem Material
3rd Edition. London: Pharmaceutical Press.

Settle, F. A. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical

Chemistry. New Jersey: Prentice-Hall Inc.

Shargel, L., Yu, A., and Wu, S., 2005, Biofarmasetika dan Farmakokinetika
Terapan, Edisi kedua, Airlangga University Press, Surabaya. 167 – 187.