Anda di halaman 1dari 5

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Jenis, Lokasi dan Waktu Penelitian


Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen. Penelitian ini dilaksanakan
pada bulan Februari sampai dengan bulan April 2019 yang bertempat di Laboratorium
Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.

3.2. Bahan dan Alat


Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas jam, autoklaf,
timbangan analitik, laminar air flow cabinet (LAFC), pH meter, hot plate dan
magnetic stirrer, gelas ukur, gelas beker, erlenmeyer, pipet tetes, mikropipet, pipet
volumetric, scalpel dan mata pisau, pinset, spatula, bunsen, cawan petri, corning,
tube, hand sprayer, kompor, sentrifugase, jarum ose, loop, filter sterilize, suntikan,
panci, penggaris, gunting, pengaduk, corong, kertas label, lemari pendingin, rak kultur
yang dilengkapi dengan lampu neon sebagai sumber penyinaran, dan alat tulis.
Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah benih padi
varietas Fatmawati, bakteri A. tumefaciens strain LBA4404 yang membawa plasmid
pCAMBIA1300 yang telah disisipi gen folat (CGH1) (Gambar 3), konstruksi gen
diperoleh dari Dr. Tri Joko Santoso, SP, M.Si (Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor), media LB
(Luria Bertani), media MS (Murashige and Skoog), PPM (Plant Perspektif Medium),
glukosa, asetosiringon, cefotaxime, kanamisin, higromisin, magnet, larutan HCl,
larutan NaOH, alkohol 70%, alkohol 96%, sodium hypochlorite (NaOCl), betadine,
gula (sukrosa), agar, tissue, aquades steril, kertas saring, aluminium foil, dan plastik
wrap.
Cat-1 Intron
MCS
Hyg-R
pr35S tNOS prUbi1
LB T-DNA t35S RB T-DNA

Gen OsCGH1

Kpnl Sacl
1.200 bp

Gambar 3. Diagram konstruksi plasmid vector ekspresi pCambia1300-OsCGH1


Sember : Susiyanti et al., ( 2018)
3.3. Metode Penelitian
3.3.1. Rancangan Lingkungan
Penelitian ini dilakukan dengan metode transformasi gen secara in planta. Rancangan
lingkungan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL)
yang yang disusun secara faktorial. Faktor pertama adalah tanpa dan pemberian medan magnet
(A) dan faktor kedua adalah konsentrasi higromisin (B), dimana masing-masing perlakuan
diulang sebanyak 3 kali.

3.3.2. Rancangan Perlakuan


Penelitian ini terdiri atas dua faktor. Faktor pertama yaitu tanpa dan pemberian medan
magnet yang terdiri 2 taraf yaitu :
a1 : Tanpa Medan Magnet
a2 : Medan Magnet
Faktor kedua yaitu konsentrasi higromisin yang terdiri dari 3 taraf yaitu :
b1 : Higromisin 25 mg/L
b2 : Higromisin 50 mg/L
b3 : Higromisin 75 mg/L
b4 : Higromisin 100 mg/L
Dengan demikian terdapat 8 kombinasi perlakuan yang masing-masing diulang sebanyak
3 kali sehingga terdapat 24 satuan percobaan. Dalam satu satuan percobaan terdapat 5 eksplan
sehingga total eksplan yang digunakan adalah 120 eksplan.

3.3.3. Rancangan Analisis


Model linier yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
Yijk = μ + αi + βj + (αβ) ij + εijk
Dimana :
Yijk : Nilai pengamatan faktor medan magnet taraf ke-i dan faktor konsentrasi higromisin
taraf ke-j dan ulangan ke-k
μ : Nilai tengah umum
αi : Pengaruh perlakuan tanpa dan pemberian medan magnet ke-i, dimana i = 1, 2.
βj : Pengaruh perlakuan konsentrasi higromisin ke-j, dimana 7 = 1, 2, 3, 4.
(αβ)ij : Pengaruh interaksi perlakuan tanpa dan pemberian medan magnet taraf ke-i dan
perlakuan konsentrasi higromisin taraf ke-j
εijk : Pengaruh galat perlakuan tanpa dan pemberian medan magnet taraf ke-i dan perlakuan
konsentrasi higromisin taraf ke-j dan pada ulangan ke-k
i : 1,2, (Taraf tanpa dan pemberian medan magnet)
j : 1,2,3,4 (Taraf konsentrasi higromisin)
k : ulangan 1,2,3.
Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan menggunakan analisis sidik ragam. Apabila
hasil sidik ragam menunjukkan pengaruh nyata sampai sangat nyata maka dilakukan uji lanjut.
Dalam penelitian ini digunakan uji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT)
pada taraf 5 %.

3.3.4. Rancangan Respon


Respon yang diamati pada metode transformasi secara in planta, diantaranya :
1. Efisiensi Transformasi (%)
Efisiensi transformasi didefinisikan sebagai jumlah eksplan lolos media seleksi
dibandingkan dengan total eksplan yang ditransformasi. Pengamatan dilakukan pada tahap
akhir seleksi. Persentase efisiensi transformasi dihitung dengan rumus:
Jumlah eksplan tahan higromisin
𝑥 100%
Total eksplan
2. Lethal Dosis 50% (LD50) Higromisin
Pengamatan uji lethal dosis 50% (LD50) higromisin dilakukan pada akhir tahap seleksi
eksplan padi. Dengan menentukan dosis higromisin yang dapat mengakibatkan lethal dosis atau
kematian 50% dari total eksplan. Kecambah yang tidak berkembang atau berubah warna menjadi
cokelat atau hitam menunjukkan kondisi yang mati.

3.4. Pelaksanaan Penelitian


Transformasi genetik secara in planta menggunakan bahan tanam berupa skutelum dengan
mengikuti prosedur Supartana et al. (2005) dengan modifikasi. Transformasi genetik secara in
planta dilakukan secara bertahap sebagai berikut :
1. Persiapan dan Sterilisasi Eksplan
Benih padi varietas Fatmawati yang digunakan pada metode ini adalah benih masak. Benih
padi yang digunakan sebagai eksplan dicuci bersih dan direndam selama 20 menit pada larutan 2
g/l detergent, 2 g/l fungisida, dan 2 g/l bakterisida. Setelah itu benih dibilas dengan aquades.
Benih padi dikupas lalu dibawa ke LAF (laminar air flow) kemudian disterilkan kembali dengan
sodium hypoclorit selama 50 menit. Setelah itu benih dibilas dengan akuades steril. Sebagai
penutup benih padi sebelum ditanam benih direndam dalam larutan betadine sebanyak 2-3
tetes/100 ml (Sumadji et al., 2014 dengan modifikasi). Selanjutnya benih direndam dalam air
steril selama 2 hari pada suhu 20oC. Air diganti sekali selama proses perendaman. Setelah 2 hari
perendaman, bagian embrio akan berubah menjadi putih (Suparthana et al., 2014). Pada tahap ini
di lakukan perlakuan dengan pemberian medan magnet dan tanpa magnet. Magnet yang
digunakan adalah magnet yang berbentuk I. Magnet tersebut diletakkan diatas rak kultur,
sebelumnya rak kultur disterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol 70% yang dilap
dengan tisu. Magnet yang akan diletakan juga disterilisasi terlebih dahulu dengan alkohol 70%
dan dibersihkan dengan tisu. Perlakuan pemberian medan magnet ini di lakukan sampai tahap
seleksi.
2. Kultur bakteri Agrobacterium tumefaciens.
Bakteri Agrobacterium tumafaciens strain LBA4404 yang membawa plasmid
pCAMBIA1300 yang mengandung gen folat (CGH1) ditumbuhkan pada media LB padat yang
mengandung 100 mg/l kanamisin selama 2 hari sebelum digunakan. Koloni tunggal bakteri
diambil dari cawan petri dan ditumbuhkan pada 5 ml media LB cair + 100 mg/l kanamisin.
Bakteri diinkubasi pada 28oC dalam keadaan gelap selama satu malam dengan penggoyangan
150 rpm. (Puranamaningsih, 2012 dengan modifikasi). Suspensi bakteri ditumbuhkan pada
media LB padat + 50 mg/l kanamisin + 50 mg/l higromisin dengan cara suspense bakteri diambil
kemudian di streak menggunakan loop, bakteri diinkubasi pada suhu 28oC selama 3 hari.
Sebelum digunakan untuk transformasi, bakteri dilarutkan terlebih dahulu dalam aquades steril.
Bakteri diambil dengan menggunakan loop/spatula dan disuspensi dalam 1 ml aquades steril dan
ditambahkan 100 µM. Selanjutnya diukur OD600 dengan menggunakan spektrofotometer.
Kepadatan sel bakteri yang digunakan untuk transformasi in planta adalah OD600=0,3 (Sianturi,
2012).
3. Inokulasi bakteri A. tumefaciens pada Meristem Apikal Embrionik Padi
A. tumefaciens diinokulasikan ke dalam embrio dengan menusukkan jarum steril
(kedalaman 1-1,5 mm) kemudian direndam ke dalam inokulum A. tumefaciens. Benih padi yang
telah diinokulasi diletakkan diatas kertas saring di dalam cawan petri Benih padi didalam cawan
petri ini selanjutnya diinkubasi dalam ruang tertutup selama 5 hari. Pada masa inkubasi ini 70-
75% benih padi akan berkecambah yang selanjutnya kecambah-kecambah padi tersebut di
rendam dalam larutan mengandung cefotaksim (300 ppm) selama 1 jam pada suhu ruang
(Suparthana et al., 2014 dengan modifikasi).
4. Seleksi Kecambah Tahan Higromisin
Benih yang telah berkecambah dipindahkan ke botol kultur yang mengandung media MS0
+ 300 mg/L cefotaksim dengan perlakuan antibiotik higromisin dengan konsentrasi 25 mg/L, 50
mg/L, 75 mg/L dan 100 mg/L. Setelah itu diinkubasi selama berumur 7 hari, dengan
ditambahkan pelakuan pemberian medan magnet dan tanpa magnet (Sianturi, 2012 dengan
modifikasi). Planlet tanaman padi yang lolos media seleksi dapat dijadikan indikator tanaman
padi putative transforman.
5. Pasca Seleksi
Setelah keluar dari tahap seleksi, tanaman padi putative transforman kemudian
ditumbuhkan pada media MS0 untuk pengakaran dan selanjutnya tanaman padi dapat di
aklimatisasi (Ningtyas, 2013).