Anda di halaman 1dari 9

GUIDING QUESTION : TUGAS 1C

Diajukan untuk memenuhi tugas mata kuliah Bioteknologi

Kelompok 1
Anggota :
Faza Aulia Maulana 150510170199
Theresia A Saragih 150510170172
Zakka Tafwidh Mubarok 150510170019
Edo Kelvin Simanjutak 150510170149

Kelas:
Agroteknologi C

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2019
TUGAS 1C

1. Kenapa harus menggunakan teknik transfer gen untuk memperoleh biji padi/beras yang
mengandung beta karoten?
Sebuah strategi untuk mengurangi risiko kekurangan vitamin A yang tinggi dalam
negara adalah membentengi makanan pokok utama, beras, dengan provitamin A melalui
pemuliaan tanaman. Hal ini hanya dapat dicapai dengan rekombinan teknologi daripada
dengan pemuliaan konvensional, karena tidak adanya kultivar padi yang memproduksi
provitamin A dalam endosperm. Kedua karena transformasi beras stabil dan biosintesis
karotenoid seluruh jalur molekuler telah diidentifikasi baru-baru ini, itu sepertinya layak
untuk memperkenalkan jalur lengkap biosintesis provitamin A (β-karoten) ke endosperm
beras melalui rekayasa genetik.
2. Gen apa dan berasal dari mana saja yang diinsersikan ke dalam tanaman padi tsb?
Golden rice diciptakan oleh transformasi padi dengan dua karoten biosintesis gen-beta :
 Psy yang mengkode pembentukan enzim phytoene sintase dari daffodil
(Narcissus pseudonarcissus) pada Golden Rice prototype dan Golden Rice 1 atau
psy dari jagung (Zea Mays) pada Golden Rice II
 Crtl yang mengkode enzim carotene desaturase dari tanah bakteri Erwina
uredovora
 Penyisipan gen Lcy (Lycopene cyclase) dari daffodil (Narcissus pseudonarcissus)
dianggap diperlukan, tetapi penelitian lebih lanjut menunjukkan hal itu sudah
diproduksi dalam jenis padi endosperma-liar dan keberadaan gen psy juga crti
telah mampu menyelesaikan jalur biosintesis downstream xanthophyl
3. Dengan teknik transfer gen yang seperti apa, gen-gen asing tersebut bisa disisipkan?
Dengan menggunakan plasmid Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor.
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah gram positif yang bersifat
fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri tersebut secara alami mempunyai kemampuan
untuk mentransfer potongan DNA yang kemudian dikenal dengan T- DNA.
4. Bagaimanakah cara mengkonstruksi gen beta carotene yang akan digunakan?
Cara mengkontruksi gen beta carotene adalah dengan terlebih dahulu mengetahui dan
paham mengenai komponen-komponen dalam jalur biosintesis beta carotene secara lengkap
dan mencari tahu komponen mana yang tidak ada atau menjadi permasalahan di dalam
endosperma padi. Perlu diketahui juga perangkat pendukung konstruk gen target sebagai
sekuens transkripsi seperti promoter,terminator dan marker selektif.
Di dalam biji padi terdapat bahan dasar (prekusor) untuk bioseintesis karotenoid,
termasuk beta-karoten, yaitu geranyl geranyl diphosphate (GGDP). Namun secara alami biji
padi tidak menghasilkan phytoene karena terjadi penghambatan fungsi dari enzim phytoene
synthase (PHY) dalam mengubah GGDP menjadi phytoene. Meskipun demikian,
penghambatan fungsi enzim tersebut bisa dihilangkan dengan cara mengintroduksi gen PHY
dari tanaman daffodil (bunga narsis/bakung) dengan menggunakan promoter spesifik untuk
endosperma. Selain PHY dan Ctrl, masih ada satu enzim lagi yang diperlukan untuk
mengubah lycopene menjadi beta-karoten yaitu lycopene cyclase (LYC) yang juga berasal
dari tanaman daffodil.
Namun penelitian baru menunjukkan bahwa gen psy dari graminae (jagung,padi) mampu
meningkatkan jalur biosintesis beta carotene dan penyisipan gen LCY tidak diperlukan
dikarenakan telah ada secara alami dalam endosperma padi dan keberadaan gen psy juga crti
telah mampu menyelesaikan jalur biosintesis downstream xanthophyl.
5. Plasmid apa yang digunakan?
Plasmid Ti yang digunakan merupakan plasmid yang disolasi dari Agrobacterium
tumifaciens, antara lain :
 Prototype : transformasi pB19hpc, co-transformasi pZPsc dan pZLcyH
 Golden Rice I : co-transformasi pOGR011
 Golden Rice II : transformasi pSYN12424
6. Selectable marker gene apa yang digunakan?
 Prototype : pB19hpc (aphIV dan nptII), pZPsc dan pZLcyH (aphIV)
aphIV : gen hygromycin phosphotransferase diisolasi dari E.coli, resistan
terhadap antibiotic higromycin
nptII : gen Neomycin phosphotransferase resistan terhadap antibiotic kanamycin
 Golden Rice I : pOGR011
Menggunakan co-transformasi dan penghilangan marker selektif
 Golden Rice II : pSYN12424 (PMI)
PMI: gen phosphomannose-isomerase dari E.coli,mampu mengkonversi mannose-
6-phosphate ke fructose-6-phosphate
7. Teknik insersi apa yang digunakan untuk memasukkan plasmid DNA ke dalam tanaman?

1. Tanaman diinokulasi dengan bakteri Agrobacterium Tumefaciens


2. Tanaman memberikan sinyal berupa komponen fenolik yang dikenali oleh protein Vir
A pada kapsul bakteri Agrobacterium Tumefaciens
3. Aktivasi Vir A mengaktifkan pula protein VirG melalui phosphorilasi
4. VirG mengaktivasi transkripsi sekuens vir pada Ti-plasmid bakteri menghasilkan
produk VirD1 dan VirD2
5. Protein VirD memotong sekuens 25bp pada setiap ujung DNA target mengasilkan
untai tunggal T-DNA yang terikat dengan protein VirD2 di salah satu ujungnya
6. VirD2 bersama untai tunggal T-DNA masuk secara langsung ke dalam sel tanaman
melalui proses yang mirip dengan proses konjugasi pada bakteri
7. Di dalam nucleus sel tanaman, T-DNA berintegrasi dengan genom tanaman

8. Langkah/prosedur apa saja yang harus disiapkan untuk merakit tanaman transgenik?
a. Identifikasi gen yang mengekspresikan sifat yang diinginkan.
b. Pembuatan DNA rekombinan dan cloning DNA

- Kloning gen yang diinginkan dengan PCR.


- Menentukan vector (biasanya plasmid) yang sesuai.
- Menentukan enzim restriksi yang kompatibel untuk memotong gen yang
diinginkan ataupun plasmid, pastikan bahwa enzim restriksi tersebut hanya
berada pada MCS plasmid sehingga tidak dapat memptong daerah lain.
- Menyatukan gen yang dikehendaki dengan plasmid menggunakan enzim ligase.
- Multiplikasi DNA rekombinan (bisa dilakukan melalui bakteri Agrobacterium
tumafaciens atau dengan PCR).
c. Seleksi plasmid hasil cloning gen
Seleksi plasmid dilakukan untuk mamastikan bahwa plasmid yang telah menajdi DNA
rekombinan berhasil multiplikasi di dalam sel bakteri. Seleksi ini dapat dilakukan jika
sebelumnya telah diinsersikan gen resisten antibiotic ke dalam plasmid sehingga ketika
bakteri ditumbuhkan dalam media yang mengandung antibiotic maka hanya sel bakteri
yang mengandung plasmid yang akan tumbuh.
d. Insersi DNA rekombinan ke dalam sel tanaman.
Insersi dapat dilakukan dengan teknik bakteri Agrobacterium tumefaciens, teknik gene
gun, mikroinjeksi, elektroforensis, microinjection, dll.
e. Menumbuhkan tanaman transgenic

9. Bagaimana cara menyeleksi tanaman pada tahap invitro dan tahap pertanamanan di lapangan?
Secara in vitro tanaman dapat diseleksi dengan melakukan aklimatisasi atau
penumbuhan klon yang akan diseleksi dalam medium selektif. Cara lain yang dapat
dilakukan adalah dengan seleksi molekuler menggunakan teknik blotting.
Seleksi tanaman pada tahap pertanaman di lapangan menggunakan seleksi fenotipik atau
seleksi penampilan tanaman.

10. Teknik molekuler apa yang digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa tanaman yang kita
peroleh itu benar-benar tanaman transgenik?

Dengan menggunakan teknik blotting yaitu teknik untuk menapis klona bakteri. Dengan
metode ini peneliti dapat mendeteksi sekuens nukleotida di dalam sampel DNA yang
kompleks.

1. Preparasi Fragmen Restriksi


Setiap sampel DNA dicampur dengan enzim restriksi yang sama. Digesti dari
setiap sampel menghasilkan campuran dari ribuan fragmen restriksi
2. Elektrofiresis Gel
Fragmen restriksi pada setiap sampel dipisahkan melalui elektroforesis,
membentuk pola pita yang khas
3. Transfer DNA (blotting)
Dengan gel yang disusun mulai dari bawah yaitu larutan alkali, spons, gel,
membrane nitroselulose, tisu dan beban berat, daya kapilaritas menarik larutan
alkalin ke atas kea rah gel, mentransfer DNA ke membrane nitroselulosa,
menghasilkan blot. DNA terdenaturasi dalam proses ini (versi lain dapat
menggunakan arus listrik untuk mempercepat transfer DNA). Untai tunggal DNA
yang menempel ke nitroselulosa membentuk pita pita yang sesuai pada gel
4. Hibridisasi dengan kuar radioaktif
Blot nitroselulosa dipaparkan ke larutan yang mengandung kuar berlabel
radioaktif. Kuar berpasangan basa dengan fragmen yang mengandung sekuens
DNA target.
5. Deteksi Kuar
Selembar film fotografik diletakkan diatas blot. Radioaktivitas dalam kuar terikat
akan terpapar ke film sehingga terbentuk citra yang sesuai dengan pita pita
pengandung DNA yang berpasangan basa dengan kuar.
Daftar Pustaka

Al-babili, S., dan Peter Beyer. 2005. Golden Rice- Five Years on the Road- Five Years to Go?.
Germany. http://www.goldenrice.org/PDFs/Al-Babili_Beyer_TIPS_2005.pdf

Al-babili, S., dkk. 2000. Engineering the Provitamin A (Beta Carotene) Biosynthetic Pathway
Ino (Caratenoid-Free) Rice Endosperm. Academic Research Library.
http://www.goldenrice.org/PDFs/Ye_et_al_Science_2000.pdf

Pine, dkk. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through Q1 increased pro-
vitamin A content. http://www.goldenrice.org/Content2-How/how1_sci.php

Golden Rice website http://www.goldenrice.org/

Artikel Golden Rice http://www.goldenrice.org/PDFs/Al-Babili_Beyer_TIPS_2005.pdf

BB Biogen. 2011.Padi Emas: Salah Satu Jawaban untuk Kebutuhan vitamin


Ahttp://biogen.litbang.pertanian.go.id/wp/wp-content/uploads/kalins-pdf/singles/padi-emas-
salah-satu-jawaban-untuk-kebutuhan-vitamin-a.pdf

Campbell, Reece. 2010. BIOLOGI. Penerbit Erlangga : Jakarta