PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK

Disusun Oleh:

Taruni Sri Prawasti

Yohana C. Sulistyaningsih
Dorly
Berry Juliandi
Juliarni

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN IPA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

1
 Kata Pengantar

Buku penuntun praktikum Mikroteknik ini merupakan tulisan yang disusun untuk memenuhi
kebutuhan para mahasiswa yang mengikuti praktikum mata ajaran Mikroteknik di Jurusan Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Buku penuntun ini
diharapkan dapat memberi bekal teori dan petunjuk-petunjuk kelancaran pelaksanaan praktikum.

Materi yang terkandung dalam buku ini merupakan kumpulan dari acara-acara praktikum yang
disusun berdasarkan topik perkuliahan meliputi penyiapan sediaan mikroskopis jaringan hewan dan
tumbuhan, pengenalan mikroskop elektron dan fotomikroskop.

Penyusun mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan
buku penuntun praktikum ini.

Bogor, Agustus 2014

Penyusun

iii
iv
 Daftar Isi

Kata Pengantar iii

Daftar Isi v
Materi Hewan:
SEDIAAN APUS (SMEAR) 1
SEDIAAN UTUH 2
MASERASI HEWAN 3
SEDIAAN SAYATAN 4
PEWARNAAN NISSL 5
HISTOKIMIA 6
SEDIAAN UTUH (WHOLE MOUNT) HEWAN 7
Materi Tumbuhan:
WHOLE MOUNT TUMBUHAN 9
SEDIAAN SEGAR MITOSIS TUMBUHAN 10
SEDIAAN SEGAR MIOSIS TUMBUHAN 11
SEDIAAN PERMANEN MITOSIS & MEIOSIS TUMBUHAN 12
MASERASI TUMBUHAN 13
HISTOKIMIA TUMBUHAN 14
SEDIAAN IRISAN TUMBUHAN 15
PENGENALAN MIKROSKOP ELEKTRON PAYARAN (Scanning Electron Microscope) 17
PENGENALAN FOTOMIKROSKOP (Optiphot-2) 18

v
vi
 SEDIAAN APUS (SMEAR)

Tujuan : Membuat sediaan olesan dari substansi berupa cairan.

Bahan : Darah, ikan, katak, cicak, burung, dan tikus; Protozoa dalam kultur, protozoa
komensal.
Metode : Smear (apus) tipis.
Cara kerja :
A. Darah
1. Ambil darah dengan spuit yang berisi heparin.
2. Teteskan pada gelas obyek bersih.
3. Buat apus tipis dengan bantuan gelas obyek yang lain, kemudian kering
anginkan.

a. Teteskan darah pada gelas obyek A, pasang gelas obyek B di kiri tetes
darah membentuk sudut 45° dengan A.
b. Tarik gelas obyek B ke kanan sampai menyentuh tetesan darah.
c. Setelah terbentuk kapiler, dorong gelas obyek B dengan cepat ke kiri.
d. Apus darah pada gelas obyek A.
4. Fiksasi dengan metanol 5 menit.
5. Kering anginkan.
6. Warnai dengan pewarna Giemsa 3% selama 30 menit (Giemsa stock = 30%,
encerkan pada saat akan dipakai).
7. Cuci dengan akuades.
8. Kering anginkan.
9. Periksa dengan mikroskop perbesaran 1000x.

B. Protozoa dalam kultur atau Protozoa dalam garam fisiologis

1. Teteskan cairan yang mengandung Protozoa pada gelas obyek.
2. Periksa dengan mikroskop apakah Protozoa yang dimaksud ada.
3. Goyangkan agar terbentuk lapisan tipis pada gelas obyek.
4. Kering anginkan.
5. Celupkan pada akuades.
6. Fiksasi dengan alkohol 70% 2-3 menit.
7. Warnai dengan pewarna hemaktosilin 1% dalam air 1-2 menit.
8. Cuci dengan air.
9. Dehidrasi dengan etanol bertingkat.
10. Penjernihan dengan xilol.
11. Tutup dengan perekat entellan.

1
 SEDIAAN UTUH

Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh.
Bahan : a. Cacing pipih
b. Kutu
c. Bentos
Pewarna : Carmine alum.
Eosin 1% dalam air.
Cara kerja :
A. Cacing pipih
1. Cacing dijepit di antara 2 gelas obyek, ikat dengan karet.
2. Masukkan ke fiksatif (etanol 70% atau formalin 4%) 2 x 24 jam.
3. Lepaskan cacing dari gelas benda, fiksir lagi beberapa jam.
4. Cuci. Jika fiksatifnya etanol 10%, cuci dengan etanol 50%, lalu dengan akuades.
Jika fiksatifnya formalin 4%, cuci dengan akuades.
5. Warnai dengan eosin 1% akuosa 24 jam atau carmine alum 3-4 jam.
6. Cuci dengan air.
7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat. Etanol 30%, 50%, 70%. 95%, 100%,
masing-masing 15 menit.
8. Penjernihan dengan lactophenol 30 menit dan xilol 2 x 15 menit.
9. Tempel pada gelas obyek dengan perekat entellan.

B. Kutu, pinjal
1. Kutu, pinjal, difiksasi dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam.
2. Pindahkan ke KOH 10%. Lama penyimpanan dalam KOH tergantung ketebalan
kutin dari spesimen (pinjal ±6 hari, kutu ±1 hari).
3. Cuci dengan akuades.
4. Dehidrasi dengan etanol 50%, 70%, 95%, 100% masing-masing 10 menit.
5. Pindahkan ke minyak cengkeh sampai tampak jernih (±15-30 menit).
6. Pindahkan ke xilol 110 menit, lalu xilol II10 menit.
7. Atur di atas gelas obyek, tutup dengan perekat entellan.

C. Bentos
1. Bentos yang sudah bersih difiksasi dengan etanol 70% minimal 24 jam.
2. Cuci dengan akuades.
3. Warnai dengan eosin 1% dalam air 24 jam.
4. Cuci dengan air.
5. Dehidrasi dengan etanol bertingkat, masing-masing 10 menit.
6. Penjenuhan dengan xilol 2x15 menit.
7. Letakkan pada gelas benda dan ditutup dengan entellan.

2
 MASERASI HEWAN

Bahan : Tulang ayam

Sediaan : Penampang bujur tulang ayam.
Metode : Maserasi - gosok.
Cara kerja :
1. Potongan tulang dimaserasi (direndam) dalam air 2 x 24 jam.
2. Keringkan dalam oven.
3. Potong dengan gergaji halus (membujur).
4. Tempelkan pada kayu.
5. Gosok pada batu pengasah atau amplas halus sampai tipis.
6. Tempel pada gelas obyek.

3
 SEDIAAN SAYATAN
Tujuan : Membuat sediaan sayatan organ hewan.
Bahan : Organ hewan (jantung, usus, ovarium, dan sebagainya).
Metode : Parafin
Cara kerja :
1. Hewan dibius dengan kloroform atau eter, bedah dan ambil organ yang
diperlukan.
2. Organ yang akan diproses dicuci dengan garam fisiologis.
3. Potong dengan pisau tajam dengan ukuran kira-kira ½ cm.
4. Fiksasi dengan larutan FAAAC atau Bouine minimal 24 jam (tergantung jenis
organ dan ukurannya).

Komposisi FAAAC Komposisi Bouine

Formalin 40% 100 ml Formalin 15 ml
Asam asetat glasial 50 ml Asam pikrat jenuh 5 ml
Akuades 850 ml Asam asetat glasial 1 ml
CaCI2.2H20 13 gram

5. Pencucian: larutan fiksatif dibuang dan dicuci beberapa kali dengan akuades.
6. Dehidrasi: dengan etanol bertingkat 30%, 50%, 70%, 95%, 100% masing-
masing 15-30 menit tergantung organ yang diproses.
7. Penjernihan: dengan xilol 30 menit. Apabila belum transparan, waktu
penjernihan ditambah.
8. Infiltrasi: jaringan dimasukkan ke dalam infiltran
 Parafin:xilol (1:1) 30 menit
 Parafin I 30 menit
 Parafin II 30 menit
 Parafin III 30 menit
Semua langkah infiltrasi dikerjakan di dalam oven. Parafin yang dipakai harus
sama dengan titik lebur parafin untuk embedding.
9. Embedding: cetak blok parafin dalam kotak-kotak dan atur letak/posisi organ
sesuai dengan tujuan.
10. Penyayatan:
 Blok dipasang pada holder, rapikan, sisi atas sejajar dengan sisi bawah.
 Holder dipasang pada tempatnya di mikrotom putar.
 Sayat dengan ketebalan 6 μm.
11. Penempelan: Tempelkan sayatan pada gelas obyek dengan perekat entellan.
12. Pewarnaan: pewarnaan ganda hemaktosilin - eosin.
 Deparafinasi dengan xilol 3x5 menit.
 Masukkan ke etanol 95%, 80%, 70%, 50% masing-masing beberapa
celupan.
 Masukkan ke zat warna hemaktosilin aquosa ±2 menit.
 Cuci dengan air.
 Masukkan ke etanol 30%, 50%, 70%.
 Warnai dengan eosin 1% dalam etanol 70% 1-2 menit.
 Dehidrasi dengan etanol bertingkat 70%. 80%, 95%, 100% beberapa
celupan.
 Penjernihan dengan xilol 2x5 menit.
 Tutup dengan gelas penutup dengan perekat entellan.

4
 PEWARNAAN NISSL

Tujuan : Melakukan pewarnaan Nissl dengan thionine, yang secara spesifik mewarnai
DNA dan substansi Nissl (RNA) untuk mempelajari struktur umum otak mencit.
Dasar : Pewarnaan Nissl dikembangkan oleh Franz Nissl (1860-1919) saat ia
mempelajari patologi sel-sel di otak. Dengan metode ini, DNA dan RNA yang
bermuatan negatif akan berwarna biru, sehingga dapat memberikan gambaran
umum struktur suatu organ secara cepat. Oleh sebab itu, pewarnaan Nissl
menjadi terkenal dan digunakan secara luas di kalangan peneliti yang
memerlukan kajian histologi dalam penelitiannya. Pewarnaan ini pun memiliki
beragam zat warna yang dapat digunakan seperti zat warna aniline, cresyl
violet, dan thionine.
Bahan : Awetan otak mencit (irisan koronal tebal 50 μm).
Metode : Nissl.
Cara kerja :
1. Awetan otak mencit yang telah diiris dengan mikrotom, disusun pada gelas
objek. Letakkan sekitar 4-6 irisan per gelas objek. Gunakan PBS atau larutan
buffer lainnya untuk mempermudah penyusunan. Biarkan mengering di suhu
ruang atau di dalam inkubator 37 °C. (Pastikan preparat benar-benar kering
dan menempel pada gelas objek!)
2. Cuci preparat dengan akuades selama 1 menit.
3. Untuk dehidrasi dan pengektraksian lipid dari preparat, lakukan perendaman
dalam etanol bertingkat secara berurutan: 50% (3 menit), 70% (3 menit), 95%
(3 menit), 95% (3 menit), 100% (3 menit), dan 100% (3 menit).
4. Rendam dalam xylene 2 kali @ 3 menit.
5. Untuk persiapan pewarnaan dan rehidrasi preparat, lakukan kembali
perendaman dalam etanol bertingkat secara berurutan: 100% (1 menit), 100%
(1 menit), 95% (1 menit), 95% (1 menit), 70% (1 menit), dan 50% (1 menit).
6. Cuci kembali preparat dengan akuades selama 1 menit.
7. Warnai dengan thionine 0.1% (w/v) pH 4.0 selama 2-5 menit. Amati dengan
seksama perkembangan warna preparat! Segera lanjut ke langkah 8 bila warna
preparat telah dianggap cukup gelap.
8. Cuci preparat dengan air mengalir hingga sisa aliran sudah tidak mengandung
pewarna.
9. Cuci kembali preparat dengan akuades selama 1 menit.
10. Untuk re-dehidrasi preparat, lakukan kembali perendaman dalam etanol
bertingkat secara berurutan: 50% (1 menit), 70% (1 menit), 95% (1 menit), 95%
(1 menit), 100% (1 menit), dan 100% (1 menit).
11. Rendam kembali dalam xylene 2 kali @ 3 menit.
12. Tutup preparat dengan gelas penutup yang telah diberi Permount.
13. Amati preparat dengan mikroskop cahaya.
Catatan :
1. Gunakan pipet untuk meletakkan larutan ke atas preparat secara perlahan.
2. Gunakan suction pump untuk membersihkan larutan yang telah selesai
digunakan dari atas preparat.

5
 HISTOKIMIA

Tujuan : Melihat adanya glikogen dalam sediaan melintang hati mamalia.

Bahan : Sayatan hati.
Metode : Parafin dengan pewarnaan khusus best carmine
Cara kerja :
1. Siapkan larutan yang akan dipakai.

Hemaktosilin Harris
Hemaktosilin 1 gram
Alkohol absolut 10 ml
Ammonium (potassium) alum 20 gram
Akuades 200 ml
Merkuri oksida 0,5 gram

Best carmine (stock)

Carmine 2 gram
Kalium karbonat 1 gram
Kalium klorida 5 gram
Akuades 60 ml
Amoniak 20 ml

Semua (kecuali ammonia) dimasak jadi satu selama 5 menit. Dinginkan,

kemudian tambahkan ammonia. Selanjutnya simpan dalam botol berwarna
gelap di dalam lemari es.

Hemaktosilin Harris
Larutan baku 2 bagian
Amoniak 2 bagian
Metil alkohol 3 bagian

Best carmine (stock)

Metil alkohol absolut 40 ml
Etil alkohol absolut 80 ml
Akuades 100 ml

2. Deparafinasi.
3. Sediaan dibawa ke kondisi akuades.
4. Warnai dengan hemaktosilin Harris 2 menit.
5. Cuci dengan air ledeng.
6. Selama preparat masih dalam air ledeng, buatlah larutan pewarna best
carmine tepat sebelum digunakan. Masukkan larutan best carmine tersebut ke
dalam staining jar yang tertutup agar amoniak dan metil alkohol yang terdapat
di dalamnya tidak menguap. Tinggalkan preparat dalam larutan ini selama 5-10
menit.
7. Masukkan segera dalam larutan pendiferensiasi. Selama diferensiasi,
tebal/tipisnya zat warna harus diperhatikan.
8. Selanjutnya masukkan ke dalam alkohol absolut, diganti-ganti sampai 2-3 kali.
Tinggalkan dalam alkohol absolut yang ketiga selama 2 menit.
9. Jernihkan dalam xilol atau toluene, kemudian mounting dengan kanada
balsam.

6
 SEDIAAN UTUH [WHOLE MOUNT) HEWAN

Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh.
Bahan : Semut, cacing pipih (Sagitta), embrio ayam.
Cara kerja :
A. Semut
1. Fiksasi semut dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam.
2. Dehidrasi dengan etanol bertingkat 80%, 95%, dan 100% masing masing
selama 10 menit.
3. Jernihkan dengan minyak cengkeh selama 5 menit.
4. Pindahkan ke xilol selama 2x5 menit. Xilol berfungsi sebagai penjernih dan
sebagai medium pelarut entellan.
5. Atur di atas gelas obyek, tetesi dengan entellan sebagai perekat.
6. Tutup dengan gelas penutup, biarkan sampai kering.

B. Cacing pipih (Sagitta)

1. Cacing yang bergelombang (tidak lurus) harus dijepit di antara gelas objek
kemudian difiksasi dengan etanol 70% atau formalin 4% minimal 2 x 24 jam.
2. Lepaskan cacing dari gelas benda dan fiksasi lagi selama beberapa jam.
3. Apabila fiksatifnya adalah etanol 70%, cuci dengan etanol 50% kemudian bilas
dengan akuades. Apabila fiksatifnya adalah formalin 4%, cuci dengan akuades.
4. Warnai dengan eosin 1% dalam air selama beberapa jam, tergantung kepada
hewannya.
5. Cuci dengan air.
6. Dehidrasi dengan etanol bertingkat 30%, 50%, 70%, 95%, dan etanol absolut
masing-masing selama tiga sampai lima menit.
7. Jernihkan dengan laktofenol selama 30 menit dan silol selama 2 x 10 menit.
8. Letakkan di atas gelas obyek.
9. Tutup dengan gelas penutup dengan perekat entellan.

C. Embrio ayam
1. Telur diteropong untuk melihat posisi titik embrio.
2. Tandai bagian yang berembrio dengan pensil.
3. Telur diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 36°C selama 24 jam, 36 jam, dan
48 jam.
4. Teropong telur untuk melihat apakah embrio berkembang.
5. Gunting cangkang pada bagian yang telah ditandai.
6. Tempelkan cincin kertas saring mengelilingi embrio.
7. Gunting selaput embrio di sekeliling luar cincin kertas saring.
8. Angkat embrio dengan pinset.
9. Cuci dengan garam fisiologis.
10. Fiksasi dengan larutan Bouine selama 30 menit.
11. Cuci dengan etanol 70%.
12. Warnai dengan eosin 1% dalam etanol 70% selama lima menit.
13. Cuci dengan etanol 70%, dehidrasi dengan etanol 80%, 95%, dan 100% selama
masing-masing 10 menit.
14. Jernihkan dengan xilol selama 2 x 10 menit.

7
 15. Letakkan embrio pada gelas benda cekung dan tutup dengan gelas penutup
dengan perekat entellan.

D. Whole mount tungau dengan perekat polyvinil laktofenol

Larutan laktofenol: Larutan polyvinil laktofenol:

Aquades 1 bagian Larutan polyvinil alkohol 15% dalam air 2 bagian
Asam laktat 1 bagian Asam laktat 1 bagian
Phenol jenuh 1 bagian Larutan fenol jenuh 1 bagian
Gliserin 2 bagian

1. Tungau difiksasi dengan etanol 70% minimal 24 jam.

2. Jernihkan dengan laktofenol (± 24 jam, tergantung besar kecilnya tungau).
3. Letakkan tungau pada gelas obyek.
4. Ditutup dengan gelas penutup dengan perekat polyvinil laktofenol.
5. Biarkan mengering.

8
 WHOLE MOUNT TUMBUHAN

Tujuan : Membuat sediaan organisme/bagian tumbuhan secara utuh.

Bahan : Daun dari suatu spesies tanaman (sayatan paradermal) dan alga.
Metode : Gliserin-xilol
Cara kerja :
1. Fiksasi: daun di fiksasi dalam alkohol 70% selama 24 jam Sedangkan algae
difiksasi selama 24 jam di dalam komposisi larutan berikut ini:

Formaldehid 5 bagian
Asam asetat glasial 2 bagian
Akuades 93 bagian

2. Pencucian: larutan fiksatif dibuang, diganti dengan akuades beberapa kali.

3. Daun dilunakkan dengan merendamnya di dalam larutan HN03 25% selama ,
15-30 menit.
4. Sebelum dibuat sayatan paradermal, daun dicuci terlebih dahulu dengan
akuades.
5. Pewarnaan: sayatan epidermis daun diwarnai dengan pewarna tunggal yaitu
safranin 1% (aquosa) selama 24 jam, sedangkan alga diberi pewarna ganda
yaitu safranin 1% (aquosa) selama 24 jam dan fast-green 0.5% (dalam etanol
95%) selama 10 menit.
6. Dehidrasi: bahan direndam di gliserin bertahap yaitu gliserin 10% dan 25%
(ditaruh pada wadah terbuka selama beberapa hari hingga gliserin menjadi
murni). Untuk mempercepat proses ini, bahan dapat disimpan di dalam oven
(suhu 35-40°C) dijaga bahan jangan sampai kering. Kemudian bahan dicuci dan
gliserin dengan etanol 95% 2 kali masing-masing selama 15 menit. Untuk alga
diwarnai dengan pewarna fast-green 10 menit. Selanjutnya kedua bahan
tersebut direndam dalam etanol absolut selama 10 menit.
7. Dealkoholisasi: bahan direndam dalam campuran etanol absolut dan xilol
dengan perbandingan berturut-turut 1:1 dan 1:3 masing-masing selama 5
menit Selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan xilol murni sebanyak 2 kali,
masing-masing tahap selama 10 menit.
8. Penutupan: bahan diberi media entellan atau canada balsam dan ditutup
dengan gelas penutup.
9. Pemberian label: label ditempel pada sisi kiri gelas obyek.

9
 SEDIAAN SEGAR MITOSIS TUMBUHAN

Bahan : Ujung akar bawang merah dan bawang bombai.

Metode : Remasan (squash).
Cara kerja :
1. Persiapan material: umbi bawang merah ditumbuhkan di kapas lembap dan
bawang bombai ditumbuhkan di dalam wadah botol yang berisis air sampai
bawang mengeluarkan akar.
2. Pra-perlakuan: Ujung akar terpilih (ujung akar utuh dan berwarna putih susu)
dipotong sepanjang 1-2 cm , dicuci bersih dan dimasukkan ke dalam botol
/tabung film hitam yang berisi larutan 0,002 M 8-hydroxyquinolin( lalu
disimpan pada suhu 20°C (lemari es) selama 3-5 jam.
3. Pencucian: akar dicuci dalam air mengalir beberapa kali.
4. Fiksasi: akar setelah dicuci bersih direndam dalam larutan asam asetat 45%
selama 10 menit.
5. Maserasi: akar dimasukkan ke dalam larutan maserasi berupa campuran HC1 1
N dan asam asetat 45% dengan perbandingan 3:1 kemudian diletakkan pada
penangas (waterbath) pada suhu 60°C selama 1 menit.
6. Pewarnaan: akar diletakkan pada gelas arloji dengan posisi konsentris yaitu
bagian ujung akar diletakkan di pusat gelas arloji, kemudian ditetesi aceto
orcein dan dibiarkan selama 30 menit sambil ditutup dengan cawan petri agar
pewarna tidak menguap.
7. Pemencetan (squash): ujung akar dipotong ±1-2 mm, diletakkan pada gelas
obyek lalu ditetesi 1-2 tetes aceto orcein baru. Kemudian spesimen diberi gelas
penutup dan dilewatkan di atas lampu spiritus sambil dirasakan hangat kuku di
kulit tangan. Gelas obyek diletakkan di atas kertas tissu, lalu dipukul-pukul
halus dengan pensil berkaret hingga sel-sel pecah dan menyebar rata. Terakhir
bahan ditekan halus dengan ibu jari lalu dihangatkan lagi.
8. Pengamatan: spesimen diamati di mikroskop pertama-tama dengan
pembesaran obyetif lemah (10x) guna melihat keseluruhan sel. Setelah
diperoleh sel-sel terpilih diamati dengan perbesaran kuat (40x). Preparat yang
bagus akan dijadikan preparat permanen.

10
 SEDIAAN SEGAR MIOSIS TUMBUHAN
Bahan : Kepala sari bunga lili (Lilium sp.) dan bunga Rhoeo discolor.
Metode : Remasan (squash).
Cara kerja :
1. Fiksasi: sejumlah kuncup bunga lili dan Rhoeo discolor dikumpulkan, kemudian
segera ke dalam larutan fiksatif Carnoy/Farmer selama ± 24 jam atau disimpan
di dalam lemari es jika lebih dari 24 jam. Komposisi fiksatif Carnoy dan Farmer
masing-masing sebagai berikut:

Fiksatif Carnoy: Fiksatif Farmer:

Etanol absolut 6 bagian Etanol absolut 3 bagian
Kloroform 3 bagian Asam asetat glasial 1 bagian
Asam asetat glasial 1 bagian

2. Salah satu kuncup bunga dari botol penyimpanan dipilih.

3. Diseksi dan pelunakan: selama diseksi, kuncup bunga diletakkan di gelas arloji
yang berisi larutan fiksatif yang baru. Anter bunga lili dan Rhoeo discolor
diambil lalu direndam dalam larutan HCI 1 N selama 5-10 menit.
4. Pewarnaan: anter bunga lili dan Rhoeo discolor diletakkan pada gelas arloji,
kemudian ditetesi aceto orcein dan dibiarkan selama 30 menit sambil ditutup
dengan cawan petri agar pewarna tidak menguap.
5. Pemencetan (squash): PMC bunga lili dan anter bunga Rhoeo discolor
diletakkan pada gelas obyek lalu ditetesi 1-2 tetes aceto-orcein baru,
dihaluskan dengan skalpel/jarum kemudian ditutup dengan gelas penutup dan
dilewatkan di atas lampu spiritus sambil dirasakan hangat kuku di kulit tangan.
Gelas obyek di letakkan di atas kertas tissu, lalu dipukul-pukul halus dengan
pensil berkaret hingga sel-sel pecah dan menyebar rata. Terakhir bahan
ditekan halus dengan ibu jari lalu dihangatkan lagi.
6. Pengamatan: preparat diamati di mikroskop dengan pembesaran lensa
obyektif 10x, 45x, dan 100x. Pinggiran gelas penutup diberi kutek (cat kuku)
supaya tidak kering. Preparat yang menunjukkan hasil yang memuaskan akan
dibuat preparat permanennya.

11
 SEDIAAN PERMANEN MITOSIS & MIOSIS TUMBUHAN

Bahan : Preparat segar mitosis akar dan miosis bunga.

Metode : Mc-Clintock
Cara kerja :
1. Pelepasan gelas penutup: gelas obyek yang berisi preparat mitosis dan miosis
direndam dalam petridish yang berisi larutan asam asetat 45%. Dengan
bantuan pinset gelas obyek dipisahkan dari gelas penutupnya. Obyek
(preparat) yang melekat baik pada gelas obyek maupun gelas penutup dibuat
preparat permanennya.
2. Dehidrasi: gelas obyek/gelas penutup direndam dalam seri campuran asam
asetat glasial dan etanol absolut dengan perbandingan 1:3 dan 1:9 masing-
masing selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan dengan merendam dalam etanol
absolut selama 3 menit.
3. Dealkoholisasi: preparat direndam dalam campuran larutan etanol absolut dan
xilol dengan perbandingan 1:1 selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan
perendaman sebanyak 2 kali dalam xilol murni masing-masing selama 3 menit.
4. Perekatan (mounting): sediaan berupa gelas obyek yang berisi preparat
ditetesi entellan, ditutup dengan gelas penutup secara hati-hati. Sedangkan
sediaan berupa gelas penutup yang berisi preparat ditempelkan pada gelas
obyek baru yang telah ditetesi entellan. Selanjutnya dikeringkan pada pemanas
(hotplate) suhu 40°C.
5. Pemberian label: pada sisi kiri gelas obyek direkatkan label.

12
 MASERASI TUMBUHAN

Tujuan : Membuat sediaan dengan cara menghancurkan lamela tengah yang

menghubungkan antara satu sel dengan sel lainnya sehingga diperoleh
gambaran bentuk utuh dari sel-sel tersebut.
Bahan : Batang kayu tanaman: Bauhinia sp. dan Pinus sp.
Metode : Schultze.
Cara kerja :
1. Potongan kayu dipotong kecil sebesar korek api.
2. Potongan-potongan tersebut direbus dalam larutan asam nitrat (HNO3) pekat
yang ditambah sedikit kristal kalium klorat (KCI03) sampai bahan berwarna
putih dan lunak.
3. Material di cuci dengan air mengalir.
4. Material dihancurkan dengan gelas pengaduk hingga sel-sel terlepas.
5. Warnai dengan safranin 1% selama 24 jam.
6. Cuci dengan air (material diendapkan dengan cara sentrifugasi).
7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat: etanol 30%, 50%, 70%, 95%, 100%,
masing-masing selama 10 menit (dibantu dengan sentrifugasi).
8. Dealkoholisasi menggunakan campuran etanol dan xilol bertingkat dengan
perbandingan 3:1,1:1,1:3 dan larutan xilol murni masing-masing selama 5
menit (disentrifugasi).
9. Mounting dengan media entellan atau canada balsam lalu ditutup dengan
gelas penutup.
10. Pemberian label: pada sisi kiri gelas obyek diberi label.

13
 HISTOKIMIA TUMBUHAN

Tujuan : Mengenali kandungan suatu jaringan dengan uji warna atau pembentukan
kristal.
Bahan : Bunga papaitan (Thitonia sp.), daun alang-alang (Imperata cylindrica), dan
braktea Heliconia sp., kencur dan beberapa spesies tumbuhan obat.
Metode :
Cara kerja :
1. Pigmen xantofil. Petal bunga papahitan (Tithonia sp.) disayat secara
paradermal pada permukaan atasnya. Sayatan diletakkan di atas gelas objek,
ditetesi dengan beberapa tetes kloroform selanjutnya segera ditetesi dengan
petrolium eter dan ditutup dengan gelas penutup. Amati kristal yang terbentuk
di bawah mikroskop.
2. Silika. Daun alang-alang (Imperata cylindrica) disayat atau dikerik pada
permukaan atasnya dengan menggunakan pisau silet. Sayatan diletakkan di
atas gelas objek, kemudian ditambahkan kristal fenol dan dipanaskan beberapa
saat, selanjutnya tutup dengan gelas penutup. Amati di bawah mikroskop,
kristal silika akan berwarna merah muda.
3. Lilin. Sayat secara melintang braktea bunga Heliconia sp dan letakkan di atas
gelas obyek, tetesi dengan eter, kemudian tutup secepatnya dengan gelas
penutup. Biarkan eter menguap secara perlahan. Amati kristal yang terbentuk
di bawah mikroskop.
4. Minyak. Rimpang kencur disayat secara melintang dan diletakkan di gelas
obyek yang telah ditetesi Sudan IV, kemudian ditutup dengan gelas penutup.
Amati di bawah mikroskop, adanya kandungan senyawa minyak ditandai
dengan warna kuning hingga jingga.
5. Terpenoid. Pengujian terpenoid pada sel/jaringan dilakukan menggunakan
pereaksi tembaga asetat. Organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat
diiris setipis mungkin dengan silet, kemudian ditetesi dengan tembaga asetat di
atas gelas objek. Adanya kandungan senyawa terpenoid pada sel/jaringan
ditandai dengan warna kuning kecokelatan.
6. Alkaloid. Pengujian alkaloid pada sel/jaringan dilakukan menggunakan
pereaksi Wagner. Organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat diiris
setipis mungkin dengan silet, kemudian ditetesi dengan larutan Wagner di atas
gelas objek. Adanya kandungan senyawa alkaloid pada sel/jaringan ditandai
dengan warna merah kecokelatan. Sebagai kontrol negatif, kandungan alkaloid
pada sayatan segar dilarutkan dengan 5% asam tartaric (tartaric acid) dalam
alkohol 95% selama 48 jam pada suhu kamar, selanjutnya direaksikan dengan
reagen Wagner.
7. Fenol. Uji senyawa fenol menggunakan ferric trichloride. Sayatan segar organ
daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat direndam dalam larutan 10%
ferric trichloride dalam air dan ditambahkan sedikit natrium karbonat selama
15 menit pada suhu kamar. Senyawa fenol akan bereaksi dengan ion besi
menghasilkan deposit berwarna hijau gelap atau hitam.

14
 SEDIAAN IRISAN TUMBUHAN
Bahan : Organ tumbuhan (akar, batang, daun).
Metode : Parafin, menggunakan seri larutan Johansen dengan tertier butil alkohol (TBA)
sebagai dehidran.
Cara kerja :
1. Fiksasi: bahan difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA dengan komposisi
sebagai berikut:

Etanol 50% atau 70% 90 bagian

Asam asetat glasial 5 bagian
Formaldehyde 5 bagian

2. Pencucian: larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 x
dengan waktu penggantian masing-masing selama 1 jam.
3. Dehidrasi dan penjernihan: dilakukan secara bertahap dengan merendam
bahan dalam larutan seri Johansen l-VII dengan komposisi sebagai berikut:

Larutan Johansen
Komposisi larutan
1 II Ill IV V VI VII
Air 50% 30% 15% - - - -
Etanol 95% 40% 50% 50% 45% - - -
Etanol 100% - - - - 25% -
Tertier butil alkohol 10% 20% 35% 55% 75% 100% 50%
Minyak parafin - - - - - - 50%

Waktu perendaman untuk masing-masing tahap adalah sebagai berikut:

Johansen 1 2 jam Johansen VI semalam
Johansen II semalam Johansen VI 2 jam
Johansen III 2 jam Johansen VI 2 jam
Johansen IV 2 jam Johansen VI 2 jam
Johansen V 2 jam Johansen VII, dalam botol yang berisi
⅓ bagian parafin beku.

4. Infiltrasi: wadah berisi material dan campuran TBA, minyak parafin, serta A
bagian parafin disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam (tutup di buka),
kemudian dalam oven (58°C) selama 12 jam (tutup di buka). Tuang seluruh
parafin, diganti dengan parafin cair baru (dilakukan 3 x penggantian setiap 6
jam) disimpan pada suhu 58°C.
5. Penanaman (blok): tuang semua cairan parafin ganti dengan parafin cair murni
disimpan di oven suhu 58°C selama 1 jam. Selanjutnya material siap di blok.
6. Penyayatan: blok yang sudah dirapikan ditempel pada holder dan disayat
dengan mikrotom putar setebal 10 μm.
7. Perekatan: sayatan direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumin-
gliserin dan ditetesi air. Kemudian gelas berisi pita parafin dipanaskan pada
hot-plate dengan suhu 45°C selama 3-5 jam.
8. Pewarnaan: dilakukan pewarnaan ganda safranin 2% dalam air dan fastgreen
0,5% dalam etanol 95%. Berturut-turut gelas obvek di rendam ke dalam larutan
berikut:

15
Xilol 1 5-10 menit Akuades 1-2 menit
Xilol 2 5-10 menit Etanol 30% 2-5 menit
Etanol:xilol 3:1 2-5 menit Etanol 50% 2-5 menit
Etanol:xilol 1:1 2-5 menit Etanol 70% 2-5 menit
Etanokxilol 1:3 2-5 menit Etanol 90% 2-5 menit
Etanol absolut 2-5 menit Fast-green 0,5% 5-30 detik
Etanol 95% 2-5 menit Etanol absolut 2-5 menit
Etanol 70% 2-5 menit Etanokxilol 3:1 2-5 menit
Etanol 50% 2-5 menit Etanokxilol 1:1 2-5 menit
Etanol 30% 2-5 menit Etanokxilol 1:3 2-5 menit
Akuades 1-2 menit Xilol 1 5-10 menit
Safranin 12-24 jam Xilol 2 5-10 menit

9. Penutupan: bahan diberi media entellan atau canada balsam dan ditutup
dengan gelas penutup.
10. Pemberian label: label ditempel pada sisi kiri gelas obyek.

16
 PENGENALAN MIKROSKOP ELEKTRON PAYARAN
(Scanning Electron Microscope)
Tujuan : Mengamati struktur eksternal suatu objek dalam bentuk stereo (3 dimensi)
menggunakan mikroskop elektron payaran.
Bahan : Polen tumbuhan.
Metode : Tanpa perlakuan
Cara kerja :
1. Pembersihan dan pengeringan. Polen tumbuhan dibersihkan dari kotoran yang
melekat. Selanjutnya dikeringkan secara alami.
2. Pelekatan polen pada specimen stub. Polen yang telah kering direkatkan pada
specimen stub menggunakan selotape karbon 2 sisi. Guntinglah selotape
sepanjang diameter specimen stub, kemudian lepaskan kertas pemisahnya dan
rekatkan selotape pada specimen stub. Setelah merapikan sisi-sisi selotape
lepaskan kertas pemisah ke dua dan selanjutnya taburkan secara merata polen
di atasnya. Pastikan polen tidak terlepas dari selotape.
3. Pelapisan permukaan luar polen dengan emas. Logam emas diuapkan secara
vakum sehingga melapisi permukaan polen. Proses ini dilakukan dengan
bantuan vacuum evaporation device.
4. Pengamatan struktur eksternal polen menggunakan mikroskop elektron
payaran.
5. Pengambilan foto polen.

Mikroskop Elektron Payaran (Scanning Electron Microscope)

17
 PENGENALAN FOTOMIKROSKOP (Optiphot-2)
Tujuan : Pengamatan dan pengambilan foto spesimen menggunakan fotomikroskop.
Bahan : Preparat semi permanen/permanen.
Cara kerja :
1. Persiapan. Nyalakan fotomikroskop dengan menekan ON tombol power yang
terdapat di bagian belakang mikroskop dan juga menekan ON tombol power
alat pengoperasian kamera.
Isilah film ke dalam ruang film kamera dengan cara sebagai berikut. Bukalah
penutup belakang kamera dengan menarik tuas penggulung film ke atas.
Setelah terbuka, masukkan gulungan film ke dalam ruang film kamera, film
ditarik sedikit sampai bagian ujungnya masuk ke dalam celah kumparan
penerima.
Setelah selesai memasukkan film, tutup penutup belakang kamera. Secara
otomatis film akan tergulung pada kumparan penerima. Pada keadaan ini
kamera siap digunakan.
Siapkan preparat/spesimen yang akan difoto.

Fotomikroskop (Optiphot-2)

2. Pengambilan foto spesimen.

2a. Pengamatan sebelum pengambilan foto
 Letakkan preparat/spesimen pada meja mikroskop. Pastikan objek yang
diteliti terletak di tengah lubang mikroskop.
 Amati preparat menggunakan lensa objektif yang sesuai dengan kebutuhan
(10 x atau 40 x). Melalui lensa okuler pada bagian mikroskop, aturlah
ketajaman (focus) preparat dengan cara memutar pengatur kasar atau
halus (tergantung pada besarnya lensa objektif yang digunakan).

18
  Untuk mendapatkan daya pisah optimal aturlah pembukaan kondensor,
sedangkan untuk mendapatkan tingkat kecerahan (kontras) yang optimal
aturlah pencahayaan dengan menggerakkan tombol pengatur cahaya ke
kanan untuk memperbesar atau ke kiri untuk memperkecil.
 Setelah didapatkan tampilan preparat yang fokus dengan tingkat kecerahan
yang optimal, aturlah tampilan untuk pemotretan dengan mengikuti
prosedur selanjutnya.
2b. Pengambilan foto
 Melalui jendela pengamat kamera (dilihat dari lensa okuler pada bagian
kamera) aturlah ketajaman gambar dengan cara memutar gelang
pengaturnya yang melekat pada lensa okuler. Pastikan delapan garis
pendek yang terdapat pada jendela pengamat kamera terlihat dengan jelas.

Jendela pengamat kamera

 Setelah objek yang akan difoto terfokuskan dengan jelas, tariklah keluar
knob penerus cahaya ke kamera.
 Untuk memulai pemotretan, tekan tombol lampu untuk pemotretan
(terdapat di sebelah kiri display panel pencahayaan). Lampu foto akan
bergerak ke nomor 9.
 Setelah itu tekan tombol shutter release (pelepas rana). Setiap selesai
menekan tombol, film akan maju secara otomatis.
 Untuk pengambilan objek lainnya, lakukan tahapan seperti di atas.
 Setelah selesai pemotretan, matikan lampu foto.
2c. Penggulungan film yang telah digunakan
 Tekanlah tombol kecil (berwarna hitam) yang terdapat pada sisi atas
kamera. Film akan terlepas dari kumparan penerima.
 Tariklah ke atas tuas pemutar balik film (terdapat di bagian atas kumparan
penerima), gulunglah film searah tanda anak panah yang terdapat pada
tuas pemutar balik film. Teruskan menggulung sampai putaran terasa
ringan (film sudah tergulung sempurna ke dalam tabungnya).
 Keluarkanlah film dari ruang film kamera dengan cara menarik ke atas tuas
penggulung balik film. Pastikan sudah terdengar bunyi teeeek yang berarti
pintu ruang kamera akan terbuka. Setelah tabung film dikeluarkan dari
ruang film kamera, tutuplah kembali pintu ruang film kamera.
3. Penutupan
Setelah selesai menggunakan fotomikroskop, keluarkan preparat dari meja
mikroskop. Pada waktu mengeluarkan preparat, agar preparat tidak
membentur lensa objektif, pindahkan lensa objektif yang dipakai dengan lensa
objektif terkecil yang terdapat pada mikroskop dengan cara memutar revolver
pengganti lensa objektif. Simpanlah preparat kembali. Matikan fotomikroskop
dengan menekan tombol power utama dan tombol power kamera.
Pastikan tidak ada sampah yang tercecer di sekeliling fotomikroskop.

19