Penuntun Praktikum Mikroteknik PDF
Penuntun Praktikum Mikroteknik PDF
Disusun Oleh:
2014
1
Kata Pengantar
Buku penuntun praktikum Mikroteknik ini merupakan tulisan yang disusun untuk memenuhi
kebutuhan para mahasiswa yang mengikuti praktikum mata ajaran Mikroteknik di Jurusan Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Buku penuntun ini
diharapkan dapat memberi bekal teori dan petunjuk-petunjuk kelancaran pelaksanaan praktikum.
Materi yang terkandung dalam buku ini merupakan kumpulan dari acara-acara praktikum yang
disusun berdasarkan topik perkuliahan meliputi penyiapan sediaan mikroskopis jaringan hewan dan
tumbuhan, pengenalan mikroskop elektron dan fotomikroskop.
Penyusun mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan
buku penuntun praktikum ini.
Penyusun
iii
iv
Daftar Isi
v
vi
SEDIAAN APUS (SMEAR)
a. Teteskan darah pada gelas obyek A, pasang gelas obyek B di kiri tetes
darah membentuk sudut 45° dengan A.
b. Tarik gelas obyek B ke kanan sampai menyentuh tetesan darah.
c. Setelah terbentuk kapiler, dorong gelas obyek B dengan cepat ke kiri.
d. Apus darah pada gelas obyek A.
4. Fiksasi dengan metanol 5 menit.
5. Kering anginkan.
6. Warnai dengan pewarna Giemsa 3% selama 30 menit (Giemsa stock = 30%,
encerkan pada saat akan dipakai).
7. Cuci dengan akuades.
8. Kering anginkan.
9. Periksa dengan mikroskop perbesaran 1000x.
1
SEDIAAN UTUH
Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh.
Bahan : a. Cacing pipih
b. Kutu
c. Bentos
Pewarna : Carmine alum.
Eosin 1% dalam air.
Cara kerja :
A. Cacing pipih
1. Cacing dijepit di antara 2 gelas obyek, ikat dengan karet.
2. Masukkan ke fiksatif (etanol 70% atau formalin 4%) 2 x 24 jam.
3. Lepaskan cacing dari gelas benda, fiksir lagi beberapa jam.
4. Cuci. Jika fiksatifnya etanol 10%, cuci dengan etanol 50%, lalu dengan akuades.
Jika fiksatifnya formalin 4%, cuci dengan akuades.
5. Warnai dengan eosin 1% akuosa 24 jam atau carmine alum 3-4 jam.
6. Cuci dengan air.
7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat. Etanol 30%, 50%, 70%. 95%, 100%,
masing-masing 15 menit.
8. Penjernihan dengan lactophenol 30 menit dan xilol 2 x 15 menit.
9. Tempel pada gelas obyek dengan perekat entellan.
B. Kutu, pinjal
1. Kutu, pinjal, difiksasi dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam.
2. Pindahkan ke KOH 10%. Lama penyimpanan dalam KOH tergantung ketebalan
kutin dari spesimen (pinjal ±6 hari, kutu ±1 hari).
3. Cuci dengan akuades.
4. Dehidrasi dengan etanol 50%, 70%, 95%, 100% masing-masing 10 menit.
5. Pindahkan ke minyak cengkeh sampai tampak jernih (±15-30 menit).
6. Pindahkan ke xilol 110 menit, lalu xilol II10 menit.
7. Atur di atas gelas obyek, tutup dengan perekat entellan.
C. Bentos
1. Bentos yang sudah bersih difiksasi dengan etanol 70% minimal 24 jam.
2. Cuci dengan akuades.
3. Warnai dengan eosin 1% dalam air 24 jam.
4. Cuci dengan air.
5. Dehidrasi dengan etanol bertingkat, masing-masing 10 menit.
6. Penjenuhan dengan xilol 2x15 menit.
7. Letakkan pada gelas benda dan ditutup dengan entellan.
2
MASERASI HEWAN
3
SEDIAAN SAYATAN
Tujuan : Membuat sediaan sayatan organ hewan.
Bahan : Organ hewan (jantung, usus, ovarium, dan sebagainya).
Metode : Parafin
Cara kerja :
1. Hewan dibius dengan kloroform atau eter, bedah dan ambil organ yang
diperlukan.
2. Organ yang akan diproses dicuci dengan garam fisiologis.
3. Potong dengan pisau tajam dengan ukuran kira-kira ½ cm.
4. Fiksasi dengan larutan FAAAC atau Bouine minimal 24 jam (tergantung jenis
organ dan ukurannya).
5. Pencucian: larutan fiksatif dibuang dan dicuci beberapa kali dengan akuades.
6. Dehidrasi: dengan etanol bertingkat 30%, 50%, 70%, 95%, 100% masing-
masing 15-30 menit tergantung organ yang diproses.
7. Penjernihan: dengan xilol 30 menit. Apabila belum transparan, waktu
penjernihan ditambah.
8. Infiltrasi: jaringan dimasukkan ke dalam infiltran
Parafin:xilol (1:1) 30 menit
Parafin I 30 menit
Parafin II 30 menit
Parafin III 30 menit
Semua langkah infiltrasi dikerjakan di dalam oven. Parafin yang dipakai harus
sama dengan titik lebur parafin untuk embedding.
9. Embedding: cetak blok parafin dalam kotak-kotak dan atur letak/posisi organ
sesuai dengan tujuan.
10. Penyayatan:
Blok dipasang pada holder, rapikan, sisi atas sejajar dengan sisi bawah.
Holder dipasang pada tempatnya di mikrotom putar.
Sayat dengan ketebalan 6 μm.
11. Penempelan: Tempelkan sayatan pada gelas obyek dengan perekat entellan.
12. Pewarnaan: pewarnaan ganda hemaktosilin - eosin.
Deparafinasi dengan xilol 3x5 menit.
Masukkan ke etanol 95%, 80%, 70%, 50% masing-masing beberapa
celupan.
Masukkan ke zat warna hemaktosilin aquosa ±2 menit.
Cuci dengan air.
Masukkan ke etanol 30%, 50%, 70%.
Warnai dengan eosin 1% dalam etanol 70% 1-2 menit.
Dehidrasi dengan etanol bertingkat 70%. 80%, 95%, 100% beberapa
celupan.
Penjernihan dengan xilol 2x5 menit.
Tutup dengan gelas penutup dengan perekat entellan.
4
PEWARNAAN NISSL
Tujuan : Melakukan pewarnaan Nissl dengan thionine, yang secara spesifik mewarnai
DNA dan substansi Nissl (RNA) untuk mempelajari struktur umum otak mencit.
Dasar : Pewarnaan Nissl dikembangkan oleh Franz Nissl (1860-1919) saat ia
mempelajari patologi sel-sel di otak. Dengan metode ini, DNA dan RNA yang
bermuatan negatif akan berwarna biru, sehingga dapat memberikan gambaran
umum struktur suatu organ secara cepat. Oleh sebab itu, pewarnaan Nissl
menjadi terkenal dan digunakan secara luas di kalangan peneliti yang
memerlukan kajian histologi dalam penelitiannya. Pewarnaan ini pun memiliki
beragam zat warna yang dapat digunakan seperti zat warna aniline, cresyl
violet, dan thionine.
Bahan : Awetan otak mencit (irisan koronal tebal 50 μm).
Metode : Nissl.
Cara kerja :
1. Awetan otak mencit yang telah diiris dengan mikrotom, disusun pada gelas
objek. Letakkan sekitar 4-6 irisan per gelas objek. Gunakan PBS atau larutan
buffer lainnya untuk mempermudah penyusunan. Biarkan mengering di suhu
ruang atau di dalam inkubator 37 °C. (Pastikan preparat benar-benar kering
dan menempel pada gelas objek!)
2. Cuci preparat dengan akuades selama 1 menit.
3. Untuk dehidrasi dan pengektraksian lipid dari preparat, lakukan perendaman
dalam etanol bertingkat secara berurutan: 50% (3 menit), 70% (3 menit), 95%
(3 menit), 95% (3 menit), 100% (3 menit), dan 100% (3 menit).
4. Rendam dalam xylene 2 kali @ 3 menit.
5. Untuk persiapan pewarnaan dan rehidrasi preparat, lakukan kembali
perendaman dalam etanol bertingkat secara berurutan: 100% (1 menit), 100%
(1 menit), 95% (1 menit), 95% (1 menit), 70% (1 menit), dan 50% (1 menit).
6. Cuci kembali preparat dengan akuades selama 1 menit.
7. Warnai dengan thionine 0.1% (w/v) pH 4.0 selama 2-5 menit. Amati dengan
seksama perkembangan warna preparat! Segera lanjut ke langkah 8 bila warna
preparat telah dianggap cukup gelap.
8. Cuci preparat dengan air mengalir hingga sisa aliran sudah tidak mengandung
pewarna.
9. Cuci kembali preparat dengan akuades selama 1 menit.
10. Untuk re-dehidrasi preparat, lakukan kembali perendaman dalam etanol
bertingkat secara berurutan: 50% (1 menit), 70% (1 menit), 95% (1 menit), 95%
(1 menit), 100% (1 menit), dan 100% (1 menit).
11. Rendam kembali dalam xylene 2 kali @ 3 menit.
12. Tutup preparat dengan gelas penutup yang telah diberi Permount.
13. Amati preparat dengan mikroskop cahaya.
Catatan :
1. Gunakan pipet untuk meletakkan larutan ke atas preparat secara perlahan.
2. Gunakan suction pump untuk membersihkan larutan yang telah selesai
digunakan dari atas preparat.
5
HISTOKIMIA
Hemaktosilin Harris
Hemaktosilin 1 gram
Alkohol absolut 10 ml
Ammonium (potassium) alum 20 gram
Akuades 200 ml
Merkuri oksida 0,5 gram
Hemaktosilin Harris
Larutan baku 2 bagian
Amoniak 2 bagian
Metil alkohol 3 bagian
2. Deparafinasi.
3. Sediaan dibawa ke kondisi akuades.
4. Warnai dengan hemaktosilin Harris 2 menit.
5. Cuci dengan air ledeng.
6. Selama preparat masih dalam air ledeng, buatlah larutan pewarna best
carmine tepat sebelum digunakan. Masukkan larutan best carmine tersebut ke
dalam staining jar yang tertutup agar amoniak dan metil alkohol yang terdapat
di dalamnya tidak menguap. Tinggalkan preparat dalam larutan ini selama 5-10
menit.
7. Masukkan segera dalam larutan pendiferensiasi. Selama diferensiasi,
tebal/tipisnya zat warna harus diperhatikan.
8. Selanjutnya masukkan ke dalam alkohol absolut, diganti-ganti sampai 2-3 kali.
Tinggalkan dalam alkohol absolut yang ketiga selama 2 menit.
9. Jernihkan dalam xilol atau toluene, kemudian mounting dengan kanada
balsam.
6
SEDIAAN UTUH [WHOLE MOUNT) HEWAN
Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh.
Bahan : Semut, cacing pipih (Sagitta), embrio ayam.
Cara kerja :
A. Semut
1. Fiksasi semut dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam.
2. Dehidrasi dengan etanol bertingkat 80%, 95%, dan 100% masing masing
selama 10 menit.
3. Jernihkan dengan minyak cengkeh selama 5 menit.
4. Pindahkan ke xilol selama 2x5 menit. Xilol berfungsi sebagai penjernih dan
sebagai medium pelarut entellan.
5. Atur di atas gelas obyek, tetesi dengan entellan sebagai perekat.
6. Tutup dengan gelas penutup, biarkan sampai kering.
C. Embrio ayam
1. Telur diteropong untuk melihat posisi titik embrio.
2. Tandai bagian yang berembrio dengan pensil.
3. Telur diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 36°C selama 24 jam, 36 jam, dan
48 jam.
4. Teropong telur untuk melihat apakah embrio berkembang.
5. Gunting cangkang pada bagian yang telah ditandai.
6. Tempelkan cincin kertas saring mengelilingi embrio.
7. Gunting selaput embrio di sekeliling luar cincin kertas saring.
8. Angkat embrio dengan pinset.
9. Cuci dengan garam fisiologis.
10. Fiksasi dengan larutan Bouine selama 30 menit.
11. Cuci dengan etanol 70%.
12. Warnai dengan eosin 1% dalam etanol 70% selama lima menit.
13. Cuci dengan etanol 70%, dehidrasi dengan etanol 80%, 95%, dan 100% selama
masing-masing 10 menit.
14. Jernihkan dengan xilol selama 2 x 10 menit.
7
15. Letakkan embrio pada gelas benda cekung dan tutup dengan gelas penutup
dengan perekat entellan.
8
WHOLE MOUNT TUMBUHAN
Formaldehid 5 bagian
Asam asetat glasial 2 bagian
Akuades 93 bagian
9
SEDIAAN SEGAR MITOSIS TUMBUHAN
10
SEDIAAN SEGAR MIOSIS TUMBUHAN
Bahan : Kepala sari bunga lili (Lilium sp.) dan bunga Rhoeo discolor.
Metode : Remasan (squash).
Cara kerja :
1. Fiksasi: sejumlah kuncup bunga lili dan Rhoeo discolor dikumpulkan, kemudian
segera ke dalam larutan fiksatif Carnoy/Farmer selama ± 24 jam atau disimpan
di dalam lemari es jika lebih dari 24 jam. Komposisi fiksatif Carnoy dan Farmer
masing-masing sebagai berikut:
11
SEDIAAN PERMANEN MITOSIS & MIOSIS TUMBUHAN
12
MASERASI TUMBUHAN
13
HISTOKIMIA TUMBUHAN
Tujuan : Mengenali kandungan suatu jaringan dengan uji warna atau pembentukan
kristal.
Bahan : Bunga papaitan (Thitonia sp.), daun alang-alang (Imperata cylindrica), dan
braktea Heliconia sp., kencur dan beberapa spesies tumbuhan obat.
Metode :
Cara kerja :
1. Pigmen xantofil. Petal bunga papahitan (Tithonia sp.) disayat secara
paradermal pada permukaan atasnya. Sayatan diletakkan di atas gelas objek,
ditetesi dengan beberapa tetes kloroform selanjutnya segera ditetesi dengan
petrolium eter dan ditutup dengan gelas penutup. Amati kristal yang terbentuk
di bawah mikroskop.
2. Silika. Daun alang-alang (Imperata cylindrica) disayat atau dikerik pada
permukaan atasnya dengan menggunakan pisau silet. Sayatan diletakkan di
atas gelas objek, kemudian ditambahkan kristal fenol dan dipanaskan beberapa
saat, selanjutnya tutup dengan gelas penutup. Amati di bawah mikroskop,
kristal silika akan berwarna merah muda.
3. Lilin. Sayat secara melintang braktea bunga Heliconia sp dan letakkan di atas
gelas obyek, tetesi dengan eter, kemudian tutup secepatnya dengan gelas
penutup. Biarkan eter menguap secara perlahan. Amati kristal yang terbentuk
di bawah mikroskop.
4. Minyak. Rimpang kencur disayat secara melintang dan diletakkan di gelas
obyek yang telah ditetesi Sudan IV, kemudian ditutup dengan gelas penutup.
Amati di bawah mikroskop, adanya kandungan senyawa minyak ditandai
dengan warna kuning hingga jingga.
5. Terpenoid. Pengujian terpenoid pada sel/jaringan dilakukan menggunakan
pereaksi tembaga asetat. Organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat
diiris setipis mungkin dengan silet, kemudian ditetesi dengan tembaga asetat di
atas gelas objek. Adanya kandungan senyawa terpenoid pada sel/jaringan
ditandai dengan warna kuning kecokelatan.
6. Alkaloid. Pengujian alkaloid pada sel/jaringan dilakukan menggunakan
pereaksi Wagner. Organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat diiris
setipis mungkin dengan silet, kemudian ditetesi dengan larutan Wagner di atas
gelas objek. Adanya kandungan senyawa alkaloid pada sel/jaringan ditandai
dengan warna merah kecokelatan. Sebagai kontrol negatif, kandungan alkaloid
pada sayatan segar dilarutkan dengan 5% asam tartaric (tartaric acid) dalam
alkohol 95% selama 48 jam pada suhu kamar, selanjutnya direaksikan dengan
reagen Wagner.
7. Fenol. Uji senyawa fenol menggunakan ferric trichloride. Sayatan segar organ
daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat direndam dalam larutan 10%
ferric trichloride dalam air dan ditambahkan sedikit natrium karbonat selama
15 menit pada suhu kamar. Senyawa fenol akan bereaksi dengan ion besi
menghasilkan deposit berwarna hijau gelap atau hitam.
14
SEDIAAN IRISAN TUMBUHAN
Bahan : Organ tumbuhan (akar, batang, daun).
Metode : Parafin, menggunakan seri larutan Johansen dengan tertier butil alkohol (TBA)
sebagai dehidran.
Cara kerja :
1. Fiksasi: bahan difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA dengan komposisi
sebagai berikut:
2. Pencucian: larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 x
dengan waktu penggantian masing-masing selama 1 jam.
3. Dehidrasi dan penjernihan: dilakukan secara bertahap dengan merendam
bahan dalam larutan seri Johansen l-VII dengan komposisi sebagai berikut:
Larutan Johansen
Komposisi larutan
1 II Ill IV V VI VII
Air 50% 30% 15% - - - -
Etanol 95% 40% 50% 50% 45% - - -
Etanol 100% - - - - 25% -
Tertier butil alkohol 10% 20% 35% 55% 75% 100% 50%
Minyak parafin - - - - - - 50%
4. Infiltrasi: wadah berisi material dan campuran TBA, minyak parafin, serta A
bagian parafin disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam (tutup di buka),
kemudian dalam oven (58°C) selama 12 jam (tutup di buka). Tuang seluruh
parafin, diganti dengan parafin cair baru (dilakukan 3 x penggantian setiap 6
jam) disimpan pada suhu 58°C.
5. Penanaman (blok): tuang semua cairan parafin ganti dengan parafin cair murni
disimpan di oven suhu 58°C selama 1 jam. Selanjutnya material siap di blok.
6. Penyayatan: blok yang sudah dirapikan ditempel pada holder dan disayat
dengan mikrotom putar setebal 10 μm.
7. Perekatan: sayatan direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumin-
gliserin dan ditetesi air. Kemudian gelas berisi pita parafin dipanaskan pada
hot-plate dengan suhu 45°C selama 3-5 jam.
8. Pewarnaan: dilakukan pewarnaan ganda safranin 2% dalam air dan fastgreen
0,5% dalam etanol 95%. Berturut-turut gelas obvek di rendam ke dalam larutan
berikut:
15
Xilol 1 5-10 menit Akuades 1-2 menit
Xilol 2 5-10 menit Etanol 30% 2-5 menit
Etanol:xilol 3:1 2-5 menit Etanol 50% 2-5 menit
Etanol:xilol 1:1 2-5 menit Etanol 70% 2-5 menit
Etanokxilol 1:3 2-5 menit Etanol 90% 2-5 menit
Etanol absolut 2-5 menit Fast-green 0,5% 5-30 detik
Etanol 95% 2-5 menit Etanol absolut 2-5 menit
Etanol 70% 2-5 menit Etanokxilol 3:1 2-5 menit
Etanol 50% 2-5 menit Etanokxilol 1:1 2-5 menit
Etanol 30% 2-5 menit Etanokxilol 1:3 2-5 menit
Akuades 1-2 menit Xilol 1 5-10 menit
Safranin 12-24 jam Xilol 2 5-10 menit
9. Penutupan: bahan diberi media entellan atau canada balsam dan ditutup
dengan gelas penutup.
10. Pemberian label: label ditempel pada sisi kiri gelas obyek.
16
PENGENALAN MIKROSKOP ELEKTRON PAYARAN
(Scanning Electron Microscope)
Tujuan : Mengamati struktur eksternal suatu objek dalam bentuk stereo (3 dimensi)
menggunakan mikroskop elektron payaran.
Bahan : Polen tumbuhan.
Metode : Tanpa perlakuan
Cara kerja :
1. Pembersihan dan pengeringan. Polen tumbuhan dibersihkan dari kotoran yang
melekat. Selanjutnya dikeringkan secara alami.
2. Pelekatan polen pada specimen stub. Polen yang telah kering direkatkan pada
specimen stub menggunakan selotape karbon 2 sisi. Guntinglah selotape
sepanjang diameter specimen stub, kemudian lepaskan kertas pemisahnya dan
rekatkan selotape pada specimen stub. Setelah merapikan sisi-sisi selotape
lepaskan kertas pemisah ke dua dan selanjutnya taburkan secara merata polen
di atasnya. Pastikan polen tidak terlepas dari selotape.
3. Pelapisan permukaan luar polen dengan emas. Logam emas diuapkan secara
vakum sehingga melapisi permukaan polen. Proses ini dilakukan dengan
bantuan vacuum evaporation device.
4. Pengamatan struktur eksternal polen menggunakan mikroskop elektron
payaran.
5. Pengambilan foto polen.
17
PENGENALAN FOTOMIKROSKOP (Optiphot-2)
Tujuan : Pengamatan dan pengambilan foto spesimen menggunakan fotomikroskop.
Bahan : Preparat semi permanen/permanen.
Cara kerja :
1. Persiapan. Nyalakan fotomikroskop dengan menekan ON tombol power yang
terdapat di bagian belakang mikroskop dan juga menekan ON tombol power
alat pengoperasian kamera.
Isilah film ke dalam ruang film kamera dengan cara sebagai berikut. Bukalah
penutup belakang kamera dengan menarik tuas penggulung film ke atas.
Setelah terbuka, masukkan gulungan film ke dalam ruang film kamera, film
ditarik sedikit sampai bagian ujungnya masuk ke dalam celah kumparan
penerima.
Setelah selesai memasukkan film, tutup penutup belakang kamera. Secara
otomatis film akan tergulung pada kumparan penerima. Pada keadaan ini
kamera siap digunakan.
Siapkan preparat/spesimen yang akan difoto.
Fotomikroskop (Optiphot-2)
18
Untuk mendapatkan daya pisah optimal aturlah pembukaan kondensor,
sedangkan untuk mendapatkan tingkat kecerahan (kontras) yang optimal
aturlah pencahayaan dengan menggerakkan tombol pengatur cahaya ke
kanan untuk memperbesar atau ke kiri untuk memperkecil.
Setelah didapatkan tampilan preparat yang fokus dengan tingkat kecerahan
yang optimal, aturlah tampilan untuk pemotretan dengan mengikuti
prosedur selanjutnya.
2b. Pengambilan foto
Melalui jendela pengamat kamera (dilihat dari lensa okuler pada bagian
kamera) aturlah ketajaman gambar dengan cara memutar gelang
pengaturnya yang melekat pada lensa okuler. Pastikan delapan garis
pendek yang terdapat pada jendela pengamat kamera terlihat dengan jelas.
19