KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:
 Melakukan analisa sampel (zat warna) secara kromatografi lapis tipis

II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

a. Alat yang Digunakan
 Pelat TLC
 Chamber Chromatography
b. Bahan yang Digunakan
 Toluen
 Benzen
 Sikloheksan
 Zat warna(Sintesis)
 Aquadest

III. DASAR TEORI

KLT (kromatgrafi Lapis Tipis)/TLC (Thin Layer Chromatography)

merupakan salah satu cara untuk memisahkan dan menganalisa zat dalam
jumlah yang kecil. Pada TLC, adsorben tersebar secara merata dalam
permukaan gelas dan membentuk suatu lapisan tipis, terbentuk pita-pita yang
tidak horizontal, maka sulit untuk mengumpulkan komponen-komponen.
Ujung dari pita kedua akan terbawa sebelum seluruh pita pertama keluar dari
kolom. Ada dua factor penyebab masalah ini yaitu permukaan atas dari
adsorben tidak rata serta kolom tidak benar-benar vertical.

Fenomena lain adalah terbentuknya lengkungan pada salah satu sisi

pita. Hal ini dapat terjadi bila ada ketidakteraturan pada permukaan adsorben
atau terdapat gelembung udara pada kolom.
 Pada TLC, cuplikan yang akan dipisahkan atau dianalisa diteteskan
pada pelat dengan menggunakan kapiler. Pemisahan dapat terjadi dengan
memasukkan pelat ke dalam chamber (kamar) yang telah jenuh dengan pelarut.
Pelarut akan naik secara perlahan-lahan sepanjang pelat tersebut. Cuplikan
akan terdistribusi antara fasa diam (adsorben) dan fasa gerak (pelarut). Sebagai
fase gerak umumnya zat yang kurang polar dibandingkan dengan fasa diam
sehingga komponen dalam cuplikan yang kurang polar akan bergerak lebih
cepat dari komponen cuplikan yang lebih polar. Bila larutan hamper mencapai
ujung pelat maka pelat dikeluarkan dari chamber dan dibiarkan hingga pelarut
yang menempel pada pelat menguap. Akan terlihat noda-noda pada pelat yang
menunjukan jumlah komponen yang ada dalam cuplikan. Perbandingan antar
jarak perjalanan komponen dengan jarak perjalanan pelarut disebut Rf. Rf
dinyatakan dengan bilangan dan dapat digambarkan seperti berikut ini.

.
distance travelled by distance travelled by
.
the solvent the various dyes
M

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛

Rf= 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1,7 cm

dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5,0 cm sehingga nilai Rf untuk
komponen berwarna merah menjadi:

1,7
Rf = 5,0

= 0,34
 Bila kondisi pengerjaan sama, maka niali Rf untuk kompoen tertentu
adalah sama. Nilai Rf dapat digunakan untuk mengidentifikasi komponen.

Istilah kromatografi berasal dari bahasa Latin chroma berarti warna dan
graphien berarti menulis.Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh
Michael Tswest (1903) seorang ahli botani dari Rusia. Michael Tswest dalam
percobaannya ia berhasil memisahkan klorofil dan pigmen-pigmen warna lain
dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat
(CaCO3) yang diisikan ke dalam kaca dan petroleum eter sebagai pelarut.
Proses pemisahan itu diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada
permukaan atas kalsium karbonat (CaCO3), kemudian dialirkan pelarut
petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat sepanjang
kolom sebagai hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak
tumbuhan. Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari
berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam sistem
yang terdiri dari fase diam dan fase gerak. Semua pemisahan pada kromatografi
tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen diantara kedua
fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan lebih lemah oleh fase
diam akan bergerak lebih cepat daripada komponen yang satu dengan lainnya
disebabakan oleh perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarputan atau penguapan
diantara kedua fase.
Adsorben yang digunakan pada kromatogrfai lapis tipis biasanya terdiri
dari silika gel atau alumina dapat langsung atau dicampur dengan bahan
perekat misalnya kalsium sulfat untuk disalutkan pada pelat. Pada
pemisahannya, fase bergerak akan membawa komponen campuran sepanjang
fase diam pada pelat sehingga terbentuk kromatogram. Pemisahan yang terjadi
berdasarkan adsorbsi dan partisi. Teknik kerja KLT prinsipnya hampir sama
dengan komatografi lapis tipis (KLT).
Penentuan harga Rf pada KLT sama dengan pada kromatografi lapis
tipis (KLT). Harga Rf dapatdigunakan untuk identifikasi kualitatif. Untuk
tujuan penentuan kadar, bercak komponen dapat dikerok lalu dilarutkan dalam
pelarut yang sesuai untuk dianalisa dengan metode lain yang tepat. Aplikasi
KLT sangat luas, termasuk dalam bidang organik dan anorganik. Kebanyakan
senyawa yang dapat dipisahkan bersifat hidrofob seperti lipida dan hidrokarbon
dimana sukar bila dikerjakan dengan kromatografi lapis tipis (KLT). KLT juga
penting untuk pemeriksaan identitas dan kemurnian senyawa obat, kosmetika,
tinta, formulasi pewarna dan bahan makanan.
Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase-fase yang
digunakan.Kromatografi juga dapat digolongkan atas prinsipnya, misalnya
kromatografi partisi (Partition chromatography) dan kromatografi serapan
(Adsorption chromatography).Sedangkan menurut teknik kerja yang
digunakan, misalnya kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis (KLT),
kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi gas.
Dalam proses kromatografi selalu terdapat kecenderungan yaitu:
a. Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan
b. Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada permukaan
padatan halus (adsorpsi penyerapan)
c. Kecenderungan komponen-komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar
ion)
d. Kecenderungan molekul-molekul terekslusi pada pori-pori fase diam.

Faktor reterdasi (Rf ), merupakan parameter kharakteristik

kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi lapis tipis. Harga Rf
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatogram dan
pada kondisi tetap merupakan besaran kharakteristik dan reproduksibel. Rf
didefenisiskan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap
jarak yang ditempuh pelarut (fase bergerak). Hubungan ini berlaku jika Kd dan
penampang lintang tidak tetap sepanjang lintasan zat terlarut.
Pemilihan pelarut tergantung dari campuran sampel yang diteliti.
Pelarut yang cocok untuk pemisahan merupakan campuran dua pelarut,
sehingga nilai Rf senyawa-senyawa dalam campuran sampel tersebar di
sepanjang lapis tipis (KLT). Nilai pH pelarut juga harus diperhatikan, karena
banyak pelarut yang mengandung asam asetat atau ammonia yang
menghasilkan lingkungan yang sangat asam atau sangat basa.
Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi dibandingkan pemisahan
metode lainnya yaitu:
a. Dapat digunakan pada sampel atau konstituen yang sangat kecil (semi mikro
dan mikro)
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organic multi komponen
c. Proses pemisahan dalat dilakukan dalam waktu yang relative singkat
d. Seringkali murah dan sederhana, karena umumnya tidak memerlukan alat
yang mahal dan rumit.
Untuk tujuan identifikasi, noda-noda sering dikarakterisasikan
berdasarkan nilai Rfnya. Nilai Rf adalah rasio jarak yang dipindahkan oleh
suatu zat terlarut terhadap jarak yang dipindahkan oleh garis depan pelarut
selama waktu yang sama. Nilai Rf yang identik untuk suatu senyawa yang
diketahui dan yang tidak diketahui dengan menggunakan beberapa system
pelarut berbeda memberikan bukti yang kuat bah bahwa nilai untuk kedua
senyawa tersebut adalah identic, terutama jika senyawa tersebut dijalankan
secara berdampingan di sepanjang pita lapis tipis (KLT) yang sama.

Beberapa kelebihan dari KLT yaitu sebagai berikut :

1. Waktu pemisahan lebih cepat
2. Sensitif, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.

Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh

prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang
akan dipisahkan digunakan suatu penyuntik berukuran mikro. Sampel harus
nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan
dengan mengorek lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Resolusi KLT jauh
lebih tinggi daripada kromatografi lapis tipis (KLT) karena laju difusi yang luar
biasa kecilnya pada lapisan pengadsorbsi. Semua teknik yang dipakai
krometografi lapis tipis (KLT) juga dapat digunakan untuk kromatografi lapis
tipis.
 Nilai Rf dipengaruhi oleh ketebalan lapisan, sebagian besar prosedur
pemisahan untuk analisis kualitatif menggunkan ketebalan lapisan 250 µm dan
untuk anlisis preparatif digunakan ketebalan sampai 5 mm. Kadang-kadang
digunakan kalsium sulfat sebagai adsorben untuk mengikat lapisan pada
lempeng. Silika gel adalah bahan yang paling banayak digunakan untuk
pemisahan sejumlah besar senyawa. Hal yang harus diperhatikan adalah
atmosfer ruang pemisahan harus jenuh dengan pelarut, karena menentukan
besar kecilnya nilai Rf. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan wadah
sekecil mungkin dan menghubungkan dinding dengan lapis tipis (KLT) yang
terendam dalam pelarut.
Teknik pemisahan dalam kromatografi ada dua macam, yaitu :
1. Descending-chromatografy adalah yang berdasarkan cairan pengelusi
yang dibiarkan bergerak menuruni lapis tipis (KLT) akibat gaya
gravitasi.
2. Ascending-chromatografy yaitu pemisahan yang berdasarkan cairan
pengelusi bergerak ke atas dengan gaya kapiler.

Kromatografi juga bisa digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi

komponen-komponennya .Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan
tipis jel silika atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik

Gambar 4.Skema alat TLC

Bagian-bagian TLC
 Pelat : Berupa kaca yang dilapisi fase diam seperti
CaCO3
 Chamber : Tempat memasukkan pelarut( fase gerak) dan pelat
(fase diam)
 Fase diam : Zat padat inert yang melapisi pelat
 Fase gerak : Zat cair (pelarut organik) seperti etanol yg
membawa cuplikan

Prinsip Kerja TLC

Perhitungan dalam TLC

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛

Rf = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡

Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf pada TLC

 Struktur kimia darei senyawa yang dipisahkan
 Sifat dari penyerap dan derajat aktifasinya
 Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
 Kemurnian pelarut (fase gerak)
  Jumlah cuplikan yang digunakan
 Suhu
 Kesetimbangan

IV. PROSEDUR PERCOBAAN

1. Meyiapkan pelat yang telah selesai dilapisi silica
2. Meneteskan cuplikan dengan menggunakan pipa kapiler pada permukaan
pelat
3. Memasukkan pelat kedalam chamber yang telah diisi dengan sikloheksan.
Tetesan yang berada pada pelat tidak terendam pelarut. Dan digunakaan
campuran toulene sikloheksan (10:90) yang bersifat polar.
4. Pelarut akan naik secara perlahan-lahan disepanjang pelat sehingga sampai
diujung yang lain dari pelat. Batas perjalanan pelarut telah ditandai.
5. Pelat telah dikeringkan dan telah dibandingkan harga Rf dari noda yang
terbentuk.