Actividad enzimática en procesos de transformación
Yeni Moreno. Paula Bravo.
Resumen
Abstract
Introducción
Dentro de los procesos que se llevan a cabo en el
cuerpo humano, la mayoría de las reacciones se
producen gracias a la catálizis de enzimas, la
primera característica que contribuyen estas es la
aceleración de reacciones químicas, la primera
sustancia involucrada es el sustrato sobre el cual
actúa la enzima, uniéndose a un lugar especifico
llamado sitio activo. Después de terminada la
reacción, se libera la enzima, que se vuelve a unir
con otro sustrato y así sucesivamente en un sin fin
de reacciones. La razón de que la enzima
involucrada sea la que aumente la velocidad de una
reacción, está ligada a la expresión de la inversa de
la energía de activación y la velocidad de la
reacción, a medida que la energía de activación
aumenta, la velocidad de esta es menor. (Garrido,
A. Teijón J. 2006).
La cinética enzimática es la encargada de explicar
la velocidad de reacción de enzimas, los principales
interventores en este proceso son las
concentraciones de sustrato y enzima, esto
obedece a la ley de Michaelis y Menten, donde
proponen dos etapas, en la primera se forma un
complejo enzima-sustrato y en la segunda, se
analiza el producto resultante del complejo enzima-
sustrato liberando la enzima. (Daniel, L. R, Donald.
2000).
Otro de los factores que intervienen en la cinética
enzimática es el pH del medio en el que se
encuentran dichas reacciones. Existen condiciones
óptimas para que la reacción se lleve a cabo de
manera que el producto sea máximo, la ionización
del sitio activo de la enzima, incrementa
gradualmente conforme aumenta el pH, esto sucede
porque se encuentra más grupos de ácidos
carboxílicos ya ionizados y hace que para la enzima,
sea mucho más fácil enlazarse con los sustratos,
existen puntos máximos para cada enzima
respectiva donde se encuentra la mayor cantidad de
hidronios para protonar la sustancia. (Roosdiana A.
Prasetyawan, S. Mahdi, C. Sutrisno. (2013).
Otro factor que influye en la reacción de una enzima
es la temperatura, a medida que incrementa esta
variable, aumenta consigo la energía cinética de las
moléculas reaccionantes, y por consecuencia, es
mayor la probabilidad de que se den colisiones
efectivas para que dichas reacciones se lleven a
cabo. Conforme aumenta la temperatura, aumenta
la velocidad de reacción también, pero cuando
alcanza un valor determinado, dependiendo de la
enzima, esta empieza a desnaturalizarse y la
velocidad de reacción comienza a verse
perjudicada, por lo tanto, la temperatura óptima de
reacción es aquella en donde la velocidad de
reacción es máxima. (Peña, A. Arroyo, A. Gómez, A.
Tapia, R. 2004).
Por último, el factor que tampoco se puede dejar de
lado dentro de los que interfieren en las reacciones
enzimáticas, son los productos de estas, se supone
que en una reacción, la sustancia que se necesita
son generalmente los productos de dichas
reacciones, sin embargo, en un proceso metabólico
existe lo que se llama una retroalimentación
negativa, esto quiere decir que el exceso de
productos no será favorable, sino que la reacción
será bloqueada por estos, impidiendo a la enzima a
volver a unirse con sustratos, actuando como un
inhibidor, este es uno de los mecanismos más
importantes de regulación metabólica. (N.
Campbell. 2001).
Metodología
Antes de que se procediera a llevar a cabo los
distintos procedimientos, era necesario extraer la
fosfatasa ácida, la cual consistía en pesar 10
gramos de germen de trigo y agregarlos a 50 ml de
agua fría, después de esto, se agitó la mezcla hasta
que se obtuvo una suspensión uniforme. Se dejó en
reposo por 30 minutos y luego se decantó por otros
15 minutos. La solución requerida es sin residuos, ni A. Determinación de tiempo óptimo de
precipitado, este fue entonces el extracto crudo de incubación.
fosfatasa ácida.
Se prepararon las siguientes mezclas de reacción
- Curva calibración fosfato inorgánico
Se prepararon las siguientes soluciones. Tabla 3: Volúmenes de reactivos para tiempo óptimo
Buffer Extrac
β-glicero
Tabla 1. Volumen de reactivos para la preparación de la citráto to
fosfato Agua
Tubo 0.1 M de enzim
curva de calibración de fosfato inorgánico. de sodio (ml)
pH 5.3 ático
(ml)

Mezcle bien los tubos y agregue

Patrón de (ml) (ml)
Agua Ácido
Tubo fosfato Blanco buffer
(ml) molíbdico (ml)
mg/ml (ml) (BB) 5.6 – 2.4 –

a continuación
B – 4.0 0.5
Blanco
1 0.1 3.9 0.5
sustrato (BS) 5.6 1.6 0.8 –
2 0.2 3.8 0.5
3 0.3 3.7 0.5 Blanco
4 0.4 3.6 0.5 enzima (BE) 5.6 – 1.6 0.8
5 0.5 3.5 0.5
Tiempo
5.6 1.6 – 0.8
reacción (TR)
Se agitaron bien los tubos y se dejaron reposar Se mezclaron muy bien y se dejó incubar a
durante 3 minutos, después de esto se adicionaron temperatura ambiente; el blanco de buffer (BB) y el
0,5ml de la solución de ácido ascórbico a cada tubo blanco de sustrato (BS) se dejaron reaccionar por
expuesto en la figura 1. Con ayuda del vortex, se
30 minutos, pasado el tiempo se tomaron pequeños
mezclaron muy bien y se dejaron reposar otros 10 volúmenes de 1ml y se virtieron sobre ácido
minutos, para permitirle a la reacción que tricloroacético al 10%.
desarrollara el calor. Se determinó la absorbancia a
660nm. Además de esto, durante los 30 minutos que se
mantuvieron en incubación BB y BS, se tomaron
- A.1. Determinación de cantidad de fosfato por
muestras de 1ml de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20 y
acción de fosfatasa ácida.
30 minutos, todas estas se virtieron en tubos que
contenían 1ml de tricloroacético al 10%, después de
Se agregaron los siguientes reactivos en todos los
esto se agitaron y centrifugaron a 4000 rpm durante
casos, en el orden indicado.
3 minutos.

Tabla 2: Volúmenes de sustancias para determinación de

Se determinó la cantidad de fosfato producido en el
fosfato.
sobrenadante, ajustando el 100% de temperatura
Sobrenadante de la reacción
0.5 ml (cero en ABS) con el tubo BB y siguiendo el
enzimática
Agua destilada 3.5 ml procedimiento A1.
Ácido molíbdico 0.5 ml Desde este punto, se pararon las reacciones en
cada tubo, al momento que se cumplen los 10
Se agitó bien y se dejó reposar por 3 minutos; minutos de adicionarles la enzima.
después se adicionaron 0,5 ml de ácido ascórbico.
Se agitó bien con ayuda del vortex y se dejó reposar B. Determinación del pH óptimo
por 10 minutos. Se hizo la lectura de absorbancia a
660nm en todos los casos que se emplearon este Se realizaron las siguientes soluciones, según la
procedimiento, esto, con el fin de hallar la cantidad figura a continuación.
en forma de concentración de fosfato.
 Tabla 4: volúmenes utilizados para pH óptimo extracto preparado al inicio del procedimiento, el
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 tiempo de reacción fue de 10 minutos y la
Sustrato
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 temperatura de incubación fueron diferentes,
(ml)
Buffer
dependiendo a la que corresponda, tal como se
2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 muestra en la figura 6 a continuación.
(ml)
pH del
5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2
buffer Tabla 6. Temperaturas utilizadas para la
determinación de la temperatura óptima.
Con respecto a lo anterior, el sustrato corresponde
Temperatura, °C Medio
a la solución de *-glicerofosfato de sodio 0,1M. La
0 Agua – Hielo
solución buffer de citrato 0,1 M a diferentes pH. La
18 Temperatura ambiente
enzima utilizada fue el extracto crudo que se 37 Termostato
preparó al principio de la práctica. Y el tiempo de 60 Termostato
reacción correspondió a 10 minutos. 98 Agua en ebullición

Se mezcló todo muy bien e inmediatamente se
agregó la enzima, esta vez con intervalos de 30
segundos. Se le agregaron 0,2 ml de enzima a los
tubos desde el BE hasta el tubo 6 y con ayuda del
vortex, otra vez se aseguró que se homogeneizara
bien y se dejó incubando durante 10 minutos a
temperatura ambiente, después de este tiempo se
le agregaron 2 ml de ATA al 10% de concentración.
Se mezcló, se centrifugó a 4000 rpm durante 3
minutos.
Se descartó el precipitado y sobre el
sobrenadante de todos los tubos, se determina la
concentración por medio del procedimiento A1.
C. Determinación de la temperatura óptima
Las soluciones se mezclaron bien y se les agregó
0,2ml de la enzima en intervalos de 30 segundos,
exceptuando a los tubos BB y BS.
Con ayuda del vortex, se agitaron nuevamente y se
dejaron todos los tubos en incubación por 10
minutos. Pasado este tiempo, se adicionó 2 ml de
ATA a todos los tubos al 10% y se centrifuga a 4000
rpm durante 3 minutos. Después de esto, se
descartó el precipitado y se determinó la
concentración de fosfato inorgánico, por medio del
procedimiento A1.
D. Concentración de la enzima en la velocidad de
reacción.

Se prepararon las siguientes soluciones de acuerda Se realizaron las siguientes soluciones, tal como se
la figura a continuación. muestra en la figura 7.

Tabla 5. Volúmenes de reactivos para prueba de Tabla 7. Volúmenes empleados para la determinación del
temperatura óptima. efecto de concentración de la enzima.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
Buffer
1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 Buffer
(ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
(ml)
Sustrato
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Sustra
(ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Agua to (ml)
0.6 0.2 0.4 – – – – –
(ml) Agua
0.8 0.4 0.75 0.35 0.30 0.25 0.10 –
Temper (ml)
atura 18 18 18 0 18 37 60 92
°C
De acuerdo a la figura anterior, la solución buffer se
indicó que era de citrato, 0,1M pH 5,3, el sustrato
De acuerdo a la figura 5, la solución buffer fue de
era una solución de b-glicerofosfato de sodio 0,1M,
citrato 0,1M, ph 5,3. El sustrato fue una solución de la enzima fue el extracto preparado al inicio del
b-glicerofosfato de sodio 0,1M, la enzima fue el
procedimiento, el tiempo de reacción es de 10
 minutos y la temperatura de reacción fue ambiente.
Se mezcló bien y se adicionó la enzima de acuerdo
a la siguiente figura,
Tabla 8. Adición de enzima para determinación de efecto
de concentración.
indican la cantidad y concentración a adicionar. La
enzima utilizada fue la misma que en los otros
procedimientos, el extracto crudo del procedimiento
primero, el tiempo de duración de la reacción es de
10 minutos y la temperatura fue la ambiente.

Enzima (µl) – – 50 50
Con ayuda del vortex, se agitaron bien y se dejaron
en incubación por el tiempo mencionado
anteriormente, pasado este tiempo, se adicionaron
a todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se
centrifugaron a 4000 rpm durante 3 minutos. En el
sobrenadante de todos los tubos se determina la
concentración de fosfato inorgánico, mediante el
procedimiento A1.
E. Efecto de la concentración de sustrato en la
constante de Michaelis.
Se prepararon las siguientes soluciones con el fin de
determinar el efecto que tiene el sustrato en la
velocidad de reacción de acuerdo a la constante
Km.
100 150 300 400 Se mezcla todo bien y se agrega la enzima 0,2 ml a
los tubos desde el BE hasta el 8, en intervalos de 30
segundos. Después de esto, con ayuda del vortex
se agita muy bien y se deja incubar, pasado este
tiempo se adicionaron 2 ml de ATA al 10% a todos
los tubos y se centrifugaron a 4000 rpm durante 3
minutos. En el sobrenadante de todos los tubos se
determinó la concentración de fosfato inorgánico,
siguiendo los pasos del procedimiento A1.
F. Efecto de la presencia de inhibidor en la
velocidad de reacción.
Se utilizaron los siguientes volúmenes para las
soluciones requeridas.
Tabla 10. Volúmenes utilizados para la determinación del
efecto de la concentración del sustrato con inhibidor en la
velocidad de reacción.
B B
Tubo

Tabla 9. Volúmenes de reactivos para la determinación BS 1 2 3 4 5 6 7 8

B E
de concentración de sustrato.
1. 1. 1. 1. 1.
Buffer

B
(ml)

1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Tubo

BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8 2 2 2 2 2
B
ar* (ml)

0. 0. 0.
adicion

Sustrat

1. 1. 1. 1.
Buffer

o a

– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8

(ml)

1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 4 4 4

4 4 4 4

0. 0. 0. 10 10
adicion

Sustrat

conce
mM

– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8 – 5 – 5 10 20 40 60 80

[S]
oa
ar*

n*

4 4 4 0 0

10 10 1. 0. 0. 0. 0.
concen
[S} mM

Agua
(ml)

– 5 – 5 10 20 40 60 80 0.6 0.4 0.4 0.4 0.4 –

2 8 4 4 4
*

0 0

1. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0.
Inhibid
or (ml)
Agu
(ml)

0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
a

0 4 4 4 2 2 2 2

La solución buffer fue de citrato 0,1M y pH 5,3, el
sustrato fue una solución de b-glicerofosfato de
sodio de diversas concentraciones, en el rango de 5
- 100mM, esto se ve en la figura número 9 en la
casilla de “concentración*” donde indica la
concentración a adicionar en cada tubo distinto, esta
fila se debe mirar en conjunto con la casilla que dice
“sustrato”, pues ambas, complementariamente,
De acuerdo a la figura 11, la solución de buffer fue
de citrato 0,2 M con pH de 5,3, en cuanto al sustrato
es una solución de b-glicerofosfato de sodio de
diversas concentraciones, en la casilla de sustrato
se indica los mililitros a adicionar y en la de
concentración* [S] se indica la respectiva
concentración a la que debe estar el sustrato de
acuerdo al tubo que corresponda, la enzima fue la
del extracto preparada en el primer procedimiento,
el tiempo de reacción fue de 10 minutos, la Absorbancia VS
temperatura fue la de ambiente y el inhibidor Concentración
correspondiente fueron 5mg/ml de HgCl2. 0.500

Absorbancia
Se mezcló todo muy bien e inmediatamente se 0.400
agregó 0,2ml de la enzima con intervalos de 30 0.300
segundos a todos los tubos excepto a los de BB y 0.200 y = 4.8702x - 0.0034
BS, con ayuda del vortex se homogeneizaron mejor 0.100 R² = 0.9999
las soluciones y se dejaron en incubación. Después 0.000
0.000 0.050 0.100 0.150
de este tiempo, se adicionaron 2ml de ATA a todos
Concentración (mg/mL)
los tubos al 10% y se centrifugaron a 4000 rpm
durante 3 minutos, en el sobrenadante resultante de
todos los tubos, se determina la concentración de De esta gráfica, se puede usar la ecuación de la
fosfato inorgánico, de acuerdo al procedimiento A1. recta (Abs = 4,8702 [s] -0,0034) para conocer las
contracciones iniciales de la enzima y del sustrato,
Análisis y resultados.
respectivamente.

Curva calibración fosfato inorgánico. Con estos resultados es posible hallar la

Para la realización de la curva de calibración se concentración y obtener la ecuación de la curva de
analizaron 5 tubos de ensayos con cantidades de calibración, esta con el fin de utilizarla para
patrón de fosfato distintos. interpolar los valores en la cantidad de fósforo
producido por acción de la fosfatasa ácida y de esta
Tabla 11. Datos de concentración y absorbancia
manera encontrar la concentración de fósforo en
obtenidos en el laboratorio.
dichas soluciones, de una manera gráfica y no con
Concentración
Tubo Absorbancia la ecuación.
(mg/mL)
1 0,020 0,093 A. Determinación de tiempo óptimo de
2 0,039 0,185 incubación.
3 0,059 0,284 En primer lugar, para determinar la velocidad de
4 0,078 0,376 reacción a distintos tiempos de incubación, se mide
5 0,098 0,473 la absorbancia en los tubos con soluciones a
diferentes tiempos, esta se reemplaza en la
De acuerdo con la tabla anterior, se logra determinar ecuación obtenida en la curva de calibración, para
cada concentración de fosfato inorgánico diluido en determinar la concentración contenida en cada tubo.
cada uno de los tubos de ensayos, utilizando la Las enzimas pueden llegar a deteriorar su actividad
fórmula mostrada a continuación. dependiendo que tanto tiempo reaccione con el
medio, por lo tanto se pretende determinar cuál es
V1C1 = V2C2 el tiempo óptimo de incubación con esta prueba.
Ecuación 1. Concentración de fósforo en diferentes
volúmenes.
Tabla 12. Valores de absorbancia para tiempo real
de blanco de la enzima.
Se realiza una gráfica para analizar el
comportamiento de la absorbancia vs la
concentración hallada, expresada en la tabla
anterior.

Gráfica 1. Curva de calibración de fosfato patrón

 desnaturaliza, es por esto que el tiempo óptimo es
Tiempo Absorbancia tan corto y tiende a cero.
(min) BE TR
B. Determinación del pH óptimo
2 0,389 0,440
5 0,419 0,524 Para la determinación de la concentración de cada
10 0,485 0,618 tubo, se mide la absorbancia de cada tubo con un
15 0,515 0,519 medio de pH distinto y se reemplaza en la ecuación
20 0,530 0,477 resultante utilizando la curva de calibración,
arrojando los siguientes resultados,
30 0,442 0,870
Tabla 14. Resultados de absorbancia,
Luego se procede a hallar la diferencia entre TR y concentración para pH distintos y Vo.
BE para determinar la verdadera absorbancia en Vo
nanómetros, que permite realizar el cálculo de la Tubo pH Absorbancia Corrección [S] (mg/mL)
(mg/mL)/
concentración de fosfato en cada tiempo y así BS 5,3 0,006 - 0 -
concluir en que tiempo se genera un mayor BE 5,3 0,647 - 0 -
rendimiento. 1 3,0 0,584 0 0 0
2 4,0 0,667 0,020 0,005 0,0005
Tabla 13. Valores de absorbancia y concentración de 3 5,0 0,693 0,046 0,010 0,0010
fósforo liberado. 4 5,3 0,768 0,121 0,026 0,0026
Tiempo [s] Vo 5 5,6 0,706 0,059 0,013 0,0013
(min) Absorbancia (mg/mL) (mg/mL)/min 6 6,2 0,762 0,115 0,024 0,0024
2 0,051 0,011 0,0056
5 0,105 0,022 0,0045 Para el cálculo de velocidad inicial de reacción
10 0,133 0,028 0,0028 expresado en la tabla anterior, se realiza con la
15 0,004 0,002 0,0001 siguiente fórmula,
20 0,000 0,000 0,0000
30 0,428 0,089 0,0030 V0=[Concentración] / tiempo
Ecuación 2. Velocidad de reacción en función de la
concentracion y tiempo correspondiente.
Gráfica 2. Gráfica de tiempo óptimo de incubación.

Velocidad vs tiempo Se toma un tiempo de 10min para cada uno de los

tubos y las concentraciones especificadas en la
0.006
Vo (mg/mL)/min

0.004
0.002
0
0 10 20
Tiempo (min)
Como se puede ver en la tabla anterior, el tiempo
óptimo de reacción se encuentra en los primeros 10
minutos, mientras menor es el tiempo de reacción,
mayor es la actividad enzimática, ya que se
encuentra una pendiente más alta y constante en
este rango de tiempo, esto quiere decir que hay un
mayor valor velocidad. La relación enzima –
proteína si no está en su temperatura óptima se
tabla 14.
Se realiza una curva de pH vs velocidad inicial para
establecer el pH óptimo de la reacción, este
30 40
parámetro es muy importante debido a que
especifica la cargas de los residuos de los
aminoácidos que pueden influenciar la estructura de
una enzima y como consecuencia su actividad
catalítica. Teóricamente la reacción tiene una mayor
actividad a medida que el pH aumenta, dentro del
rango de los ácidos, en este punto la ionización del
sitio activo de la enzima aumenta gradualmente
también, ya que existen más grupos de ácidos
carboxílicos ya ionizados y hace que para la enzima,
sea mucho más fácil enlazarse con los sustratos. El
punto máximo se establece entre 4 y 6 porque es
donde se encuentra la mayor cantidad de hidronios Corrección Vo
para protonar la sustancia. (F. B. Armstrong. 1982). Tubo Absorbancia [S] (mg/mL) Temperatura
absorbancia (mg/mL)/min
BS 0,0055 0,009 0,003 18 0,0003
Gráfica 3. Curva de pH vs Vo. BE 0,369 - 0,000 18 0,0000
1,0 0,574 0,205 0,043 0 0,0043
pH vs Vo 2,0 0,444 0,075 0,016 18 0,0016
0.003 3,0 0,5275 0,1585 0,033 37 0,0033
0.0025 4,0 0,6095 0,2405 0,050 60 0,0050
0.002 5,0 0,607 0,238 0,050 92 0,0050
0.0015
Vo

0.001
0.0005 A cada concentración obtenida, fue necesario
0 dividirla sobre el tiempo (el cual es 10min para todos
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 los tubos), para así, conseguir los datos de
pH velocidad a cada concentración a distintas
temperaturas.

De acuerdo a la gráfica 3, tenemos que el punto Gráfica 4. Velocidad inicial de reacción vs temperaturas
máximo de pH efectivamente se encuentra entre los distintas.
puntos 5 y 6, se acerca bastante a la literatura, ya
que como se dijo anteriormente, se encuentra en el Velocidad vs Temperatura
rango establecido. La razón por la que sigue siendo 0.0060
Vo (mg/mL)/min

ácido el medio en el que la reacción tiene su mayor 0.0050

0.0040
actividad, es debido a que está almacenada por 0.0030
lisosomas, quienes reaccionan con endosomas, los 0.0020
cuales poseen un pH ácido. 0.0010
0.0000
0 20 40 60 80 100
C. Determinación de la temperatura óptima.
Temperatura (°C)

Al igual que en el procedimiento de pH, para

determinar la temperatura óptima en la que se
Para la determinación óptima de la temperatura en
obtiene la mayor velocidad de reacción, se calculan
esta reacción, en cuanto a la gráfica, a temperaturas
las concentraciones, por medio de la curva de
mayores de 50ºC la enzima comienza a
calibración donde se reemplazan los datos de
desnaturalizarse, lo que indica que habrá una
absorbancia obtenidos en el laboratorio por cada
pérdida de actividad enzimática. Esta variable es
tubo, luego, se hace una corrección en estos datos
una de las más importantes en términos de medio
de absorbancia, esto quiere decir que se le resta el
óptimo para que la reacción se lleve a cabo.
dato que corresponde al blanco de la enzima. Desde
Hipotéticamente, el punto máximo de temperatura
ahí las concentraciones correspondientes y las
debe estar entre los 35 y 45ºC, en este punto, se
velocidades de reacción, en medios con
encuentra el mayor número de colisiones de enzima
temperaturas distintas, los datos arrojados fueron
- sustrato, incrementando el producto deseado. (F.
los de la siguiente tabla.
B. Armstrong. 1982)
En la gráfica número 4 se puede ver que el punto
Tabla 15. Datos de absorbancia corregida, concentración
máximo de temperatura esta entre los 50 y 65ºC lo
y velocidad de reacción a distintas temperaturas.
cual no se aleja mucho de la literatura de las
velocidades de reacción encontradas, pero si se ve
una inconsistencia en los resultados obtenidos, ya
que uno de los puntos máximos esta en los 60°C, a
esta temperatura la enzima debería
desnaturalizarse, es falso que en este punto tendría
su mayor punto de actividad enzimática. Velocidad VS Concentración
Este tipo de errores en los resultados se deben a las enzima
fallas experimentales que se tiene al momento de 0.03

Vo (mg/mL)/min
llevar a cabo la práctica. y = 0.0527x - 0.0011
0.02 R² = 0.9866
Del mismo modo, cabe resaltar que la actividad
0.01
enzimática está directamente relacionada con la
temperatura en la que se desenvuelve la reacción, 0
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50
el aumento de la actividad enzimática está atada al
punto en donde la temperatura es óptima, si la Concentración enzima (mL)
temperatura es menor o mayor a este punto, no se
encontrará en la máxima posible.
De acuerdo a la gráfica anterior, se puede decir que
a mayor concentración de enzima, mayor es la
D. Efecto de la concentración de la enzima en la
velocidad que habrá en la reacción, como se
velocidad de reacción
muestra en la gráfica, la velocidad máxima
representada, corresponde a una concentración de
Para esta parte de la práctica, se mide la
0,4mL de enzima. Otro punto importante que
absorbancia para las distintas concentraciones de
resaltar, es que, como se sabe, a medida que la
enzima que se tenía en cada tubo, esta
velocidad aumenta, la concentración de enzima
concentración se reemplaza en la ecuación que se
también incrementa, pero hasta que se aproxima de
obtiene de la curva, graficando absorbancia vs
forma asintótica a una velocidad máxima (F. B.
concentración, de esta manera se obtienen los
Armstrong. 1982), esto es imposible verlo en esta
siguientes resultados.
práctica experimental, ya que se necesitan más
puntos para poder ver la asíntota, solo con 5 puntos
Tabla 16. Datos de Absorbancia para diferentes
no se puede ver el fenómeno.
concentraciones de enzima.
Enzima Corrección Vo
Tubo [S] (mg/mL) E. Efecto de la concentración de sustrato,
(mL) Absorbancia absorbancia (mg/mL)/min
determinación de la constante de Michaelis
BS - 0,551 - - -
BE 0,05 0,110 - - -
(KM).
1,0 0,05 0,148 0,038 0,009 0,0009
2,0 0,10 0,291 0,181 0,038 0,0038 Para el cálculo de la constante de Michaelis, se
3,0 0,15 0,503 0,393 0,081 0,0081 prepararon diferentes soluciones a distintas
4,0 0,30 0,853 0,743 0,153 0,0153 concentraciones de sustrato, a las cuales se les
5,0 0,40 1,047 0,937 0,193 0,0193 mide la absorbancia con la ecuación de la curva de
calibración, es importante corregir la concentración
Para cada concentración obtenida, se le resta el de sustrato que se utiliza en
blanco del sustrato y enzima y se divide sobre el Teniendo datos del prefijo anterior, se realiza la
tiempo el cual para todos los tubos es 10 min, de gráfica de concentración vs velocidad inicial de
esta manera se obtuvieron los datos de velocidad y reacción, con el fin de calcular el Km, usando el
concentración expresados en la tabla anterior. intercepto con el eje y la pendiente de la gráfica,
Con estos datos, se analiza la gráfica de velocidad cabe aclarar que esto se hace con los datos de la
de reacción versus concentración de enzima. gráfica ya linealizada.
Antes de realizar los cálculos y todo lo anterior
Gráfica 5. Velocidad de reacción vs distintas establecido, es necesario hacer una corrección en
concentraciones de enzima. las unidades de sustratos, conociendo su peso
molecular:
B-glicerofosfato de sodio = 216,04 mol/g
 1𝑀 1𝐿 1𝑔 Debido a que en la anterior gráfica no se cuenta con
𝑥𝑚𝑀 = ( )∗( )∗( )
1000𝑚𝑀 1000𝑚𝐿 216,04 𝑚𝑜𝑙/𝑔 los suficientes puntos para analizarla por medio de
1000𝑚𝑔 Michaelis – Menten, es necesario hacer una
∗( )
1𝑔 corrección, hora graficamos los inversos de la
Ecuacion #, Conversión de unidades de sustrato a velocidad y concentración de sustrato, con el fin de
concentración del mismo. lograr linealizar la gráfica para determinar el Km ya
con las unidades corregidas.
Donde x es la respectiva concentración de sustrato
que se utilizó para hacer las diluciones.
Gráfica 7. Concentraciones de sustrato vs Velocidades
C1V1 = C2V2 linealizadas.
C2 = C1V1 / V2
Ecuación #, Concentración real de sustrato 1/Vo VS 1/[S]
140

1/Vo ((mg/mL)/min)^-1
Ahora, aplicando la ecuación anterior, las nuevas 120
concentraciones de sustratos serán, 100
80
Tabla 17. Nuevas concentraciones de sustrato y 60
velocidades de reacción. y = 4.0903x + 109.69
40 R² = 0.73
[S] mg/mL [S] Vo 20
Tubo Absorbancia
Agregado mg/mL (mg/mL)/min
0
BS - 0,020 - - 0 2 4 6
BE 0 0,407 - 0
1/[S] (mg/mL)^-1
1,0 0,196 0,382 0,079 0,008
2,0 0,393 0,380 0,079 0,008
3,0 0,786 0,409 0,085 0,008 Al linealizar la gráfica anterior, ***Cálculo de Vmax y
4,0 1,571 0,395 0,082 0,008
Km
5,0 2,357 0,425 0,088 0,009
6,0 3,142 0,498 0,103 0,010
F. Determinación de la velocidad de reacción en
7,0 3,928 0,451 0,093 0,009
8,0 3,928 0,458 0,095 0,009
presencia de inhibidor.

Para esta última parte, se midió la absorbancia de

Se grafica el comportamiento de la velocidad inicial
los tubos, donde cada uno de estos tenía la misma
vs la concentración de sustrato corregido
cantidad de inhibidor a una concentración distinta de
sustrato, se reemplazan estos datos en la ecuación
Gráfica 6. Velocidad inicial vs concentración de sustrato.
obtenida en la curva de calibración, para determinar
Vo vs [S] la concentración de cada tubo, como se ha venido
haciendo para todos los procedimientos. Es
0.012
Vo (mg/mL)/min

0.01 necesario restar el blanco sustrato y enzima y

0.008 dividirlo entre el tiempo de reacción, el cual es 10
0.006 minutos para cada tubo,
0.004
0.002
Tabla 18. Concentración del sustrato y velocidades de
0
0 2 4 6 8 10 reacción.
[S] mg/mL
 [S] mg/mL [S] Vo
Tubo 1/[S]
Agregado Absorbancia mg/mL (mg/mL)/min Tubo 1/Vo
BS - 0,002 - - 1 5,1 113,2
BE 0,000 0,913 - - 2 2,5 109,6
1 0,196 0,427 0,088 0,009
3 1,3 103,8
2 0,393 0,441 0,091 0,009
4 0,6 87,8
3 0,786 0,466 0,096 0,010
4 1,571 0,551 0,114 0,011 5 0,4 96,2
5 2,357 0,503 0,104 0,010 6 0,3 95,0
6 3,142 0,509 0,105 0,011 7 0,3 73,6
7 3,928 0,658 0,136 0,014 8 0,1 93,8
8 7,856 0,516 0,107 0,011
La gráfica número , se adapta a un modelo que
Se grafican los datos de velocidad inicial vs la estudia este comportamiento en cuanto a las
concentración de sustrato en presencia del velocidades y concentraciones de sustrato, este se
inhibidor, llama Michaelis-Menten. (Daniel L, R. Donald.
2000). Donde por medio de una ecuación, se
Gráfica 8. Grafica Vo vs [S] con presencia de linealiza la figura anterior y queda de la siguiente
inhibidor. manera,

Vo vs [S] Gráfica 9. Gráfica linealizada de concentración de

0.015 sustrato vs velocidad de reacción.
Vo (mg/mL)/min

0.01
1/Vo vs 1/[S]
0.005
140
0
1/Vo ((mg/mL)/min)^-1

120
0 2 4 6 8 10
[S] mg/mL 100

80

60
Al tener estos datos, es necesario linealizarlos ya
40 y = 3,9964x + 95,4
que no se tienen los datos necesarios para analizar
R² = 0,8759
el comportamiento de la gráfica, por lo tanto se 20
acude a Lineweaver Burk, donde se saca el inverso
0
de la concentración de sustrato y la velocidad inicial, 0 2 4 6
obteniendo los siguientes resultados. 1/[S] (mg/mL)^-1

Tabla 19. Datos obtenidos de velocidad y concentración Conclusiones.

de sustratos linealizados.

BIBLIOGRAFÍA.
- Garrido, A. Teijón, J. Blanco, D. Villaverde,
C. Mendoza, C. Ramirez, J. (2006).
“Fundamentos de bioquimica estructural”.
Editorial Tébar, S. L. Madrid, España.
- Daniel, L. R, Donald. (2000). “Handbook of East Java, Indonesia.
biochemical Kinetics”. Academics Press.
Gainessville, Florida, EE UU. - F. B. Armstrong. (1982). “Bioquímica”. Ed.
REVERTÉ S.A. Barcelona, España.
- Roosdiana A. Prasetyawan, S. Mahdi, C.
Sutrisno. (2013). “Production and - Capbell, Neil A. (2001) “Biología: Conceptos
characterization of Bacillus firmus y Relaciones” 3a ed. Pearson Education,
Pectinase”. Laboratory of Biochemistry, Mexico.
Faculty of mathematics and Natural
Science. University of Brawijaya. Malang,
-