I.

Tahapan Isolasi DNA

Adapun tahap-tahap dalam isolasi DNA, yaitu:

1. Isolasi jaringan
Tahapan pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan
yang ingin digunakan.
2. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel
dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan
lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel
atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan karena substansi gen
yang diinginkan ada didalamya. Penambahan larutan pelisis sel ini
bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel
yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari
kompoen – komponen lainnya yang tidak berfungsi.
3. Pengesktraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatant yang terbentuk dibuang dan kemudian
dilakukan ekstraksi didalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar
didapat ekstrak
4. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat
– zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan
diinkubasi selama 10 menit pada suu 65ᴼC. Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh
temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan
kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
5. Presipitasi
Tahap akhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan
protein histon, sehingga untai – untai DNA tidak menggulung (coiling)
dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi
terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan
presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk
menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas
 ammonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
(Arrizqi, 2014)

II. Tahapan Isolasi RNA

Adapun tahap-tahap dalam isolasi RNA menurut beberapa metode yang ada,
yaitu:
A. Metode Modifikasi Guanidin Tiosianat
1) Sampel dari Jaringan
a) Bekukan jaringan di dalam nitrogen cair atau dry ice
segera setelah pemotongan. Jaringan tahan disimpan
selama beberapa bulan pada suhu -80°C.
b) Potong jaringan yang telah beku menjadi potongan-
potongan kecil (kurang dari 0,5 cm kubus) dan
pindahkan ke dalam tabung, sesuai dengan jumlah
jaringannya (jangan gunakan tabung polikarbonat
dengan guanidine thiocyanate). Tambahkan 1 mL
larutan GTC (guanidium thiocyanate 4 M, sodium sitrat
25 mM, pH 7.0, sarkosyl 0,5%, 2-mercaptoethanol 0,1
M, simpan di tempat yang terhindar dari cahaya) per
100 mg jaringan.
c) Homogenisasi jaringan dengan ditusuk-tusuk
menggunakan jarum suntik ukuran 18-21. Jika jaringan
sulit untuk dihancurkan, dapatdigunakan homogenizer,
atau dapat digerus dengan menggunakan mortal dan alu
dengan nitrogen cair.
2) Sampel dari Kultur Sel
a) Cuci sel dengan menggunakan larutan phosphate buffer
saline (PBS) dingin dan pindahkan ke tabung
mikrosentrifuge steril.
b) Centrifuge 1.000 rpm selama 10 menit dan tambahkan
secukupnya larutan GTC (1 mL per 107 sel).
c) Setelah kedua proses di atas selesai, kemudian
dilanjutkan dengan isolasi RNA
d) Tambahkan larutan berikut untuk homogenisasi dan
campur dengan cara membolak-balikkan tabung setelah
ditambahkan masing-masing reagen (semua jumlah dan
volume pada prosedur ini ditujukkan untuk 100 mg
jaringan atau 107 sel): 0,1 mL sodium asetat 2M (pH
4,0), 1 mL fenol asam (pH 5,0) dan 0,2 mL kloroform.
e) Kocok suspensi selama 30 detik.
f) Inkubasi di es selama 15 menit.
g) Centrifuge sampel 10.000 rpm selama 20 menit pada
suhu 4ºC.
h) Pindahkan fase cair bagian atas (mengandung RNA) ke
tabung baru. Pastikan jangan mengganggu interfase
yang mengandung protein dan DNA.
i) Tambahkan 1 mL isopropanol100% ke fase cair,
campur dan endapkan RNA dengan cara diinkubasi
pada suhu -20°C selama 1 jam.
j) Sentrifuge 14.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C.
k) Resuspensi pellet RNA dalam 0,5 mL larutan GTC dan
pindahkan ke tabung mikrosentrifuge 1,5 mL yang
baru.
l) Endapkan RNA dengan menambahkan 0,5 mL
isopropanol 100% dan inkubasi pada -20°C selama 1
jam.
m) Centrifuge selama 10 menit pada suhu 4°C (14.000
rpm), cuci pelet RNA dua kali dengan ethanol 70% dan
keringkan presipitat.
n) Resuspensi RNA di dalam 50 μl RNase-free water atau
buffer TE. Jika mRNA akan diisolasi, resuspensi di
dalam 5 mL STE/NaCl0,5 M / Proteinase K (200
μg/mL) dan proses dengan prosedur seleksi poly (A)+.
 RNA dapat disimpan pada suhu -80°C selama beberapa
bulan. Untuk penyimpanan yang lama, RNA sebaiknya
disimpan di formamida.

B. Metode Kromatografi Selulosa Oligo-deoxythymine (DT)

a) Siapkan selulosa oligo (dT) (Boehringer or equivalent).
b) Cuci 1 g selulosa oligo (dT) dalam 50 mL NaOH0,2 M, di air
steril selama 30 menit pada suhu ruangan pada rotating wheel.
Netralisasi dengan pencucian 2x di dalam 50 ml Tris-HCl
500mM (pH 7,4), diikuti 6 kali dibilas di air steril. Lalu cuci
dengan 50 mL RNA preparation binding buffer untuk
menyamakan konsentrasi garam, pulihkan dengan sentrifugasi
dan kemudian resuspensi dalam 50 mL RNA preparation
binding buffer.
c) Resuspensi RNA total dalam 5 mL STE/ NaCl 0,5 M/
Proteinase K 200 μg/mL dan tambahkan 0,25 mL selulosa
oligo (dT). Biarkan RNA untuk berikatan, inkubasi selama 1
jam pada rotating wheel pada suhu ruangan.
d) Selulosa oligo (dT) dalam lisat disentrifuge pada kecepatan
2.000 rpm selama 1 menit. Buang supernatan dan resuspensi
lagi dalam 15 mL buffer pengikat. Ulangi tahap ini dua kali
untuk menghilangkan RNA yang tidak berikatan (utamanya
ribosomal RNA).
e) Pindahkan selulosa oligo (dT) ke alkali-treated econo-column
(BioRad®). Kolom dengan perlakuan alkali ini akan diperoleh
dengan mencuci kolom dengan NaOH 0,2 M, kemudian diikuti
dengan bufer pengikat secukupnya.
f) Cuci selulosa oligo (dT) dengan 10 mL RNA preparation
binding buffer diikuti dengan 2 mL RNA preparation washing
buffer.
g) Larutkan RNA dengan 1 mL RNA preparation elution buffer.
Etanol akan mengendapkan RNA dengan ditambahkan 100 μL
NaCl 5M dan 2,5 mL etanol 100%. Bekukan pada suhu -20°C.
 h) Bolak-balikkan RNA, cuci 2x dengan etanol 70%, keringkan
pelet RNA dan resuspensi dalam sejumlah volume RNase-free
water atau buferTE. Gunakan aliquot untuk ukuran OD
260/280. Simpan pada suhu -80°C.
i) Untuk memperbaharui selulosa oligo (dT), cuci RNA dalam
sejumlah volume RNA preparation elution buffer, re-treat
dengan NaOH 0.2 M, bolak-balikkan dan resuspensi dalam
Tris-HC1 500 mM (pH 7,4). Cuci selama 15 menit, putar, cek
pH supernatan dan resuspensi lagi dalam Tris-HC1 500 mM
(pH 7.4) jika pH-nya masih basa. Resuspensi selulosa oligo
(dT) yang telah dinetralisasi di air steril, cuci untuk
menghilangkan garam, putar lagi, dan resuspensi di etanol
absolut. Simpan pada suhu -20°C, jauhkan dari cahaya.

C. Metode Trizol ( Modifikasi Guanidin tiosianat )

a) Campurkan ke dalam microtube 1,5 mL, 1 mL Trizol dan 250
uL suspensi sampel, kocok dan inkubasi 5 menit pada suhu
kamar.
b) Tambahkan 200 uL kloroform, kocok, dan inkubasi pada suhu
kamar 10-15 menit.
c) Centrifuge pada kecepatan 13,000 rpm selama 15 menit pada
2-8°C.
d) Pindahkan cairan bening berisi RNA ke dalam tabung 1,5 uL
yang baru
e) Tambahkan 500 ul isopropanol, kocok dan inkubasi pada suhu
kamar selama 10 menit.
f) Centrifuge pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit pada
4°C. Presipitasi RNA akan membentuk pelet seperti gel pada
dasar tabung
 g) Buang supernatan secara hati-hati dengan menggunakan
mikropipet
h) Cuci pelet dengan menambahkan 1 mL etanol 75% dingin.
i) Centrifuge dengan kecepatan 13,000 rpm selama 15 menit pada
suhu 2-8°C.
j) Buang supernatan secara hati-hati dengan menggunakan
mikropipet
k) Keringkan pelet di udara hingga tidak ada residu etanol
l) Larutkan RNA dalam 10-100 uL Rnase-free water (DEPC
WATER),
m) Setelah proses isolasi selesai, kemudian dilanjutkan dengan
analisis

D. Metode Langsung Isolasi RNA menggunakan Reagen kit

a) Lakukan ekstraksi RNA di BSC Class II dengan menggunakan
APD
b) Siapkan Buffer AVL yang dicampur dengan carrier RNA-AVE
c) Masukkan 560 uL buffer AVL yang telah dicampur carrier
RNA-AVE ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL.
d) Tambahkan 140 uL sampel ke dalam tabung tersebut. Vortek
dengan hati-hati kurang lebih 15 detik
e) Inkubasi pada suhu kamar (15-250C) selama 10 menit.
f) Tambahkan 560 uL etanol, vortek kemudian centrifuge dengan
kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
g) Pindahkan 630 uL campuran tersebut kedalam mini spin
column, kemudian sentrifuge dengan kecepatan 8000 rpm
selama 1 menit. Pindahkan mini spin column ke dalam tabung
penampung 2 mL yang steril.
h) Ulangi langkah No. 6, kemudian tambahkan 500 uL Buffer
AW1, kemudian centrifuge selama 1 menit pada 8000 rpm.
i) Pindahkan mini spin column pada tabung penampung yang
baru, tambahkan 500 uL AW2, kemudian sentrifus 14.000 rpm
selama 3 menit.
 j) Pindahkan mini spin column pada tabung sentrifus 1,5 mL
yang baru, tambahkan 60 µL Buffer AVE, biarkan pada suhu
kamar (15-250C) selama 1 menit.
k) Centrifuge selama 1 menit pada 8000 rpm, buang mini spin
column dan gunakan filtrat RNA untuk pemeriksaan
selanjutnya.
l) Setelah proses isolasi selesai, kemudian dilanjutkan dengan
analisis isolat RNA.

Daftar Pustaka
Arrizqi, ZR. 2014. Materi Isolasi DNA. Diperoleh dari
https://www.academia.edu/16807033/Laporan_Praktikum_Bioteknolog
i_Isolasi_DNA . diakses pada 20 September 2019.

Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Sains & Teknologi.
10(1), 61-67

Nursa’adah, I. 2012. Isolasi DNA Kasar. Diperoleh dari

https://docplayer.info/49829264-Laporan-praktikum-bioteknologi-
isolasi-dna-kasar.html . diakses pada 20 September 2019.