Sinergia de presión hidrostática alta en ozono para la estabilización del jugo refrigerado de

pitaya (Stenocereus pruinosus)

Resumen

El efecto sinérgico de la combinación de ozono (24 mg / O3 / L / min) y presión hidrostática alta

(HHP, 179–321 MPa) se evaluó con respecto a los efectos individuales de estos sobre la
población microbiana en el jugo de pitaya utilizando una metodología de superficie de respuesta
y un diseño de medidas repetidas con la prueba de Tukey. El tratamiento con 300 MPa / 5 min
redujo 6.89-log10 y 0.89-log10 CFU / mL de la población de Saccharomyces cerevisiae y Listeria
innocua, respectivamente; y el tratamiento con 9.6 minutos de tiempo de ozonización redujo
0.47-log10 y 2.51-log10 UFC / mL de S. cerevisiae y L. innocua población respectivamente; sin
embargo, L. innocua se redujo 5.1-log10 UFC / ml con exposición al ozono durante 7 minutos
seguido de 316 MPa / 5 minutos. Del mismo modo, estas condiciones de tratamiento
mantuvieron la microbiota nativa del jugo en niveles no detectables y lograron la preferencia
sensorial más alta (79%) en comparación con el jugo no tratado a 30 d (5 ± 2 ° C). El ozono-HHP
redujo el recuento de bacterias, lo que sugiere un jugo de pitaya microbiológicamente seguro,
contrario a lo que se obtuvo con la aplicación individual de estas tecnologías.

Introducción

Los jugos de frutas han sido objeto de interés debido a sus propiedades nutricionales (Tiwari,
O'donnell y Cullen, 2009). Por lo tanto, su consumo se considera como una de las principales
estrategias para lograr un estilo de vida saludable (Jaramillo-Sánchez, García-Loredo, Gómez y
Alzamora, 2018). La pitaya (Stenocereus spp.) Es una fruta muy valorada debido a su elevado
contenido de betalaínas y compuestos fenólicos con propiedades antioxidantes (García-Cruz,
Valle-Guadarrama, Salinas-Moreno y Joaquín-Cruz, 2013; García-Cruz, Valle -Guadarrama,
Salinas-Moreno y Luna-Morales, 2016; Pérez-Loredo, García-Ochoa y Barragán-Huerta, 2016).
Los estudios han informado que la ingesta de betalaínas causa efectos antiinflamatorios y
anticancerígenos (por ejemplo, cáncer de ovario, cuello uterino y vejiga) (Azeredo, 2009). Por
otro lado, los compuestos fenólicos exhiben propiedades antialérgicas, antiaterogénicas,
antiinflamatorias, antioxidantes, antimicrobianas, antitrombóticas, cardioprotectoras y
vasodilatadoras (Balasundram, Sundram y Samman, 2006). Por lo tanto, las frutas pitaya tienen
potencial agroindustrial (García-Suárez, Carreto-Montoya, Cárdenas-Navarro, Díaz-Pérez y
López-Gómez, 2007). Sin embargo, las frutas pitaya son altamente perecederas
(aproximadamente 5 días a temperatura ambiente) (Armella, Soriano y Ramírez, 2003).

La aplicación de tratamientos térmicos a los jugos de frutas es una tecnología ampliamente

adoptada para la extensión de la vida útil. Los tratamientos térmicos pueden causar cambios
indeseables en los alimentos y modificar el equilibrio entre la alta calidad (color, sabor y
funcionalidad) y la seguridad alimentaria. Dado que los consumidores exigen alimentos frescos,
nutritivos, seguros y libres de productos químicos, las industrias alimentarias han centrado su
interés en las tecnologías no térmicas (Jaramillo-Sánchez et al., 2018; Ludikhuyze y Hendrich,
2001). Una tecnología no térmica ampliamente estudiada es la alta presión hidrostática (HHP),
que ha demostrado capacidad para preservar el sabor, el olor y el color en los productos tratados
al tiempo que inactiva los microorganismos. Esto se basa en el hecho de que HHP no afecta los
enlaces covalentes de los compuestos en los alimentos (Mozhaev, Heremans, Frank, Masson y
Balny, 1994). Además, el HHP permite obtener alimentos seguros, ya que puede causar daño
estructural, pérdida de selectividad de la membrana celular e inactivación enzimática de
microorganismos, incluidos enteropatógenos, mohos y levaduras (Lado y Yousef, 2002). No
obstante, trabajos anteriores mostraron que la efectividad antimicrobiana del HHP en el jugo de
pitaya (sin acidificar) se basa en el uso de niveles de presión elevados durante períodos
prolongados de tiempo (550-600 MPa, 12-16 min) (Quiroz-González, Rodríguez- Martínez, del
Rosario García-Mateos, Antonio Torres y Welti-Chanes, 2018).

Otra alternativa del procesamiento no térmico para mejorar la vida útil de algunos jugos ha sido
la aplicación de ozono. El ozono es un oxidante fuerte, efectivo para el control del crecimiento
de bacterias, mohos, protozoos y virus (Rodoni, Casadei, Concellón, Chaves Alicia y Vicente,
2010). La degradación del ozono produce radicales libres, principalmente hidroxilo, y sus efectos
están asociados con la inactivación enzimática, la alteración del ácido nucleico y la peroxidación
lipídica de la membrana microbiana (Patil, Valdramidis, Tiwari, Cullen y Bourke, 2011). El efecto
del ozono sobre el crecimiento bacteriano se ha evaluado en jugos de naranja, manzana y
durazno (García, Guerrero y Alzamora, 2015; Patil, Bourke, Frias, Tiwari y Cullen, 2009; Torlak,
2014). Si bien los informes han confirmado el efecto positivo del ozono sobre la calidad
microbiana de los jugos, se debe investigar el impacto de este fuerte oxidante sobre los
compuestos bioactivos. Se observaron reducciones en el contenido de antocianinas (hasta
98.2%) y ácido ascórbico (hasta 85.8%) cuando se aplicaron 10.6–70.8 mg de O3 L − 1 durante
10 minutos en jugo de fresa (Tiwari et al., 2009). Del mismo modo, los efectos negativos sobre
el color, las propiedades reológicas y el contenido fenólico del jugo de manzana se detectaron
mediante el tratamiento con 10–48 mg de O3 L − 1 durante 10 minutos (Torres et al., 2011). Por
otra parte, García et al. (2015) evaluaron (CFU mL − 1) jugo de durazno con 22–40 mg de O3 L −
1 durante 12 min y lograron inactivar 1, 4.3 y 4.9 log10 de poblaciones de Saccharomyces
cerevisiae, coliformes y Listeria innocua, respectivamente; sin embargo, se observó la
recuperación de estos microorganismos durante el almacenamiento (14 d). Estos estudios
demuestran que las altas concentraciones de ozono pueden afectar negativamente la calidad
de los jugos; en contraste, las bajas concentraciones pueden poner en riesgo la seguridad de los
jugos. El objetivo de la presente investigación fue evaluar un posible efecto sinérgico de una
dosis de ozono relativamente baja (24 mg L − 1 de jugo min − 1) en combinación con niveles
relativamente bajos de HHP (179–321 MPa, 5 min) durante el seguridad, color, propiedades
fitoquímicas y aceptabilidad sensorial del jugo de pitaya.

Materiales y métodos

Material vegetal

Los frutos de Pitaya (Stenocereus pruinosus) (madurez hortícola, 75% de tonalidad roja en
pericarpio, 75–90 g) se cosecharon de una plantación comercial ubicada en Santa Clara
Huiziltepec, Puebla, México (Latitud: 18 ° 46 ′ N; Longitud: 97 ° 53 ′ W).

Productos quimicos

Los métodos estándar de agar (SMA), agar de papa dextrosa (PDA), agar de tripticasa de soja
(TSA), caldo de tripticasa de soja (TSB) y extracto de levadura (YE) se obtuvieron de BD Bioxon
(Estado de México, México). El ácido tartárico y el extracto de malta (ME) se compraron de
Meyer (Ciudad de México, México) y Difco (Sparks, MD), respectivamente. Agua de peptona
tamponada, metanol, glucosa, ácido gálico (GA), reactivo Folin-Ciocalteu, 2,2-difenil-1-
picrylhydrazyl (DPPH) y ((±) -6-Hydroxy-2,5,7,8- el ácido tetrametilcromano-2-carboxílico
(Trolox) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Carbonato de sodio (Na2CO3) y se obtuvo
de JT Baker (Luis I, Madrid). Cloro (Cloralex ™, hipoclorito de sodio al 6%) se obtuvo de un
supermercado local (Monterrey, México). Se usó agua destilada para la preparación de todos
los medios de cultivo y reactivos para análisis fitoquímicos y antioxidantes.

Extracción de jugo

Después de la cosecha, las pitayas se enfriaron (para eliminar el calor del campo) hasta obtener
una temperatura interna de la fruta de 10 ± 1 ° C (se tomaron muestras de 3 frutas y se analizaron
con la interfaz de recolección de datos Vernier LabPro® (Beaverton, OR). Para la extracción del
jugo, fruta las espinas fueron removidas manualmente, luego las frutas fueron lavadas,
desinfectadas con hipoclorito de sodio (216 mg L − 1), y su pericarpio fue removido. Luego, la
pulpa fue colocada en un extractor de jugo (TURMIX ™, México), donde estaban las semillas
separado del jugo. Finalmente, el jugo [pH 5.13 ± 0.06, 12.23 ± 0.06 ° Brix, 0.02 ± 0.00% de ácido
málico (peso fresco)] fue recolectado y congelado (−20 ° C) hasta la aplicación de los
tratamientos. El pH, Los sólidos solubles totales (TSS) y el contenido de ácido málico del jugo de
pitaya se midieron utilizando los métodos AOAC 981.12, 932.12 y 942.15 (AOAC, 1995),
respectivamente. Todas las mediciones se informan como el promedio ± desviación estándar
para tres réplicas de 15 ml de jugo cada uno.

Inoculación de jugo

Para evaluar el efecto antimicrobiano del tratamiento, se utilizaron las cepas L. innocua ATCC
33090 y S. cerevisiae CDBB-L-331. Ambas cepas se obtuvieron de la Colección Nacional de Cepas
Microbianas y Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del
Instituto Politécnico Nacional (Ciudad de México, México). L. innocua se empleó como un
sustituto de L. monocytogenes, que es un patógeno bien conocido que puede crecer en
alimentos refrigerados y causa listeriosis. Alrededor del 20-30% de las infecciones por listeriosis
pueden ser fatales (Ramaswamy et al., 2007). Además, se utilizó L. innocua ya que trabajos
anteriores han demostrado que presenta resistencia a la alta presión (Quiroz-González et al.,
2018). Por otro lado, S. cerevisiae se empleó debido a su importancia en la fermentación de jugo
de pitaya.

Curva de crecimiento

Para la activación de la cepa, se inoculó L. innocua en TSB con 0.6% (p / v) YE (TSB-YE) y se incubó
a 37 ° C durante 16 h en un horno (Riossa ™, México). Posteriormente, se transfirió una alícuota
(1 ml) a TSB-YE y se incubó en las mismas condiciones. Se tomaron muestras cada 6 h durante
30 h para obtener la curva de crecimiento (datos no mostrados). En el caso de S. cerevisiae, se
usó medio YMB (0.3% YE, 0.3% ME, 0.5% peptona y 1% glucosa, ajustado a pH 3.5 con 10% de
ácido tartárico). La temperatura de incubación fue de 27 ° C durante 16 h para activar la cepa.
El muestreo para construir la curva de crecimiento se realizó cada 8 h durante 30 h. El tiempo
para alcanzar la fase exponencial fue de 15 y 20 h para L. innocua y S. cerevisiae,
respectivamente, mientras que la fase estacionaria temprana se alcanzó a las 17 y 24 h,
respectivamente.
Cultura de stock

Una alícuota (1 ml) de L. innocua activada se inoculó en TSB-YE (100 ml) y se incubó en las
condiciones descritas anteriormente hasta alcanzar la fase exponencial (Bruschi et al., 2017).
Para obtener un sedimento celular, se centrifugaron 50 ml de L. innocua en fase exponencial a
2900 × g (Thermo Fisher Scientific, Sorvall ST 8, Waltham, MA) durante 5 minutos. Luego, el
sedimento se lavó dos veces con agua de peptona tamponada (0,1% p / v) y se resuspendió en
una solución de peptona-glicerol (4: 1) para obtener el cultivo de reserva. El cultivo stock se
almacenó a -20 ° C y se usó durante 15 días. El cultivo de stock de S. cerevisiae se preparó de
manera similar, pero con su medio de cultivo correspondiente e incubación a 27 ° C.

Inóculo

Se añadió un ml de cultivo madre de L. innocua no congelado a 100 ml de TSB-YE y se incubó a

37 ° C hasta alcanzar la fase estacionaria temprana. Siguiendo la metodología descrita
anteriormente, las células se recuperaron por centrifugación, se lavaron dos veces con agua de
peptona tamponada y se resuspendieron en agua de peptona tamponada (3 ml). Asimismo, se
inoculó 1 ml de cultivo madre de S. cerevisiae no congelado a 100 ml de CLM, se incubó a 27 ° C
hasta alcanzar la fase estacionaria temprana, se lavó y se resuspendió en 3 ml de agua de
peptona tamponada. La concentración fue de aproximadamente 8,5 log10 (UFC mL − 1) para
ambos microorganismos.

Inoculación de jugo de pitaya

El inóculo (1 ml) se transfirió a 150 ml de jugo de pitaya estéril (esterilizado en autoclave a 121
° C durante 15 minutos) para lograr una concentración inicial de 6,9 ± 0,34 y 7,6 ± 0,24 log10
(UFC ml − 1) de S. cerevisiae y L innocua, respectivamente. Para favorecer la adaptación de los
microorganismos, el jugo inoculado se almacenó durante 3 h a 21 ± 1 ° C antes de la aplicación
de los tratamientos.

Efecto del ozono o HHP sobre las poblaciones de L. innocua y S. cerevisiae en el jugo de pitaya

Los efectos individuales del tiempo de ozonización (24 mg O3 L − 1 de jugo min − 1 para 1.8, 3,
5.75, 8.5 y 9.6 min) y el nivel de presión (179, 200, 250, 300 y 321 MPa durante 5 min, vienen-
tiempo de actividad = 10.5–19.8 s, el calor adiabático = 23.2–25.0 ° C) se evaluó en jugo de pitaya
inoculado con L. innocua o S. cerevisiae. Se aplicó ozono a 125 ml de jugo con un sistema Biozon
K-20 (Benito Juárez, Ciudad de México, México). Mientras tanto, se usó un volumen menor de
jugo (10 ml) para HHP. El jugo se envasó al vacío (Henkelman, Países Bajos) en bolsas de
polietileno (Oster ™, Ciudad de México, México) y posteriormente se aplicó HHP (Elmhurst
Systems, LLC, South Albany, Nueva York) en una cámara de presión (1 L) usando agua como
medio de presurización.

Evaluación microbiana

Las diluciones decimales de jugo tratado y no tratado (control) se realizaron en agua de peptona
tamponada al 0,1% (p / v). L. innocua se sembró en placas TSA con 0.6% (p / v) YE (TSA-YE) y se
incubó a 37 ° C durante 48 h (Bruschi et al., 2017). El recuento de S. cerevisiae se realizó en
medio PDA (pH 3.5) y la incubación se realizó a 27 ° C durante 5 días (Leyva Daniel, Escobedo-
Avellaneda, Villalobos-Castillejos, Alamilla-Beltrán y Welti-Chanes, 2017). Los valores se
expresaron como log10 (N / N0) (N: recuento después del tratamiento, N0: recuento inicial) y el
valor medio de tres réplicas (se realizaron dos repeticiones de cada réplica).

Efecto de la combinación de ozono-HHP sobre poblaciones de L. innocua y S. cerevisiae

El jugo de pitaya (125 ml) inoculado con L. innocua o S. cerevisiae se trató con ozono. Luego, una
muestra de jugo ozonizado (10 ml) se envasó al vacío en bolsas de polietileno, y finalmente se
presurizó. La descripción de los tratamientos se muestra en la Tabla 1. La evaluación de L.
innocua y S. cerevisiae se realizó siguiendo el método descrito en la Sección 2.5.1.

Validación del daño letal causado por la combinación óptima de O3-HHP sobre L. innocua y S.
cerevisiae

Las muestras de jugo de pitaya previamente inoculadas con L. innocua o S. cerevisiae se trataron
con la combinación óptima de ozono-HHP (reducción de> 5 log10 FCU mL − 1 de ambas
poblaciones microbianas) y luego se almacenaron durante 15 d (5 ± 2 ° C). La evaluación
microbiana se realizó cada 5 d.

Período de validez del jugo de pitaya tratado con una combinación óptima de ozono-HHP

Después de evaluar la efectividad del tratamiento de ozono-HHP seleccionado, las muestras de

jugo de pitaya sin esterilizar y no inoculadas se trataron con la combinación óptima de ozono-
HHP y se almacenaron durante 35 d (5 ± 2 ° C). El jugo de pitaya sin tratar se usó como control.

Microbiota nativa

La evaluación de la microbiota nativa del jugo de pitaya se realizó de acuerdo con los métodos
descritos Leyva-Daniel et al. (2017) Se hicieron diluciones decimales para tratar y controlar el
jugo de pitaya en agua de peptona tamponada al 0,1% (p / v). Las diluciones de mesófilos
aerobios se sembraron en SMA y se incubaron a 37 ° C durante 48 h. Se sembraron levaduras y
mohos (Y&M) en placas PDA (pH 3,5) y se incubaron a 27 ° C durante 5 días. Los valores se
expresaron como log10 CFU mL − 1 y se informaron como la media de tres réplicas (se realizaron
dos repeticiones de cada réplica).

Parámetros colorimétricos

Según la metodología descrita por McGuire (1992), la diferencia neta de color (ΔE, Eq. (1)), la
luminosidad (L *), el croma (C *, Eq. (2)) y el ángulo de tono (H *, La ecuación (3)) se determinó
con los valores L *, a * yb * obtenidos con un colorímetro Hunter Lab (MiniScanTM XE Plus No.
45 / OL, serie 5348, Reston, VA).

Propiedades fitoquímicas y antioxidantes.

Preparación del extracto. Una muestra de jugo de pitaya se diluyó 10 veces con metanol.
Posteriormente, la dilución se sonicó en un equipo de ultrasonido (Cole Parmer 8890, Illinois,
EE. UU.) Durante 5 minutos y se centrifugó (Sol-bat J-600, México) a 4000 × g durante 5 minutos.
El extracto metanólico recuperado se usó para el análisis de fenólicos totales, betalaínas totales
(betacianinas y betaxantinas) y actividad antioxidante (AA).

Contenido de betalaína. Para la evaluación de betalaína, el método informado por Pérez-Loredo

et al. (2016) fue seguido y adaptado a un formato de microplaca de 96 pocillos. El extracto
metanólico se diluyó 1: 9 en agua. A partir de esta dilución, se colocaron 300 μL en una
microplaca y se leyeron a una absorbancia de 535 y 483 nm (BioTek ™, Sinergy 2, EE. UU.) Para
betacianinas y betaxantinas, respectivamente. La concentración de betacianinas y betaxantinas
se determinó con la ecuación descrita por García-Cruz et al. (2016) (ecuación 4).

Contenido fenólico total

Evaluación de la actividad antioxidante.

Evaluación sensorial

Se aplicó una prueba de opción forzada de 2 alternativas a 56 panelistas no capacitados (15–34

años) que eran consumidores de pitaya. Cada panelista recibió 2 pares de simples codificados,
donde cada par contenía jugo de pitaya de control (fresco, sin tratar) y jugo tratado (7 min de
ozono +316 MPa y se almacenó durante 30 días a 5 ± 2 ° C). Se solicitó a los panelistas probar la
muestra (10 ml) una vez y elegir el jugo de su preferencia de cada par. En caso de no tener
preferencia, los panelistas recibieron instrucciones de elegir al azar (Hernández-Montes, 2007).

Resultados y discusión

Efecto del ozono o HHP sobre las poblaciones de L. innocua y S. cerevisiae

S. cerevisiae fue más susceptible a la presión que L. innocua, ya que S. cerevisiae se inhibió
totalmente a 300 MPa, mientras que L. innocua se redujo solo un 12% a la misma presión (Tabla
2). Estos resultados están de acuerdo con Trujillo (2002), quien descubrió que los mohos y las
levaduras son más sensibles al HHP que las bacterias. Los resultados también son consistentes
con Lado y Yousef (2002), quienes informaron que las bacterias son más resistentes al HHP que
los hongos debido al hecho de que el área de contacto superficial reducida entre las células más
pequeñas y el medio ambiente puede limitar la fuga celular a una presión dada, minimizando el
tratamiento efecto. En contraste, L. innocua fue más sensible a la aplicación de ozono que S.
cerevisiae (Tabla 2). Lo mismo se informó en el jugo de durazno tratado con 22–40 mg de O3 L
− 1 min − 1 durante 2 min (Garcia et al., 2015). Por lo tanto, los resultados sugieren que para
lograr una reducción de> 5 log10 CFU mL − 1 (FDA, 2001) de S. cerevisiae y L. innocua, se
requieren altos niveles de presión y ozono. Una alternativa sería aplicar ambas tecnologías no
térmicas en combinación (ozono-HHP) para evaluar un posible efecto sinérgico.
Efecto de la combinación de ozono-HHP sobre las poblaciones de L. innocua y S. cerevisiae

La combinación de ozono-HHP mostró un ligero efecto biocida sinérgico sobre la inactivación de

la población de S. cerevisiae. En particular, la inactivación aumentó significativamente con el
tiempo de ozonización (Fig. 1). Sin embargo, este nivel de inactivación fue muy pequeño,
aproximadamente 5 log10 menos que el obtenido con la aplicación de> 300 MPa (5 min). Esto
confirma la resistencia de S. cerevisiae a la exposición al ozono, lo que sugiere que durante la
ozonización las células de esta levadura permanecen casi intactas, y solo la aplicación de> 300
MPa puede causar daño estructural. Sobre este tema, se ha informado que la estructura interna
de las células tratadas con HHP, especialmente la membrana nuclear, comienza a dañarse a 100
MPa, y a medida que aumenta la presión, las mitocondrias, el núcleo, el retículo endoplásmico
y la vacuola comienzan a dañarse. (Shimada et al., 1993). En contraste, como se mencionó
anteriormente, L. innocua fue muy resistente al HHP, ya que se obtuvo una reducción máxima
de 1.34 log10 UFC mL − 1 aplicando 321 MPa (5 min). Esta baroresistencia elevada se observó
en un estudio anterior, en el que la población de L. innocua disminuyó 5 log10 UFC mL − 1 a 600
MPa durante 12 minutos en jugo de pitaya (Quiroz-González et al., 2018). Sin embargo, en el
presente trabajo se encontró que la combinación ozono-HHP produjo un efecto sinérgico sobre
la inactivación de L. innocua, permitiendo el uso de niveles de presión más bajos (Tabla 3).

El modelo predictivo simplificado (R2 = 92.75%, ecuación (9)) indicó que la aplicación de 7 min
de ozono, seguido de 316 MPa durante 5 min (7O3 + 316 MPa) fue suficiente para inactivar L.
innocua 5.1 log10 CFU mL− 1 (Fig. 2).

El efecto sinérgico del ozono-HHP sobre la inactivación de L. innocua podría deberse al daño
cooperativo de estos dos tratamientos no térmicos. El ozono puede reaccionar con las proteínas
de la membrana celular, causando su deterioro (Thanomsub, Anupunpisit, Chanphetch y
Watcharachaipong, 2002), mientras que el HHP, además de modificar la estructura cuaternaria
de las proteínas, también puede dañar la membrana celular al causar un cambio de fase de sus
fosfolípidos (gel sólido).

Validación del daño letal causado por la combinación óptima de ozono-HHP sobre L. innocua y
S. cerevisiae

Aunque no hubo necesidad de combinar ozono y HHP para inactivar S. cerevisiae, la validación
del daño letal provocado por el tratamiento con 7O3 + 316 MPa se realizó tanto en S. cerevisiae
como en L. innocua, ya que el daño a las células microbianas (bacterias o levaduras) podría ser
reversible durante el almacenamiento (Bozoglu, Alpas y Kaletunç, 2004), lo que significaría una
reactivación posterior de estos microorganismos y, en consecuencia, podría poner en riesgo la
salud del consumidor y / o la calidad del jugo.

Las poblaciones microbianas se elevaron durante 15 días de almacenamiento (5 ± 2 ° C) en jugos

de pitaya no tratados con una disminución mínima de 0.23 log10 CFU mL − 1 en S. cerevisiae
(Fig. 3). Por otro lado, los jugos tratados con 7O3 + 316 MPa mostraron la reducción
pronosticada (> 5 log10 CFU mL − 1) inmediatamente después del tratamiento más una
disminución adicional durante el almacenamiento, ya que tanto L. innocua como S. cerevisiae
se redujeron a no detectables niveles a 10 d de almacenamiento (Fig. 3). Esta disminución
adicional podría deberse al hecho de que los microorganismos estaban tan dañados que no fue
posible su recuperación, o es posible que la presencia de betalaínas en el jugo de pitaya
contribuya con la actividad antimicrobiana. Se ha informado que las betalaínas tienen actividad
quelante de los metales y, en consecuencia, podrían haber quelado cationes internos como Ca2
+, Fe2 + y Mg2 + de los microorganismos (Hayek & Ibrahim, 2012). Este efecto antimicrobiano
también se ha observado en extractos de xoconostle (Opuntia matudae) y pitahaya (Hylocereus
polyrhizus) (Carlo, Novellino y Basile, 2011; Hayek e Ibrahim, 2012), ambas frutas que, como la
pitaya, tienen betalaínas como pigmentos. La evidencia mostrada anteriormente sobre la
inactivación microbiana estaría incompleta sin un análisis del efecto del tratamiento con 7O3 +
316 MPa sobre el color, el potencial nutracéutico y la aceptabilidad sensorial. Por lo tanto, se
realizó un estudio de vida útil.

Período de validez del jugo de pitaya tratado con una combinación óptima de ozono-HHP

Microbiota nativa

Los jugos de pitaya no tratados mostraron un aumento en su concentración de microbiota nativa

durante el almacenamiento hasta alcanzar un incremento máximo de 4.7 y 2.6 log10 UFC mL −
1 de mesófilos aeróbicos y Y&M, respectivamente (Tabla 4). Mientras tanto, los
microorganismos de los jugos tratados con 7O3 + 316 MPa permanecieron en niveles no
detectables durante 30 días de almacenamiento; no obstante, en el día 35, la población de Y&M
aumentó abruptamente. Parece que una cepa resistente (colonias rosadas no identificadas) al
tratamiento con 7O3 + 316 MPa estaba presente en la microbiota nativa. Posiblemente, el
tratamiento solo causó un daño subletal a la levadura, lo que le permitió adaptarse al medio. Se
ha informado que las levaduras responden al daño subletal a través de varios mecanismos, como
la síntesis de proteínas de choque térmico, la modulación de los procesos de intercambio iónico
y la alteración de la composición de la membrana lipídica y la actividad ATPasa de la membrana
plasmática (Birch & Walker, 2000; Lado Y Yousef, 2002). Aunque se observó anteriormente que
HHP era suficiente para inactivar Y&M, es notable que el tratamiento sea insuficiente para
causar daño letal a las células resistentes detectadas en el presente estudio. Asimismo, la
combinación ozono-HHP no potenció el daño. Estudios anteriores han demostrado que la
resistencia de las levaduras a la ozonización es mayor que algunas bacterias, como los coliformes
y L. innocua (García et al., 2015; Kim, Yousef y Dave, 1999).

De acuerdo con el estándar oficial mexicano NOM-130-SSA1–1995 (Secretaría de Salud, 1995),

no debe haber> 25 CFU mL − 1 de Y&M en los jugos pasteurizados. La concentración de la
levadura resistente detectada después de 35 días de almacenamiento fue de 2,37 × 103 UFC ml
− 1. No se detectaron mesófilos aeróbicos ni Y&M hasta 30 d de almacenamiento (Tabla 4). Por
lo tanto, el color, los fitoquímicos y la aceptabilidad sensorial se evaluaron en jugos almacenados
durante 30 días.

Parámetros colorimétricos

Después de la aplicación del tratamiento óptimo (7O3 + 316 MPa), ΔE de jugo de pitaya aumentó
significativamente (1.4 unidades). Del mismo modo, al final del período de almacenamiento (30
d) los jugos tratados mostraron un ΔE más alto (1.1 unidades) en comparación con los jugos no
tratados (Fig. 4A). Este ΔE se asoció con una disminución en la luminosidad (Fig. 4B) y el croma
(Fig. 4C), y un aumento en el ángulo de matiz (Fig. 4D). El tratamiento con la combinación 7O3
+ 316 MPa causó la reducción (12.8%) de la ligereza y el croma (5.9%) de los jugos. Esta
disminución se observó inmediatamente después de la aplicación del tratamiento (Fig. 4B y C,
respectivamente). La ligereza y el croma disminuyeron aún más después de 30 días de
almacenamiento (22.8% y 16.7%, respectivamente). El ángulo de tonalidad no se vio afectado
significativamente, pero se incrementó hasta 11.9% en los jugos tratados y no tratados durante
el almacenamiento (Fig. 4D). Estos resultados significan que el tratamiento causó un ligero
oscurecimiento y una ligera pérdida de intensidad de color del jugo de pitaya, mientras que el
almacenamiento solo causó en los jugos tratados y no tratados un pequeño color amarillento.
Los cambios observados en los jugos tratados podrían deberse a la oxidación de los pigmentos
rojos por el ozono, ya que se informó anteriormente que la fuerte actividad oxidante del ozono
puede afectar negativamente a los pigmentos (Tiwari, Cullen, Brennan y O'Donnell, 2013).

Propiedades fitoquímicas y antioxidantes.

El contenido total de betalaína en el jugo de pitaya no tratado se redujo un 14% durante el

almacenamiento, mientras que el jugo tratado con 7O3 + 316 MPa se redujo un 10% (Tabla 5).
Sin embargo, la mayor disminución (33%) fue causada por el efecto inmediato del tratamiento.
La disminución de las betalaínas durante el almacenamiento podría haber sido causada por la
presencia de enzimas que permanecieron activas después del tratamiento. Esto ha sido
observado por García-Palazón Suthanthangjai, Kajda y Zabetakis (2004) y Morales-de la Peña,
Salinas-Roca, Escobedo-Avellaneda, Martín-Belloso y Welti-Chanes (2018) en puré de fresas y
mango tratados con HHP Sin embargo, también es posible que las enzimas oxidantes se hayan
activado (p. Ej., Peroxidasa y polifenoloxidasa) mediante la aplicación de ozono (Ong, Ali,
Alderson y Forney, 2014).

En particular, las betaxantinas (39% de reducción) fueron más sensibles (p <0.05) a la oxidación
por el tratamiento que las betacianinas (27% de reducción). Asimismo, el almacenamiento
afectó (p <0.05) tanto a su concentración, donde las betacianinas y las betaxantinas se redujeron
6.21 y 15%, respectivamente (Tabla 6). Es notable que los jugos no tratados mostraron
estabilidad de las betacianinas durante el almacenamiento, mientras que las betaxantinas se
redujeron en un 25%. Esta reducción podría deberse a la acción de algunas enzimas en el jugo,
ya que se informó (Azeredo, 2009) que las betacianinas son más susceptibles a la degradación
de las enzimas que las betaxantinas durante el almacenamiento. Otros investigadores han
indicado que las betacianinas son más estables que las betaxantinas cuando están expuestas a
la luz blanca (Moreno, Belén y Viloria, 2002) al calor o al oxígeno (Azeredo, 2009). Hasta donde
sabemos, esta es la primera vez que se informa la dinámica de la degradación de la betalatina
mediante la aplicación de un tratamiento que involucra ozono en los jugos. Los fenólicos totales
también se redujeron (8%) en los jugos tratados (Tabla 5) pero se mantuvieron estables durante
el Todo el período de almacenamiento. De acuerdo con Jiménez-Aguilar et al. (2015) y Sandate-
Flores et al. (2017), las betalaínas y los fenólicos no se ven afectados por el HHP. Por lo tanto, la
disminución observada en ambos compuestos podría deberse al ozono. La degradación de los
fitoquímicos puede ser causada por una reacción directa con ozono u oxidantes secundarios,
como · OH, HO2 ·, · O2 - y · O3 - (Tiwari et al., 2013). Estos oxidantes pueden producir reacciones
nucleofílicas y electrofílicas sobre compuestos aromáticos que se sustituyen con un donador de
electrones (por ejemplo, OH-), causando su oxidación. El efecto del ozono sobre la fracción
aromática de los fenólicos favorece la formación de compuestos hidroxilados y quinonas
(Asokapandian, Periasamy y Swamy, 2018), que pueden causar el oscurecimiento de los
alimentos. Es posible que estas reacciones oxidantes hayan tenido lugar en los jugos tratados,
lo que causó una reducción en su ligereza (ver Sección 3.4.2). La disminución en los compuestos
fenólicos fue menor (6%) que la reportada en el jugo de manzana (50%) tratado con ozono
solamente (48 mg O3 L − 1 durante 10 min) (Torres et al., 2011), lo que sugiere que el La menor
concentración de ozono (24 mg L − 1 min − 1) y el tiempo de aplicación (7 min) utilizados en el
presente estudio permiten obtener un jugo de pitaya con alto contenido fenólico.

Se evaluó AA con los ensayos ABTS y DPPH, y en ambos métodos se redujo AA inmediatamente
después de aplicar el tratamiento 7O3 + 316 MPa (Tabla 7). No obstante, en el ensayo ABTS (que
fue el más sensible ya que detectó diferencias significativas durante el almacenamiento de los
jugos) se observó una reducción del 29% de AA, mientras que no se observaron diferencias
significativas con el ensayo DPPH. Al final del período de almacenamiento (30 días) se detectó
una disminución del 13% en los jugos no tratados y tratados (con ensayo ABTS). La reducción de
AA se correlacionó positivamente (p = 0,0001) con la disminución de betalaínas (r = 96%) y
fenólicos (r = 73%) debido a la aplicación de 7O3 + 316 MPa. Esto concuerda con otros estudios,
que han declarado que las betalaínas y los compuestos fenólicos contribuyen al AA de la pitaya
(Leticia García-Cruz et al., 2016; Ochoa- Velasco y Guerrero Beltrán, 2013) y la pera cactus
(Ramírez-Ramos, García- Mateos, Corrales-García, Ybarra Moncada y Castillo-González, 2015).

Evaluación sensorial

Los resultados de la prueba de elección forzada de 2 alternativas fueron prometedores, ya que

el 79% de los panelistas prefirieron el jugo de pitaya tratado con 7O3 + 316 MPa y se
almacenaron durante 30 días sobre el jugo no tratado (Tabla 8) Esto sugiere que, además del
hecho de que el El jugo tratado permaneció microbiológicamente seguro durante 30 días de
almacenamiento, se mejoraron sus propiedades sensoriales. Según los comentarios voluntarios
de varios panelistas al final de la evaluación, la mejora de estas propiedades podría haberse
debido a un posible cambio en la viscosidad mediante la aplicación de ozono, según lo informado
por Jaramillo-Sánchez et al. (2018) y Torres et al. (2011) en durazno (60 mg O3 L − 1 durante
0.3–12 min) y jugo de manzana (10–48 mg O3 L − 1 durante 10 min). Sin embargo, la evaluación
de la viscosidad estaba más allá del alcance del presente estudio.

Conclusiones

S. cerevisiae fue más sensible al HHP, mientras que L. innocua al ozono. La aplicación de 7 min
de ozono (24 mg L − 1 min − 1) más 316 MPa (5 min) fue el tratamiento óptimo y sinérgico para
inactivar> 5 log10 (CFU mL − 1) la población de L. innocua en jugo de pitaya. La aplicación de
este tratamiento mantuvo el jugo de pitaya microbiológicamente seguro durante 30 días (5 ± 2
° C). Sin embargo, el tratamiento disminuyó la ligereza y el croma, mientras que el
almacenamiento aumentó el ángulo de matiz. Del mismo modo, los jugos tratados tenían un
menor contenido de compuestos bioactivos y AA, pero a pesar de estos cambios, se observó una
mayor preferencia por los jugos tratados en comparación con los jugos no tratados. Por lo tanto,
las combinaciones de ozono-HHP se pueden explorar en otros jugos con el propósito de
mantenerlos microbiológicamente seguros con una alta aceptabilidad sensorial.