1 Laporan Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.

1038 / s41598-017-01956-1
www.nature.com/scientificreports
Pencitraan pH sel tunggal dan
deteksi untuk profil pH dan label-
identifikasi cepat kanker- gratis
sel
Hui Hou
1,2
, Yangyang Zhao
1
, Chuanping Li
1,2
, Minmin Wang
1,2
, Xiaolong Xu
1
& Yongdong Jin
1
Deteksi pH sel tunggal dan deteksi akurat serta identifikasi cepat sel-kanker
berlabel adalah dua
pengejaran jangka panjang dalam ilmu sel dan kehidupan, karena pH intraseluler
memainkan peran penting dalam banyak seluler
Peristiwa dan nasib, sedangkan yang terakhir sangat penting untuk theranostik
kanker awal. Banyak metode berdasarkan
Nanopartikel fungsional dan probe fluoresensi telah dikembangkan untuk sensor pH
sel, tetapi
sering terhambat untuk studi sel tunggal dengan kelemahan utama persiapan probe
yang rumit
dan pelabelan, sensitivitas rendah dan reproduktifitas buruk. Di sini kami
melaporkan metode yang sederhana dan andal
untuk pencitraan dan penginderaan pH sel tunggal dengan penggunaan gabungan
inovatif dari mikrospektroskopi UV-Vis dan
indikator pH umum. Deteksi pH yang akurat dan sensitif pada level sel tunggal atau
sub sel dengan baik
reproduktifitas dicapai dengan metode ini, yang memungkinkan pembuatan profil pH
sel tunggal dan bebas label
identifikasi cepat sel-sel kanker (karena tingkat pH intraseluler dapat dibedakan)
untuk kanker awal
diagnosis, dan dapat membuka jalan baru untuk studi sel tunggal terkait-pH.
Nilai pH intraseluler merupakan faktor penting yang mengatur banyak perilaku
seluler, seperti banyak patologis
dan proses fisiologis, fungsi banyak organel serta aktivitas enzim dan degradasi
protein
1,
2
. Untuk sel mamalia yang khas, nilai pH intraseluler dapat bervariasi dari 4,7
dalam lisosom hingga 8,0 dalam mitokon-
dria. Variasi yang mengganggu dalam pH intraseluler dapat menyebabkan gangguan
fungsional organel
3, 4
. Biasanya
nilai pH intraseluler abnormal adalah karakteristik dari banyak penyakit umum
seperti penyakit Alzheimer, stroke,
dan kanker
4, 5
. Seperti kita ketahui, sel kanker biasanya ditandai oleh pertumbuhan sel yang
tidak terkontrol dan abnormal
nilai pH intraseluler asam
6, 7
. Hingga kini, berbagai nanopartikel difungsikan
6, 8
dan indikasi fluoresensi
tors
5, 9-12
telah dikembangkan untuk mengukur pH intraseluler. Namun, proses sintesis semacam
itu
nanopartikel difungsikan rumit dan biasanya perlu pelabelan, dan metode pencitraan
fluoresensi
digunakan untuk pencitraan sel hidup selalu menderita sinyal latar belakang yang
tidak dapat diabaikan, pemotretan foto dan ketidakstabilan.
Kerugian ini membatasi penggunaannya untuk deteksi dan studi pH sel tunggal yang
akurat. Karena itu, masih ada
permintaan mendesak untuk mengembangkan metode sederhana dan andal yang efektif
untuk deteksi dan pemantauan sensitif
perubahan pH intraseluler pada tingkat sel tunggal atau sub-sel, yang sangat
penting untuk mempelajari metabolisme seluler dan
lebih lanjut mendapatkan wawasan tentang proses fisiologis dan patologis yang
tergantung-pH
13-16
.
Di sini, kami mengembangkan metode pencitraan kolorimetri sederhana dan efektif
untuk penginderaan pH sel tunggal dan
deteksi akurat dengan menggabungkan mikroskop-bidang cerah-UV-Vis microspectroscopy
dan pH umum
indikator, seperti yang diilustrasikan secara skematis pada Gambar. 1a. Dua
indikator pH yang umum digunakan, bromothymol blue dan
bromocresol green (struktur kimia yang ditunjukkan pada Gambar. 1b) dipilih untuk
penginderaan pH sel hidup dalam penelitian ini.
Mereka memiliki rentang penginderaan pH yang berbeda (Gambar. S1) yang pada
dasarnya mencakup kisaran pH intraseluler normal atau
sel kanker. Biasanya, bromocresol green adalah indikator pH yang banyak digunakan
dalam aplikasi yang membutuhkan pengukuran
zat yang memiliki pH relatif asam (kisaran pH: ~ 3,8-5,4). Ini akan terionisasi
untuk memberikan bentuk monoanionik
(kuning), dan selanjutnya deprotonate pada pH yang lebih tinggi untuk menghasilkan
bentuk dianionik (biru). Warna bromokresol
solusi hijau / PBS bervariasi dari kuning terang ke biru tua karena pH meningkat
dari 3,0 menjadi 7,5 (nilai pH dari
Solusi PBS disesuaikan dengan HCl) (Gbr. S1A). Bromothymol blue (juga dikenal
sebagai bromothymolsulfonephthalein
dan BTB), yang bertindak sebagai asam lemah dalam larutan, adalah indikator pH yang
sebagian besar digunakan untuk mengukur zat yang
1
Laboratorium Kunci Negara Kimia Elektroanalitik, Institut Kimia Terapan Changchun,
Akademi Cina
Ilmu Pengetahuan, Changchun, 130022, Jilin, Cina.
2
Universitas Akademi Ilmu Pengetahuan Cina, Beijing, 100049, Cina.
Korespondensi dan permintaan materi harus ditujukan ke Y. J. (email:
ydjin@ciac.ac.cn)
Diterima: 3 Maret 2017
Diterima: 5 April 2017
Diterbitkan: xx xx xxxx
BUKA
www.nature.com/scientificreports/
2 Laporan Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
memiliki pH yang relatif netral (dekat 7). Dengan demikian dapat dalam bentuk
terprotonasi atau terdeprotonasi, tampak kuning atau biru,
masing-masing. Warnanya hijau kebiruan dalam larutan netral. Kehadiran satu
kelompok penarik elektron moderat
(atom bromin) dan dua kelompok donor moderat (substituen alkil) bertanggung jawab
atas biru bromotimol
kisaran indikasi aktif pH antara 6.0 dan 7.6. Warna larutan bromothymol blue / PBS
bervariasi dari
kuning cerah menjadi biru pekat saat pH meningkat dari 4,0 menjadi 7,5 (Gbr. S1B).
Ketika diinkubasi dan berinteraksi dengan
Indikator pH sel-sel kanker di bawah mikroskop bidang terang menunjukkan warna
kuning dan cerah karena asam
nilai pH ekstra dan intra seluler
6, 7
; Sementara sel mamalia sehat menyajikan warna biru dan gelap sebagai milik mereka
lingkungan intraseluler mendekati netral
13
. Ini membentuk dasar untuk identifikasi visual yang mudah dari sel-sel kanker
dari sel sehat normal dengan metodologi pencitraan pH sel.
Hasil
Pencitraan pH bidang terang sel hidup dan identifikasi kolorimetri sel kanker
dengan pH indi -
kator. Kami pertama-tama memeriksa dengan cermat kelayakan dari dua indikator pH
untuk penginderaan pH intraseluler dan
pencitraan. Dalam percobaan yang khas, sel-sel yang menempel pada plat hanya
diobati dengan 1 mg mL
−1
dari bromothymol
larutan biru atau bromokresol hijau dan diinkubasi sebentar selama ~ 5 menit.
Setelah dicuci dengan 20% etanol air
solusi selama tiga kali untuk menghilangkan indikator pH ekstraseluler berlebih,
piring kemudian diserahkan untuk mikroskop
pencitraan. Empat garis sel tumor yang khas (HepG2, HeLa, A549, dan 4T1) dan dua
garis sel normal (HL7702 dan
L929) diuji. Di sini, untuk memeriksa potensi kerusakan sel setelah perawatan, kami
memilih secara acak
garis sel tumor (HeLa) dan garis sel normal (L929), dan memperlakukan mereka dengan
etanol 20% selama 10 menit (yang merupakan
jauh lebih lama dari waktu yang kami gunakan dalam percobaan), kemudian sel-sel
diwarnai dengan pewarna biru trypan. Semua
sel HeLa (A) dan L929 (B) bersih tetapi tidak diwarnai biru, yang berarti bahwa
hampir semua sel tetap
hidup setelah perawatan (Gbr. S2). Oleh karena itu, perlakuan etanol 20% tidak
memiliki efek yang dapat terdeteksi pada sel
kelangsungan hidup. Gambar 2a menunjukkan gambar mikroskop lapangan terang yang
representatif dari enam jenis sel sebelumnya (yang pertama
baris) dan setelah (baris kedua) perawatan dengan bromothymol blue. Garis besar dan
struktur subseluler
semua enam baris sel yang diuji (tanpa pengobatan dengan bromothymol blue) sangat
tidak jelas. Setelah perawatan dengan
bromothymol blue garis sel dan beberapa struktur subseluler terlihat jelas. Oleh
karena itu mengungkapkan bahwa
molekul biru bromothymol dapat masuk dengan mudah ke dalam sel dan didistribusikan
secara seragam, menjadikannya menjanjikan
sebagai yang efektif.
Agen pewarnaan sel untuk aplikasi pencitraan sel hidup potensial potensial. Keempat
jenis sel kanker tersebut
dicelup dengan warna kuning terang karena lingkungan pH ekstra dan intra selulernya
yang asam (Gbr. 2a)
6, 7, 16–18
. Tapi untuk
berbeda garis sel kanker, ada perbedaan warna yang dapat diamati dalam gambar
mikroskop bidang terang, yaitu
menunjukkan lingkungan intraseluler asam yang agak berbeda dari sel. Untuk HL7702
normal yang sehat,
Sel L929, tingkat warna secara signifikan lebih dalam daripada sel kanker. Inti dan
sitoplasma
dari sel-sel normal diwarnai dengan biru gelap karena lingkungan intraselulernya
mendekati netral
13
. Itu
sel normal dan sel kanker karena itu dapat dengan mudah dibedakan karena perbedaan
pencitraan yang diucapkan, bahkan
jika warna biru (intraseluler) sebagian tumpang tindih dengan (latar belakang)
kuning cerah yang timbul di luar sel
disebabkan oleh permukaan sel-teradsorpsi atau ekstraseluler yang tersisa sejumlah
kecil molekul biru bromothymol. Kita
selanjutnya menguji kelayakan bromocresol green untuk penginderaan dan pencitraan
pH intraseluler. Bromokresol
Gambar 1. Skema pencitraan dan deteksi pH sel tunggal kolorimetri dengan dua
indikator pH. (Sebuah)
Skema pencitraan dan deteksi pH sel tunggal dengan menggunakan kombinasi UV-Vis
berbasis bidang-mikroskop cerah
mikrospektroskopi dan indikator pH umum. Satu area terpilih
spektrum serapan sel dikumpulkan oleh
mikroskop optik yang dilengkapi dengan spektrometer portabel dan pembagi optik
dengan area pengumpul kecil.
(B) Struktur dua indikator pH yang digunakan dalam penelitian ini.
www.nature.com/scientificreports/
3 RepoRts Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
hijau menunjukkan hasil yang sama dengan bromothymol blue (Gbr. S3). Dibandingkan
dengan bromothymol blue
Kisaran indikasi pH hijau bromokresol relatif sempit (kisaran pH: ~ 3,8-5,4), kami
tidak menerapkannya untuk
deteksi pH akurat sel tunggal berikutnya. Kebetulan, kami juga mencoba menggunakan
indikator pH metil merah
dan timol biru untuk pengukuran pH intraseluler, tetapi semuanya gagal (Gbr. S4).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel
masih tidak berwarna setelah perawatan, yang berarti bahwa dua indikator (metil
merah dan timol biru) sulit
untuk memasuki sel. Jika tidak, sel akan mewakili warna tertentu (merah, kuning
atau biru) karena intraselulernya
lingkungan pH.
Studi Kelayakan Sel. Selanjutnya, sitotoksisitas bromothymol blue dan bromocresol
green dengan hati-hati
diperiksa dengan standar 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5 diphenyltetrazolium
bromide (MTT) assay
19
. Sebagai ilus-
ditunjukkan pada Gambar. 2b, kelangsungan hidup sel dari semua empat sel yang diuji
(A549, HeLa, HL7702, dan sel L929) tidak terlupakan.
sangat terpengaruh setelah 24 jam inkubasi dengan bromothymol blue atau bromocresol
green pada konsentrasi 1 mg mL
−1
,
menunjukkan bahwa dua indikator pH aman untuk sel. Oleh karena itu, kami menerapkan
dua indikator pH dalam penelitian ini
untuk diskriminasi visual lebih lanjut dari sel kanker (dari sel normal
terkoordinasi) dan kolorimetri akurat
deteksi pH sel tunggal dengan gabungan penggunaan mikrospektroskopi UV-Vis.
Identifikasi pencitraan bidang terang dari sel kanker dan normal yang
terkoordinasi. Untuk pemeriksaan lebih lanjut
kelayakan metode pencitraan kolorimetri untuk aplikasi klinis potensial, suatu
kultur 4T1 kanker
dan sel HL7702 normal (rasio 1: 1), bertindak sebagai sampel sel simulasi klinis
dalam penelitian ini, disiapkan dan
diuji. Gambar 2c menunjukkan gambar mikroskop lapangan terang dari sel 4T1 dan
HL7702 yang dikulturkan sebelum dan sesudah
pengobatan bromocresol green. Sel HL7702 didistribusikan secara tersebar dalam
struktur jaringan
sel 4T1 ketika mereka dikultur. Lebih penting lagi, sel-sel tumor masih dapat
dengan mudah diidentifikasi secara visual
dari sel-sel sehat normal terkoordinasi karena perbedaan warna (dan bentuk) yang
berbeda, oleh pencitraan kolorimetri
metode setelah ~ 5 menit inkubasi dengan bromocresol green. Dengan demikian, agen
dan pendekatan memiliki potensi
diagnosis kanker awal yang sensitif pada tingkat sel dan aplikasi terkait.
Dibandingkan dengan pekerjaan kami yang baru-baru ini dilaporkan
skrining sel kanker dengan menggunakan nanoprobe glukosa plasmonik
20–22
, metode ini jauh lebih sederhana dan lebih efektif.
Deteksi dan profiling pH sel tunggal yang akurat. Deteksi pH sel tunggal lebih
lanjut dicapai oleh kami
Metode mikroskopik UV-Vis, menggunakan bromothymol blue sebagai indikator pH dan
mengumpulkan penyerapan
spektrum pada tingkat sel tunggal. Pertama, kami mempelajari spektrum serapan
larutan PBS bromothymol blue
nilai pH bervariasi untuk mendapatkan korelasi untuk deteksi pH kuantitatif sel
tunggal. Ada dua yang jelas
Gambar 2. Identifikasi visual dan skrining sel kanker dari sel normal dan uji
sitotoksisitas. (Sebuah)
Gambar mikroskop optik bidang terang dari sel HepG2 kanker, HeLa, A549, 4T1, normal
HL7702 dan L929
sebelum dan sesudah 5 menit inkubasi dengan 1 mg mL
−1
dari bromothymol blue, masing-masing; Semua bar skala: 20 μm.
(B) Uji sitotoksisitas untuk sel A549, HeLa, HL7702, dan L929 setelah inkubasi
dengan bromothymol
biru atau hijau bromokresol. A, B, C, D di bawah koordinat X mewakili sel A549,
HeLa, HL7702, dan L929,
masing-masing. (c) Gambar mikroskop lapangan terang dari sel kanker 4T1 dan sel-sel
HL7702 normal sebelumnya
(kiri, batang skala: 50 μm) dan setelah (kanan, batang skala: 15 μm) pengobatan
dengan bromocresol hijau. Sel-sel di dalamnya
garis putih putus-putus diidentifikasi sebagai sel HL7702.
www.nature.com/scientificreports/
4 RepoRts Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
fitur dalam spektrum (Gbr. 3a). Salah satunya adalah puncak penyerapan berpusat
sekitar ~ 400-440 nm, yang sangat tinggi
Bergantung pada pH dan akan berubah menjadi lebih kuat dan pergeseran merah secara
jelas dari 403 nm menjadi 433 nm (dan mencapai saturasi)
sesudahnya) sebagai larutan nilai pH turun dari 7,5 menjadi 4,5. Fitur lainnya
adalah bahwa puncak penyerapan tetap
berpusat pada 616 nm muncul dan intensitas puncak berkurang secara bertahap dan
akhirnya menghilang ketika pH larutan
ternyata asam. Puncak ini dapat dikaitkan dengan terjadinya transferensi hidrogen
(pada gugus fenolik) dan
transfer muatan intramolekul (disebabkan oleh efek konjugasi sistem)
23, 24
, Yang rumit dalam sel
sistem dan rentan terhadap kesalahan dan karena itu tidak berlaku untuk analisis pH
sel tunggal kuantitatif dalam penelitian ini.
Gambar 3b menunjukkan plot dari puncak penyerapan pertama sebagai fungsi pH untuk
larutan bromothymol blue
Nilai pH bervariasi dari 3,5 hingga 7,5, dengan bar kesalahan berasal dari tiga
ulangan. Inset pada Gambar. 3b adalah pas
kurva kalibrasi nonlinear untuk rentang pH 4,5-7,5 dengan R
2
= 0,992.
Biasanya spektral penyerapan sel tunggal dan mikroskop optik bidang dinormalisasi
yang dinormalisasi
sponding gambar mikroskop sel tunggal sel HL7702, L929, HeLa, dan A549 direkam
dengan metode ini
(Gbr. 4a), menggunakan bromothymol blue sebagai indikator pH dan sel tunggal kosong
A549 yang dipilih secara acak (bebas indikator)
sebagai sampel kosong. Di sini, spektra serapan sel tunggal dicatat hanya dari sel
tunggal yang utuh
(bertindak sebagai wadah sampel) dan digunakan untuk mendapatkan nilai pH rata-rata
dari satu sel utuh. UV-Vis
puncak penyerapan sel HL7702, L929, HeLa, dan A549 tunggal jelas diamati tanpa
gangguan dari
zat intraseluler sel. Puncaknya dibedakan dengan pergeseran merah bertahap, yang
berarti
Gambar 3. Spektrum serapan UV-Vis dan kurva kalibrasi larutan bromothymol blue /
PBS dengan berbeda
nilai pH. (a) Spektrum serapan UV-Vis tradisional larutan bromothymol blue / PBS
(10 mM) dengan beragam
nilai pH. Inset adalah spektra serapan UV-Vis dinormalisasi 350-500 nm untuk
bromothymol blue / PBS
solusi (10 mM) dengan nilai pH bervariasi. (B) Kurva kalibrasi larutan bromothymol
biru dalam hal
puncak serapan UV-Vis tergantung pH untuk pengukuran pH. Inset menunjukkan kurva
kalibrasi dari pH
4,5 hingga 7,5. Bar kesalahan menggambarkan deviasi standar relatif (RSD) selama
tiga ulangan.
Gambar 4. Deteksi dan profiling pH sel tunggal dengan kolorimetri UV-Vis berbasis
microspectroscopy
metode. (a) Spektrum serapan sel tunggal berbasis mikroskop lapangan cerah yang
dinormalisasi dan
gambar mikroskop sel dari sel HL7702, L929, HeLa, dan A549 yang direkam oleh
microspectroscopy UV-Vis kami,
setelah perawatan dengan bromothymol blue. (B) Histogram distribusi pH untuk HL7702
tunggal, L929,
Sel HeLa, A549, dan 4T1, masing-masing, terdeteksi oleh metode dengan bar kesalahan
berdasarkan setidaknya dua puluh tunggal
sel untuk setiap baris sel.
www.nature.com/scientificreports/
5 RepoRts Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
bahwa nilai pH mereka menurun secara bertahap sesuai dengan Gambar. 3a. Hasilnya
cukup dapat direproduksi untuk masing-masing
tipe sel, membuat metode ini layak dan andal untuk deteksi pH sel tunggal yang
akurat. Kebetulan, kami menemukan
secara eksperimen bahwa selalu ada deviasi red-shift tetap ~ 17 nm dari puncak
serapan indikator yang diperoleh
oleh metode spektroskopi berbasis mikroskop (Gbr. S5) dibandingkan dengan yang
diambil oleh UV-Vis tradisional
spektrometer, yang mungkin berasal dari perbedaan metodologi dan efek pengurungan
permukaan itu
mungkin ada dalam metode mikroskopis. Oleh karena itu, untuk deteksi pH sel tunggal
yang akurat, spektrum serapan
sel tunggal bromothymol yang diwarnai biru dikoreksi. Gambar 4b menunjukkan
histogram pH
distribusi untuk sel HL7702, L929, HeLa, A549, dan 4T1 tunggal, masing-masing,
terdeteksi oleh metode setelah
kalibrasi. Untuk setiap jenis sel, kami mendeteksi spektrum serapan setidaknya dua
puluh sel tunggal yang dipilih secara acak
untuk memastikan reproduksibilitas dan keandalan metode. Seperti ditunjukkan pada
Gambar. 4b, keragaman pH sel berbeda
tipe sel terungkap, dengan nilai pH rata-rata sel HL7702 tunggal, L929, HeLa, A549,
dan 4T1 dalam hal ini
studi diukur menjadi 7,23 ± 0,2, 7,0 ± 0,18, 5,75 ± 0,10, 5,5 ± 0,15, dan 5,32 ±
0,13, masing-masing. Yang diukur
nilai pH rata-rata dari sel HeLa tunggal utuh sangat konsisten dengan nilai yang
dilaporkan sebelumnya (5,7 ± 0,2)
5
.
Kanker
identifikasi sel dari sel sehat terkultur melalui pencitraan pH dan deteksi akurat
-
tion. Kami selanjutnya memeriksa kelayakan metode deteksi pH sel tunggal untuk
aplikasi klinis potensial.
kation. Coculture sel kanker 4T1 dan HL7702 normal (rasio 1: 1) disiapkan dan
diuji. Gambar 5a
dan 5b menampilkan gambar mikroskop optik bidang terang dan spektrum serapan UV-Vis
sel tunggal yang sesuai,
diambil dari empat sel tunggal yang dipilih secara acak seperti dilambangkan pada
Gambar. 5a, dari sel cocultured diobati dengan bro-
mothymol biru. Spektrum serapan yang diambil dari sel 1 dan sel 2 hampir identik,
demikian juga halnya dengan sel 3
dan sel 4. Spektrum serta nilai-nilai pH yang dihitung (seperti yang ditunjukkan
pada inset Gambar 5b) dalam keadaan baik.
dengan yang diambil dari sampel sel yang dikultur secara individu (lih. spektra
untuk HL7702 dan sel 4T1 pada Gambar. 4a dan
distribusi pH yang sesuai pada Gambar. 4b). Oleh karena itu, sel-sel kanker 4T1
dapat dengan mudah diidentifikasi dari
Gambar 5. Identifikasi sel kanker dari sel normal terkoordinasi dengan pencitraan
dan deteksi pH, dan sub-
deteksi pH seluler. (A) Gambar mikroskop optik bidang terang dari sel HL7702 dan
4T1 cocultured
diobati dengan bromothymol blue. Empat sel tunggal utuh (dengan area akuisisi
spektrum yang sesuai
ditandai dengan titik putih bertitik) dipilih secara acak untuk deteksi pH sel
tunggal. Skala bar: 20 μm. (b)
Spektrum serapan sel tunggal berdasarkan mikroskop bidang dinormalisasi sesuai dari
empat yang dipilih
sel sebagaimana dilambangkan dalam (a). (c) Gambar mikroskop optik bidang terang
1L929 sel yang diobati dengan bromothymol
biru. Sel L929 tunggal ditandai oleh dua kotak putih putus-putus (di berbagai
bagian sel) dipilih untuk sub-
deteksi pH seluler. Skala bar: 10 μm. (D) Sesuai dengan spektrum penyerapan sub-
seluler dinormalisasi
Sel L929 diambil dari dua bagian sel yang berbeda sebagaimana dinyatakan dalam (c).
www.nature.com/scientificreports/
6 RepoRts Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
sel terkoordinasi. Ini berarti bahwa metode yang dikembangkan dapat diterapkan
untuk identifikasi cepat kanker tanpa label
Sel-sel dari sel-sel normal terkoordinasi karena mereka memiliki tingkat pH
intraseluler yang berbeda.
Deteksi pH sub-seluler. Akhirnya, kami juga memeriksa kemungkinan metode untuk pH
sub-seluler
deteksi. Dalam penelitian ini, kami secara acak memilih sel L929 sebagai sampel.
Gambar 5c menunjukkan mikroskop bidang terang
gambar sel L929 dicelup biru bromothymol ditandai oleh dua kotak putih putus-putus
(dalam inti dan sitoplasma
bagian sel, masing-masing), yang dipilih untuk deteksi pH sub-seluler. Gambar 5d
menunjukkan korespondensi
ing spektra serapan sub-seluler area terpilih. Seperti terlihat jelas dari gambar,
daya serap puncak
sel yang diambil terutama dari nukleus memiliki pergeseran merah yang jelas (~ 16
nm) dibandingkan dengan yang diambil dari
bagian sitoplasma, dari mana nilai pH inti dan bagian sitoplasma sel dihitung
menjadi 5,63
dan 7.10, masing-masing. Ini juga merupakan indikator kuat bahwa pH yang diukur
merespons intraseluler
lingkungan daripada lingkungan ekstraseluler. Jika indikator terlokalisir pada
membran sel, penyerapan
puncak kedua bagian harus sama. Juga, pengukuran pH dalam penelitian ini cukup
dapat direproduksi dan
nilai pH yang diukur bervariasi hanya antara garis sel yang berbeda, yang
selanjutnya dapat mengecualikan kemungkinan pH
indikator lebih banyak dipengaruhi oleh lingkungan ekstraseluler daripada
lingkungan intraseluler.
Diskusi
Kami telah berhasil mengembangkan agen (dan metode) yang sederhana dan efektif
dengan menggunakan bromothymol blue atau bro-
mocresol green, yang biasanya digunakan untuk pengukuran pH larutan, untuk
pencitraan sel hidup juga
pengindraan dan profiling pH sel tunggal untuk pertama kalinya, dan berhasil
menggunakan metode ini untuk kanker
identifikasi sel dengan menggunakan gabungan mikroskop bidang terang. Setelah
menginkubasi indikator pH dengan sel hidup
untuk jangka waktu tertentu, garis besarnya, bahkan inti dan sitoplasma sel dapat
dengan mudah dibedakan,
itu berarti bahwa indikator pH dapat digunakan sebagai zat pewarnaan sel yang baru
dan efektif untuk pencitraan sel hidup. Untuk
percobaan, bromothymol blue atau bromocresol green yang baru disiapkan segera
diinkubasi
sel-sel setelah dihapus media kultur dan dibilas tiga kali dengan larutan etanol
20%. Dari
Gambar 2a, kita dapat secara visual mengidentifikasi sel-sel kanker dari sel-sel
normal yang sehat dengan cepat dan cepat. Sel hidup
percobaan pencitraan dan profil pH cukup dapat direproduksi. Kami mengulangi setiap
pengalaman selama lebih dari 3
kali semua memiliki hasil yang serupa. Lebih penting lagi, seperti yang ditunjukkan
pada Gambar. 2c, sel-sel tumor dapat dengan mudah diidentifikasi secara visual
dari sel-sel kesehatan normal yang dikultur bersama (yang mensimulasikan sampel sel
klinis), membuat indikator pH dan
pendekatan berbasis mikroskop sangat menjanjikan untuk penggunaan klinis potensial.
Selain itu, seperti dapat dilihat dari Gambar 3 dan
4, nilai-nilai pH dari berbagai jenis sel dapat dideteksi dengan menggunakan
kombinasi indikator pH dan bidang terang
mikroskop tunggal UV-Vis microspectroscopy sel tunggal. Sementara itu, metode ini
dapat diterapkan untuk yang cepat
identifikasi sel kanker dari sel normal terkoordinasi karena pH intraselulernya
yang berbeda
level (Gbr. 5a dan b). Juga, dapat digunakan dalam deteksi pH sub-seluler area
terpilih, karena bagian yang berbeda
dari sel tunggal memiliki tingkat pH yang berbeda dan mewakili spektra serapan
berbasis mikroskop yang berbeda (Gbr. 5c
dan d).
Tercatat bahwa walaupun ekstrusi asam oleh transpor aktif penting dalam sel kanker
yang aktif secara metabolik,
di mana ia menghilangkan kelebihan asam intraseluler dan mengatur pH istirahat
intraseluler
7
, tingkat pH intraseluler yang tepat
(Asam atau basa daripada sel normal) sel kanker masih diperdebatkan karena
kurangnya metode langsung dan dapat diandalkan untuk
mendeteksi pH sel tunggal, terutama untuk pH inti
13
. Sebagian besar peneliti berasumsi bahwa itu adalah nuklir
sama dengan sitosol, yang didasarkan pada mekanisme yang diasumsikan yang
membutuhkan validasi eksperimental
13
. Itu
metode deteksi pH seluler langsung, andal (sub) yang kami kembangkan di sini dapat
memberikan bukti sel tunggal yang kuat
untuk membantu menyelesaikan kontroversi seperti itu, dan akan memperluas metode
untuk mengeksplorasi sub-seluler yang menarik dan penting
studi terkait pH.
Hingga kini, kanker telah menjadi salah satu ancaman kesehatan global yang paling
serius, dan morbiditasnya meningkat.
Semakin banyak metode telah digunakan sebagai alat yang kuat untuk deteksi klinis
kanker, termasuk magnetik
resonance imaging (MRI), saat ini dikomputasi tomografi (CT), uji imunofluoresensi
dan patologis
imunohistokimia (IHC), teknologi chip protein dan sebagainya. Namun, metode ini
selalu menderita
beberapa kelemahan, seperti terlalu mahal untuk melakukannya pada semua pasien yang
dicurigai, nilai prediksi positif rendah,
variasi individu yang tinggi dan prosedur yang memakan waktu. Selain itu, mereka
masih belum cukup sensitif
diagnosis dini kanker, terutama pada tingkat sel tunggal. Karena kesederhanaan,
kecepatan, efektivitas dan ketersediaan,
indikator pH kami dan teknik pencitraan mikroskop lapangan terang akan menjanjikan
untuk deteksi dini
kanker, terutama untuk skrining awal kanker in-vitro throughput tinggi-sampel untuk
dicurigai
pasien.
Sebagai kesimpulan, kami melaporkan metode kolorimetri sederhana dan dapat
diandalkan untuk pencitraan dan penginderaan pH sel tunggal
dengan kombinasi penggunaan mikrospektroskopi UV-Vis dan dua indikator pH umum.
Intra akurat dan sensitif
profiling pH seluler dan deteksi pada tingkat sel tunggal atau sub-sel dengan
reproduksibilitas yang baik telah dicapai oleh
metode ini, yang memungkinkan diskriminasi pH yang mudah dan identifikasi cepat
sel-sel kanker dari -
sel mal (karena tingkat pH intraseluler dapat dibedakan). Kepraktisan pendekatan
yang diusulkan lebih jauh
hanya diilustrasikan oleh aplikasi yang sukses untuk membedakan sel-sel kanker dari
sel-sel normal yang terkoordinasi sebagaimana mereka
memiliki tingkat pH intraseluler yang berbeda. Probe dan sensor penginderaan pH sel
molekul kecil yang diusulkan,
yang didasarkan pada penggunaan agen umum non-sitotoksik dan mikroskop medan terang
dan hanya memiliki sangat
proses satu langkah sederhana, jauh lebih sederhana dan efektif daripada metode
yang dilaporkan sebelumnya yang biasanya perlu
persiapan nanoprobe rumit dan kurang reproduktifitas. Karya ini menyediakan metode
baru dan andal untuk
penginderaan pH dan profil intraseluler yang akurat, dan dapat membuka jalan baru
untuk studi sel tunggal terkait-pH,
yang penting dan akan mempromosikan pemahaman tentang sifat fisikokimia sel,
terutama
sel kanker
Kami juga membayangkan bahwa penggunaan gabungan platform penelitian sel tunggal
berbasis microspectroscopy
dan nanoprobe plasmonic cerdas / multifungsi
21, 22, 25, 26
akan bermanfaat dan memperkaya studi sel tunggal. Pekerjaan
juga mengilhami pengembangan agen baru dan alat yang efektif untuk diagnosis kanker
dini pada tingkat sel tunggal.
www.nature.com/scientificreports/
7 RepoRts Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
Material dan metode
Materi. Sodium klorida (NaCl), kalium klorida (KCl), disodium hidrogen fosfat (Na
2
HPO
4
),
potassium phosphate monobasic (KH
2
PO
4
) dan asam klorida (HCl) dibeli dari Beijing Chemical
Bromothymol blue, bromocresol green, methyl red dan thymol blue diperoleh dari
Aladin Ltd.
(Shanghai, Cina). 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
(MTT) dibeli dari
Boster Biological T echnology Co, Ltd Dimethyl sulfoxide (DMSO) diperoleh dari
Xilong Chemical Industry
Incorporated Co, Ltd Serial bovine medium dan Fetal Eagle dibeli dari Gibco.
Penisilin dan strep-
tomisin diperoleh dari Invitrogen. Semua bahan kimia digunakan saat diterima dan
tanpa purifikasi lebih lanjut.
fikasi. Semua gelas dan pengaduk dibersihkan dengan sangat hati-hati di aqua regia
(3: 1 v / v HCl (37%): HNO
3

(65%)) solusi (Perhatian: solusi aqua regia sangat korosif dan harus ditangani
dengan sangat hati-hati,
sarung tangan dan pelindung mata diperlukan untuk penanganan. Jangan pernah
menyimpan solusi ini dalam wadah tertutup) dan kemudian
dibilas secara menyeluruh dengan H
2
O sebelum digunakan. Semua larutan berair disiapkan menggunakan air deionisasi
(DI).
Air disiapkan dalam sistem pemurnian Millipore Milli-Q tiga tahap dan memiliki
resistivitas lebih tinggi dari
18,2 MΩ cm.
Budaya sel. Sel HeLa, HepG2, A549, HL7702, L929, dan 4T1 diperoleh dari American
Type
Koleksi Budaya (ATCC, USA). Sel-sel dipelihara dalam medium Eagle yang dimodifikasi
milik Dulbecco yang dimodifikasi.
mented dengan 10% serum janin sapi yang mengandung 200 unit mL
−1
streptomisin dan 200 unit mL
−1
penisilin.
Semua sel dikultur dalam piringan kultur sel plastik yang dipelihara dalam labu
kultur pada suhu 37 ° C dalam kondisi lembab
atmosfer mengandung 5% CO
2
. Jumlah sel dihitung sebagai ca. 5 × 10
6
sel mL
−1
.
Pewarnaan Sel dan Pembuatan Profil pH dengan Indikator pH. Untuk pewarnaan sel dan
profiling pH, kultur sel
media pertama kali dihilangkan dan kemudian dicuci sel dengan larutan etanol 20%
selama tiga kali.
Selanjutnya, larutan indikator pH (1 mg mL
−1
) ditambahkan ke piring dan dihapus setelah berinteraksi dengan sel untuk
~ 5 mnt. Akhirnya, sel-sel dicuci dengan larutan etanol 20% lagi selama tiga kali
untuk menghilangkan
indikator pH berlebihan.
Studi Kelayakan Sel. Untuk menilai sitotoksisitas bromothymol blue dan bromocresol
green, the
Uji metil tiazoliltratrazolium (MTT) standar dilakukan untuk menentukan viabilitas
sel relatif setelah 24 jam
perawatan dengan bromothymol blue atau bromocresol green. Absorbansi formazan
(diproduksi oleh belahan dada)
MTT oleh dehydrogenases dalam sel hidup) berbanding lurus dengan jumlah sel hidup
27
. Untuk setiap MTT
uji, 96 sumur biakan sel A549, HeLa, HL7702, dan L929 disiapkan (~ 5000 sel /
baik). Setelah sel
menempel ke piring, media kultur sel tersedot keluar, dan kemudian 0,1 ml
bromothymol blue (1 mg mL
−1
)
atau bromokresol hijau (1 mg mL
−1
) ditambahkan ke masing-masing jenis sel dan diinkubasi selama ~ 10 menit, masing-
masing. Lanjut,
indikator pH disedot dan media kultur (0,1 mL) ditambahkan kembali ke pelat uji 96-
sumur.
Setelah 24 jam inkubasi, 10 μL larutan MTT ditambahkan ke masing-masing sumur dari
pelat uji sumur 96 dan sumur
campuran sangat. Empat jam kemudian, 100 μL DMSO ditambahkan ke masing-masing sumur
untuk melisiskan sel. Pengujian lengkap adalah
dilakukan setidaknya tiga kali, dan hasilnya rata-rata. Viabilitas sel dihitung
sebagai rasio
absorbansi sampel dengan baik terhadap sumur kontrol dan dinyatakan sebagai persen
viabilitas, menugaskan viabilitas
sel yang tidak diobati 100%.
Pencitraan Sel Colorimetric Berbasis Mikroskop dan Deteksi pH Single-Cell.
Mikroskopis dan
gambar bidang terang diperoleh dengan mikroskop terbalik DMI6000 B (Leica) dan
warna digital DFC450
kamera (Leica). Sebelum pencitraan, media kultur sel telah dihapus dan kemudian
sel-sel dicuci dengan 20%
larutan etanol berair selama tiga kali. Selanjutnya, larutan indikator pH
ditambahkan ke piring dan dikeluarkan
setelah berinteraksi dengan sel selama ~ 5 menit. Akhirnya, sel-sel dicuci dengan
larutan etanol 20% lagi
selama tiga kali untuk menghapus indikator pH berlebihan. Untuk pengujian MTT,
nilai absorbansi formazan
terdeteksi oleh Bio-Rad model-680 microplate reader pada 570 nm. Untuk mengumpulkan
spektrum serapan tunggal
sel, spektrometer Spectrasuite dengan tempat pengumpulan kecil (300 × 300 μm)
digunakan. Spektrum referensi
dikumpulkan dari area bersih di mana tidak ada sel atau kontaminan yang disajikan,
dan kemudian dikurangi dan digunakan
untuk menormalkan spektrum serapan sampel.
Referensi
1. Ishaque, A. & Al-Rubeai, M. Penggunaan pH intraseluler dan uji aliran annexin-V
aliran untuk memantau apoptosis dan penindasannya
oleh bcl-2 ekspresi berlebihan dalam kultur sel hybridoma. J. Immunol. Metode 221,
43–57, doi: 10.1016 / S0022-1759 (98) 00166-5 (1998).
2. Gottlieb, R. A., Nordberg, J., Skowronski, E. & Babior, B. M. Apoptosis
diinduksi dalam sel Jurkat oleh beberapa agen didahului oleh
pengasaman intraseluler. Proc Natl. Acad. Sci. AS 93, 654–658, doi: 10.1073 /
pnas.93.2.654 (1996).
3. W an, Q., Chen, S., Shi, W., Li, L. & Ma, H. Lysosomal pH Naik selama Heat
Shock Dipantau oleh Lysosome-T argeting Near-Infrared
Probe Fluorescent Ratiometrik. Angew. Chem Int. Ed. 53, 10916-10920, doi: 10.1002 /
anie.201405742 (2014).
4. Chen, S. et al. Penginderaan pH Intraseluler Full-Range oleh Ratiometrik Dua
Saluran yang Diinduksi Emisi-Aktif Agregasi
Fluorogen. Selai. Chem Soc. 135, 4926–4929, doi: 10.1021 / ja400337p (2013).
5. Lee, M. H. et al. Penyelidikan Dua-Warna untuk Memantau Beragam pH V dalam sel.
Angew. Chem Int. Ed. 52, 6206–6209, doi: 10.1002 /
anie.201301894 (2013).
6. Cao, Y., Qian, R.-C., Li, D.-W. & Long, Y.-T. Raman / fluoresensi sensor ganda
dan pencitraan distribusi pH intraseluler. Chem
Komunal. 51, 17584–17587, doi: 10.1039 / c5cc07697h (2015).
7. Hulikova, A., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. & Swietach, P. Regulasi pH
intraseluler dalam garis sel kanker di bawah normoksia
dan hipoksia. J. Cell. Physiol. 228, 743–752, doi: 10.1002 / jcp.24221 (2013).
8. Wang, F. et al. Deteksi Hamburan Hamburan Raman yang Ditingkatkan Permukaan
dengan Asam 4-Mercaptobenzoic Terenkapsulasi Silika
Nanopartikel Perak Difungsionalisasi. Anal Chem 84, 8013–8019, doi: 10.1021 /
ac3018179 (2012).
9. Tian, J. et al. Nanopartikel yang Dimuat dengan Spesifik dan pH-Diaktifasi
untuk Fotodinamik Inframerah Dekat Sangat Selektif
Terapi melawan Kanker. Selai. Chem Soc. 135, 18850–18858, doi: 10.1021 / ja408286k
(2013).
10. Shi, W., Li, X. & Ma, H. A Sensor Ratiometrik Merdu Berbasis Carbon Nanodots
untuk Pengukuran Kuantitatif
PH intraseluler dari Sel Utuh. Angew. Chem Int. Ed. 51, 6432-6435, doi: 10.1002 /
anie.201202533 (2012).
www.nature.com/scientificreports/
8 RepoRts Ilmiah | 7: 1759 | DOI: 10.1038 / s41598-017-01956-1
11. T ang, B. et al. Probe Fluoresen pH Netral Near-Infrared untuk Memantau
Perubahan pH Kecil: Pencitraan dalam Kehidupan HepG2 dan
HL-7702 Sel. Selai. Chem Soc. 131, 3016–3023, doi: 10.1021 / ja809149g (2009).
12. Li, X., Gao, X., Shi, W. & Ma, H. Strategi Desain untuk Probe Kromogenik dan
Fluorogenik Molekul Kecil yang Larut Dalam Air. Chem
Rev. 114, 590–659, doi: 10.1021 / cr300508p (2014).
13. Casey, J. R., Grinstein, S. & Orlowski, J. Sensor dan regulator pH
intraseluler. Nat. Pdt. Mol. Biol sel. 11, 50–61, doi: 10.1038 /
nrm2820 (2010).
14. Srivastava, J., Barber, D. L. & Jacobson, M. P. Sensor pH intraseluler:
Prinsip Desain dan Signifikansi Fungsional. Fisiologi 22,
30–39, doi: 10.1152 / physiol.00035.2006 (2007).
15. Roos, A. & Boron, W. F. PH intraseluler. Physiol. Rev. 61, 296-434 (1981).
16. Pasang surut, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P. & Barber, D. L.
Dysregulated pH: badai yang sempurna untuk perkembangan kanker. Nat. Pdt. Kanker
11, 671–677, doi: 10.1038 / nrc3110 (2011).
17. Jalankan dengan cepat, P. et al. Pengaruh pH Rendah pada Protein Perlawanan
Kanker Payudara (ABCG2) -Mediated Transport of Methotrexate,
7-Hydroxymethotrexate, Methotrexate Diglutamate, Asam Folat, Mitoxantrone,
Topotecan, dan Resveratrol dalam In Vitro Drug
Model Transportasi. Mol. Farmakol 71, 240–249, doi: 10.1124 / mol.106.028167
(2007).
18. Lindner, D. & Raghavan, D. pH ekstra-seluler intra-tumoural: parameter yang
berguna sebagai respons terhadap kemoterapi pada tumor syngeneic
garis. Br. J. Kanker 100
1287–1291, doi: 10.1038 / sj.bjc.6605022 (2009).
19. Ho, H. et al. Menyempurnakan respons LSPR dari nanopartikel inti-kulit
nanorod-polianilin emas dengan fototermal tinggi
efisiensi untuk ablasi sel kanker. J. Mater. Chem B. 3, 5189–5196, doi: 10.1039 /
C5TB00556F (2015).
20. Chen, L. M., Li, H. J., Dia, H. L., Wu, H. X. & Jin, Y. D. Nanosensor Glukosa
Plasmonic Cerdas sebagai Agen Theranostik Generik untuk
Penapisan dan Pembunuhan Sel Kanker Bebas Penargetan. Anal Chem 87, 6868-6874, doi:
10.1021 / acs.analchem.5b01260 (2015).
21. Dia, H. L., Xu, X. L., Wu, H. X. & Jin, Y. D. Teknik Plasmonik Enzimatik
Nanoshells Ag / Au Bimetal dan Penggunaannya untuk
Sensitif Glukosa Optik Sensing. Adv. Mater. 24, 1736–1740, doi: 10.1002 /
adma.201104678 (2012).
22. Jin, Y. D. Multi Compact Compact Hybrid Nanoshells: Generasi Baru Probe
Nanoplasmonic untuk Biosensing, Pencitraan,
dan Rilis Terkendali. Acc. Chem Res. 47, 138–148, doi: 10.1021 / ar400086e (2014).
23. Rottman, C., Grader, G., De Hazan, Y., Melchior, S. & Avnir, D. Modifikasi
Reaktifitas Dopan yang Diinduksi Surfaktan dalam Sol-Gel
Matriks. Selai. Chem Soc. 121, 8533-8543, doi: 10.1021 / ja991269p (1999).
24. El-Nahhal, I. M., Zourab, S. M., Kodeh, F. S. & Abdelsalam, F. H. Enkapsulasi
sol-gel indikator pH biru bromothymol dalam
Kehadiran surfaktan Gemini 12-2-12. J. Sol-Gel Sci. Technol. 71, 16–23, doi:
10.1007 / s10971-014-3324-6 (2014).
25. Jin, Y. D. & Gao, X. Titik kuantum neon plasmonik. Nat Nano 4, 571-576, doi:
10.1038 / nnano.2009.193 (2009).
26. Jin, Y. D., Jia, C., Huang, S.-W., O'Donnell, M. & Gao, X. Nanopartikel
multifungsi sebagai agen kontras. Nat Commun 1,
41 (2010).
27. Chen, C., Zhou, L., Geng, J., Ren, J. & Qu, X. Fotosensitizer-Dimasukkan
Quadruplex DNA-Gated Nanovechicles for Light-
Pengiriman Obat Ganda yang Dipicu dan Ditargetkan ke Sel Kanker. Kecil 9, 2793–
2800, doi: 10.1002 / smll.v9.16 (2013).
Ucapan Terima Kasih
Karya ini didukung oleh National Science Foundation of China (No. 21475125,
21175125), Seratus
Program Bakat dan penelitian ilmiah dan proyek pengembangan peralatan (No.
Y728011001) dari Cina
Akademi Ilmu Pengetahuan, dan Laboratorium Kunci Negara Kimia Elektroanalitik (No.
110000 R387).
Kontribusi Penulis
H.H. dan Y .J. merancang penelitian dan menulis teks naskah utama. H.H., Y .Z.,
C.L., M.W., X.X. dan Y.J. dianalisis
data dan meninjau naskah.
informasi tambahan
Informasi tambahan menyertai makalah ini di doi: 10.1038 / s41598-017-01956-1
Minat Bersaing: Penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki minat bersaing.
Catatan penerbit: Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi
dalam peta yang diterbitkan dan
afiliasi kelembagaan.
Akses Terbuka Artikel ini dilisensikan di bawah Creative Commons Attribution 4.0
International
Lisensi, yang mengizinkan penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi, dan reproduksi
dalam media apa pun atau
format, selama Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan
sumbernya, berikan tautan ke Pembuat
Ijin Commons, dan menunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak ketiga
lainnya dalam hal ini
artikel termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel, kecuali dinyatakan
sebaliknya dalam batas kredit ke
bahan. Jika materi tidak termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel dan
penggunaan yang Anda maksudkan tidak
disahkan oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang diizinkan,
Anda harus mendapatkan izin langsung dari
pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi ini, kunjungi
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

© Penulis (s) 2017