Diversidad genética de la comunidad bacteriana y hongos micorrícicos arbusculares en el maíz bajo

diferentes fuentes de fosfato

Amanda Nayê Guimarães Tavares (1); Ubiana Cássia Silva (2), Ubiraci Gomes de Paula Lana (3,4);

Eliane Aparecida Gomes (5); Christiane Abreu de Oliveira Paiva (5); Vera Lucia dos Santos (6)

(1) Estudiante, miembro de FAPEMIG, Facultad de Ciencias de la Vida; (2) Estudiante de Doctorado

en Microbiología, Universidad Federal de Minas Gerais - UFMG, Belo Horizonte, MG;

ubiana.microb.ufmg@gmail.com; (3) Analista de investigación; Embrapa Maíz y Sorgo; (4) profesor;

Centro Universitario de Sete Lagoas - UNIFEMM; (5) Investigador, maíz Embrapa y sorgo; (6)

Profesor, UFMG.

RESUMEN El maíz (Zea mays L.) es uno de los cultivos más importantes en la agricultura
mundial, siendo Brasil el tercer mayor productor. Sin embargo, la productividad de este
cultivo en Brasil todavía se considera baja. Lograr mayores rendimientos requiere el uso de
tecnologías sostenibles que interfieran con los factores de producción, como el uso de
inoculantes microbianos capaces de poner el fósforo (P) a disposición de la planta. En este
contexto, los estudios que apuntan a conocer la diversidad microbiana asociada con el maíz
cultivado bajo diferentes tensiones pueden promover el desarrollo de inoculantes
microbianos eficientes para promover el crecimiento de las plantas. Este estudio tuvo como
objetivo estudiar el perfil de la comunidad bacteriana y los hongos micorrícicos arbusculares
(AMF) asociados con la rizosfera y las partes internas de la raíz del maíz, cultivadas con
diferentes fuentes de fosfato, utilizando la técnica t-RFLP. El ADN extraído del suelo
rizosférico y las bacterias endofíticas de la raíz se amplificó con cebadores para los genes
16S rRNA y 23S rRNA de bacterias y AMF, respectivamente. Los resultados mostraron que
tanto las comunidades bacterianas como las AMF fueron alteradas de acuerdo con la fuente
de P agregada. La comunidad bacteriana también difería con el ambiente colonizado, el
suelo rizosférico y la región de la raíz interna (comunidad endofítica). Se concluye que
diferentes tipos de fertilización con fosfato modulan la composición de la comunidad
microbiana asociada al maíz, lo que debería ser un factor importante a considerar cuando el
objetivo es acceder a estos microorganismos a partir de técnicas de aislamiento y su uso
como bioinoculantes.

Términos de índice: tRFLP, bacterias, hongos, suelo. INTRODUCCION El maíz (Zea mays
L.) es uno de los cultivos más importantes en la agricultura mundial, siendo el segundo cereal
más utilizado para el consumo humano (Monje, 2011). El maíz (Zea mays L.) es uno de los
cultivos más importantes en la agricultura mundial, siendo el segundo cereal más utilizado
para consumo humano (Monje, 2011). El maíz (Zea mays L.) es uno de los cultivos más
importantes en la agricultura mundial, siendo el segundo cereal más utilizado para el
consumo humano (Monje, 2011). Para el cultivo a gran escala de este producto es necesario
agregar fertilizantes como nitrógeno (N), fósforo (P) y potasio (K). P es el tercer componente
que limita el crecimiento de las plantas y actúa en una serie de procesos, incluida la
fotosíntesis, la respiración, la señalización celular y la síntesis de ácido nucleico (Vance et
al., 2003). Para el maíz, el P es extremadamente necesario durante la floración, completando
su requerimiento máximo cuando el grano comienza a llenarse (Vasconcellos, 2000). En
este contexto, el efecto de la interacción planta-microorganismo puede ser beneficioso para
la planta huésped al ayudar en su desarrollo (Mendes et al., 2013). Los microorganismos
pueden interactuar de diferentes maneras con las plantas, funcionando colectivamente como
un microbioma. Pueden colonizar los tejidos internos de las plantas, y se denominan
microorganismos endofíticos, superficies foliares (epífitas) y compartimentos radiculares por
separado: rizosfera, rizoplano y endosfera (Ryan et al., 2008; Philippot et al., 2013). El
conocimiento y la manipulación de los microbiomas de las plantas pueden ser un recurso
biotecnológico alineado con los intereses de disminuir los costos de producción y aumentar
la sostenibilidad en la agricultura. Una tecnología prometedora es el uso de inoculantes
microbianos capaces de promover el crecimiento de las plantas o actuar como agentes
biológicos de control de plagas y enfermedades (Mendes et al., 2013). El objetivo de este
trabajo fue evaluar el perfil de la comunidad bacteriana y los hongos micorrícicos
arbusculares asociados con la rizosfera y las partes internas de la raíz del maíz, cultivadas
con diferentes fuentes de fosfato, utilizando la técnica t-RFLP.

(Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal). MATERIAL Y MÉTODOS

Diseño experimental El experimento se instaló en Embrapa Corn and Sorghum en Sete
Lagoas, MG (19º28’S 44º15’W), consistente en tres tratamientos (T1: suelo agrícola sin
adición de P; T2: suelo agrícola con adición soluble de P; T3: suelo agrícola con adición de
fosfato de Araxá), con un total de nueve parcelas, divididas en tres bloques debajo del Diseño
experimental de bloques al azar. El maíz Embrapa maíz y sorgo híbrido 30F35YH se plantó
manualmente con sonajero en hileras de 5 m de largo, separadas 70 cm. El tratamiento de
fertilización con fosfato recibió 100 Kg.ha-1 de P2O5 de trifosfato triple y fosfato de Araxá
aplicado a una profundidad de 5 cm a través de la abertura de las ranuras de azada debajo
y al lado de la línea de siembra. Después de 60 días de plantación, de cada repetición, se
recolectaron 5 plantas, totalizando 15 plantas por tratamiento y 45 muestras totales. Estos
fueron transportados al laboratorio en bolsas de plástico.

Recolección y procesamiento de muestras Las submuestras de raíz con suelo rizosférico

adherido se procesaron para la extracción total de ADN. Inicialmente, las muestras recién
recolectadas en el campo se lavaron con presión de agua para eliminar el exceso de tierra.
Se añadieron aproximadamente 5 g de las raíces más delgadas con suelo rizosférico
adherido a un tubo cónico que contenía 30 ml de tampón fosfato (6,33 g de L-1
NaH2PO4.H2O y 16,5 g de L-1 Na2HPO4.7H2O). Los tubos se agitaron durante 15
segundos y las raíces se transfirieron a un nuevo tubo de 50 ml que contenía 30 ml de
tampón fosfato. El suelo obtenido de este procedimiento correspondió a la primera fracción.
Luego, las raíces se homogeneizaron y se sonicaron a baja frecuencia (50-60 Hz) durante 5
min, 5 veces de sonicación 30 s, seguido de 30 segundos de descanso. Las raíces se
transfirieron a un nuevo tubo que contenía 30 ml de tampón fosfato y se obtuvo la segunda
fracción de suelo (Lundberg et al., 2012). Las dos fracciones de suelo rizosférico se
mezclaron, centrifugaron, congelaron en pellets en nitrógeno líquido y se almacenaron a -
80ºC. Para obtener las bacterias endofíticas de las raíces, se lavaron con agua destilada
hasta que se aclararon y se sometieron a desinfección. Para este propósito, las raíces se
mantuvieron sumergidas durante 3 minutos en 30 ml de solución de etanol al 70% (v / V), se
lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de alcohol y se sumergieron en 30 ml de
hipoclorito de sodio al 2% (m / v) durante 5 min. Al final, las raíces se lavaron 4 veces con
agua destilada en autoclave, la última se sembró en placas para verificar la eficacia de la
desinfección (Bulgari et al., 2009). A continuación, la liberación de células bacterianas se
realizó de acuerdo con la metodología establecida por Sessitsch et al. (2012), con
modificaciones. Brevemente, se cortaron las raíces y después de hacer surcos de bisturí
estériles, se transfirieron a erlenmeyer que contenía solución salina y perlas de vidrio al
0,85% (v / v). Después de agitar a 200 rpm durante 7 horas. A temperatura ambiente, la
suspensión se filtró en una membrana de 5 m usando un sistema de vacío. El filtrado se filtró
con membrana con poro de 0,22 µm para concentrar las células bacterianas y estas
membranas se almacenaron a -80ºC.

Extracción de ADN Para la extracción de ADN genómico del suelo y las membranas que

contienen células bacterianas, se usó el kit de ADN Power Max Soil (MoBIO Laboratories,

Inc.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad del ADN se evaluó mediante

electroforesis en gel de agarosa al 1% (m / v) y cuantificación mediante espectrofotómetro

(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). T-RFLP Para el análisis bacteriano, la región del

gen 16S rDNA se amplificó con los cebadores 8F (6-FAM) y 1492R (LaMontagne et al.,

2002). La reacción de PCR consistió en 50 ng de ADN, 0.25 mmol / L de cada cebador, 5 μL

de tampón de reacción 10X, 3 mmol / L de MgCl2, 0.125 mmol / L de dNTP, 2.5 U Taq ADN

polimerasa (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) a 50 µL. Para la amplificación del gen 23S

rDNA de hongos micorrícicos arbusculares (AMF), se usó PCR anidada de la reacción con

los cebadores LR1 y FLR2 (Trouvelot et al., 1999). La reacción inicial consistió en 50 ng de

ADN, 0.2 mmol / L cebador, 5 μL 10X buffer de reacción, 2.5 mM MgCl2, 0.125 mmol / L

dNTPs, 2.5 U Taq DNA polimerasa ( Invitrogen) a 50 μL. Para la segunda reacción de PCR,

se usaron 2.5 μL del primer producto de reacción y los cebadores FLR3 (6-FAM) y FLR4

(NED) (Gollotte, 2004). Las condiciones de PCR fueron las mismas que las utilizadas en la
primera reacción. Los fragmentos amplificados se digirieron con enzimas de restricción AluI

(16S rDNA) y TaqI (23S rDNA). Para la digestión, se usaron 10 μL de producto de PCR, 2

μL de tampón 10X y 1 U de cada enzima en 20 μL. Para evaluar los fragmentos de ADN

generados, se mezclaron 2 μL de la digestión con 9.8 μL de formamida desionizada (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) Y 0.2 μL del estándar ROX 500 (Applied Biosystems).

El análisis se realizó en Genetic Analyzer 3500XL (Applied Biosystems) con el software

GeneMapper 5.0. Posteriormente, los datos se analizaron utilizando el software en línea T-

REX (Culman et al., 2009), que permite el filtrado de ruido y la alineación automática del

tamaño de los fragmentos. Luego, los datos se exportaron en una hoja de cálculo binaria y

se ordenaron por análisis de componentes principales (PCA) o escalado multidimensional

no métrico (NMDS) desde un Matriz de similitud de Jaccard utilizando el programa pasado versión

3.04 (Hammer et al., 2001).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De acuerdo con los resultados obtenidos, podemos observar la separación de la comunidad bacteriana

según los ambientes, el suelo rizosférico y el interior de la raíz (Figura 1). Los microorganismos pueden

interactuar de diferentes maneras con las plantas y colonizar tejidos internos y externos, así como la

región de la rizosfera. Sin embargo, cada entorno tiene características físicas y químicas diferentes, lo

que puede desencadenar la selección de comunidades microbianas distintas. La región de la rizosfera

se caracteriza por recibir metabolitos producidos por la planta, como mucílagos y exudados liberados

por las raíces que estimulan el crecimiento y la diversidad de la microbiota (Bais et al., 2011). La

rizosfera está directamente influenciada por los componentes del suelo y las tensiones abióticas, como

la disponibilidad de agua y nutrientes. La comunidad microbiana que habita en el interior de la planta

ya está en un entorno protegido, pero expuesta a otras tensiones bióticas, como las presiones de

selección del sistema de defensa de la planta, seleccionando microorganismos capaces de penetrar en

los tejidos de la planta sin ser reconocidos como patógenos ( Kogel et al., 2006).
Figura 1. Análisis de escalamiento multidimensional no métrico (MDS) de la diversidad genética,

determinado por T-RFLP, para bacterias rizosféricas y endofíticas en maíz.

Además de la diferencia encontrada entre la rizosfera y los ambientes interiores de la planta, también

se observa que la comunidad microbiana de bacterias se agruparon de acuerdo con la fuente de P

agregada al suelo, lo que indica que, independientemente del ambiente evaluado, el tipo de fertilización

con fosfato afectó la composición. comunidad bacteriana (Figuras 2 y 3). Para los hongos micorrícicos

arbusculares también se observó separación de las muestras según el tipo de fertilización con fosfato

(Figura 4).

Figura 2. Análisis de escalamiento multidimensional no métrico (MDS) para bacterias endofíticas en

función de las fuentes de P: No se agrega P (rojo), fosfato de Araxá (azul) y P soluble (negro).

Figura 3. Análisis de componentes principales para bacterias rizosféricas en función de fuentes de P:

No se agregó P (rojo), fosfato de Araxá (azul) y P soluble (negro).

Figura 4. Análisis de componentes principales de la diversidad genética, determinada por T-

RFLP, de hongos micorrícicos en función de las fuentes de P: sin adición de P (rojo), Araxá
(azul) y P soluble (negro). Toljander y col. (2008) también verificaron el efecto de la
fertilización en la comunidad bacteriana y AMF comparando tratamientos con fertilizantes
orgánicos e inorgánicos por T-RFLP. Las modificaciones se correlacionaron con el nivel de
fosfato en el suelo, pero principalmente con el pH del suelo. Los estudios que tienen como
objetivo conocer la diversidad microbiana asociada con el maíz cultivado bajo diferentes
tensiones y comprender su papel en la nutrición de este cultivo pueden dirigir la búsqueda
de microorganismos eficientes en la promoción del crecimiento, promoviendo el desarrollo
de inoculantes microbianos efectivos en el suministro de nutrientes al cultivo. Maíz
CONCLUSIONES La estructura de las comunidades bacterianas asociadas al maíz puede
variar según la parte de la planta colonizada, la rizosfera y la endosfera radicular. La fuente
de P añadida al suelo también afecta la diversidad de la comunidad bacteriana tanto en la
rizosfera como en la endosfera, así como la composición de la comunidad AMF. El t-RFLP
tiene sensibilidad para detectar diferencias en la estructura de comunidades bacterianas y
de AMF asociadas con plantas de maíz. AGRADECIMIENTOS A Embrapa Corn and
Sorghum, la Fundación de Apoyo a la Investigación del Estado de Minas Gerais - FAPEMIG
y la Coordinación para el Mejoramiento de la Educación Superior - CAPES.

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