JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan
fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya).
Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC
fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis
tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika
mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan
puncak yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh
ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan
oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan
(ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk
solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak
diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang
tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3)

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada
banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah
polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya.
Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi
penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik
serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi
masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau
menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati
porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh
lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir
adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus,
akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini
tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam
mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks.
1. Kromatografi Adsorbs!
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dafam kromatografi kolom dan kromatografi
lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbs! biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya
solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor'31.
Fase gerak memegang perananyang penting pada kromatografi adsorpsi. Faktanya, fase gerak dapat
memberikan perubahan yang besar dalam karakteristik retensi sampel. Kekuatan pelarut (fase gerak)
akan mengontrol nilai faktor retensi semua puncak sampel. Parameter kekuatan pelarut (£°) telah
digunakan beberapa tahun Untuk untuk silika dan alumina secara kuantitatif. Parameter kekuatan
pelarut didefinisikan sebagai energi adsorpsi pelarut pada penjerap per unit luas pelarut. Tabel 4.3.
memberikan nilai kekuatan peiarut (fase gerak) untuk beberapa pelarut yang digunakan dalam
kromatografi adsorpsi. Semakin kecil nilai £°menunjukkan pelarut yang semakin lemah, demikian juga
sebaliknya. Pelarut-pelarut yang diringkas pada tabel 4.3. merupakan pelarut tunggal. Pada umumnya,
fase gerak menggunakan campuran pelarut untuk dengan perbedaan nilai £° yang luas, sehingga akan
diperoleh campuran pelarut dengan nilai £°yang diinginkan. Pada akhirnya pengaturan nilai £° ini
ditujukan untuk diperolehnya nilai faktor retensi pada kisaran 1 -"lO®.
Tabel 4.3. Pelarut-pelarut yang digunakan dalam kromatografi adsorpsi'81.
Pelarut

Kekuatan pelarut (£°)

n-heksana

0,01 Silika

0,01 Alumina

1-klorobutana

0,20 Silika

0,26 Alumina

Kloroform

0,26 Silika

0,40 Alumina

Isopropil eter

0,34 Silika

0,28 Alumina

Etil asetat
0.38 Silika

0,58 Alumina

Tetrahidrofuran

0,44 Silika

0,57 Alumina

Asetonitril

0,50 Silika

0,65 Alumina

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimo-difikasi secara kimiawi atau fase terikat.
Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non- polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C,g) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan airatau dengan larutan bufer.
Untuksolutyang bersifatasam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase
gerak tidak diatur, maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang
terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut
dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi, karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat(3).
3. Kromatografi penukar ion
KCKTpenukar ion menggunakan fase diam yang dapatmenukar kation atau anion dengan suatu fase
gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut
organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan
ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemi sahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan
ion yang mempunyai muatan yang berlawanan'2'.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul (BM) > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai
BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang berukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang berukuran jauh lebih kecil. Hal ini di-sebabkan solut dengan
BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian,
 dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam
seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini. pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase
diam mengandung gugus-gugus moleku! yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi
antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks'2'.
Skema yang paling urnum untuk melakukan krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi
gradien sebagaimana ditunjukkan oleh Gambar 4.3. Skema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam
kolom afinitas dengan adanya fase gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan
solut-ligan. Pelarut ini, yang menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan
bufer aplikasi. Selama fase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan
afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi. Meskipun demikian,
karena selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampel-sampel lain yang tidak terikat akan melewati
kolom tanpa tertahan. Setelah komponen-komponen yang tidak t'ertahan telah
tercucisecarasempurnadari kolom, solut yang tertahandapatdielusi dengan menggunakan pelarutyang
mampu mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut. Pelarut ini
merupakanfasegerakyangkuat dan seringkalidikenalsebagai bufer elusi. Begitu solut yang dikehendaki
keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom
selanjutnya diiregenerasi dengan cara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi
sebelum injeksi lanjut

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
 Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci
dan kemurnian larutan harus dijaga.

Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

Contoh fase gerak yang bersifat polar adalah air, asetonitril dan isopropanol.
Sedangkan contoh fase diam yang bersifat non-polar adalah C18 (ODS), C8, phenyl,
TMS dan cyano (CN).

Tm (dead time) merupakan waktu retensi dimana senyawa tidak terpengaruh oleh kolom atau dengan
kata lain waktu yang diperlukan senyawa yang tidak berinteraksi dengan fase diam dalam kolom mulai
injeksi sampel sampai ke detektor.
Tr-tm – tr’

Tm = Vm

Tr= Vr

Waktu retensi : tr (2-5 menit)

Hubungan faktor kapasistas (k) dengan kromatigram adalah pemisahannya. Nilainyabaik 1<k’<10
biasnay 2-10

Faktor selektifitas = faktor yang selektif untuk pemisahan. Jika faktor besar hasilnya besar , yang baik
harus >1

Efisiensi kolom = (N) panjang kolom (L), biasanya 10000 dan tinggi kolom (H) harganya 500-500000.

W= lebar area

N= 554 juga ada rumusnya

Resolusi (R) =pemisahannya . trb =waktu dimana akan menghsilkan puncak di B, dipengaruhi olej k
selektifitas dan N

N naik daya resolusi lebih bagus W lebih kecil

Puncak satu dengan puncak lain lbeih lebar maka resolusi semakin bagus

K turun pemsihana jelek tr pendek

K terus dinaikkan aka terjadi tinggi puncak akan turun, pemisahan jd lbih lama . jadi k harus pas

Luas puncak (A)= dari puncak kebawah t kali l

Tinggi puncak (tetap) dan lebar puncak sudah ada dipuncak (mempengaruhi ada/tdknya suatu zat)

Yang bs berubah = W, tr

Kalau W total pakai rms di ppt untuk N  dilanjut menghitung R

Hal. 327 tugasss, 360, 464