Tugas

Biokimia Enzim

TEKNIK ISOLASI ENZIM LIPASE

BAHRUN
H012191021

PROGRAM STUDI KIMIA

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
1. ISOLASI ENZIM LIPASE DARI MIKROORGANISME
Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Lipase dari Aspergillus oryzae
pada Kopra Berjamur
Oleh: Seniwati Dali, Abdul Rauf Patong, Muhammad Noor Jalaluddin, Pirman
Andi Parenrengi

1. Produksi dan isolasi enzim lipase

Produksi enzim lipase dilakukan dengan fermentasi dalam labu kocok
yang mengandung media produksi yang diinokulasi dengan larutan suspensi
biakan murni Aspergillus oryzae yang telah diaktifkan. Pepton dan minyak zaitun
divariasikan konsentrasinya masing-masing, pepton (0,5; 0,8; 1,0; 1,3 dan 1,5)%
dan minyak zaitun (1, 2, 3, 4 dan 5)% serta kecepatan pengadukan (50,100,150,
200 dan 250) rpm untuk memperoleh komposisi media produksi dan kecepatan
pengadukan optimum dalam memproduksi enzim lipase. Proses fermentasi
dilakukan pada suhu 37oC selama 8 hari. Sel Aspergillus oryzae hasil fermentasi
dipisahkan dari medianya dengan cara sentrifugasi pada suhu 4oC dengan
kecepatan 3500 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh selanjutnya
digunakan sebagai enzim kasar.
2. Pemurnian enzim lipase
Pemurnian awal dengan fraksinasi amonium sulfat 0-100% selanjutnya
enzimnya diendapkan dengan cara sentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan
10.000 rpm selama 20 menit dan dilarutkan dalam bufer borat 0,2 M pH 8,2.
Selanjutnya larutan ini dimasukkan ke dalam kantong selofan viksing, kemudian
didialisis dengan bufer borat konsentrasi 0,05 M, diaduk dengan magnetic stirer
selama 1 malam pada suhu 5oC. Setiap 3 jam dilakukan penggantian bufer. Pada
fraksi amonium sulfat yang memiliki aktivitas enzim lipase yang tertinggi,
dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi kolom penukar ion berdasarkan
metode Mingrui Yu dkk (2007) yang dimodifikasi menggunakan matriks
Q sepharosa FF (panjang kolom 35 x 1 cm) dengan kecepatan alir 30 tetes/ menit)
dan terakhir dengan kromatografi kolom filtrasi gel dengan matriks sephadex
G-75 (panjang kolom 35 x 1 cm) dengan kecepatan alir 6 tetes/ menit).
3. Uji kemurnian enzim
Larutan enzim yang diperoleh pada setiap tahap pemurnian diuji
kemurniannya dengan gell 10% SDS-PAGE (Bollag, D.M and S.J. Edelstein,
1991)
4. Karakterisasi enzim
Karakterisasi enzim meliputi: penentuan pH dan suhu optimum, penentuan
berat molekul, nilai Km dan Vmaks dari fraksi yang diperoleh pada hasil
pemurnian dengan kromatografi kolom sephadex G-75. Suhu optimum ditentukan
dengan menguji aktivitas enzim pada kisaran suhu 200C-500C. Sedangkan pH
optimum ditentukan dengan menguji aktivitas enzim pada kisaran pH 7,0-9,0
menggunakan bufer borat.
5. Pengujian aktivitas enzim
Aktivitas enzim lipase ditentukan dengan menggunakan metode
Vorderwulbecke, et al., 1992. Sebanyak 0,1 mL larutan enzim lipase atau blanko
ditambahkan ke dalam bufer 0,89 mL yang mengandung Tris-HCl 0.05 M pH 7,0.
Selanjutnya ditambahkan 0,01 mL substrat p-nitrofenilbutirat 0,1 M (pelarut
dimetilsulfoksida), dikocok kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu
370C. Campuran reaksi diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 410 nm. Aktivitas enzim lipase dihitung berdasarkan
p-nitrofenol yang terbentuk dari hasil hidrolisis enzim lipase terhadap substrat
p-nitrofenilbutirat
6. Penentuan kadar protein
Untuk menghitung aktivitas spesifik, kadar protein enzim ditentukan
berdasarkan metode Lowry (Colowick and Kaplan, 1957) menggunakan serum
bovine albumin (BSA) sebagai larutan standar. Untuk mengetahui pola
proteinnya, larutan enzim dibaca absorbansnya pada panjang gelombang 280 nm
(Deutscher, 1990).
2. ISOLASI ENZIM LIPASE DARI TUMBUHAN

Isolasi dan Akitivitas Spesifik Enzim Lipase Indigenous Biji Kenari

Oleh: G.S. Suhartati Djarkasi, Sri Raharjo, Zuheid Noor, 2017
(Jurnal Teknologi Pertanian Volume 8, Nomor 1, Juni 2017)

1. Persiapan Ekstrak Kasar Kenari

Buah kenari segar dikupas kulitnya sehingga diperoleh NIS (nut-in-shell).
NIS dipecah tempurungnya sehingga diperoleh kernel atau biji kenari. Biji kenari
dikeringkan dengan menggunakan alat pengering kabinet pada suhu 55-60ºC
selama 10 jam. Sebanyak 5 gram biji kenari ditimbang kemudian dihaluskan
menggunakan grinder. Biji kenari halus (homogenat) ditambahkan buffer fosfat
pH 8,0 mengandung NaCl 0,4 M, (1:10, w/v), kemudian diaduk menggunakan
magnetic stirrer selama 1 jam diikuti sentrifus pada 10000 rpm selama 20 menit
pada suhu 4ºC . Supernatan yang diperoleh adalah larutan ekstrak kasar.
2. Pengendapan Protein Dengan Amonium Sulfat
Amonium sulfat padat ditambahkan pada larutan ekstrak kasar dengan
kejenuhan 70% diaduk selama 1 jam pada suhu 4oC dan dibiarkan selama 12 jam
selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4oC selama 20
menit. Endapan diambil sebagai ekstrak protein. Protein diresuspensi dengan
buffer (0,1 M Tris HCl, pH 7,0), selanjutnya didialisa dengan buffer yang sama
(0,1 M Tris-HCl, pH 7,0) dengan volume sebanyak ±2 liter selama 12 jam. Proses
ini untuk menghilangkan sisa amonium sulfat.
3. Fraksinasi Dengan Kromatografi Kolom
Ekstrak protein kenari dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom
menggunakan matriks sephadex G-100 ukuran kolom (30x1,5cm) dan dielusi
dengan buffer Tris-HCl pH 7,0. Laju aliran adalah 30 ml/jam. Sampel
dikumpulkan setiap 3 ml dengan mengunakan fraction collector. Masing-masing
fraksi dianalisa aktivitas lipolitik dan kadar protein.
4. Stabilitas Enzim Lipase Terhadap Suhu
Untuk mengetahui stabilitas terhadap suhu, enzim lipase diinkubasikan
selama 30 menit pada berbagai tingkat suhu (20, 30, 40, 50, 60, 70, dan 80oC pada
pH 7,0) dalam buffer Tris-HCl. Selanjutnya, enzim dianalisa aktivitasnya.
3. ISOLASI ENZIM LIPASE DARI HEWAN

Purification and Characterization of Lipase from the Liver of Carp, Cyprinus

carpio l. (1758), Living in Lake Tödürge (sivas, türkiye)
Oleh : Görgün, S. dan Akpınar, M.A., 2012
(Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 12: 207-215.)

1. Preparasi Sampel
Cyprinus carpio yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Danau
Tödürge pada bulan Oktober. Sampel hati dikeluarkan dalam kondisi beku dan
disimpan pada suhu -20 °C sampai digunakan. Sampel hati beku dicairkan pada
suhu 4 °C, selannjutnya dibersihkan dengan akuades dan dibilas dengan larutan
NaCl 0,9% dingin. Sampel hati dipotong-potong kecil untuk dihomogenisasi.
2. Ekstraksi Enzim Lipase
Sampel hati yang telah dipotong-potong, dihomogenisasi menggunakan
homogenizer Electromag M 11 dalam buffer 60 mM Tris-HCl, pH 7,4 yang
mengandung 0,25 mM D-Mannit dan 1 mM Na4EDTA (buffer A). Selanjutnya
disaring menggunakan wol kaca, filtrat kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
60.000 rpm selama 1 jam pada suhu 4 °C. Endapan dipisahkan dengan
penyaringan menggunakan saringan wol kaca, filtrat yang diperoleh diendapkan
dengan PEG-6000 30% (b/v) dan disentrifugasi dengan kecepatan
8000 rpm selama 20 menit pada 4 °C. Endapan yang dihasilkan dilarutkan
kembali dalam buffer A dan digunakan pada langkah berikutnya.
3. Prosedur Pemurnian Enzim
Bahan penukar anion Q sepharose diisi ke dalam kolom (1x20 cm) dan
dicuci dengan air suling 100 ml. Selanjutnya, kolom dijenuhkan dengan 20 mM
Tris-HCl pH 7,8, mengandung 1 mM Na4EDTA dan 0,2 mM DTT (buffer B).
Selanjutnya sampel diaplikasikan pada kolom dan dielusi menggunakan 100, 200,
300, 400, 600, 800, dan 1000 mM NaCl dalam buffer B. Fraksi yang
menunjukkan aktivitas lipase dikumpulkan dan dipekatkan serta dihilangkan
garamnya menggunakan penyaring Millipore Amicon Ultra Centrifugal (10 kDa
MWCO, SIGMA-ALDRICH Inc. St. Louis, AS). Sampel yang telah dipekatkan
selanjutnya diaplikasikan ke dalam kolom filtrasi gel sephacryl S 200 HR
(1x30 cm) sebagai langkah kromatografi kedua, yang sebelumnya telah
dijenuhkan dengan 20 mM Tris-HCl, pH 7,8, mengandung 0,2 mM DTT
(buffer C). Elusi dilakukan dengan menggunakan buffer C hingga absorbansi
pada panjang gelombang 280 nm eluat mencapai minimum. Fraksi yang memiliki
aktivitas lipase dikumpulkan dan diaplikasikan ke dalam kromatografi kolom
interaksi hidrofobik fenil sepharosa CL-4B (1x20 cm), yang telah dijenuhkan
dengan 20 mM Tris-HCl, pH 7,8, mengandung 150 mM ammonium sulfat
((NH4)2SO4) (buffer D). Langkah kromatografi ini melibatkan pencucian kolom
dengan buffer D untuk menghilangkan protein yang tidak terikat dan kemudian
mencuci dengan 10, 20, 50% seri isopropanol dalam buffer D.
4. Penentuan Kadar Protein
Konsentrasi protein (mg/ml) ditentukan denan menggunakan metode
Bradford skala mikro (Bollag et al., 1996), dengan Bovine Serum Albumin (BSA)
sebagai standar.
5. Penentuan Aktivitas Enzim Lipase
Aktivitas enzim lipase diuji seperti yang dilaporkan oleh Bülow dan
Mosbach (1987) dengan sedikit modifikasi. Larutan substrat yang digunakan
adalah 50 mM p-NPB dalam etanol dan buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8,0,
mengandung 4% etanol. Aktivitas lipase diuji secara spektrofotometri pada
panjang gelombang 405 nm dengan mengukur laju hidrolisis p-NPB. Satu unit
aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis pelepasan 1 μmol
p-nitrophenol (p-NP) per menit dalam kondisi pengujian.