DISBIOSIS MIKROBIOTA MENGONTROL RESPON

NEUROINFLAMASI SETELAH STROKE

Abstrak

Iskemia otak akut menginduksi reaksi peradangan saraf lokal dan mengubah homeostasis
imun perifer pada saat yang sama. Bukti terbaru menunjukkan peran kunci mikrobiota usus
pada penyakit autoimun dengan memodulasi homeostasis imun. Oleh karena itu, kami
menyelidiki hubungan mekanistik antara iskemia otak akut, perubahan mikrobiota, dan respon
imun setelah cedera otak. Menggunakan dua model yang berbeda dari oklusi arteri serebral
menengah akut, kami menunjukkan dengan generasi berikutnya bahwa lesi stroke besar
menyebabkan dysbiosis mikrobiota usus, yang pada gilirannya mempengaruhi hasil stroke
melalui mekanisme yang dimediasi imun. Berkurangnya keanekaragaman spesies dan
pertumbuhan bakteri yang berlebihan dari bacteroidetes diidentifikasi sebagai ciri-ciri
dysbiosis pasca stroke, yang dikaitkan dengan disfungsi penghalang usus dan berkurangnya
motilitas usus seperti yang ditentukan oleh pelacakan bolus usus in vivo. Rekolonisasi tikus
bebas kuman dengan dysbiotic poststroke microbiota memperburuk volume lesi dan defisit
fungsional setelah stroke eksperimental dibandingkan dengan rekolonisasi dengan microbiota
kontrol normal. Selain itu, rekolonisasi tikus dengan microbiome dysbiotic menginduksi
polarisasi sel T proinflamasi di kompartemen kekebalan usus dan di otak iskemik.
Menggunakan penelitian pelacakan sel in vivo, kami menunjukkan migrasi limfosit usus ke
otak iskemik. Transplantasi terapeutik mikrobiota tinja menormalkan dysbiosis yang
diinduksi oleh lesi otak dan meningkatkan hasil stroke. Hasil ini mendukung mekanisme baru
di mana mikrobioma usus adalah target dari perubahan sistemik yang diinduksi stroke dan
efektor dengan dampak besar pada hasil stroke.

Kata Kunci:

PENDAHULUAN

Reaksi inflamasi terhadap cedera jaringan steril adalah komponen patofisiologis yang
kritis pada cedera organ-spesifik, termasuk stroke iskemik (Iadecola dan Anrather, 2011;
Chamorro et al., 2012), infark miokard (Hofmann dan Frantz, 2015), dan kondisi lainnya
( Huang et al., 2007). Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa sel-sel T memainkan
peran yang menentukan dalam peradangan saraf sekunder setelah iskemia otak (Shichita et al.,
2009; Liesz et al., 2013c; Schwartz dan Raposo, 2014). Pendekatan eksperimental
menggunakan farmakologis atau paradigma penipisan limfosit genetik pendekatan kologis
untuk memblokir invasi limfosit serebral (Liesz et al., 2011; Neumann et al., 2015) telah
membentuk peran utama untuk limfosit, terutama sel T, sebagai mediator penting dari agunan
inflamasi. kerusakan otak yang terluka setelah stroke.

Penelitian sebelumnya dari kelompok kami dan yang lain telah mengusulkan bahwa
subpopulasi sel Thelper mungkin memiliki efek yang berbeda pada hasil stroke: proinflamasi
Th1, Th17, dan sel T telah dikaitkan dengan peningkatan kerusakan inflamasi dan hasil yang
lebih buruk, sedangkan sel T regulator (Tregs) memiliki telah terbukti menekan reaksi
peradangan saraf yang berlebihan terhadap cedera otak (Liesz et al., 2009a; Shichita et al.,
2009; Gelderblom et al., 2012; Liesz et al., 2013c). Berbeda dengan penyakit autoimun primer
SSP, iskemia otak akut menginduksi aktivasi imun lokal dan perifer yang cepat (Iadecola dan
Anrather, 2011; Shichita et al., 2012; Liesz et al., 2015). Sel T direkrut ke otak yang terluka
sudah dalam beberapa hari pertama setelah stroke (Gelderblom et al., 2009; Zhou et al., 2013)
dan aktivasi sel T perifer juga dapat diamati (Offner et al., 2006; Yilmaz et al., 2006; Liesz et
al., 2009b; Vogelgesang et al., 2010). Namun demikian, mekanisme aktivasi sel T perifer,
khususnya polarisasi sel Thelper, setelah cedera otak akut masih sulit dipahami.

Beberapa jalur bukti menunjukkan bahwa mikrobiota usus adalah pengatur utama
homeostasis sel-T dan terlibat secara rumit dalam pematangan sistem kekebalan tubuh dan
mempertahankan koeksistensi bersama antara inang dan mikroba (Ivanov et al., 2009; Hooper
et al. , 2012; Arpaia et al., 2013). Baru-baru ini, hubungan fungsional antara mikrobiota usus
dan fungsi otak, disebut "sumbu usus-otak," telah menjadi bidang yang muncul dalam ilmu
saraf dan neuroimunologi (Collins et al., 2012; Cryan dan Dinan, 2012). mengaitkan peran
yang menentukan dalam penyakit autoimun SSP (Berer et al., 2011; Lee et al., 2011). Laporan
terbaru oleh l (Benakis et al. (2016) telah menunjukkan bahwa dysbiosis yang diinduksi oleh
antibiotik dari mikrobiota usus. mempengaruhi peradangan saraf stroke dan hasil akhir dalam
model stroke eksperimental.Namun, dampak stroke pada komposisi mikrobiota dan kontribusi
perubahan mikrobiota spesifik stroke pada peradangan saraf sebelumnya tidak diketahui.Oleh
karena itu, karya ini adalah untuk menyelidiki perubahan mikrobiota setelah otak iskemia dan
perannya dalam reaksi peradangan saraf pasca stroke.

Dalam penelitian ini, kami mengamati dysbiosis mikrobiota usus melalui kelumpuhan usus
yang dimediasi stres setelah stroke. Pada gilirannya, dysbiosis mikrobiota secara kausal
terkait dengan perubahan homeostasis sel T, induksi respon proinflamasi, dan penurunan hasil
stroke. Transplantasi mikrobiota tinja untuk menormalkan dysbiosis pasca stroke dikaitkan
dengan peningkatan hasil stroke. Secara keseluruhan, data kami menunjukkan interaksi baru
yang sangat kompleks antara otak dan mikrobiota usus setelah cedera otak akut di mana
mikrobiota adalah target jalur yang dimediasi stres yang menghasilkan dysbiosis, serta efektor
homeostasis imun dengan dampak mendalam pada hasil stroke.

MATERIAL DAN METODE

Eksperimen hewan. Semua percobaan hewan dilakukan konsisten dengan pedoman untuk
penggunaan hewan percobaan dan telah disetujui oleh komite pemerintah Bavaria Atas
(Regierungspraesidium Oberbayern # 2532-65-2014). Tikus C57BL / 6J tipe liar dan tikus
Rag1 / jantan diperoleh dari Laboratorium Charles River. Tikus bebas kuman (GF) C57BL /
6J dan GF Rag1 / betina diperoleh dari Clean Mouse Facility, University of Bern, Swiss.
Perhitungan ukuran sampel apriori didasarkan pada varians dan ukuran efek dari penelitian
sebelumnya atau pada percobaan pendahuluan yang dilakukan selama penelitian ini. Data
dikeluarkan dari semua tikus yang mati setelah operasi.

Hewan diacak untuk kelompok perlakuan dan semua analisis dilakukan oleh peneliti yang
tidak mengetahui alokasi kelompok. Unblinding dilakukan setelah menyelesaikan analisis
statistik. Semua percobaan hewan dilakukan dan dilaporkan konsisten dengan pedoman
ARRIVE (Kilkenny et al., 2010). Penanganan tikus GF dan rekolonisasi usus. Tikus GF
ditempatkan di dalam steril HAN-gnotocage dan menerima air steril dan makanan pellet yang
sama seperti tikus konvensional atau rekolonisasi. Semua prosedur bedah, perubahan sangkar,
dan tes perilaku tikus GF dilakukan dalam kabinet keselamatan mikrobiologis aliran laminar
yang didesinfeksi. Tikus GF direkolonisasi dengan mikrobiota usus yang diperoleh dari model
oklusi model arteri serebral arteri (MCA) palsu (MCA) pasca-filamen (fMCAo) dengan donor
gavage mikrobiota cecum yang baru disiapkan. Singkatnya, tikus donor terbunuh, dibersihkan
dengan etanol 70%, dan rongga peritoneum dibuka untuk mengekspos sekum. Isi sekum
dikumpulkan dalam tabung steril, diencerkan dalam air steril hingga 200 mg / ml, dan
disentrifugasi pada 2000 rpm selama 10 menit untuk menghilangkan partikel besar.
Supernatan dikumpulkan ke dalam tabung steril segar dan masing-masing tikus penerima
menerima 200 l bolus tunggal dari suspensi mikrobiota yang baru disiapkan.

Model oklusi MCA distal permanen (cMCAo). Iskemia serebral fokal diinduksi seperti yang
dijelaskan sebelumnya oleh oklusi permanen dari distal MCA arteri lenticulostriate (Llovera
et al., 2014). Singkatnya, tikus dibius dengan suntikan fentanyl intraperitoneal (0,05 mg / kg),
midazolam (5 mg / kg), dan medetomidine (0,5 mg / kg). Tengkorak terkena oleh sayatan
kulit, lubang duri dibor di tulang temporal, dan MCA secara permanen tersumbat
menggunakan forsep elektrokoagulasi frekuensi tinggi. Segera setelah operasi, anestesi
dimusuhi dengan injeksi intraperitoneal dari kombinasi naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5
mg / kg), dan atipamezol (2,5 mg / kg). Setelah pemulihan, tikus dikembalikan ke kandangnya
dengan akses ad libitum ke air dan makanan. Operasi palsu dilakukan dengan prosedur bedah
yang sama tanpa koagulasi MCA yang terpapar. Sepanjang prosedur bedah, suhu tubuh
dipertahankan pada 37 ° C menggunakan bantal pemanas yang dikendalikan oleh umpan balik.
Tingkat kematian keseluruhan pada kelompok eksperimen ini adalah 5%. Kriteria eksklusi
adalah perdarahan subarachnoid atau kematian selama operasi. FMCAo sementara. Tikus
dibius dengan isofluran yang dikirim dalam campuran 30% O2 dan 70% N2O. Sayatan dibuat
antara telinga dan mata untuk mengekspos tulang temporal. Probe Doppler laser ditempelkan
pada tengkorak di atas wilayah MCA dan tikus ditempatkan pada posisi terlentang. Sayatan
dibuat di daerah leher garis tengah dan arteri karotis umum dan arteri karotis eksternal kiri
diisolasi dan diikat; filamen berlapis 2 mmsilicon (katalog # 701912PKRe; Doccol)
dimasukkan ke dalam arteri karotis internal dan oklusi MCA dikonfirmasi oleh penurunan
aliran darah yang sesuai (mis., penurunan sinyal aliran laser Doppler). Setelah 60 menit oklusi,
hewan-hewan tersebut dianestesi ulang dan filamennya dihilangkan. Untuk masa hidup, tikus-
tikus itu disimpan di kandang rumah mereka dengan akses yang mudah ke air dan makanan.
Tikus yang dioperasikan palsu menerima prosedur bedah yang sama kecuali filamen
dimasukkan dan segera diangkat. Suhu tubuh dipertahankan sepanjang operasi menggunakan
bantal pemanas yang dikendalikan oleh umpan balik. Tingkat kematian keseluruhan dalam
kelompok ini (tidak termasuk hewan yang dioperasi) adalah 10%. Kriteria eksklusi adalah
sebagai berikut: oklusi MCA yang tidak mencukupi (pengurangan aliran darah hingga 20%
dari nilai dasar), tikus yang mati selama operasi, dan tikus yang tanpa induksi iskemia otak
sebagaimana diukur postmortem dengan analisis histologis.

Tes silinder. Tikus GF yang diinokulasi dengan suspensi fecal yang diperoleh dari kontrol
dan tikus yang diinduksi fMCAo diuji untuk penggunaan forepaw dan asimetri dengan
mengukur asimetri perilaku dan aktivitas umum pada hari pertama dan ketiga setelah operasi
cMCAo. Tes ini dilakukan dalam kabinet keselamatan aliran laminar steril. Tikus ditempatkan
dalam silinder kaca akrilik transparan (diameter: 8 cm; tinggi: 25 cm) di depan dua cermin
dan direkam video (Llovera et al., 2014). Untuk menilai penggunaan kaki depan yang
independen, kontak dengan satu kaki depan selama bagian belakang penuh dan mendarat
dengan hanya satu kaki depan setelah bagian belakang penuh dinilai dengan melakukan
analisis frame-by-frame dari video yang direkam. Semua gerakan pemeliharaan selama
percobaan dihitung dan digunakan sebagai ukuran aktivitas keseluruhan hewan.

Transfer mikrobiota tinja (FMT). Kotoran buang air besar yang baru dikumpulkan dari
tikus yang ditahan dan ditempatkan dalam tabung steril. Tikus donor (Sungai Charles)
ditempatkan di bawah kondisi SPF dan yang sama digunakan untuk semua tikus penerima
dalam kelompok tertentu. Setelah pengumpulan, pelet tinja Singh, segera dicampur dalam air
steril (hingga 200 mg / ml) dan suspensi disentrifugasi pada 2000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dikumpulkan dan 200 l diberikan ke masing-masing tikus dengan gavage lambung.
Perawatan FMT diberikan setiap hari untuk periode kelangsungan hidup dimulai pada hari
yang sama dari induksi stroke. Untuk percobaan FMT, tikus penerima ditempatkan di
kandang dengan tempat tidur steril dan akses ad libitum ke air steril. Untuk model fMCAo,
tikus tidak memiliki akses ke makanan untuk menghilangkan efek membingungkan dari
perbedaan konsumsi makanan antara fMCAo, yang dioperasikan secara palsu, dan kelompok
perlakuan. Oleh karena itu, tikus penerima fMCAo dan FMT menerima tiga dosis oral harian
cacing tanah ultra-halus yang mengandung air yang mengandung komposisi dan asupan kalori
yang sama dengan makanan pelet (setara dengan 2,5 mg chow).

Volume infark. Otak perfusi dikeluarkan pada titik waktu yang ditunjukkan setelah induksi
stroke dan dibekukan pada bubuk es kering. Cryosection koral (tebal 20 m) dipotong pada
interval 400 m. Bagian diwarnai dengan cresyl violet konsisten dengan protokol standar dan
dipindai pada 600 dpi. Area infark diukur pada setiap bagian menggunakan perangkat lunak
ImageJ. Untuk model fMCAo, koreksi edema untuk volume infark dilakukan dengan
menggunakan rumus berikut: (area iskemik) (volume lesi langsung) [(hemisfer ipsilateral)
(hemisfer kontralateral)]. Volume total infark dihitung dengan mengintegrasikan area yang
diukur dan interval antar bagian.

Persiapan sel dari organ limfoid. Tikus dibius dengan ketamin (120 mg / kg) dan xylazine
(16 mg / kg). Darah diperoleh dengan tusukan intrakardiak dan dikumpulkan ke dalam tabung
tes EDTA; plasma diisolasi dengan sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit dan disimpan
pada 80 ° C sampai digunakan lebih lanjut. Tikus-tikus tersebut kemudian diperfusi secara
transkartial dengan salin normal dan limpa dan tambalan Peyer (PP) dipindahkan ke dalam
larutan garam seimbang Hank dingin. Organ-organ dihomogenisasi dan disaring melalui
saringan 30–40 mcell; dalam sampel limpa, eritrosit dilisiskan menggunakan buffer amonium
klorida isotonik. Jumlah sel total per organ diukur menggunakan penghitung sel otomatis
(Bio-Rad). Untuk isolasi leukosit mukosa, ileum distal dibedah dengan hati-hati untuk
menghilangkan lapisan otot. Jaringan mukosa kemudian dicincang menjadi potongan-
potongan kecil dan diinkubasi dalam medium RPMI yang mengandung 10 g / ml DNase I dan
0,5 mg / ml collagenase D (Roche) selama 10 menit pada suhu 37 ° C. Suspensi sel kemudian
dihomogenisasi secara mekanis, disaring, dan dicuci sebelum analisis aliran cytometric.
Isolasi leukosit yang menyerang otak. Mencit dibius secara mendalam dengan ketamin (120
mg / kg) dan xylazine (16 mg / kg) dan diperfusi secara transkartial dengan salin normal. Otak
dengan hati-hati dikeluarkan dan belahan ipsilateral digunakan untuk persiapan sel seperti
yang dijelaskan sebelumnya (Liesz et al., 2011). Secara singkat, otak dipotong kecil-kecil dan
dicerna dalam medium RPMI yang mengandung 10 g DNase I dan 0,5 mg / ml collagenase D
(Roche) selama 10 menit pada suhu 37 ° C. Suspensi sel secara homogen dihomogenkan dan
melewati saringan sel 40 m (Falcon). Suspensi sel disuspensi ulang dengan larutan 40%
Percoll (GE Healthcare) dan dilapiskan pada larutan 70% Percoll. Setelah sentrifugasi pada
2100 rpm selama 25 menit pada suhu kamar, sel-sel pada interfase dikumpulkan dan dicuci
dalam buffer isotonik.

Analisis aliran cytometry. Antibodi khusus antigen tikus berikut dibeli dari eBioscience /
BioLegend: CD3 FITC (17A2), CD4 PerCP Cy5 (klon RM4–5), CD45 eF450 (30-F11),
CD11b PerCP Cy5.5 (M1 / 70), IFN - FITC (XMG1.2), dan IL-17 APC (17B7). Untuk
mengukur berbagai populasi sel, sel diwarnai dengan antibodi spesifik sesuai dengan protokol
pabrikan. Untuk pewarnaan sitokin intraseluler, suspensi sel dari limpa dan PPs disuspensikan
kembali dalam media RPMI yang mengandung 10% serum betis janin yang dilemahkan
dengan panas, 1% penicillin / streptomycin, dan 10 M 2-mercaptoethanol. Sel-sel tersebut
dilapisi pada kepadatan 3 105 sel / sumur pada antibodi anti-CD3 (klon 145-2C11;
eBioscience) -lapisi pelat 96-sumur, costimulated dengan antibodi CD28 terlarut (klon 37,51;
eBioscience), dan diinkubasi selama 40 h pada 37 ° C dan 5% CO2. Setelah inkubasi,
GolgiPlug (BD Biosciences) ditambahkan ke sel selama 4 jam, setelah itu sel dipanen untuk
pewarnaan intraseluler menggunakan Foxp3 / Transcription Factor Staining Kit (eBioscience).
Sel-sel yang diwarnai diukur dalam FACSverse flow cytometer (BD Biosciences) dan
dianalisis menggunakan FlowJo versi 10 (TreeStar).

IKAN dan pewarnaan histokimia. Ileum distal diikat pada kedua sisi dengan jahitan bedah,
diangkat, difiksasi dalam paraformaldehyde 4%, dan bagian melintang setebal 6 m disiapkan.
Bagian dipasang pada slide kaca dan IKAN dilakukan dalam ruang kelembaban seimbang
pada 46 ° C dalam buffer hibridisasi yang mengandung 0,9MNaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7,2,
formamida 30%, dan SDS 0,01% selama 3 jam. Probe (EUB338: Cy5-GCT GCC TCC CGT
AGG AGT-Cy5; EUB338-III: Cy5-GCT GCC ACC CGT AGG TGT-Cy5) digunakan pada
konsentrasi akhir 5 ng / l. Bagian hibridisasi dalam 20 l buffer hibridisasi yang mengandung
probe EUB338 atau EUB338-III. Bagian-bagian tersebut kemudian ditempatkan dalam buffer
pencuci sebelum air (48 ° C) yang mengandung 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, dan
5 mM EDTA dalam air Milli-Q (Millipore) yang diautoklaf secara otomatis selama 10 menit.
SYTOX green (1: 5000) digunakan untuk melawan inti. Gambar (1024 1024 piksel,
kecepatan pemindaian 400 Hz) diperoleh sebagai z-tumpukan menggunakan 63 tujuan
gliserol pada mikroskop confocal (TCS SP5 X; Leica).

Imunohistologi. Untuk analisis sel T berlabel dari PPs, 12 m bagian otak koronal pada
ketinggian bregma diwarnai dengan antibodi poliklonal CD3 anti-tikus (1:50; Abcam) dan
kambing anti-kelinci Alexa Fluor 488 (1: 200; Laboratorium Jackson) antibodi. Setelah
pewarnaan nuklir dengan DAPI, bagian dianalisis untuk keberadaan sel DAPI CDD CMDiI
menggunakan mikroskop confocal (TCS SP5 X; Leica).
Melacak migrasi leukosit dari PP ke otak. Empat puluh delapan jam setelah operasi
cMCAo atau pura-pura, sel-sel dalam PP diberi label oleh mikroinjeksi pewarna sel-fluoresen
CFSE (25 M dalam 2 l PBS per PP) atau CM-DiI (5 M dalam 2 l PBS per PP) (Teknologi
Kehidupan). Tikus terbunuh 24 jam setelah pelabelan sel dan otak disiapkan untuk analisis
aliran sitometrik (pelabelan CFSE) atau analisis imunohistologis (pelabelan CM-DiI) seperti
dijelaskan di atas. Model ileus pasca operasi. Tikus dibius dengan isofluran yang dikirim
dalam campuran 30% CO2 dan 70% N2O. Sebelum operasi, injeksi karprofen (5 mg / kg)
diberikan kepada tikus. Setelah ini, tikus difiksasi dengan plester bedah dalam posisi
terlentang pada bantalan pemanas yang diatur oleh umpan balik. Rongga perut kemudian
dibuka sepanjang 2 cmin sepanjang linea alba. Dengan dua aplikator kapas steril yang lembab,
isi usus halus disentuh dengan hati-hati dari pilorus ke sekum seperti yang dijelaskan
sebelumnya (Vilz et al., 2012). Setelah operasi, tikus dijahit, dipantau di ruang pemulihan,
dan kemudian kembali ke kandang rumah mereka. Sampel tinja dikumpulkan sebelum dan 3
hari setelah operasi untuk isolasi DNA mikroba dan analisis metagenomik. Langsung setelah
itu, bolus oral FITCdextran diberikan untuk tes motilitas usus.

Analisis motilitas gastrointestinal. Tikus menerima 100 l bolus oral 50 mg / ml FITC-

dekstran (70.000 kDa; Sigma-Aldrich) dalam 0,9% PBS. Satu jam setelah pemberian, tikus-
tikus tersebut dibunuh dan seluruh saluran usus dari lambung sampai usus besar diangkat dan
dicitrakan menggunakan sistem deteksi chemiluminescence (Fusion FX7). Untuk mengukur
transit gastrointestinal (mis., Motilitas), saluran gastrointestinal lengkap dibagi menjadi
beberapa segmen, setiap segmen disiram dengan air suling, dan fluoresensi larutan
pembilasan yang dimurnikan diukur menggunakan pembaca plat fluoresensi (Promega). Nilai
yang diperoleh dinormalisasi menjadi kontrol kosong dan dinyatakan sebagai persentase
fluoresensi per segmen usus.

ELISA untuk kuantifikasi albumin. Tikus dibunuh 3 hari setelah operasi fsham atau
fMCAo dan sampel feses dan plasma dikumpulkan untuk pengukuran konsentrasi albumin.
Tinja sampel (50 mg / ml) dan plasma (1: 50000) diencerkan dalam buffer uji (50 mM Tris,
0,1 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) dan ELISA dilakukan dengan pengenceran standar
albumin yang sesuai. Albumin dikuantifikasi oleh ELISA dan rasio feses terhadap plasma
albumin disajikan (Bethyl Labratories).

Kultur bakteri. Tikus-tikus dibius secara mendalam dan diperfusi secara transcardial dengan
salin normal. Isi cecum kemudian dipindahkan ke tabung steril di bawah kondisi aseptik yang
ketat. Jumlah konten cecum yang tetap dari masing-masing tikus dicampur dalam PBS hingga
50 mg / ml dan pengenceran disiapkan. Dua pengenceran (1: 40.000 dan 1: 400.000) dari
masing-masing sampel dilapisi pada pelat agar darah (Oxoid) dan diinkubasi pada suhu 37 ° C
selama 48-72 jam. Untuk menghasilkan lingkungan anaerob, pelat ditempatkan di stoples
anaerob yang mengandung sachet kertas AnaeroGen (Oxoid). Setelah masa inkubasi, lempeng
diperiksa untuk pertumbuhan bakteri dan jumlah koloni ditentukan.

Analisis komunitas mikroba. DNA dari kotoran tikus diisolasi menggunakan QIAamp Fast
DNA Stool Mini Kit (Qiagen). Jumlah total DNA dalam setiap sampel diukur menggunakan
Qubit fluorometer (Life Technologies). Amplikon 16S rRNA dihasilkan menggunakan primer
yang sesuai dengan daerah hipervariabel V1-V3 (primer 27F: AGA
GTTTGATCCTGGCTCAG; primer 534R: ATTACCGCGGCTGCTGG), dan produk PCR
dimurnikan. Perpustakaan direparasi menggunakan prosedur tagmentasi standar (Nextera XT;
Illumina). Semua sampel diurutkan pada platform Illumina MiSeq menggunakan pendekatan
berpasangan 300 bp. Dataset sequencing amplicon dianalisis menggunakan pipa
Metagenomics (MG) -RAST (versi 3.3.6) (Meyer et al., 2008). Bacaan berkualitas rendah
(terdiri dari 0,01% dari semua bacaan) dipangkas menggunakan program SolexaQA; hanya
bacaan berkualitas tinggi yang dimasukkan dalam analisis selanjutnya. Gen 16S rRNA
diidentifikasi dengan melakukan pencarian BLAT (Kent, 2002), dan amplikon
dikelompokkan pada identitas 97% dengan nilai e-value dari 1e-5. Pencarian kesamaan BLAT
untuk perwakilan klaster terpanjang dilakukan terhadap database Ribosomal Database Project
(RDP). Kurva Rarefaction, keragaman, dan analisis filogenetik dilakukan dan pohon
filogenetik digambar menggunakan platform MG-RAST. Hitungan baca dinormalisasi secara
logaritma untuk analisis selanjutnya. Plot analisis komponen utama diambil menggunakan
nilai normal dan jarak Bray-Curtis. Perbedaan antara rata-rata kelompok untuk genera
dianalisis menggunakan ANOVA atau uji t Student. nilai p disesuaikan untuk perbandingan
beberapa perbandingan menggunakan koreksi Bonferroni. Urutan DNA telah disimpan dalam
MG-RAST (http://metagenomics.anl.gov/) di bawah nomor aksesi 9778. Metode ukuran
diskriminan analisis (LDA) efek ukuran (LEfSe) digunakan untuk mengidentifikasi taksa
mikroba yang menunjukkan berbeda secara statistik kelimpahan relatif antara mikrobiota
setelah operasi palsu dan fMCAo (Segata et al., 2011). Eksperimen dilakukan dengan set
kesalahan ke 0,05 dan ambang LDA ditetapkan ke 2,0.

RT-PCR kuantitatif. Jaringan otak dari belahan ipsilateral dan kontralateral dilisiskan dalam
Reagen Lisis Qiazol (Qiagen) dan RNA total diekstraksi menggunakan kit MaXtract High
Density High (Qiagen). RNA dimurnikan menggunakan Mini Kit RNeasy sesuai dengan
instruksi pabrik (Qiagen). Jumlah RNA yang sama dari masing-masing sampel digunakan
untuk mensintesis cDNA dengan Kit Transkripsi Terbalik cDNA Kapasitas Tinggi (Applied
Biosystems). Ekspresi kuantitatif dari berbagai sitokin diukur menggunakan RT2 qPCR
Primer Assays yang telah dirancang sebelumnya dan SYBR GreenROXqPCR Mastermix
(Qiagen) dalam LightCycler 480 II (Roche). Kurva amplifikasi-amplifikasi linier diperoleh
dari sampel gabungan yang diencerkan. Menggunakan kurva ini, ekspresi masing-masing gen
diukur relatif terhadap ekspresi gen housekeeping yang mengkode peptidylprolyl isomerase A
(mis., Cyclophilin). Semua pengujian dilakukan dalam rangkap dua.

Analisis statistik. Data dianalisis menggunakan GraphPad Prism versi 6.0. Semua data
ringkasan dinyatakan sebagai rata-rata SD. Semua dataset diuji normalitas menggunakan uji
normalitas Shapiro-Wilk. Grup yang berisi data yang terdistribusi normal diuji menggunakan
uji t Student dua arah (untuk dua kelompok) atau ANOVA (untuk lebih dari dua kelompok).
Data yang tersisa dianalisis menggunakan uji Mann-Whitney U. Varians serupa dijamin untuk
semua kelompok, yang dibandingkan secara statistik. Perbedaan dengan nilai p 0,05 dianggap
signifikan secara statistik. nilai p disesuaikan untuk perbandingan beberapa perbandingan
menggunakan koreksi Bonferroni. Metode yang lebih rinci untuk menganalisis hasil
sekuensing amplikon dan data metabolomik disediakan di bagian Bahan dan Metode masing-
masing.

HASIL
Stroke menginduksi dysbiosis mikrobiota usus. Untuk menyelidiki dampak stroke akut pada
mikrobiota usus, kami menggunakan fMCAo, model stroke eksperimental yang menghasilkan
lesi hemisferik yang besar (rata-rata SD dari semua eksperimen kontrol dalam penelitian ini:
72 18mm3; Gbr. 1a). Sequencing generasi selanjutnya dari komposisi mikrobiota usus pada
tikus setelah fMCAo dan kontrol (pengobatan naif dan palsu) menunjukkan perubahan
substansial 3 d setelah stroke parah (Gambar 1b). Kami mengamati penurunan signifikan
dalam keanekaragaman spesies sebagai fitur kunci dari dysbiosis mikrobiota setelah stroke
(Gambar 1c). Ciri-ciri dysbiosis pasca stroke termasuk perubahan genus bakteri spesifik
dalam filum yang paling melimpah: Firmicutes, Bacteroidetes, dan Actinobacteria (Gbr. 1d).
Kami selanjutnya melakukan analisis taksa indikator menggunakan analisis algoritma LEfSe
untuk mendeteksi fitur spesifik yang secara statistik berbeda antara tikus yang dioperasikan
dengan famCA dan fMCA. Dengan menggunakan strategi analisis ini, kami mengidentifikasi
beberapa spesies yang berubah secara signifikan setelah induksi stroke yang konsisten dengan
analisis pohon filogenetik yang ditunjukkan di atas; namun, kami juga mengidentifikasi
perubahan terkait pada taksa tingkat tinggi dari masing-masing spesies yang diubah (Gbr. 1e).
Hasil ini menyarankan dampak yang konsisten dan spesifik dari cedera otak pada populasi
mikrobiota dalam filum bakteri yang paling melimpah.
Gambar 1. Stroke berat menginduksi dysbiosis mikrobiota. a, Gambar representatif dari bagian otak koronal
cresyl-violet-bernoda 3 d setelah fMCAo. Di setiap bagian, area infark diuraikan dalam warna merah 5 mm). b,
Analisis komponen utama (PC) mikrobiota usus dengan pola kelimpahan taksonomi pada tikus naif (sebelum
operasi palsu atau fMCAo) dan setelah operasi palsu dan fMCAo. c, Analisis kuantitatif keragaman menegaskan
secara signifikan berkurangnya keanekaragaman spesies mikrobiota usus setelah cedera otak dalam model
fMCAo (uji Mann-Whitney U). d, pohon filogenetik yang mengilustrasikan distribusi genera bakteri yang
teridentifikasi dalam filum yang paling melimpah (Actinobacteria, Bacteroidetes, dan Firmicutes)
membandingkan tikus post-fMCAo dengan tikus yang dioperasikan dengan sham dan sebelum fMCAo. Genera
yang secara signifikan diubah pada kelompok fMCAo dibandingkan dengan kelompok palsu dan sebelum-
fMCAo ditandai dengan warna merah (ANOVA, n 5 tikus per kelompok). e, analisis algoritma LEfSe dilakukan
untuk analisis taksa indikator yang mengidentifikasi fitur yang secara statistik berbeda antara shamand fMCAo
yang dioperasikan tikus. Label dalam kotak menentukan masing-masing unit taksonomi operasional yang diatur
secara signifikan (OTU, angka) dan taksa urutan lebih tinggi.
Cidera otak yang luas merusak fungsi pencernaan. Selanjutnya, kami menyelidiki
mekanisme mana yang menghubungkan cedera otak akut dan microbiota dysbiosis.
Dilaporkan sebelumnya bahwa pasien dengan cedera otak parah mengalami penurunan
motilitas gastrointestinal (Olsen et al., 2013; Engler et al., 2014). Konsisten dengan
pengamatan klinis ini, kami mendeteksi kelumpuhan gastrointestinal yang parah setelah infark
besar yang diinduksi oleh model stroke fMCAo menggunakan teknik pelacakan bolus
fluorescent lambung (Gbr. 2a, b). Pengurangan motilitas gastrointestinal dikaitkan dengan
pertumbuhan berlebih dari bakteri usus setelah stroke eksperimental yang parah dibandingkan
dengan operasi palsu (Gambar 2c). Karena gangguan fungsi gastrointestinal ini, kami meneliti
lebih lanjut dampak stroke pada fungsi sawar usus. Kami tidak mengamati translokasi bakteri
atau invasi bakteri transmucosal setelah stroke dengan hibridisasi in situ dengan penyelidikan
bakteri umum (EUB 388) (Gbr. 2d). Namun, kami mengukur peningkatan protein secara
signifikan oleh rasio albumin tinja / plasma setelah fMCAo dibandingkan dengan kontrol
yang diberi perlakuan palsu (Gambar 2e). Hasil ini menyarankan secara fungsional, tetapi
tidak secara morfologis, gangguan penghalang usus setelah fMCAo dalam hubungannya
dengan kelumpuhan usus pasca stroke. Laporan sebelumnya dari kelompok kami dan orang
lain telah mengidentifikasi disregulasi sistem saraf otonom dan respon stres yang nyata
setelah stroke sebagai salah satu jalur utama yang terlibat dalam memediasi efek sistemik
pada fungsi organ jarak jauh setelah cedera otak akut (Meisel et al., 2005; Chamorro et al.,
2007; Chamorro et al., 2012; Liesz et al., 2013b; Mracsko et al., 2014). Kami mendeteksi
peningkatan kadar katekolamin darah setelah stroke yang luas pada model fMCAo yang
dikaitkan dengan kelumpuhan usus pasca stroke (Gambar 2f). Konsisten dengan hasil kami,
laporan terbaru oleh Houlden et al. (2016) menunjukkan perubahan usus pasca stroke sebagai
konsekuensi dari respon stres katekolaminergik. Telah ditunjukkan sebelumnya bahwa
keparahan cedera otak berkorelasi dengan tingkat imunomodulasi sistemik sekunder (Meisel
et al., 2005; Liesz et al., 2009b).

Konsisten dengan temuan imunologis sebelumnya, induksi hanya lesi kortikal kecil dalam
model stroke kedua (cMCAo, volume infark rata-rata dalam model ini: 8 2mm3)
menyebabkan tidak ada perubahan signifikan dalam komposisi mikrobiota dan
keanekaragaman spesies (Gambar 2g, h). Lesi otak kecil dalam model cMCAo juga tidak
menyebabkan kelumpuhan gastrointestinal (Gbr. 2i). Hasil ini menunjukkan bahwa keparahan
infark mungkin menjadi faktor kunci yang menentukan disfungsi usus, meskipun kami
akhirnya tidak bisa mengesampingkan kemungkinan bahwa faktor lain yang berbeda antara
model stroke yang diteliti juga berkontribusi terhadap efek ini.
Gambar 2. Tingkat keparahan lesi menentukan disfungsi gastrointestinal. a, motilitas usus diukur 24 jam
setelah fMCAo atau operasi palsu. Gambar fluoresensi representatif dari saluran pencernaan lengkap 60
menit setelah pemberian lambung FITC-dekstran menunjukkan retensi bolus neon di saluran pencernaan
bagian atas sebagai penanda motilitas yang sangat terganggu setelah fMCAo dibandingkan dengan tikus
palsu. Panah menunjukkan cecum. b, Kuantifikasi intensitas fluoresensi di segmen usus. Perhatikan retensi
sinyal fluoresensi di saluran pencernaan bagian atas setelah fMCAo (n 8 per kelompok, 3 percobaan
individu). c, Jumlah unit pembentuk koloni (CFU) per miligram konten cecal murine yang dikultur dalam
kondisi anaerob setelah operasi palsu atau fMCAo (n 8-9 tikus per kelompok, 2 percobaan independen). d,
Tidak ada invasi bakteri ke dalam lamina propria yang ditemukan di bagian melintang dari ileum tikus,
yang digabungkan dengan menggunakan penyelidikan EUB 338 spesifik-bakteri umum dengan Syerstox
green counterstaining. Panel kiri: Pembesaran, 20; balok skala, 100 m; panel kanan: perbesaran, 63,
balok skala, 10 m. e, konsentrasi Albumin ditentukan oleh ELISA dan direpresentasikan sebagai rasio
konsentrasi dalam tinja dan plasma dari mencit yang dioperasikan sham dan fMCAo (n 5 mencit per
kelompok, 2 percobaan individu). f, Kadar katekolamin plasma, yang direpresentasikan sebagai
konsentrasi metanephrine dan normetanephrine katabololamin, secara signifikan meningkat 24 jam setelah
fMCAo dibandingkan dengan operasi palsu (n 10 per kelompok, 3 percobaan individu). g, bagian otak
koronal cresyl-violet-bernoda 3 d setelah induksi stroke dalam model cMCAo. Lesi kortikal kecil diuraikan
dalam warna merah. h, Analisis komponen utama (PC) (kiri) untuk kelimpahan taksonomi fekal setelah
csham dan cMCAo dibandingkan dengan fMCAo, dan keragaman untuk kelompok yang ditunjukkan
(kanan) menggambarkan bahwa lesi kortikal kecil tidak mempengaruhi komposit mikrobiota. i, gambar
fluoresensi representatif (kiri) dan analisis kuantitatif (kanan, n6) dari motilitas gastrointestinal setelah
operasi csham dan cMCAo yang sesuai dengan data yang ditunjukkan pada a dan b. Grafik batang: * p
0,05, berarti SD.

Untuk menyelidiki kausalitas perubahan motilitas usus setelah stroke dan mengamati
microbiota dysbiosis, kami selanjutnya menentukan efek menginduksi kelumpuhan
gastrointestinal dengan manipulasi usus fisik, model untuk ileus pasca bedah (Vilz et al.,
2012). Ileus pascaoperasi meniru pola motilitas saluran cerna yang terganggu pada hewan
stroke (Gbr. 3a) dan rekapitulasi gambaran umum mikrobiota dysbiosis seperti berkurangnya
keragaman (Gbr.3b, c). Meskipun demikian, analisis filogenetik mendalam juga
mengungkapkan perbedaan substansial dalam taksa yang diatur khusus antara stroke dan
dysbiosis yang diinduksi secara mekanis (Gbr. 3d). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan
ileus paralitik yang dimediasi stres sebagai penyebab potensial dysbiosis mikrobiota pasca
stroke, meskipun jalur alternatif spesifik SSP dapat terlibat dalam dysbiosis pascapanen.

Disbiosis terkait dengan hasil stroke yang memburuk

Kami selanjutnya menyelidiki apakah dysbiosis pasca stroke memiliki dampak fungsional
pada hasil stroke. Untuk menyelidiki mekanisme ini, kami menggunakan model transfer
mikrobiota ke tikus GF. Kami mentransplantasikan mikrobiota yang diperoleh dari tikus yang
dioperasikan secara sham dan fMCAo ke tikus penerima GF; 3 hari kemudian, kami
menginduksi lesi kortikal oleh model cMCAo, yang tidak mengubah komposisi mikrobiota
per se, seperti yang ditunjukkan di atas (Gambar 4a). Analisis metagenomik sampel tinja
penerima pada titik waktu induksi cMCAo (yaitu, 3 hari setelah transplantasi)
mengkonfirmasi pembentukan mikrobiota yang berbeda pada tikus penerima, yang
menyerupai pola spesifik donor mikrobiota (Gbr. 4b). Hebatnya, tikus yang telah menerima
mikrobiota dari hewan yang mengalami cedera otak mengembangkan volume infark yang
lebih besar secara signifikan setelah lesi kortikal pada model stroke cMCAo dibandingkan
dengan littermate yang direkolonisasi dengan mikrobiota bedah-palsu (Gambar 4c). Selain itu,
gangguan fungsional pada penerima mikrobiota disbiotik diperburuk, seperti yang ditentukan
oleh penggunaan forelimb asimetri dan aktivitas keseluruhan (upaya pemeliharaan) dalam uji
silinder yang ditetapkan untuk model stroke ini (Gambar 4d).
Gambar 3. ileus pasca bedah menginduksi disfungsi motilitas usus dan dysbiosis dari mikrobiota usus. a,
motilitas usus diukur 3 d setelah induksi ileus bedah atau operasi palsu. Ditampilkan adalah gambar
representatif dari saluran pencernaan 60 menit setelah dosis oral FITC-dextran menunjukkan retensi sinyal
fluoresensi di saluran pencernaan bagian atas (kiri). Kuantifikasi yang sesuai dari intensitas fluoresensi per
segmen usus (n 3 per kelompok, panel kanan). b, Analisis komponen utama (PC) dari komposisi mikrobiota
pada tikus sebelum dan 3 hari setelah manipulasi mekanis pada ileus menunjukkan perubahan mikrobiota. c,
Analisis indeks keanekaragaman Shannon menunjukkan berkurangnya keanekaragaman spesies yang
disebabkan oleh model ileus pasca bedah. d, Tampil adalah pohon filogenetik yang menggambarkan distribusi
pesanan bakteri yang diidentifikasi yang membandingkan mikrobiota sebelum dan 3 hari setelah operasi.
Pesanan yang berbeda secara signifikan disorot dalam warna merah (n 3 tikus per kelompok, uji t [tidak
berpasangan]). Semua grafik batang: * p 0,05, berarti SD.

Kami selanjutnya menganalisis ekspresi sitokin IL-17 dan IFN- dan faktor transkripsi Foxp3
sebagai penanda polarisasi sel Thelper pada otak 5 hari setelah cMCAo. Penerima mikrobiota
post-fMCAo menunjukkan peningkatan besar-besaran dari sitokin IFN- dan IL-17
proinflamasi, yang merupakan penanda polarisasi sel T Th1 dan Th17, masing-masing, dan
sebelumnya telah dikaitkan dengan hasil yang lebih buruk pada model stroke eksperimental
(Yilmaz et al. al., 2006; Liesz et al., 2009a; Shichita et al., 2009; Gelderblom et al., 2012).
Sebaliknya, ekspresi Foxp3, sebagai penanda untuk sel Treg neuroprotektif, tidak berbeda
secara signifikan antara penerima mikrobiota palsu dan fMCAo (Gambar 4e). Selain itu, kami
melakukan analisis aliran sitometri untuk ekspresi sitokin sel T intraseluler dalam PP untuk
menyelidiki efek dari mikrobiota berbeda pada polarisasi sel T-usus. Di sini, kami mendeteksi
4 kali lipat ekspresi proinflamasi sel Th17 (IL-17) dan Th1 (IFN-) proinflamasi dalam PP
mikrobiota fMCAo dibandingkan dengan penerima mikrobiota palsu, konsisten dengan hasil
yang diperoleh dari jaringan otak (Gbr. 4f). Hasil ini menunjukkan bahwa mikrobiota
dysbiotic setelah infark otak besar (fMCAo) menginduksi respon Th1 dan Th17 yang
dominan proinflamasi, yang berhubungan dengan peningkatan volume infark. Temuan ini
konsisten dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa polarisasi sel-T dapat
diinduksi oleh anggota terpilih Bacteroidetes dan Firmicutes (Round dan Mazmanian, 2010;
Magrone dan Jirillo, 2013). Selain polarisasi / aktivasi limfosit, produk mikroba dapat
mengatur imunitas bawaan dan berkontribusi terhadap pematangan dan aktivasi monosit /
makrofag usus (Bain dan Mowat, 2014). Di sini, kami menemukan peningkatan jumlah
monosit CD11b mukosa pada tikus yang merupakan penerima mikrobiota post-fMCAo
(Gambar 4g). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan aktivasi sel imun bawaan dan adaptif
sebagai respons terhadap mikrobiota dysbiotic pasca stroke.
Gambar 4. Disbiosis yang diinduksi iskemia otak mengubah reaksi imun pasca stroke dan memperburuk hasil
stroke. a, Desain eksperimental untuk merekolonisasi tikus GF dengan mikrobiota usus dari tikus donor SPF
yang dioperasikan sham atau fMCAo. Tiga hari setelah rekolonisasi, tikus menjalani induksi cMCAo dan
dibunuh 5 hari kemudian untuk analisis selanjutnya. b, analisis komponen utama dari komposisi mikrobiota pada
tikus donor setelah operasi palsu dan fMCAo dan komposisi mikrobiota pada tikus penerima GF 3 d setelah
transplantasi dengan mikrobiota donor. Analisis mengungkapkan pola yang berbeda dari dua populasi donor
sebelum dan sesudah transplantasi ke tikus penerima GF. c, Perbandingan volume infark otak (cMCAo) pada
tikus penerima recolonized 5 d setelah induksi cMCAo. d, tikus yang melakukan rekolonisasi dengan mikrobiota
usus yang diperoleh dari donor post-fMCAo secara signifikan meningkatkan volume lesi otak dan secara
signifikan mengurangi kinerja perilaku yang dinilai dengan mengukur forelimb menggunakan asimetri (kiri) dan
aktivitas pemeliharaan total (kanan) dalam uji silinder (n 5-8) per grup, 2 percobaan individual). e, tingkat
ekspresi gen relatif IL-17, IFN-, dan Foxp3 di belahan ipsilateral (ipsi) dan belahan kontralateral (contra) tikus
penerima GF (n8-8 per kelompok, 2 percobaan individu). Rekolonisasi dengan mikrobiota dari tikus donor
fMCAo secara besar-besaran meningkatkan ekspresi Th17 (IL-17) dan Th1 (IFN-) dibandingkan dengan
penerima mikrobiota palsu. f, Plot dot representatif dengan strategi gating untuk analisis aliran sitometri Th17
(IL-17) dan Th1 (IFN-) sel T dalam PPs (kiri). Persentase sel IL-17 dan IFN-T meningkat secara signifikan pada
PP tikus yang direkolonisasi dengan fMCAo-mikrobiota (panel kanan). g, Persentase monosit CD11b / makrofag
di lapisan mukosa usus kecil (terminal ileum) meningkat secara signifikan pada tikus yang menerima mikrobiota
dari donor fMCAo dibandingkan dengan mikrobiota palsu. Semua grafik batang: * p 0,05, berarti SD.

Sel T bermigrasi dari usus ke otak pasca stroke

Menariknya, respon imun perifer bertepatan tepat dengan peningkatan ekspresi gen serebral
secara besar-besaran untuk sitokin proinflamasi, menunjukkan bahwa sel T yang teraktivasi
secara perifer dan / atau terpolarisasi dapat bermigrasi ke otak yang terluka setelah cMCAo
pada tikus penerima GF. Untuk menyelidiki potensi migrasi sel-T dari PP ke otak, kami
menggunakan teknik pelabelan fluoresen dengan injeksi mikro CFSE atau CM-DiI di semua
PP yang terdeteksi dari usus tikus setelah cMCAo atau operasi palsu (Gbr. 5a). Kami
mengkonfirmasi bahwa teknik injeksi mikro ini hanya memberi label sel secara lokal dalam
PP, tetapi tidak ada label sistemik dengan pewarna yang berpotensi menyebar terjadi dalam
darah atau limpa (Gambar 5b). Konsisten dengan laporan sebelumnya (Benakis et al., 2016),
sel T dan monosit yang diberi label fluoresensi setelah mikroinjeksi pada PP terdeteksi di
belahan iskemik 3 hari setelah cMCAo yang konsisten dengan kinetika invasi leukosit
poststroke yang ditunjukkan sebelumnya (Gelderblom et al., 2009; Liesz et al., 2011)
(Gambar 5c, d). Sel-sel CFSE-positif yang berasal dari PP berlabel menyumbang 25% dari
total sel T dan subpopulasi sel Thelper 3 d setelah cMCAo (Gbr. 5e). Menegaskan temuan ini
dalam percobaan independen menggunakan Cm-DiI sebagai pewarna pelabelan lipofilik dan
selanjutnya analisis histologis (Gbr. 5f). Di sini, dengan menempatkan lokalisasi sel T dari
lima tikus pada satu peta bagian koronal, kami mendeteksi sel T yang menyerang otak di
sekitar inti iskemik yang konsisten dengan laporan sebelumnya menggunakan model stroke
yang sama (Liesz et al., 2011; Zhou et al., 2013 ); Selain itu, persentase sel T yang diturunkan
PP konsisten dengan hasil yang diperoleh dari analisis sitometri aliran yang ditunjukkan di
atas (Gambar 5f, g).

Hasil-hasil ini secara jelas menunjukkan invasi sejumlah besar sel T dari usus ke jaringan
periinfar yang berisiko pada otak pascakemik dengan kinetika yang sangat cepat.

Gambar 5. Limfosit bermigrasi dari PP ke otak setelah stroke.a, desain eksperimental untuk melacak migrasi
limfosit yang diturunkan PP pada tikus setelah cMCAo atau operasi palsu. CSFE atau CM-DiI disuntikkan
dalam PP 2 d setelah operasi masing-masing dan, 24 jam kemudian, otak dan organ limfoid dibedah dan
dianalisis untuk sel T pewarna-positif. b, Validasi pelabelan sel T spesifik lokasi dengan CFSEin PP 3 jam
setelah injeksi mikro; Pelabelan sel T tidak terdeteksi dalam darah dan limpa. c, Histogram representatif untuk
sel T CFSE (gated untuk ekspresi CD3 CD45) dari analisis sitometri aliran homogenat otak belahan ipsilateral
24 jam setelah mikroinjeksi CFSE pada semua PP yang terdeteksi. d, Kuantifikasi analisis aliran cytometry
menunjukkan peningkatan jumlah sel T total CFSE (CD3) dan sel Thelper (CD4) dan monosit (CD11b) dalam
hemisfer iskemik 3 hari setelah cMCAo dibandingkan dengan kontrol palsu. e, Persentase sel T CD3 dan CD4
berlabel CFSE yang diidentifikasi dalam hemisfer iskemik 3 hari setelah cMCAo dan 24 jam setelah pelabelan
PP. f, sel T CM-DiI yang menginvasi otak yang berasal dari PP diidentifikasi di wilayah peri-infark dan
diilustrasikan sebagai peta kumulatif dari lima tikus pada satu bagian otak koronal topografi pada tingkat bregma
g, Kuantifikasi CM-DiI- dan sel T CM-DiI (CD3) per satu bagian otak histologis yang digunakan untuk
menghasilkan peta kumulatif yang ditunjukkan pada f.

Transplantasi mikrobiota tinja bersifat neuroprotektif setelah stroke

Berdasarkan hasil kami, kami berhipotesis bahwa dysbiosis poststroke adalah target baru
untuk memodulasi respon imun sistemik setelah stroke. Oleh karena itu, kami menguji
penggunaan FMT sebagai pendekatan terapi untuk mengembalikan microbiome yang sehat
pada hewan setelah stroke. Memang, pengobatan FMT dimulai pada hari induksi stroke dan
dilakukan sekali sehari selama periode bertahan hidup secara signifikan mengurangi lesi
setelah stroke besar menggunakan model stroke fMCAo untuk infark otak yang parah
(Gambar 6a). Peningkatan hasil stroke ini dikaitkan dengan peningkatan jumlah sel Treg
Foxp3 di organ kekebalan perifer dan di otak iskemik setelah stroke (Gambar 6b). Untuk lebih
menjelaskan kontribusi limfosit terhadap efek ini, kami memeriksa FMT dalam model Rag1 /
tikus yang kekurangan limfosit. FMT tidak memiliki efek pada ukuran lesi pada Rag1 / tikus,
mendukung gagasan bahwa efek yang diperantarai mikrobiome pada cedera otak dimediasi
oleh limfosit (Gambar 6c). Analisis metagenomik komunitas mikroba menunjukkan
normalisasi dysbiosis yang diinduksi stroke dan sebagian keragaman mikrobiota yang
dipulihkan oleh pengobatan FMT pada tikus dengan infark yang luas (Gambar 6d, e). Analisis
yang lebih mendalam mengungkapkan bahwa pengobatan FMT meningkatkan kelimpahan
beberapa taksa yang sama, yang dikurangi dengan induksi stroke dibandingkan dengan
pengobatan palsu (Gambar 6f). Temuan ini menunjukkan bahwa terapi FMT menormalkan
perubahan yang diinduksi stroke pada komunitas mikroba secara efisien dan dengan demikian
mungkin mengerahkan fungsi neuroprotektif setelah stroke.
Gambar 6. Transplantasi mikrobiota tinja meningkatkan hasil stroke. a, Infark otak volume 3 d setelah fMCAo
dibandingkan antara tikus yang menerima kendaraan atau FMT; Pengobatan FMT secara signifikan mengurangi
volume lesi otak (tiga percobaan independen). b, Analisis sitometrik aliran menunjukkan peningkatan jumlah sel
Foxp3 Treg di limpa dan belahan iskemik setelah pengobatan FMT dibandingkan dengan kontrol 3 hari setelah
fMCAo (n5 per kelompok). c, infark otak volume 3 d setelah fMCAo pada Rag1 / tikus yang kekurangan
limfosit tidak berbeda antara perawatan kendaraan dan FMT, menunjukkan efek yang dimediasi limfosit (dua
percobaan independen). d, pengobatan FMT menormalkan komposisi mikrobiota setelah dysbiosis yang
diinduksi fMCAo seperti yang ditunjukkan oleh banyaknya taksonomi filum eubakterial. Perhatikan normalisasi
dalam rasio kelimpahan antara Firmicutes, Bacteroidetes, dan filum yang kurang melimpah (lainnya) dalam
kelompok yang diobati dengan FMT. e, Analisis keanekaragaman yang sesuai dengan indeks keanekaragaman
Shannon menunjukkan bahwa perlakuan FMT sebagian membalikkan keragaman spesies yang disebabkan oleh
fMCAo (n 5 tikus per kelompok). f, pohon filogenetik yang mengilustrasikan distribusi pesanan bakteri yang
diidentifikasi yang membandingkan tikus yang diobati dengan kendaraan dan FMT 3 hari setelah fMCAo.
Pesanan yang berbeda secara signifikan antara kelompok disorot dalam warna merah (n 5 tikus per kelompok, uji
t [tidak berpasangan]). Semua grafik batang: * p 0,05, berarti SD.

DISKUSI

Hasil kami mendukung konsep komunikasi dua arah sepanjang sumbu otak-usus-
mikrobioma-imun. Laporan terbaru menunjukkan bahwa mikrobiota memainkan peran yang
jelas dalam gangguan perkembangan dan autoimun otak (Berer et al., 2011; Cryan dan Dinan,
2012) dan bahwa antibiotik yang diinduksi dysbiosis mempengaruhi hasil stroke (Benakis et
al., 2016). Di sini, kami melaporkan bahwa stroke itu sendiri sangat mempengaruhi komposisi
mikroba usus dan bahwa perubahan ini pada gilirannya dapat menentukan hasil stroke.
Dalam penelitian kami, kami telah menunjukkan efek substansial dari cedera otak pada
komposisi mikrobiota; efek ini termasuk pengurangan keanekaragaman spesies mikrobiota
dan pertumbuhan berlebih bakteri usus dengan ekspansi preferensial dari bakteri
Bacteroidetes. Selain itu, kami mengidentifikasi perubahan spesifik yang disebabkan oleh
stroke pada genus bakteri dan bahkan tingkat spesies. Temuan ini pada dysbiosis poststroke
konsisten dengan laporan terbaru yang menggambarkan perubahan dalam komposisi
mikrobiota usus pada pasien stroke (Karlsson et al., 2012; Swidsinski et al., 2012; Yin et al.,
2015). Beberapa fitur dari perubahan mikrobiota ini adalah relevansi patofisiologis langsung;
khususnya, keanekaragaman mikrobiota yang tinggi telah disarankan sebagai fitur utama dari
mikrobioma yang sehat (Claesson et al., 2012; Human Microbiome Project, 2012). Analisis
kami juga mengungkapkan bahwa prosedur bedah itu sendiri (mis., Operasi palsu) juga
menyebabkan perubahan nyata dalam komposisi mikrobiota, sehingga menyoroti sensitivitas
komposisi mikrobiota terhadap respons stres (Carabotti et al., 2015). Namun, cedera otak
dibandingkan dengan operasi palsu memaksakan dampak tambahan dan substansial pada
komposisi mikrobiota dan kami dapat mendeteksi spesies tertentu dan taksa tingkat tinggi
yang terkait paling signifikan terkait dengan cedera otak akut dibandingkan dengan operasi
palsu menggunakan operasi taksa menggunakan analisis taksa indikator.

Hasil kami menunjukkan bahwa microbiota dysbiosis setelah stroke dikaitkan dengan
penurunan motilitas gastrointestinal dan kelumpuhan usus dalam model ileus pasca bedah
yang merekapitulasi beberapa fitur utama dysbiosis poststroke. Temuan ini memiliki
implikasi klinis yang luas; khususnya, disfungsi usus yang diungkapkan oleh model hewan
kami baru-baru ini dilaporkan pada pasien setelah cedera otak akut (Bansal et al., 2009; Olsen
et al., 2013). Namun, kausalitas yang menentukan antara respons stres pasca stroke, gangguan
motilitas, dan dysbiosis tidak dapat diklarifikasi dalam penelitian ini. Selain itu, kami tidak
dapat mengecualikan mediator langsung lainnya yang dilepaskan dari jaringan otak nekrotik
yang mempengaruhi komposisi mikrobiota melalui mekanisme yang saat ini tidak diketahui.
Salah satu mekanisme alternatif potensial yang tidak diselidiki dalam penelitian ini adalah
pelepasan alarmin proinflamasi seperti ATP, HMGB1, dan protein S100 dari otak yang
terluka dengan efek langsung potensial pada imunitas usus dan komposisi mikrobiota (Liesz
et al., 2015; Singh et al. , 2016).
Hasil kami menunjukkan bahwa microbiota dysbiosis merupakan faktor penting dalam
menentukan peradangan pasca stroke dan dengan demikian hasil stroke dalam model stroke
eksperimental. Sejumlah laporan selama dekade terakhir telah menyoroti pentingnya respon
inflamasi sekunder terhadap cedera otak sebagai mekanisme patofisiologis kunci (Iadecola
dan Anrather, 2011; Chamorro et al., 2012). Selain itu, strategi imunoterapi muncul untuk
diuji secara progresif pada pasien stroke manusia dan studi pertama melaporkan efek
menguntungkan dari menghambat invasi limfosit serebral pada pasien stroke (Fu et al., 2014;
Zhu et al., 2015). Namun, peran mikrobiota usus pada pasien stroke sulit dipahami sampai
publikasi terbaru dari laporan elegan oleh Benakis et al. (2016), yang mengamati perubahan
populasi limfosit di kompartemen imun usus setelah induksi dysbiosis dengan pengobatan
antibiotik. Perubahan yang disebabkan oleh dysbiosis pada sistem kekebalan perifer memiliki
dampak yang mencolok pada hasil stroke dengan perubahan volume infark sebesar 60%
antara kelompok perlakuan. Berbeda dengan penelitian kami, dysbiosis usus yang diinduksi
antibiotik memiliki efek neuroprotektif dengan mengurangi volume infark dan meningkatkan
hasil fungsional setelah pengobatan amoksisilin. Namun demikian, mekanisme yang
mendasari komunikasi mikrobiota-otak diidentifikasi dalam penelitian oleh Benakis et al.
(2016) dan laporan kami sebagian besar identik, seperti perubahan homeostasis sel T,
perubahan rasio Treg / Th17, dan migrasi limfosit usus ke otak iskemik.
Dampak kontradiktif pada pandangan pertama dari dysbiosis pada hasil stroke akhir mungkin
tergantung pada polarisasi imun diferensial oleh spesies bakteri tertentu. Faktanya, sementara
pengobatan antibiotik menginduksi ekspansi Treg dan pengurangan sel Th17 (Benakis et al.,
2016), dysbiosis pascapanen yang diselidiki dalam penelitian kami sendiri lebih menyukai
pola yang berlawanan dengan ekspansi subpopulasi sel T proinflamasi yang dominan. Studi
selanjutnya akan diperlukan untuk menganalisis kontribusi spesies mikroba spesifik dalam
interaksi yang sangat kompleks ini untuk mengidentifikasi bakteri pelindung saraf atau
berbahaya pada stroke.

Hasil dari percobaan transplantasi mikrobiota kami untuk hewan GF menggunakan

mikrobiota dari donor yang menjalani induksi stroke atau operasi palsu telah jelas
menunjukkan hubungan sebab akibat antara dysbiosis mikrobiota poststroke dan perubahan
kekebalan perifer dan akhirnya hasil yang lebih buruk setelah stroke. Keterbatasan potensial
dari percobaan ini adalah satu-satunya waktu rekolonisasi pendek 3 d dari transplantasi ke
induksi stroke atau 8 d dari transplantasi ke analisis, karena laporan sebelumnya telah
menyarankan bahwa rekolonisasi tikus GF dengan mikroba tinja lengkap menginduksi
aktivasi kekebalan yang diucapkan dengan aktivasi imun dengan puncak pada 4 hari setelah
dimulainya kolonisasi (El Aidy et al., 2012).

Namun, periode waktu pendek untuk rekolonisasi ini dipilih dengan sengaja untuk
menghindari perubahan komposisi mikrobiota selama periode rekolonisasi yang lebih lama.
Oleh karena itu, sementara hasil dari percobaan rekolonisasi spesifik ini mungkin melebih-
lebihkan perbedaan imunologis, mereka tetap memberikan bukti-konsep pertama untuk
kausalitas antara dysbiosis dan perubahan kekebalan pasca stroke.

Dalam penelitian kami, kami telah mengamati induksi substansial dari polarisasi sel Th1 dan
Th17 proinflamasi dengan transfer microbiome dysbiotic. Pola ekspresi sitokin yang
konsisten dengan peningkatan IFN- dan IL-17 yang nyata diamati pada otak tikus yang
menerima mikrobiota dysbiotik. Selain itu, kami dapat menentukan dalam percobaan
pelacakan sel dari PP usus ke otak iskemik bahwa setidaknya seperempat dari semua sel T
yang menyerang otak dalam fase akut setelah stroke berasal dari kompartemen kekebalan
usus, yang konsisten dengan laporan sebelumnya (Benakis et al., 2016). Pengamatan invasi
dan aktivasi sel T ini konsisten dengan banyak laporan tentang kinetika imunitas adaptif pasca
stroke yang sangat cepat (Schroeter dkk., 1994; Jander dkk., 1995; Gelderblom dkk., 2009;
Liesz dkk., 2011; Chamorro et al., 2012).

Reaksi neuroinflamasi sentral dimulai sedini jam setelah stroke, dengan sel T menyerang otak
dalam jumlah besar antara 3 dan 5 hari setelah cedera otak (Gelderblom et al., 2009;
Chamorro et al., 2012). Selain itu, kami telah mendeteksi ekspansi sel T yang substansial
sebelumnya menggunakan analisis spektratipe dalam minggu pertama setelah cedera otak
akut (Liesz et al., 2013a).

Oleh karena itu, inisiasi respon imun adaptif dan khususnya aktivasi sel T terjadi dalam
beberapa hari setelah stroke, konsisten dengan hasil yang disajikan dalam penelitian ini.
Secara khusus, telah ditunjukkan sebelumnya bahwa polarisasi sel Thelper terjadi sangat awal
setelah cedera otak dan keseimbangan Treg / Th17 berkontribusi terhadap hasil dalam 3 hari
pertama setelah stroke (Liesz et al., 2009a; Shichita et al., 2009; Kleinschnitz et al ., 2010).
Asumsi priming usus sel Thelper oleh mikrobiota dan translokasi cepat ke otak iskemik
setelah stroke lebih jauh dikuatkan oleh hasil yang diperoleh dalam percobaan di mana kami
memperlakukan tikus setelah iskemia otak yang luas (model fMCAo) oleh FMT dari donor
sehat. Pengobatan FMT mengurangi ukuran lesi dan dikaitkan dengan perluasan sel T
regulator (neuroprotektif) dalam sistem kekebalan perifer dan di otak iskemik. Temuan ini
konsisten dengan banyak laporan sebelumnya yang menunjukkan peran kunci untuk
diferensial sel Thelper priming dalam patofisiologi stroke, di mana sel-sel proinflamasi Th1,
Th17, dan T memperburuk peradangan poststroke, sedangkan sel Treg membatasi kerusakan
agunan inflamasi (Shichita et al. , 2009; Iadecola dan Anrather, 2011; Chamorro et al., 2012).

Menariknya, efek perlindungan dari pengobatan FMT tidak ada pada Rag1 / tikus yang
kekurangan limfosit, mendukung peran kunci lympyhocytes dalam memediasi efek
mikrobiota pada fungsi otak. Namun, mekanisme spesifik yang mendasari fenomena
kompleks ini masih belum jelas dan akan membutuhkan penyelidikan lebih lanjut. Secara
khusus, interaksi sel T mikrobiota-dependen diaktifkan dengan sel imunokompeten lain dari
otak pasca stroke (mikroglia, astrosit, endotelium, menyerang subpopulasi leukosit)
memerlukan analisis lebih lanjut. Laporan sebelumnya oleh Erny et al. menunjukkan peran
kunci dari mikrobiota usus dalam fungsi mikroglial dan mengusulkan asam lemak rantai
pendek yang diturunkan mikrobiota sebagai mediator yang mendasari komunikasi
mikrobiota-mikroglia (Erny et al., 2015). Oleh karena itu, masih harus dijelaskan apakah
peran penting dari polarisasi sel T yang bergantung pada mikrobiota setelah stroke yang
ditunjukkan oleh kami dan orang lain (Benakis et al., 2016) memengaruhi perlindungan saraf /
toksisitas secara langsung atau jika itu mempengaruhi hasil stroke secara tidak langsung
melalui fungsi mikroglial. , seperti yang ditunjukkan sebelumnya terjadi oleh limfosit
braininvading (Appel, 2009; Lucin dan Wyss-Coray, 2009; Liesz et al., 2011). Selain itu,
kami juga telah mengamati aktivasi monosit / makrofag usus oleh microbiome poststroke
dysbiotic.
Selain itu, monosit usus terdeteksi untuk menyerang otak pada fase akut setelah stroke. Oleh
karena itu, selain polarisasi sel-T, monosit yang menyerang otak juga berpotensi berperan
dalam efek yang ditengahi mikrobiota pada hasil stroke. Hasil kami menyarankan konsep baru
di mana dysbiosis mikrobiota usus adalah konsekuensi dari cedera otak akut dan efek utama
dalam perubahan kekebalan pasca stroke dengan dampak yang besar pada hasil stroke.
Temuan kami menunjukkan bahwa memulihkan kesehatan dan keseimbangan microbiome
usus dapat menambah pengobatan pasien stroke.