VOL. 56 TIDAK. 6, JUNI 2003 JURNAL ANTIBIOTIK hlm.

543-551
A Novel Erythromycin, 6-Desmethyl Erythromycin D, Dibuat dengan Mengganti
Domain Acyltransferase dari Erythromycin Polyketide Synthase,
HRVOJE PETKOVICa, RACHEL, LILA ANGLA, WL
ELLEN L. McCORMICKd, HAMISH AI McARTHURd, JAMES STAUNTONa, c,
PETER F. LEADLAYa, b dan STEVEN G. KENDREWa, *

a Biotica Technology Limited, ​b Departemen 181A

​ Huntingdon ​Biokimia, Road,
​ Cambridge, ​University CB3
​ ​dari Cambridge,

0DJ, UK Cambridge, CB2 1GA, UK c Departemen Kimia, Universitas Cambridge, ​d Bioproses Cambridge,
​ ​Penelitian dan CB2
​

Pengembangan, 1EW,
​ ​Pfizer Inc. Inggris, Groton,
​ Connecticut, AS
(Diterima untuk publikasi 12 November 2002)
The acyltransferase (AT ) domain dalam modul 4 dari erythromycin polyketide synthase (PKS) diganti dengan
domain AT dari rapamycin PKS module 2 untuk mengubah ​kekhususan substrat dari methylmalonyl-CoA menjadi

malonyl-CoA. Strain yang dihasilkan

​ menghasilkan 6-desmethyl erythromycin D sebagai produk utama. Pertukaran

domain AT inipertukaran ​melengkapi pustakamalonyl-CoA AT pada eritromisin PKS dan memperkuatPKS

rekayasasebagai alat yang kuat dan generik.
Erythromycin A (1) dan turunan semi-sintetis, makrolida generasi kedua seperti azithromycin (Zithromax) dan
clarithromycin (Biaxin) (5) (Gambar 1) telah menjadi antibiotik penting untuk pengobatan infeksi saluran
pernapasan selama bertahun-tahun. Namun, peningkatan jumlah patogen tahan makrolida telah sangat meningkatkan
kebutuhan untuk mengembangkan turunan baru dari molekul yang sangat efektif ini yang menggabungkan kedua
pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme resistensi yang berbeda dengan pendekatan baru untuk mengubah
sifat kimia di sekitar molekul, sementara menjaga profil keselamatan dan tolerabilitas seri Erythromycin yang sangat
baik. Selain memanfaatkan pendekatan kimia konvensional, modularitas mapantipe I Polyketide
kompleks multienzim(PKS) yang siap digunakan untuk penggunaan rekayasa genetika untuk mengembangkan
analog tidak alami dari produk yang bernilai komersial1). Dari sejumlah besar kluster PKS modular yang diurutkan
selama
dekade terakhir, eritromisin PKS (DEBS) adalah yang paling intensif dipelajari dan tetap menjadi sistem model
terbaik
untuk demonstrasi teknologi utama. Suatu sistem model yang
berasal dari DEBS digunakan untuk menunjukkanpertama
pertukaran domain AT heterologous PKS yang, menghasilkandesmethyl
laktontriketide dengan menggantimetilmalonyl-CoA
AT spesifikdari modul 1 dengan AT spesifik-CoA
malonyldari rapamycin PKS2). Pekerjaan selanjutnya dalamPKS ini
sistemtelah mengganti ATspemuatan3) dan
dari modulmodul ekstensi 2, 3, 5, dan 6 dengan cara yang serupa4-6)
untuk memberikan produk desmethyl yang diharapkan. Namun,
telah dilaporkan oleh sejumlah peneliti bahwa penggantian
DEBS AT4 oleh ATs yang menentukan malonyl-CoA menghasilkan PKS
yang tidak produktif, 4), walaupun anehnya,
penggantian AT4 dengan AT khusus untuk
turunan etilmalonyl-CoA dari gugus niddamycin
memang menghasilkan PKS8 yang produktif), walaupun denganberkurang
aktivitas sintetis yang. Sementara AT spesifik etilmalonyl-CoA
sering lebih mirip dengan AT spesifik metilmalonyl-CoA,
percobaan ini menunjukkan bahwa kegagalan
pertukaran malonyl-CoA AT yang ditukar dalam modul 4 kemungkinan disebabkan oleh kombinasi situs sambungan protein / domain yang tidak
cocok,
* Sesuai penulis: steve.kendrew@biotica.co.uk
544 PERJALANAN ANTIBIOTIK JUNI 2003
 Gbr. 1. Struktur eritromisin (1-4), klaritromisin (5) dan 6-desmethyl erythromycins (6-9).

Konstruksi Strain Rekombinan

Dua strategi digunakan untuk menghasilkandiinginkan

ain yang. Dalam yang pertama,penggantian gen konvensional

todologidigunakan untuk menggantikan DEBS AT4 dengan RAP

T2 dalam jenis liar Saccharopolyspora erythraea NRRL

6-desmethyl erythromycin A, 6: R1 = CH3, R2 = OH 6-desmethyl
erythromycin B, 7: R1 = CH3 , R2 = H 6-desmethyl erythromycin C, 8:
R1 = H, R2 = OH 6-desmethyl erythromycin D, 9: R1 = H, R2 = H

2338 (Gambar 2 dan 3). Situs sambatan protein yang

Erythromycin A, 1: R1 = CH3, R2 = OH, R3 = H Erythromycin B, 2:
R1 = CH3, R2 = H, R3 = H Erythromycin C, 3: R1 = H, R2 = OH,
R3 = H Erythromycin D , 4: R1 = H, R2 = H, R3 = H Clarithromycin,
5: R1 = CH3, R2 = OH, R3 = CH3
dipilih untuk mengapit donor AT adalah sama dengan yang
digunakan oleh OLIYNYK et al.2), meskipun strain
rekombinan yang menggunakan set situs splice yang berbeda
dan donor alternatif AT juga

menghasilkan senyawa yang diharapkan (Gambar 3). Desain

konstruksi menggabungkan sistem kaset yang memungkinkan
kami untuk memperkenalkan ATs dari banyak donor dengan
cara yang relatif sederhana, meskipun karena konstruksi awal
ketidakcocokan dari domain tertentu yang digunakan, atau
kami berfungsi, sebenarnya tidak perlu untuk menguji sejumlah
keterbatasan analisis dan deteksi produk daripada
besar ATs lebih lanjut. Dalam strategi kedua, kaset pengganti
ketidakmungkinan membuat suatu swap produktif pada titik ini.
yang mengandung AT heterolog yang dijelaskan di atas
Keinginan untuk menghasilkan senyawa ini tetap kuat; REEVES
dikeluarkan dan digunakan untuk menggantikan daerah yang
dan rekan kerja yang gagal mengembangkan strategi penggantian
setara dalam plasmid yang mengandung gen EryAI, EryAII
AT untuk produksi senyawa 6-desmethyl melaporkan penggunaan
dan EryAIII di bawah kendali sistem aktivator-aktivator
strategi mutagenesis terarah yang menghasilkan aglycone
promotif / actII-Orf4 dari Streptomyces coelicolor. PHP020
6-deoxy-6-desmethyl erythronolide B dalam campuran dengan 6-
plasmid ini kemudian dimasukkan ke dalam strain JC2 yang
deoxy erythronolide B
dihapus dari hampir seluruh wilayah PKS9), menggunakan
(6DEB) 7). Di sini, kami melaporkan konstruksi strain yang bagian TE yang tersisa dari PKS sebagai wilayah homologi
mengandung DEBS PKS hibrida di mana AT4 telah digantikan untuk integrasi (Gambar 2).
oleh AT2 yang berasal dari kluster rapamycin PKS dan
penggunaannya untuk menghasilkan antibiotik 6-desmethyl
erythromycin D (9) yang glikosilasi dan aktif secara biologis. Karakterisasi Metabolit

Strain rekombinan yang dibuat dengan penggantian dantunggal

Hasil
strategi crossoverditanam di bawahproduksi standar
VOL. 56 TIDAK. 6 JURNAL ANTIBIOTIK 545
 Gbr. 2. Strategi yang digunakan untuk konstruksi galur 6-desmethyl erythromycin D yang memproduksi.

• DEBS AT4

• ¡ATAP RAP

Sisi kiri diagram menunjukkan kaset plasmid pHP012 yang digunakan untuk memasukkan banyak AT ke dalam AT4.
Bagian atas diagram menunjukkan peristiwa crossover ganda yang diperlukan dalam kromosom S. erythraea untuk mengganti
domain AT4 menggunakan penggantian plasmid pHP014. Di bawah diagram menunjukkan konversi kaset pengganti menjadi
pHP020, berisi PKS yang dimodifikasi di bawah sistem aktivator-aktivator promoter / actII-Orf4 acti dan integrasi selanjutnya
ke dalam kromosom JC2 S. erythraea. M = MscI, Sm = SmaI, A = AvrII, Sf = SfiI.

Gambar 3. Situs sambatan yang digunakan untuk pembangunan PKS hibrida.

 Urutan protein pada batas domain AT masing-masing ditunjukkan di atas urutan DNA yang sesuai. Di bawah ini adalah perubahan urutan nukleotida yang
diperlukan untuk memperkenalkan situs pembatasan MscI, AvrII atau SnaBI yang

digunakan dalam percobaan. Mutasi yang diperkenalkan oleh situs AvrII ditandai.
546 JURNAL ANTIBIOTIK JUNI 2003
Penentuan Struktur
kondisi untuk S. erythraea dan ekstrak kultur dianalisis
dengan LC-MS. Dua komponen utama yang diamati menunjukkan Untuk memverifikasi struktur, senyawa 9 (4.2mg) diisolasi d
spektra massa yang konsisten dengan keberadaan fragmen turunan fermentasi 14 liter S. erythraea JC2 / pHP020 (BIOT0861) dalam me
desosamin (m / z = 158,5). Waktu retensi LC yang pertama, dalam Ery-P10). Rumus molekul [MH +] C35H64NO12 diverifikasi oleh F
hubungannya dengan massa induk (m / z = 690,5) dan pola MS. Data 1H dan 13C NMR untuk 9 ditunjukkan pada Tabel 1. May
fragmentasi (m / z = 546,5; hilangnya moitas carcarose, m / z = spektrum siap ditetapkan dengan perbandingan dengan eritromisin D
144), konsisten dengan struktur untuk 6-desmethyl erythromycin D kelompok metil yang ditempatkan secara teratur sangat membantu a
(9). Data LC-MS untuk komponen minor yang kurang polar (m / z spektrum 2D. Singlet luas beresonansi pada H 3.09 w
= 704.5), khususnya pengamatan fragmentasi dengan hilangnya ditetapkan sebagai 6-OH. Tidak ada sinyal yang diamati untuk menunjukkan
cladinose daripada moitas carcarose (m / z = 546; hilangnya moitas
cladinose m / z = 158), menunjukkan bahwa struktur ituadanya gugus hidroksi C12. Korelasi COZY diamati antara 6-OH dan H6 (4.H 4,26). Proton ini
kemungkinan besar adalah 6-desmethyl erythromycin B (7).juga berkorelasi dengan H5 (HH 3,59) dan H7b (1.H 1,92). Digabungkan
Puncak yang konsisten dengan kehadiran 6-desmethyl ke proton H7b a
erythromycin A dan C juga diidentifikasi.

Tabel 1. Data 1H dan 13C NMR untuk 6-desmethyl erythromycin D (9).

VOL. 56 TIDAK. 6 JURNAL ANTIBIOTIK 547

Tabel 2. Aktivitas antibakteri dari erythromycin D dan 6-desmethyl erythromycin D.

 makrolida (Tabel 2).​Diskusi

6-Desmethyl erythromycin D (9) diisolasi

dari strain di dimana acyltransferase alami modul DEBS
4, yang menentukan methylmalonyl-CoA, diganti dengan
acyltransferase yang menentukan malonyl-CoA.
Sementara penggantian domain AT telah terbukti
menghasilkan produk yang diinginkan dalam modul
DEBS 1, 2, 3, 5 dan 64- 6), substitusi yang sukses dari
domain khusus ini oleh ATS spesifik malonyl-CoA telah
menghindari sejumlah
peneliti4,7). Alasan untuk ini tidak jelas tetapi telah
dipostulasikan bahwa d domain dapat menyebabkan kompleks
PKS salah lipat, atau sebagai alternatifpolibidida yang
dimodifikasi

rantaitidak dapat dikenali oleh domain hilir PKS4,7). Di

berkorelasi dengan H8 (2.H 2,64). PengamatanHMBC
korelasiantara H5 dan anomer C1 "(ƒÂC 105,6)
dan antara H8 dan C9 (CÂC 217,5) mengkonfirmasiini
penugasan.
Aktivitas Biologis
6-Desmethyl erythromycin D memiliki aktivitas
antibakteri yang sebanding dengan eritromisin D yang
menunjukkan bahwa kelompok metil pada 6-posisi tidak
memainkan peran penting dalam aktivitas antibiotik.Seperti
yang diantisipasi, 6-desmethyl erythromycin D tidak
alami modul 4 dengan AT yang menentukan
menunjukkan aktivitas terhadap strain yang resisten
548 JURNAL ANTIBIOTIK JUNI 2003
penggabungan malonyl-CoA dapat menghasilkan
6-desmethyl erythromycins melengkapi perpustakaan
penggantian domain malonyl-CoA AT di sekitar
erythromycin PKS. Publikasi terbaru menunjukkan bahwa
substitusi ATs alami dengan ATs menentukan
ethylmalonyl-CoA atau methoxymalonyl-CoA
menghasilkan produksi senyawa yang diharapkan ketika
sisi lain produk telah diproduksi ketika AT4 telah digantikan
oleh AT spesifik untuk unit extender ethylmalonyl-CoA8)
walaupun ATs ini cenderung lebih mirip dengan ATS
methylmalonyl-CoA dan karenanya cenderung mempengaruhi
struktur PKS intrinsik. Kami juga merancang sistem plasmid
yang memungkinkan beberapa donor domain AT diuji secara
efisien. Selain strategi penggantian (double crossover)
konvensional, tetapi lebih lambat, desain sistem juga
mencakup penggunaan plasmid yang mengandung seluruh
erythromycin PKS. Setelah manipulasi PKS, plasmid ini
diperkenalkan ke S. erythraea JC2 (yang telah dihapus dari
hampir seluruh PKS9)), menggunakan TE sebagai wilayah
homologi untuk integrasi. Pendekatan ini memberi kami
kemampuan untuk membangun beberapa galur rekombinan
dengan integrasi tunggal, dan memungkinkan kami untuk
mengambil keuntungan dari peningkatan tingkat produksi
polibid yang telah kami amati dari PKS yang diekspresikan
dari sistem promoter-aktivator actI / actII promotor dalam
galur ini.
Demonstrasi yang mengganti domain asil transferase
sel direkayasa untuk mensintesis substrat yang
diperlukan8,11), lebih lanjut memperluas repertoar dari
kemungkinan manipulasi. Namun, produksi 6- desmethyl
erythromycins menggunakan strategi penggantian domain
yang dirancang secara rasional, di mana yang lain telah
gagal untuk mendeteksi senyawa tersebut dari strain yang
dibangun dengan cara yang sama, tidak menggambarkan
bahwa pengujian sejumlah situs sambungan alternatif dan
domain donor dapat menjadi penting faktor dalam
menilai mana dari reaksi-reaksi ini yang akan dipengaruhi
menentukan keberhasilan percobaan tertentu, apa pun
oleh perubahan
domain AT yang diperlukan. Ada kemungkinan bahwa
pada inti makrolida. Dalam hal ini hidroksilasi C6
karena modul 4 adalah satu-satunya modul DEBS yang
oleh EryF sitokrom P450 hidroksilase tidak terduga
mengandung loop reduktif lengkap pilihan yang tepat dari
situs sambungan dan domain yang dimasukkan memiliki karena perubahan rekayasa dalam polketida secara langsung
efek yang lebih besar pada tingkat produk yang mempengaruhi karbon yang dihidroksilasi oleh enzim ini.
diharapkan daripada di modul lain dan
Namun, EryF telah terbukti memilikidiperbesarluas12-14
membenarkan perawatan yang diambil selama desain
situs aktif yangdibandingkan dengan enzim bakteri lain dan untuk
rekayasa PKS.
menampilkan spesifisitas substrat yang). Poin-poin penting dari
Penggabungan unit asetat dalam siklus
pengenalan substrat enzim tampaknya adalah gugus hidroksil
kondensasi keempat tampaknya tidak mempengaruhi
kemampuan PKS untuk memproses polyketide yang dari C5 dan C11 dan keto dari posisi C9 di samping kontak hidrofobik
dimodifikasi. Loop reduktif pada modul 4 mengkatalisis denganmetil
reduksi total menjadi gugus metilen dan terjadi substituenpada C2, C8, C10, C12 dan C1412,13).-
kondensasi oleh KS5 hilir. Berkurangnya hasil senyawa
Kontakkontak ini dipertahankan dalam molekul poliketida yang
dibandingkan galur non-rekombinan dapat direkayasa
mengindikasikan aktivitas katalitik PKS yang lebih
dan mungkin cukup untuk pengikatan dan orientasi di
rendah tetapi percobaan kami tidak dapat menentukan
secara tepat pada titik apa, atau untuk alasan apa, lokasi aktif untuk memastikan hidroksilasi pada posisi C6.
penurunan hasil ini terjadi. REEVES dan rekan kerja7) Dengan demikian, EryF tampaknya mampu mengoksidasi karbon
mengusulkan bahwa kegagalan pertukaran AT sekunder dan karbon
heterologous mereka dalam modul 4 adalah karena
tersier walaupun, seperti yang disarankan
ketidakcocokan antara domain yang dimasukkan dan
modul 4 daripada ketidakmampuan PKS untuk sebelumnya, ini mungkin kurang energetik4). Bahwa 6-desmethyl
erythromycin D tidak memiliki hidroksilasi pada C12
memproses desmethyl-pentaketide dengan menggunakan
AT heterolog yang mampu menggabungkan malonyl- tidak mengejutkan karena EryK, sitokrom P450 yang
dan methylmalonyl-CoA, meskipun penulis ini tidak mengkatalisis reaksi ini, telah terbukti memilikijauh
melakukan uji coba ekstensif terhadap situs sambungan
kisaran substrat yanglebih sempit4,10,15) EryG, mycarose O-
domain alternatif. Produksi 6-desmethyl-6DEB sebagai
campuran menggunakan strategi mutagenesis methyltransferase yang mengkatalisis langkah terakhir dalam
diarahkan-situs untuk mengubah spesifisitas AT adalah biosintesis erythromycin juga gagal bertindak secara efisien pada
indikasi lebih lanjut bahwa PKS dapat mentoleransi
templat 6-desmethyl, meskipun kami dapat mendeteksi produksi
desmethyl
6-desmethyl erythromycin A dan B pada level yang lebih rendah
pentaketi dengan
de. LC-MS. Telah dicatat bahwa meskipun10-dan
Salah satu fitur penting dari percobaan kami adalah
turunan12-desmethyl dimetilasi secara efisien, EryG
untuk
sensitif terhadap perubahan cincin lakton dengan, misalnya,
menghasilkan erythromycins yang dimodifikasi secara
enzim ini menampilkan aktivitas yang berkurang untuk 2-desmethyl
glikosilasi sepenuhnya, dan karenanya aktif secara
biologis daripada cetakan aglycone sederhana. Ini adalah erythromycin dan ƒ ¢ 6,7- anhydroerythromycin4,16,17).
langkah-langkah pemrosesan pasca PKS seperti Sebaliknyatransferase metil gula lainnya menunjukkan
toleransi yang luas untuk sifat aglycone18 yang).
glikosilasi, hidroksilasi atau metilasi yang memberikan
Sebaliknya, percobaan kami mungkin dibantu
aktivitas biologis pada molekul-molekul ini, dan mungkin
oleh keyakinan kuat kami bahwa kami harus
sulit untuk
 berkonsentrasi pada produksi olahan, dan karenanya aktif
secara biologis, eritromisin daripada inti aglikon
sederhana. Kehadiran gula amino dalam produk
glikosilasi meningkatkan batas deteksi melalui protonasi
dan meningkatkan ionisasi dalam sumber MS
electrospray. Kadar eritromisin A yang rendah dapat
dideteksi (2-5% dari senyawa desmethyl), menunjukkan
kekhususan yang ketat dari domain yang diperkenalkan.
Ini berbeda dengan sakelar pada spesifisitas substrat AT4
VOL. 56 TIDAK. 6 JURNAL ANTIBIOTIK 549
pasokan versus yang biasanya dialami oleh domain yang
dimasukkan. Publikasi terbaru telah mulai menyelidiki aspek-aspek
manipulasi PKS ini11,19) dan jelas bahwa pemahaman yang lebih5'-TTTTTAAGCTTCCTGCGAGGCACCG-
baik tentang faktor-faktor ini akan menjadi penting karena PKSACCGGCG-3',
yang direkayasa dipindahkan melalui proses pengembangan.
Produksi campuran hanya merupakan keuntungan ketika
menghasilkan pustaka molekul yang beragam atau untuk
memproduksi molekul untuk tujuan pengujian awal di mana upaya
yang diperlukan untuk memisahkan senyawa yang berbeda oleh
kelompok metil tunggal dapat dibenarkan. Pada tahap akhir
pengembangan produk, sebuah PKS rekayasa yang pada dasarnya
memproduksi komponen tunggal jauh lebih disukai.
Eksperimental
Strain Bakteridan Plasmid
Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 dan turunan
rekombinan turunan dilapisi pada agar R2T20 dan
diperbanyak dalam TSB cair. Vektor plasmid diperbanyak di Escherichia coli ut
DH10B yang tumbuh di 2TY.termetilasi
pUC19 untuk menghasilkan pHP003. Fragmen 1.2kb turunan yang
DNA yang tidakdibuat dari E. coli strain ET12567.
dengan memperkenalkan mutasi terarah-situs yang paling
baik menghasilkan jumlah 6DEB atau
6-desmethyl-6DEB7 yang setara). Tingkat kesalahan
yang rendah dari unit extender terjadi di sejumlah sistem
PKS yang direkayasa dan alami (yaitu tidak direkayasa)
dan mungkin disebabkan oleh kombinasi faktor-faktor
seperti 'kekhususan santai' dari domain AT heterolog
dalam non-pribumi lingkungan, atau perbedaan waktu
atau konsentrasi substrat CoA
primer oligonukleotida digunakan untuk menguatkan daerah
u MscI 5'-
TTCTGCAGCGCCCTGGCCAGGGAAGACCAGGA- CCG-3
lokasi sebelumnya dan sebelum situs tersebut mula m
yang terakhir memperkenalkan situs HindIII dan
priming di situs SfiI. Produk yang diperkuat dicerna
dengan PstI dan HindIII dan disublon ke pUC19 yang
telah dicerna dengan PstI dan HindIII. Plasmid yang
dihasilkan ditunjuk pHP004. Dua primer
oligonukleotida digunakan untuk memperkuat wilayah
AvrII-hilir,
5'TTTTTGAATTCCGTCCTCCGGCGGCCACTGCT
CGG- 3' dan
5'-TTTTTCTGCAGCCTAGGGGGACGGCCGG-
CCGAGCTGCCCACC-3' , mantan memperkenalkan
situs AvrII ditambah situs PstI terletak hanya setelah
situs AvrII dan yang
terakhir sebuah situs EcoRI. Produk PCR 545 bp dipotong
engan PstI dan EcoRI dan disubkloning menjadi PstI dan EcoRI
mengandung daerah hulu MscI dikeluarkan dari

HP004 dengan PstI dan HindIII dan disubkloning ke pHP003

Konstruksi Kaset Penggantian DEBS AT4
ang telah linear dengan PstI dan HindIII, untuk menghasilkan
pHP012
pHP007. Semua fragmen PCR diurutkan untuk memastikan
Situs splice domain untuk AT heterolog dipilih menjadi
kesalahan tidak diperkenalkan selama proses amplifikasi. pHP001
MscI dan AvrII dalam posisi yang setara di DEBS AT4 dicerna dengan EcoRI dan XbaI untuk mengisolasi fragmen
sebagaimana ditentukan untuk AT1 oleh OLIYNYK et al.2). Untuk turunan PKS yang diklon ke pCJR24 yang telah dicerna dengan
membuat kaset pengganti AT4 dari DEBS2, daerah mengapit 1,2 kb EcoRI dan SpeI untuk menghasilkan
di bagian hulu dari situs MscI yang direkayasa dan daerah mengapit
di bawah 0,5kb di situs AvrII yang direkayasa, daerah yang pHP005. Fragmen SfiI 2.2kb dari pHP005 kemudian diganti
mengapit AT4, diperoleh dengan amplifikasi PCR dari pHP001 dengan fragmen SfiI 1.1kb dari pHP007 dan vektor yang
(mengandung DEBS AT4 pada sebuah 4.7kb fragmen MscI dihasilkan ditetapkan sebagai pHP012 yang merupakan kaset
disublon dari pIB023 menjadi pUC19 yang dicerna dengan SmaI). pengganti tanpa kehadiran AT4. Dengan menggunakan kaset ini,
beberapa AT heterolog dapat dimasukkan ke dalam AT4 di situs
ntuk sensitivitas thostrepton dan Southern blotting digunakan
MscI dan AvrII yang unik. ntuk memverifikasi keberadaan domain RAP AT2. Sebuah strain
i mana DEBS AT4 diganti dengan benar oleh RapAT2 ditetapkan
ebagai BIOT0875.
Isolasi S. erythraea Strain yang Mengandung Rap AT2 dengan

Penggantian
Penggantian RapAT2 Menggunakan Sistem S. erythraea
RAP AT2 yang menetapkan unit extender malonyl-CoA
C2 / pHP020
digunakan untuk menggantikan DEBS AT4 di S. erythraea. Fragmen 0.8ATB
Plasmid pHP010 adalah plasmid berbasis
pCJR249)
MscI / AvrII yangdiisolasi
dari RapAT22) mengandung DEBS1,
DEBS2 dan DEBS3
dan dikloning

ke dalam pHP012 yang telah dicerna dengan enzim yang sama di bawah kendaliactI

untuk menghasilkan pHp014 pengganti konstruksi akhir.
Plasmid pHP014 ditransformasikan menjadiS. erythraea EcoRI / XbaI 1kb tambahan (disediakan oleh Chris Wilkinson,
protoplasNRRL2338 menggunakan metode standar.
Transforman resisten tiostrepton ditambal ke
pelat R2T20 yang mengandung 25ƒÊg ml-1 tiostrepton. Untuk
mempromosikan acara rekombinasi kedua, transforman dilewatkan
dua kali dalam TSB cair tanpa antibiotik dan
romotor. pHP010 dibangun dengan memasukkan fragmen DNA
Departemen Biokimia, Universitas Cambridge) ke pIB023 di hilir
omain TE untuk memberikan homologi ekstra untuk transformasi
menjadi S. erythraea JC2. Strain ini (turunan dari NRRL2338)
elah dihapus dari hampir seluruh DEBS PKS tetapi meninggalkan
TE sebagai wilayah homologi untuk integrasi9). DEBS AT4 dari
lasmid ini diganti

disalut ke R2T20, koloni individu yang timbul dari spora disaring

550 JURNAL ANTIBIOTIK JUNI 2003
oleh RapAT2 dengan menghapus fragmen SfiI 2.2kb (situs SfiI tidak dimetilasi) dari pHP010 yang mengandung
AT4 dari erythromycin PKS dan menggantikannya dengan fragmen SfiI 2.0kb yang mengandung RapAT2 dari
pHP014 untuk menghasilkan pHP020. pHP020 diubah menjadi S. erythraea JC2 menggunakan metode standar.
Strain yang dihasilkan S. erythraea JC2 / pHP020 ditetapkan sebagai BIOT0861.
Fermentasi S. erythraea JC2 / pHP020 S. erythraea JC2 / pHP020 dibiakkan dari stock kerja vegetatif beku (1: 1,
kultur TSB: cryopreservative; cryopreservative adalah 20% gliserol: 10% laktosa w / v dalam air suling). Pra-kultur
primer ditanam dalam TSB (50 ml dalam labu 250ml) yang dikocok pada 250rpm dan 30 • Ž. Setelah dua hari ini
digunakan untuk menginokulasi (5% v / v) pra-kultur sekunder TSB (400ml dalam labu 2 liter), yang dikultur dalam
kondisi yang sama selama dua hari berikutnya. Dua belas liter medium produksi Ery-P10) diinokulasi dengan
pra-kultur sekunder
(5% v / v) dan dibiarkan berfermentasi dalam bioreaktor aduk 20 liter (Applikon) selama lima hari pada suhu 30 • Ž
denganaerasi
laju6 liter / menit.
Isolasi 6-Desmethyl Erythromycin D (9) Setelah 5 hari kaldu fermentasi S. erythraea JC2 / pHP020 diklarifikasi
dengan sentrifugasi, supernatan disesuaikan dengan pH -9,5 dengan natrium hidroksida dan kemudian diaduk
dengan resin Amberlite XAD-16 (100g) pada suhu kamar. Setelah 30 menit, resin diisolasi dengan sentrifugasi,
dicuci dengan air (200ml) dan kemudian dielusi dengan metanol (3 • ~ 200ml). Prosedur ini diulangi dua kali lebih
banyak, metanol yang dihasilkan melebur dan pelarut dihilangkan dengan tekanan rendah untuk menghasilkan
larutan berair (-50ml). Ini diencerkan dengan air (150ml) dan diekstraksi dengan etil asetat
(3 • ~ 100ml). Ekstrak digabungkan dan pelarut dihilangkan untuk menghasilkan minyak coklat (6.9g). Minyak
dipartisi antara asam asetat / natrium asetat (1: 1, 100 ml, pH 5) dan etil asetat (100ml), dan pelarut dihilangkan
untuk meninggalkan ekstrak pekat (0,5 g).
Ekstrak dimurnikan dengan kromatografi pada silika fase terbalik (Hypersil 5ƒÊm C18-BDS, 21 • ~ 150 mm),
dielusi pada laju aliran 21ml / menit denganlinier
gradienasetonitril: 20mM aseton amonium (25% -75% lebih dari 19 menit). Fraksi dikumpulkan setiap 30 detik dan
diuji dengan LC-MS. Kehilangan yang signifikan ditoleransi pada tahap ini untuk memastikan kemurnianakhir
 produk. Yang mengandung 6-desmethyl erythromycin D (9) digabungkan dan pelarut dihilangkan. Ini kemudian
dikonsentrasikan menggunakan IsoElute ENV + cartridge (200mg),
dicuci dengan air (10ml) dan dielusi dengan metanol (ml) untuk menghasilkan 6-desmethyl erythromycin D (9)
sebagai padatan putih amorf (4.2mg). Kehadiran 6- desmethyl erythromycin A, B, C (6, 7, 8) dalam fraksi alternatif
dikonfirmasi oleh analisis LC-MS, meskipun bahan tidak cukup tersedia untuk isolasi.
Strain Uji Bakteri dan Penentuan MIC Staphyloccoccus aureus 01A1046 (penr) dan S. aureus 01A1095 (ampr, cefr,
gentr, imipenem, MLSrB, tetr, van) adalah isolat klinis. Streptococcus pyogenes 02C0203 (ATCC 12384, serotipe
B, MLSS) diperoleh dari American Type Culture Collection. S. pyogenes 02C1079 adalah MLSrB. S. pneumoniae
02J1016 (serotipe 3) adalah isolat klinis yang rentan, S. pneumoniae (serotipe 6) 02C1046 adalah MLSB dan tetr.
Enterococcus faecalis 03A1085 adalah penr dan van sementara E. faecalis 03A1069 adalah strain klinis yang
resisten multi-obat (cefr, eryr, gentr, chlr, kanr, tets, van), dikonfirmasi memiliki gen ermB. Haemophilus influenzae
54A1100 adalah isolat klinis non-tipe B, erys. Escherichia coli 51A1073 (MC4100) adalah strain van tipe liar.
Penentuan MIC dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya20).
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada INES Bohm (Departemen Biokimia, University of Cambridge) untuk plasmid pIB023, Huai LO
LEE (Departemen ​strain digunakan
​ ​untuk Biokimia,
​ ​menghasilkan eritromisin Universitas
​ ​D ​ ​sebagai Cambridge)
​ ​standar, ED
untuk Hafner (Bioproses R & D, Pfizer Inc ., Groton, CT, USA) untuk merangsang diskusi dan JOAN DUIGNAN (Antimikroba
Biologi, R & D Pfizer Global, Groton, CT, USA) untuk melakukan tes antimikroba.
Referensi
1) STAUNTON, J. & B. WILKINSON: Biosintesis
erythromycin dan rapamycin. Chem Rev. 97: 2611-2629, 1997
2) OLIYNYK, M .; MJB BROWN, J. CORTES, J. STAUNTON &
PF LEADLAY: A modular modular polyketide sintase
diperoleh dengan pertukaran domain. Chem Biol. 3: 833-839, 1996
3) MARSDEN, AFA; B. WILKINSON, J. CORTES, NJ
DUNSTER, J. STAUNTON & PF LEADLAY: Teknik
kekhususan yang lebih luas menjadipenghasil antibiotik
polyaseide synthase. Sains 279: 199-202, 1998 4) RUAN, X .; A. PEREDA, DL STASSI, D. ZEIDNER, RG SUMMERS,
M. JACKSON, A. SHIVAKUMAR, S. KAKAVAS, M.
J. STAVER, S. DONADIO & L. KATZ: Pergantian domain Acyltransferase dalam erythromycin polyaseide
synthase menghasilkan novel erythromycin turunannya. J. Bacteriol. 179: 6416-6425, 1997
5) LIU, L .; A. THAMCHAIPENET, H. FU, M. BETLACH & G.
ASHLEY: Biosintesis 2-nor-b-deoxyerythronolide B
VOL. 56 TIDAK. 6 JURNAL ANTIBIOTIK 551

LEADLAY: Konstruksi vektor baru untuk ekspresi tingkat tinggi dalam

oleh substitusi domain yang dirancang secara rasional. Selai. actinomycetes. Gene 216: 215-223, 1998
Chem Soc. 119: 10553-10554, 1997 6) McDANIEL, R .; A. ACEY, MS; JP DIRLAM, RW GELDART, PF
THAMCHAIPENET, C. GUSTAFSSON, H.
LEADLAY, HAI McARTHUR, EL McCORMICK, RA
FU, M. BETLACH & G. ASHLEY: Beberapagenetika
SENIN, TN O'CONNELL, J. STAUNTON & TJ WINCHESTER: Novel
modifikasidari erythromycin polyketide synthase untuk erythromycins darirekombinan

menghasilkan perpustakaan produk alami novel yang "tidak alami". Proc Natl. Acad. Sci.
AS 96: 1846-1851, 1999 7) REEVES, CD; S. MURLI, GW ASHLEY, M. PIAGENTINI,
CR HUTCHINSON & R. McDANIEL: Perubahan spesifisitas substrat darimodular
polyketide synthase
domainacyltransferase domain melalui mutasi spesifik lokasi. Biokimia 40:
15464-15470, 2001
8) STASSI, DL; SJ KAKAVAS, KA REYNOLDS, G.
GUNAWARDANA, S. SWANSON, D. ZEIDNER, M. JACKSON, H. LIU,
A. BUKO & L. KATZ:tersubstitusi-etil
Turunan-turunan eritromisindiproduksi oleh rekayasa metabolik terarah. Proc Natl.
Acad. Sci. AS 95: 7305-7309
, 1998 9) ROWE, CJ; J. CORTES, S. GAISSER, J.
STAUNTON & PF
strain Saccharopolyspora erythraea, aktivitas biologis, isolasi, dan aktivitas biologis. J.
otik 51: 1029-1034, 1998 11) KATO, Y .; L. BAI, Q. XUE, WP
REVILL, TW YU & H.
G. FLOSS: Ekspresi fungsional gen yang terlibat dalam biosintesis dari unit ekstensi
rantai polyketide baru
, protein pembawa methoxymalonyl-acyl, dan biosintesis rekayasa 2-desmethyl-
2-methoxy-6-
erythronolide BJ Am. Chem Soc. 124: 5268-5269, 2002 12) CUPP-VICKERY, JR &
OULOS: Struktur
sitokrom P450eryf terlibat dalam biosintesis erythromycin. Nat. Struct. Biol. 2:
144-153, 1995
NDERSEN, JF; K. TATSUTA, H. GUNJI, T. ISHIYAMA &
CR HUTCHINSON: Spesifisitas substrat 6- deoxyerythronolide B hydroxylase,
 sebuahbakteri

sitokromP450 dari erythromycin A biosintesis A. Biokimia 32: 1905-1913, 1993

14) CUPP-VICKERY, J .; R. ANDERSON & Z. HATZIRIS:kristal

Strukturkompleks ligan P450eryF menunjukkan kooperatifitas homotropik. Proc

Natl. Acad. Sci. AS 97: 3050-3055, 2000 15) LAMBALOT, RH; DE CANE, JJ APARICIO
& L. KATZ:

Produksi berlebih dan karakterisasi dari erythromycin

C-12 hydroxylase, EryK. Biokimia 34: 1858-1866, 1995 16) DONADIO, S .; JB

McALPINE, PJ SHELDON, M. JACKSON

& L. KATZ: Sebuah analog eritromisin yang diproduksi dengan memprogram ulang
sintesis polketida. Proc Natl.

Acad. Sci. AS 90: 7119-7123, 1993 17) McALPINE,

JB; JS TUAN, DP COKLAT, KD

GREBNER, WHITTERN DN, A. BUKO & L. KATZ: Antibiotik baru dari

actinomycetes yang direkayasa secara genetika. I.

2-Norerythromycins, isolasi dan penentuan struktural. J. Antibiotik 40: 1115-1122,

1987

18) GAISSER, S .; R. LILL, G. WIRTZ, F. GROLLE, J. STAUNTON

& PF LEADLAY: Turunan eritromisin baru dari Saccharopolyspora erythraea

menggunakan gula O-metiltransferase darigen biosintetik spinosyn

gugus. Mol. Mikrobiol. 41: 1223-1231, 2001 19) REEVES,

CD; LM CHUNG, Y. LIU, Q. XUE, JR

CARNEY, WP REVILL & L. KATZ: Spesifisitas substrat baru untuk domain asil
transferase dari ascomycin polyketide

synthase di Streptomyces hygroscopicus. J. Biol. Chem 277: 9155-9159, 2002 20) SAKEMI, S
.; J. BORDNER, DL DECOSTA, KA DEKKER,

H. HIRAI, T. INAGAKI, YJ KIM, N. KOJIMA, SIM JC, Y.

SUGIE, A. SUGIURA, JA SUTCLIFFE, K. TACHIKAWA, SJ

TRUESDELL, JW WONG, N YOSHIKAWA & Y. KOJIMA:

CJ-15.696 dan analognya, antibiotik furopyridine baru dari jamur Cladobotryum

varium: fermentasi, isolasi, penjelasan struktural, biotransformasi dan

aktivitas antibakteri. J. Antibiotik 55: 6-18, 2002